DE69935089T2

DE69935089T2 - Verfahren zur Klonierung und Vorbereitung der AgeI Restriktions-Endonuklease in E. coli

Info

Publication number: DE69935089T2
Application number: DE69935089T
Authority: DE
Inventors: Shuang-yong Lexington XU; Robert E. Danvers Maunus; Keith D. Essex Lunnen; Rachel Beverly Allen
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1998-05-14
Filing date: 1999-04-26
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2019-04-27
Also published as: US5885818A; EP0959131A3; EP0959131B1; JPH11318476A; JP4325764B2; DE69935089D1; EP0959131A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die AgeI Restriktionsendonuclease sowie die AgeI Methyltransferase kodiert, sowie die Produktion von AgeI Restriktionsendonuclease von E. coli Zellen, die die rekombinante DNA enthalten.
Restriktionsendonucleasen des Typs II sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in Bakterien vorkommen. Wenn sie von anderen Bakterienproteinen weggereinigt werden, können Restriktionsendonucleasen im Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in kleine Fragmente zur molekularen Klonierung und Gencharakterisierung verwendet werden.
Restriktionsendonucleasen erkennen und binden sich an spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül. Nach dem Anbinden spalten sie das Molekül innerhalb, an einer Seite oder an beiden Seiten der Erkennungssequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen haben Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Mehr als zweihundertundelf Restriktionsendonucleasen mit einzigartigen Spezifitäten wurden unter den vielen hundert bisher untersuchten Bakterienspezies identifiziert (Roberts und Macelis, Nucl. Acids Res. 24: 223-235 (1996)).
Restriktionsendonucleasen werden typischerweise nach den Bakterien, von denen sie abstammen, benannt. Die Spezies Deinococcus radiophilus produziert somit beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonucleasen, nämlich DraI, DraII und DraIII. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils die Sequenzen 5'TTTAAA3', 5'PuGGNCCPy3' und 5'CACNNNGTG3'. Escherichia coli RY13 produziert hingegen nur ein Enzym, nämlich EcoRI, das die Sequenz 5'GAATTC3' erkennt.
Eine zweite Komponente von bakteriellen Restriktions-Modifikations-(R-M)-Systemen sind die Methylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das Bakterien befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die gleiche Erkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch ein spezielles Nucleotid innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe (C⁵-Methyl-Cytosin, N⁴-Methyl-Cytosin oder N⁶-Methyl-Adenin). Im Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr durch die zugehörige Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle wird durch die Aktivität ihrer Modifikationsmethylase stets vollständig modifiziert. Sie ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich. Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNR reagiert auf eine Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease empfindlich.
Anhand der DNA-Rekombinationstechnik ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Enzyme in großen Mengen überzuproduzieren. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung solcher Klone innerhalb komplexer „Bibliotheken", d.h. Populationen von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn sie in geringen Frequenzen von 10^-3 bis 10^-4 auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so dass die unerwünschte Mehrheit von Klonen zerstört wird, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
Restriktionsmodifikationssysteme des Typs II werden immer öfter kloniert. Die ersten Klonierungsverfahren nutzten eine Bakteriophage-Infektion als ein Mittel zum Identifizieren oder Selektieren von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Mol. Gen. Genet. 178: 717-719 (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97-112 (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78: 1503-1507 (1981)). Da Restriktionsmodifikationssysteme in Bakterien diese befähigen, Infektionen durch Bakteriophagen zu widerstehen, können Zellen, die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als Überlebende von Bibliotheken, die Phagen ausgesetzt wurden, selektiv isoliert werden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren nur begrenzt von Nutzen ist. Im Speziellen wurde gefunden, dass klonierte Restriktions-Modifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand aufweisen, um selektives Überleben zu gewähren.
Ein weiterer Klonierungsansatz schließt das Übertragen von anfänglich als plasmidbürtig gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsplasmide ein (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acids. Res. 12: 3659-3676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402-406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355-359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501-509 (1985)).
Ein dritter Ansatz, der zum Klonieren einer zunehmenden Zahl von R-M-Systemen angewendet wird, werden jetzt durch Selektion nach einem aktiven Methylasegen kloniert (US-Patent Nr. 5,200,333 (1993) und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acids. Res. 13: 6403-6421 (1985)). Da R-M-Gene oft eng miteinander verknüpft sind, können beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion bringt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem hervor, sondern stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10: 219-225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20: 197-204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21: 111-119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235-1241 (1983)).
Ein neueres Verfahren, das "Endo-Blue-Verfahren", wurde zum direkten Klonieren von Restriktionsendonucleasegenen in E. coli auf der Basis des Indikatorstammes von E. coli beschrieben, der die dinD::lacZ Fusion enthält (Fomenkov et al., US-Patent Nr. 5,498,535 (1996); Fomenkov et al., Nucl. Acids Res. 22: 2399-2403 (1994)). Dieses Verfahren arbeitet mit der E. coli SOS-Reaktion im Anschluss an DNA-Schäden, die durch Restriktionsendonucleasen oder unspezifische Nucleasen verursacht werden. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe thermostabiler Nucleasegene (Tth111I, BsoBI, Tf Nuclease) kloniert (US-Patent Nr. 5,498,535, 1996).
Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und, in geringerem Maße, Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zur Schaffung rekombinanter Moleküle im Labor sind, gibt es einen kommerziellen Anreiz, Stämme von Bakterien durch DNA-Rekombinationstechniken zu gewinnen, die diese Enzyme in großen Mengen produzieren. Solche Überexpressionsstämme müssten auch die Aufgabe der Enzymreinigung vereinfachen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
AgeI ist eine Restriktionsendonuclease, die die Palindromhexanucleotidsequenz ACCGGT erkennt, zwischen A und C schneidet und eine kohäsive 5'-Tetranucleotid-Verlängerung bildet (Yamada, et al., Agric. Biol. Chem., 53: 1747-1749 (1989) und (Mizuno, et al., Agric. Biol. Chem., 54: 1797-1802 (1990)). Suzuki, et al. veröffentlichten die AgeI Methylasegensequenz (Biosci. Biotech. Biochem., 60: 444-447 (1996)). Sie veröffentlichten außerdem die -150 bp Sequenz stromabwärts des ageIM Gens, Teil des ageIR Gens. Gemäß der vorliegenden Erfindung haben wir festgestellt, dass ihre Sequenz eine 13-bp-Deletion im ageIR Gen enthält. Diese Deletion würde eine inaktive AgeI Endonuclease produzieren, wenn die Deletionsmutante in E. coli exprimiert worden wäre. Suzuki, et al., (supra) berichteten, dass die Klonierung einer 1-kb-downstream-Sequenz keine AgeI Endonucleaseaktivität hervorrief. In der Tat analysierten sie die Nucleotidsequenz sowohl in stromaufwärtiger als auch in stromabwärtiger Richtung, fanden jedoch das offene Leseraster nicht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde das Methylaseselektionsverfahren zum Klonieren des AgeI Methylasegens (ageIM) von Agrobacterium gelatinovorum (ATCC 25655) verwendet. Zwei AgeI Methylase-plus-(M⁺)-Klone wurden in einer Sau3AI-partiellen Bibliothek identifiziert. Das gesamte Insert (-5400 bp) von den AgeI M⁺ Klonen wurde vollständig sequenziert. Ein offenes Leseraster wurde identifiziert, das konservierte C⁵-Cytosinmethylasemotive enthielt, und dieses Gen wurde ageIM Gen genannt. Dieser Klon produzierte jedoch keine AgeI Restriktionsendonuclease. Man folgerte, dass das AgeI Endonucleasegen im M⁺ Klon wahrscheinlich aufgrund der Art des partiellen Sau3AI Verdaus verkürzt ist. Da Methylasegene und Restriktionsendonucleasegene typischerweise in einem speziellen Restriktions-Modifikationssystem nahe beieinander liegen, wurden Anstrengungen unternommen, um ageIM upstream- und downstream-DNA-Sequenzen durch inverse PCR zu amplifizieren und klonieren. Nach vier Runden inverser PCR-Reaktionen wurde ein offenes Leseraster (ORF1) stromaufwärts des ageIM Gens gefunden und ein anderes offenes Leseraster (ORF2) wurde stromabwärts des ageIM Gens gefunden. Die Expression von ORF1 in einem T7 Expressionsvektor brachte keine AgeI Restriktionsendonucleaseaktivität hervor. Die Expression des zweiten ORF (ORF2) in E. coli rief AgeI Endonucleaseaktivität hervor. Folglich wurde ORF2 ageIR Gen genannt. Das ageIR Gen umfasst 852 bp und kodiert ein Protein mit einer vorhergesagten relativen Molekülmasse von 31.035 Dalton.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Genorganisation des AgeI Restriktions-Modifikationssystems.
2 zeigt die ORF1 DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) und ihre kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2).
3 zeigt die DNA-Sequenz des agelIM Gens (SEQ ID Nr. 3) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4).
4 zeigt die DNA-Sequenz des ageIR Gens (SEQ ID Nr. 5) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 6).
5 ist eine Fotografie, die den Restriktionsverdau unter Verwendung von E. coli Zellextrakt mit AgeI Restriktionsendonuclease veranschaulicht.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem das AgeI Methylasegen und die AgeI Restriktionsendonucleasegene bevorzugt kloniert und exprimiert werden in E. coli, beinhaltet die folgenden Schritte:
1. Konstruktion einer Sau3AI-partiellen genomischen DNA-Bibliothek
Genomische Agrobacterium gelatinovorum (ATCC 25655) DNA wurde mit Sau3AI verdaut, um den gewünschten Teilverdau zu erzielen. Die mit Sau3AI partiell verdaute genomische DNA im Bereich von 0,5-20 kb wurde in den BamHI-zerschnittenen und CIP-behandelten Vektor pAge-2 ligiert; pUC19 Derivat mit zwei AgeI Orten bei 16°C über Nacht. Die Transformation wurde mit kompetenten RR1-Zellen und ligierter DNA durchgeführt. Die Transformanten wurden gepoolt und amplifiziert. Plasmid-DNA wurde von den Übernachtzellkulturen hergestellt.
2. Aussetzen der Sau3AI-partiellen Bibliothek-DNA einem AgeI-Verdau und Klonieren des AgeI Methylasegens (ageIM)
Die Sau3AI-partielle Bibliothek-DNA wurde über Nacht mit AgeI bei 37°C verdaut. Die verdaute DNA wurde zum Retransformieren kompetenter RR1-Zellen verwendet. Plasmid-DNA wurde von Zellkultur aller Transformanten isoliert. Individuelle Plasmid-DNA wurde mit AgeI verdaut, um jegliche Verdauresistenz nachzuweisen. Zwei isolierte Plasmide, Nr. 1 und Nr. 26, wiesen Resistenz gegen AgeI-Verdau auf. Es lag eine vollständige Resistenz gegen AgeI-Verdau vor, was darauf schließen ließ, dass die Klone das AgeI Methylasegen enthielten und in E. coli exprimierten.
3. Sequenzieren des Inserts, das das AgeI Methylasegen trägt
Zwei M⁺ Klone, Nr. 1 und Nr. 26, wurden einer DNA-Sequenzierung durch Primer-Walking unterzogen. Das gesamte Insert von Nr. 26 wurde sequenziert und man fand, dass es Nr. 1 vollständig überlappte. Das Insert von Nr. 26 umfasst 5356 bp DNA mit partiellen und kompletten offenen Lesenrastern, ein großes ORF wurde jedoch mit den anderen Genen in der GenBank unter Verwendung von blastx verglichen und weist Homologie zu bekannten C⁵-Cytosinmethylasen auf. Dieses Gen wurde ageIM Gen genannt. Es gibt 3576 bp DNA stromaufwärts des ageIM Gens und 491 bp DNA stromabwärts des ageIM Gens. Einige der Sequenzen können durch Zufallsligation von Sau3AI Fragmenten im Laufe des Bibliothekenaufbaus hergeleitet werden. (In späteren Experimenten wurde gefunden, dass sich das ageIR Gen stromabwärts des ageIM Gens befindet, siehe 1).
4. Expression des AgeI Methylasegens in E. coli
Das gesamte AgeI Methylasegen (1290 bp) wurde von genomischer DNA mit Vent^® DNA-Polymerase und zwei Primern durch PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt (ageIM Gen) wurde mit BamHI verdaut, gelgereinigt und in pACYC184 kloniert. Vier Plasmidisolate wiesen volle Resistenz gegen AgeI-Verdau auf, was ein Hinweis auf eine Modifikation von Age:: Orten in vivo über Insertion und Expression des AgeI Methylasegens war.
5. Klonierung und Expression der AgeIM upstream-Sequenz
Es gibt 3576 bp DNA stromaufwärts des ageIM Gens im ursprünglichen M⁺ Klon, allerdings produziert dieser Klon keine AgeI Endonucleaseaktivität. Man folgerte, dass die 3576-bp-DNA ganz oder teilweise von einer Zufallsligation hergeleitet wurde. Mit inverser PCR wurde die kontinuierliche DNA stromaufwärts des ageIM Gens amplifiziert und kloniert. Nach zwei Runden der inversen PCR wurde ein offenes Leseraster (ORF1) von 681 bp gefunden (2). ORF1 wurde durch PCR amplifiziert und in einen T7 Expressionsvektor pAII17 (von pET11 hergeleitet) kloniert und in einen zuvor mit AgeI Methylase modifizierten Wirt transformiert. E. coli Zellen wurden mit IPTG induziert und Zellextrakt wurde im Hinblick auf AgeI Aktivität geprüft. Es wurde keine AgeI Aktivität nachgewiesen.
6. Klonierung und Expression des AgeI Restriktionsendonucleasegens
Da sich Restriktions- und Modifikationsgene typischerweise in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, ging man davon aus, dass das ageIR Gen stromabwärts gelegen ist. Mit inverser PCR wurde DNA stromabwärts des ageIM Gens amplifiziert. Nach zwei Runden der inversen PCR wurde ein offenes Leseraster (ORF2) von 852 bp gefunden. ORF2 hat eine entgegengesetzte Orientierung zum ageIM Gen (AgeI R-M Genorganisation siehe in 1). ORF2 wurde durch PCR amplifiziert und in den T7 Expressionsvektor pAII17 kloniert und in mit AgeI Methylase zuvor modifizierte Zellen transformiert. E. coli Zellen wurden mit IPTG drei Stunden lang induziert und Zellextrakte wurden präpariert und im Hinblick auf AgeI Aktivität geprüft. Acht Zellextrakte wurden geprüft und alle wiesen AgeI Aktivität auf. Folglich wurde ORF2 ageIR Gen genannt (4).
Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand des folgenden Beispiels veranschaulicht. Dieses Beispiel soll dem Verständnis der Erfindung dienen und ist nicht als diese begrenzend anzusehen.
Die oben und im Folgenden angeführten Referenzen sind hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
1. BEISPIEL
KLONIERUNG DES AGEI RESTRIKTIONS-MODIFIKATIONSSYSTEMS IN E. COLI
Genomische DNA wurde von Agrobacterium gelatinovorum (ATCC 25655) präpariert (dieser Stamm befindet sich in der New England Biolabs' Collection, NEB Nr. 552, Beverly, Massachusetts); Yamada et al, Agric. Biol. Chem. 53: 1747-1749 (1989).
1. Konstruktion einer Sau3AI-partiellen genomischen DNA-Bibliothek
Vier μg genomisches Agrobacterium gelatinovorum DNA wurden mit 0,5, 0,25 und 0,125, 0,0625, 0,03, 0,015, 0,0078, 0,0039 Einheiten Sau3AI 15 min lang bei 37°C verdaut. Alle acht Verdau-Röhrchen wurden als partieller Verdaupool kombiniert. Die mit Sau3AI partiell verdaute genomische DNA lag im Bereich 0,5-20 kb. Die mit Sau3AI partiell verdaute genomische DNA wurde in den BamHI- zerschnittenen und CIP-behandelten Vektor pAge-2 ligiert; pUC19 Derivat mit zwei AgeI Orten (Skoglund et al, Gene, 88: 1-5 (1990)) über Nacht bei 16°C. pAge-2 enthält einen AgeI Linker, (5'd(pGACCGGTC)3' 8mer) an zwei verschiedenen Orten in pUC19 (Yanisch-Perron et al Gene, 33: 103-119 (1985)); einen am SspI Ort und einen anderen am DraI Ort zwischen dem β-Lactamasegen und ori von pUC19. Nach der Ligationsreaktion fand eine Transformation durch Vermischen kompetenter RR1-(TonA-, DnaseI-)-Zellen und der ligierten DNA durch Standardverfahren statt. Transformanten wurden auf LB-Agar plus Amp (100 μg/ml) plattiert. Etwa 10.000 Kolonien wurden in Transformation erhalten. Zum Erhöhen der Anzahl der Kolonien wurde eine weitere 5X Transformation mit RR1-(TonA^-, DnaseI^-)-Zellen und der ligierten DNA durchgeführt. Es wurden etwa 50.000 Transformanten erhalten. Alle Transformanten wurden gepoolt und in 0,5 Liter LB-Nährlösung plus Amp inokuliert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Plasmid-DNA wurde von den Übernachtzellen durch CsCl-Gradient präpariert.
2. Aussetzen der Sau3AI-partiellen Bibliothek-DNA einem AgeI Verdau und Klonieren des AgeI Methylasegens (ageIM)
Zwei μg der Sau3AI-partiellen Bibliothek-DNA wurden mit 12 Einheiten AgeI über Nacht bei 37°C verdaut. Die verdaute DNA wurde zum Retransformieren kompetenter RR1-(TonA-, DnaseI-)-Zellen verwendet. Es wurden achtundvierzig Überlebende erhalten. Eine Mini-Präparation von Plasmid-DNR wurde von 10 ml Zellkultur von 28 Transformanten isoliert. Individuelle Plasmid-DNA wurde mit AgeI verdaut, um jegliche Verdauresistenz nachzuweisen. Zwei isolierte Plasmide, Nr. 1 und Nr. 26, wiesen Resistenz gegen AgeI Verdau auf. Es lag eine vollständige Resistenz gegen AgeI Verdau vor, was darauf schließen ließ, dass das klonierte AgeI Methylasegen komplett und in E. coli exprimiert war (durch Sequenzieren des Inserts wurde belegt, dass das gesamte AgeI Methylasegen kloniert war).
Ein Restriktionsverdau von Nr. 1 und Nr. 26 Plasmid-DNA mit AatII und Sau3AI wies auf überlappende DNA hin. Nr. 1 enthielt ein 1,8 kb partielles Sau3AI Fragment, das von Nr. 26 völlig überlappt wurde, die ein partielles Sau3AI Insert von etwa 5,4 kb DNA enthielt.
3. Sequenzieren des Inserts, das das AgeI Methylasegen trägt
Nr. 1 und Nr. 26 Plasmid-DNA wurde durch Primer-Walking mit dem Didesoxy-Terminationsverfahren unter Verwendung eines AmpliTaq DNR-Polymerase Dye Deoxy Terminator Sequencing Kits und eines ABI373A DNR-Sequenzierungsautomaten sequenziert. Primer wurden synthetisiert, um die nicht überlappende Region zu sequenzieren oder um den Komplementärstrang der bekannten Sequenz zu bestätigen. Das gesamte Insert von Nr. 26 wurde sequenziert und man fand, dass es 5356 bp partieller Sau3AI Fragmente enthielt, die mehrere partielle und komplette offene Leseraster kodierten. Als das große ORF mit dem bekannten Gen in der GenBank unter Verwendung von blastx verglichen wurde, zeigte ein ORF Homologie zu bekannten C⁵-Cytosinmethylasen. Ein ORF stromaufwärts des ageIM Gens weist eine schwache Homologie zu einer bekannten Transposase, Tpase D78259, auf. Das stromabwärtige partielle ORF wies keine Homologie zu irgendeinem Gen in der GenBank auf. Das AgeI Methylasegen nt 3577-4866 ist auf 1290 bp DNA kodiert und beginnt beim Codon ATG (Met) und endet beim TAG Codon.
4. Expression des ageIM Gens in E. coli
Eine PCR wurde zum Amplifizieren des ageIM Gens durchgeführt. BamHI Orte wurden in die beiden Primer 179-36 und 179-37 an den 5' Enden eingebaut. Zehn PCR-Reaktionen fanden mit 0,2 μg Genom-DNA, 10 μl 10X Thermopool-Puffer, einer 0,27 mM Konzentration von dNTP, 79 μl H₂O, 0,12 μg Primer 179-36, 0,12 μg Primer 179-37, 2 Einheiten Vent^® DNA-Polymerase statt.

5' AACGGATCCGGAGGTTTAAAAATGAAGACGATCGATCTATTTTGC 3' (179-36) (SEQ ID Nr. 7)
5' CAAGGATCCTAACTGATCGCAACCTTTATTGTTTCA 3' (179-37) (SEQ ID Nr. 8)

Die resultierende DNA wurde auf leicht schmelzendem Agarosegel gereinigt und die DNA-Banden wurden herausgeschnitten und mit gleichen Mengen Phenol-CHCl₃ und CHCl₃ extrahiert und mit kaltem Ethanol präzipitiert, getrocknet und in 80 μl TE-Puffer resuspendiert. Die PCR DNA (etwa 4 μg) wurde dann mit 200 Einheiten BamHI, 10 μl 10X BamHI Puffer verdaut und 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die mit BamHI verdaute DNA wurde gelgereinigt und mit β-Agarase behandelt und mit gleichen Mengen Phenol-CHCl₃ und CHCl₃ extrahiert und mit kaltem Ethanol präzipitiert, getrocknet und in 50 μl TE-Puffer resuspendiert. Die gereinigte DNA wurde in pACYC184 inseriert. Es wurden vierzehn Mini-Präparationen von Plasmid-DNA gemacht, wobei 11 davon das Methylasegeninsert enthielten. Der Verdau von sechs Plasmiden mit AgeI zeigte, dass vier Isolate (Nr. 1, Nr. 3, Nr. 4, Nr. 6) gegen AgeI Verdau resistent waren. Das Isolat Nr. 1 wurde zum Transformieren des T7 Expressionswirts ER2566 verwendet, um Chromosomen-DNA zuvor zu modifizieren.
5. Klonierung von DNA stromaufwärts des ageIM Gens
In 17 Reaktionen wurden 10 μg Genom-DNA mit AatII, ApoI, BanI, BsaHI, EaeI, Eco47III, HaeII, HincII, HpaI, MluI, MspI, NlaIII, PvuI, SacI, TaqI, Tsp509T und XmnI verdaut. Die resultierende DNA wurde dann mit gleichen Volumen Phenol-CHCl₃ und CHCl₃ extrahiert, mit kaltem Ethanol präzipitiert, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Zwei μg der DNA wurden mit T4 DNA-Ligase selbstligiert und dann mit Phenol-CHCl₃ und CHCl₃ extrahiert und mit kaltem Ethanol präzipitiert. Es wurde ein Satz inverser PCR-Primer synthetisiert:

5' AAGGGTGCTGAAGTACCCAAACGCCGG 3' (178-44) (SEQ ID Nr. 9)
5' GCGGAGAACAGCCGCCACAGATGCGAC 3' (178-45) (SEQ ID Nr. 10)

Die inverse PCR wurde mit den Primern 178-44 und 178-45 und der oben erwähnten DNA-Matrize durchgeführt. Inverse PCR-Produkte wurden in mit AatII, HincII, PvuI, TagI, Tsp509I und XmnI verdauter und selbstligierter DNA gefunden. Eine inverse PCR wurde an diesen sechs Reaktionen wiederholt und die Produkte wurden gelgereinigt und unter Verwendung der Primer 178-44 und 178-45 direkt sequenziert. Das AatII Fragment lieferte 449 bp DNA-Sequenz.
Es wurde ein zweiter Satz inverser PCR-Primer synthetisiert:

5' TCGGGAAGCTGGGACCTTGCGAGC 3' (178-122) (SEQ ID Nr. 11)
5' ACCACCTATATCGCCACCGCACCT 3' (178-123) (SEQ ID Nr. 12)

Zehn μg Genom-DNR wurden mit AatII, ApoI, AvaI, ApaLI, BsaHI, BstUI, HaeII, PvuI, Sau3AI, StyI und TaqI verdaut. Die resultierende DNA wurde dann mit gleichen Volumen Phenol-CHCl₃ und CHCl₃ extrahiert, mit kaltem Ethanol präzipitiert, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Zwei μg der DNA wurden mit T4 DNA-Ligase selbstligiert, dann mit Phenol-CHCl₃ und CHCl₃ extrahiert und mit kaltem Ethanol präzipitiert. Die inverse PCR wurde mit den Primern 178-122 und 178-123 und der oben erwähnten Matrix-DNA durchgeführt. PCR-Produkte wurden in der BsaHI und TagI Matrize gefunden. Die inverse PCR DNA wurde jeweils mit drei Röhrchen wiederholt und die Produkte wurden in leicht schmelzendem Agarosegel gelgereinigt. Die DNA wurde mit den Primern 178-122 und 178-123 direkt sequenziert. Es wurde ein offenes Leseraster von 681 bp gefunden. Dieses ORF wurde ORF1 genannt.
6. Expression von ORF1 im T7 Expressionsvektor
Es wurde ein Satz PCR-Primer synthetisiert:

5' CTTCCCGACCATATGGGGCCATCAACGCTGAAAAGGAGA 3' (181-184) (SEQ ID Nr. 13)
5' GCTGGATCCTCAGCGAGGATATTTGCAGACACCATA 3' (179-100) (SEQ ID Nr. 14)

ORF1 wurde durch PCR mit den Primern 181-184 und 179-100 von AgeI Genom-DNA unter den folgenden PCR-Bedingungen amplifiziert: 95°C, 30 Sekunden, 55°C, 1 Minute, 72°C, 1 Minute, und 2 Einheiten Vent^® DNA-Polymerase, 20 Zyklen. Das PCR-Produkt wurde mit NdeI und BamHI verdaut und in den T7 Expressionsvektor pAII17 kloniert. Die ligierte DNA wurde in den T7 Expressionswirt ER2566 [pACYC-AgeIM⁺] transformiert. Plasmid-DNA wurde von 20 Transformanten isoliert und mit NdeI und BamHI verdaut, um im Hinblick auf das Insert zu screenen. Zehn von 20 enthielten das Insert. Sieben Klone mit Insert wurden 2 Stunden lang mit IPTG induziert. Zellextrakte wurden präpariert und im Hinblick auf AgeI Restriktionsendonucleaseaktivität geprüft. In allen 7 Extrakten wurde keine Aktivität nachgewiesen. Man folgerte, dass ORF1 nicht das AgeI Endonucleasegen war. Das AgeI Endonucleasegen muss stromabwärts des Methylasegens liegen.
7. Amplifikation von stromabwärtiger DNA durch inverse PCR
Es wurde ein Satz PCR-Primer auf der Basis der unmittelbar stromabwärts des AgeI Methylasegens liegenden Sequenz synthetisiert:

5' AACTCGTCGTCCTGACCAGAGAAG 3' (182-159) (SEQ ID Nr. 15)
5' CGACTACTTAGTCGCCCAACTGGC 3' (182-160) (SEQ ID Nr. 16)

Es wurde ein zweiter Satz PCR-Primer 165 bp stromabwärts des AgeI Methylasegens synthetisiert:

5' TAATTCCTCTTGTCCGAGGGCCGG 3' (182-161) (SEQ ID Nr. 17)
5' ATTGAGGGACACGGGGATTTCTCG 3' (182-162) (SEQ ID Nr. 18)

Zehn μg Genom-DNA wurden mit AvaII, BsrBI, ClaI, DdeI, EcoRI, HhaI, NciI, TseI und NruI verdaut. Die resultierende DNA wurde dann mit gleichen Volumen Phenol-CHCl₃ und CHCl₃ extrahiert, mit kaltem Ethanol präzipitiert, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Zwei μg der DNA wurden mit T4 DNA-Ligase selbstligiert, dann mit Phenol-CHCl₃ und CHCl₃ extrahiert und mit kaltem Ethanol präzipitiert. Eine inverse PCR wurde mit den Primern 182-161 und 182-162 durchgeführt. Inverse PCR-Produkte wurden in HhaI und TseI DNA gefunden. Diese beiden PCR-Reaktionen wurden mit jeweils vier Röhrchen wiederholt. Die PCR DNA wurde von leicht schmelzendem Agarosegel gelgereinigt und mit den Primern 182-161 und 182-162 direkt sequenziert. Das HhaI Fragment lieferte eine neue Sequenz von 341 bp. Es wurde ein Satz inverser PCR-Primer synthetisiert:

5' CCCATGTCGGGCCAGCACTGGATT 3' (183-88) (SEQ ID Nr. 19)
5' ACTRGGTTGACCGCCTTATTCAAG 3' (183-89) (SEQ ID Nr. 20)

Zehn μg Genom-DNA wurden mit AatII, AlfIII, AluI, ApaLI, AvaI, BarBI, BfaI, BsaAI, BsaWI, BsiEI, BspEI, BspHI, BstUI, DdeI, HinfI, HpaII, MluI, MspI, StyI, TaiI, TfiI und Tsp509I verdaut. Die resultierende DNA wurde dann mit gleichen Volumen Phenol-CHCl₃ und CHCl₃ extrahiert, mit kaltem Ethanol präzipitiert, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Zwei μg der DNA wurden mit T4 DNA-Ligase selbstligiert, dann mit Phenol-CHCl₃ und CHCl₃ extrahiert und mit kaltem Ethanol präzipitiert. PCR-Produkte wurden in mit BsaWI und TaiI verdauter und selbstligierter DNA gefunden. Die obige PCR-Reaktion wurde mit BsaWI und TaiI wiederholt. Etwa 50 ng Matrix-DNR wurden mit 68 μl H₂O, 10 μl 10X Taq Polymerasepuffer, 5,4 μl 5 mM dNTP (Endkonzentration 0,27 mM), 0,12 μg Primer 183-88, 0,12 μg Primer 183-89, 2,5 Einheiten Taq DNA-Polymerase kombiniert.

5' CCCATGTCGGGCCAGCACTGGATT 3' (183-88) (SEQ ID Nr. 19)
5' ATCAGGTTGACCGCCTTATTCAAG 3' (183-89) (SEQ ID Nr. 21)

Die PCR-Reaktionen wurden in dreißig Zyklen mit 95°C, 30 Sekunden, 60°C, 30 Sekunden, und 72°C, 1 Minute, durchgeführt, mit einer Verweilzeit von 5 Minuten nach Abschluss der Zyklen; anschließend wurde sequenziert. Das BsaWI IPCR Produkt umfasste etwa 300 bp und das TaiI Produkt 170 bp und die beiden Produkte wurden auf einem leicht schmelzenden Agarosegel gereinigt. Die IPCR wurde auch an mit AflIII, AluI, BfaI, BsaAI, BsiEI, BspEI, BspHI, BsrBI, BstUI, DdeI, HinfI, HpaII, StyI, TfiI und Tsp509I verdauten und selbstligierten DNA-Matrizen wiederholt. Etwa 50 ng Matrix-DNA wurden mit 68 μl H₂O, 10 μl 10X Taq Polymerasepuffer, einer 0,27 mM Konzentration dNTP, 0,12 μg Primer 183-88, 0,12 μg Primer 183-89, 2,5 Einheiten von Taq DNA-Polymerase kombiniert. Die Reaktionen wurden einer Vorerhitzung von 95°C, anschließend dreißig Zyklen mit 95°C, 30 Sekunden, 60°C, 30 Sekunden, und 72°C, 1 Minute, unterzogen, mit einer Verweilzeit von 5 Minuten bei 72°C nach Abschluss der Zyklen. Die AflIII, AluI, BspEI, HpaII und Tsp509I Matrizen brachten etwa 300-600 bp PCR-Produkte hervor. Das Experiment wurde mit jeweils drei Röhrchen für diese fünf Matrizen wiederholt, woraufhin eine Gelreinigung und Sequenzierung folgte. Das AflIII Produkt war mit 578 bp am längsten und enthielt ein TGA Stoppcodon auf dem Komplementärstrang 371 bp stromabwärts.
PCR und DNA-Sequenzierung erfolgten zum Klären unklarer Sequenzen unter Verwendung von Primer 182-159 mit 183-89 und Primer 182-161 mit 183-89 und zwei verschiedenen Konzentrationen von MgCl₂ (1,5 und 3,0 mM), 1 μg Genom-DNA, 70 μl H₂O, 10 μl 10X Assaypuffer A, 5,4 mM konz. dNTP, 0,12 μg von jedem Primer, und 2,5 Einheiten Taq DNA-Polymerase.

5' AACTCGTCGTCCTGACCAGAGAAG 3' (182-159) (SEQ ID Nr. 15)
5' TAATTCCTCTTGTCCGAGGGCCGG 3' (182-161) (SEQ ID Nr. 17)

Die PCR-Reaktionen erfolgten über 30 Zyklen mit 94°C, 30 Sekunden, 55°C, 30 Sekunden, 72°C, 30 Sekunden, und beinhalteten schließlich eine Verweilzeit von 2 Minuten bei 72°C. Die resultierende DNA wurde Elektrophorese auf einem leicht schmelzenden Agarosegel unterzogen, die DNA-Banden wurden herausgeschnitten und mit β-Agarase verdaut und mit gleichen Volumen von Isopropanol präzipitiert, getrocknet und in TE resuspendiert. Die PCR DNA wurde mit den Primern 182-159, 182-161 und 183-89 direkt sequenziert. Das ageIR Gen umfasst 852 bp und läuft in die entgegengesetzte Richtung zum ageIM Gen.
8. Expression des ageIR Gens in E. coli
Es wurden zwei Primer konstruiert, die einen BamHI und NdeI Ort in die 5' Enden der Primer einbauten. Die PCR wurde in fünf Reaktionen unter Verwendung von 1 μg Genom-DNA, 0,12 μg Primer 184-53 (mit dem NdeI Ort), 0,12 μg Primer 184-54 (mit dem BamHI Ort), 70 μl H₂O, 10 μl 10X Thermopol-Puffer, 0,27 mM konz. dNTP, 2 Einheiten Vent^® DNA-Polymerase und 0, 2, 4, 6 und 8 μl von 100 mM MgSO₄ für eine 2, 4, 6, 8 und 10 mM Endkonzentration von MgSO₄ durchgeführt.

5' ATTTGCCCCCATRTGTGGTGTAATTATGAAGGCGGGGGA 3' (184-53) (SEQ ID Nr. 22)
5' CGCGGATCCGAARCGCAGTCCCACCGTTGCTAG 3' (184-54) (SEQ ID Nr. 23)

Es wurden zwanzig Zyklen mit 94°C, 30 Sekunden, 60°C, 30 Sekunden, 72°C, 1 Minute, durchgeführt, mit einer Endverweilzeit von 2 Minuten bei 72°C. Die 2 mM Konzentration von MgSO₄ erbrachte die besten Ergebnisse und die Reaktion wurde mit zehn Röhrchen wiederholt. Die resultierende DNA wurde von einem leicht schmelzenden Gel gereinigt und mit β-Agarase verdaut. Die DNA wurde dann mit gleichen Isopropanolvolumen präzipitiert, getrocknet und in TE resuspendiert. Etwa 4 μg der präzipitierten DNA wurden dann mit 200 Einheiten NdeI, 100 Einheiten BamHI in 22 μl 10X NEB Puffer 3 verdaut. Die DNA wurde mit dem gleichen Volumen Phenol-CHCl₃ und CHCl₃ extrahiert und mit kaltem Ethanol präzipitiert, getrocknet und in 50 μl TE-Puffer resuspendiert. Die resultierende DNA wurde dann in zwei Reaktionen in 100 ng Vektor pAII17 unter Verwendung von jeweils 0,1 μg und 0,2 μg PCR DNA (ageIR Gen), 2 μl 10X T4 Ligationspuffer, 800 Einheiten T4 DNA-Lipase ligiert und über Nacht bei 16°C inkubiert. Die gesamte rekombinante DNA von der Ligation wurde dann in 150 μl kompetente ER2566 Zellen unter folgenden Bedingungen transformiert: 30 Minuten bei 4°C, 3 Minuten bei 37°C und 5 Minuten bei 25°C. Nach der Zugabe von 170 μl SOB Nährlösung und einer einstündigen Inkubation bei 37°C wurde das Zell/DNA-Gemisch auf eine LB Agar-Platte plus 100 μg/ml Ampicillin (Ap) und 33 μg/ml Chloramphenacol (Cm) plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die 12 individuellen Ap und Cm resistenten Transformanten, die wuchsen, wurden aufgenommen und in 2 ml LB+Ap+Cm inokuliert und über Nacht bei 37°C geschüttelt. 1,5 ml Zellen wurden zentrifugiert, um Plasmid-DNA durch Qiagen Mini-Präparationsreinigung herzustellen. 25 μl (-200 ng) der resultierenden gereinigten Plasmid-DNA wurden mit 20 Einheiten BamHI, 20 Einheiten NdeI, in 3 μl 10X NEB Puffer 3 verdaut und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Acht von zwölf wiesen das AgeIR Geninsert auf. Acht Klone mit Insert wurden in 10 ml LB+Ap+Cm bis zur späten Log-Phase kultiviert, 50 μl 100 mM IPTG wurden zugegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert. IPTG-induzierte Zellen wurden geerntet und in 1 ml Beschallungspuffer resuspendiert und jeweils 3X 20 Sekunden lang beschallt, anschließend 15 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Der Zellextrakt wurde im Hinblick auf Restriktionsendonucleaseaktivität geprüft, indem 1 μg λ DNA mit jeweils 1 μl und 5 μl Zellextrakt in 3 μl 10X NEB Puffer 1 verdaut und 1 Stunde lang bei 25°C inkubiert wurde. Alle acht Proben wiesen AgeI Aktivität auf. Der ER2566 [pACYC-AgeIM⁺, pAII17-AgeIR⁺] Stamm wurde bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung am 1. April 1998 mit der Akzessionsnummer 209730 hinterlegt.
9. Reinigung von AgeI Restriktionsendonuclease
Es können zwei Protokolle zum Reinigen von AgeI verwendet werden.

Protokoll 1: Heparin Sepharose^®-Säule, Hydroxylapatitsäule, Mono-S-Säule, TSK Heparinsäule
Protokoll 2: Heparin Sepharose^®-Säule, DEAE Sepharose^®-Säule, Hydroxylapatitsäule, Phenyl-Sepharose^®-Säule

SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes DNA-Segment, das die AgeI Restriktionsendonuclease kodiert, wobei die genannte isolierte DNA von Agrobacterium gelatinovorum erhältlich ist.
Rekombinanter DNA-Vektor, in den ein DNA-Segment, das die AgeI Restriktionsendonuclease gemäß Anspruch 1 kodiert, eingefügt wurde.
Isoliertes DNA-Segment, das die AgeI Restriktionsendonuclease und -methylase kodiert, wobei die genannte isolierte DNA von ATCC Nr. 209730 erhältlich ist.
Klonierungsvektor, der das isolierte DNA-Segment aus Anspruch 3 umfasst.
Wirtszelle, transformiert durch den Vektor aus Anspruch 2 oder 4.
Verfahren zum Produzieren von AgeI Restriktionsendonuclease, das das Kultivieren einer mit dem Vektor aus Anspruch 2 oder 4 transformierten Wirtszelle unter Bedingungen zur Expression der genannten Endonuclease beinhaltet.