DE69218438T2

DE69218438T2 - Dermatansulfatoligosaccharide, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende phamazeutische Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69218438T2
Application number: DE69218438T
Authority: DE
Inventors: Pietro Bianchini; Lino Liverani; Giuseppe Mascellani
Original assignee: Opocrin SpA
Current assignee: Opocrin SpA
Priority date: 1991-08-28
Filing date: 1992-08-06
Publication date: 1997-07-10
Anticipated expiration: 2012-08-07
Also published as: ITMI912309A1; IT1251182B; ITMI912309A0; EP0600934B1; EP0600934A1; ATE150468T1; AU2396392A; DE69218438D1; WO1993005075A1

Description

Die Erfindung betrifft Oligosaccharide des Dermatansulfates mit biologischen Eigenschaften und insbesondere mit der Eigenschaft, die Bewegung von Ca-Ionen in menschlichen Trombozyten die mit polymorphkernigen autologen Leukozyten inkubiert sind, die durch chemotaktische Mittel stimuliert wurden. Diese besondere Wirkung tritt in Zusammenhang in einem allgemeineren Rahmen der pharmakologischen Wirkung auf, wie der Inhibierung von Entzündungen, der Trombozytenaggregation und bestimmten ursächlichen an thromboembolischen Erkrankungen beteiligten Faktoren. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren um diese Produkte zu erhalten und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Produkte als aktiven Bestandteil enthalten.
Dermatansulfat wurde stets als heterogenes Polysaccharid angesehen, das hauptsächlich aus dem Disaccharid (II)
besteht.
Das europäische Patent 97625 beansprucht ein Verfahren für die Herstellung von Dermatansulfat aus einer Mischung von Polysacchariden, wobei das genannte Dermatansulfat eine Anti- Kongestions- und Vernarbungswirkung besitzt. Die Patente EP-A- 199033 und EP-A-238994 beanspruchen ein Verfahren für die Extraktion und Reinigung von Dermatansulfat und dessen Verwendung als Antithrombosemittel bei der Prophyaxe venöser Trombosen.
Die EP-221977 beansprucht unter anderem Dermatansulfatfraktionen mit Molekulargewichten, die zwischen 2000 und 7000 Dalton, aber insbesondere zwischen 4000 und 6000 Dalton, liegen, erhalten durch radikalische Depolymerisation von Dermatansulfat. Ähnlich beansprucht die EP-A-269937 niedrigmolekulargewichtige Glycosamin-Glycane, die durch Gamma-Bestrahlung erhalten wurden. Die in den oben beschriebenen Patenten beanspruchten Produkte wurden init Jubel als Verbindungen mit pharmakologischer und klinischer Aktivität in der Prophylaxe venöser Thrombosen begrüßt. Die Anmeldung PCT EP/89/01214 des vorliegenden Anmelders beschreibt ein Verfahren zur Oxidation und Reduktion der C&sub2;-C&sub3; Bindungen von Uronsäuren des Dermatansulfats, bei dem die nicht sulfatisierten Uronsäuren (praktisch alle davon) zu Dialdehyden oxidiert werden und dann zu Hydroxymethylderivaten reduziert werden. Das genannte Patent beansprucht dann die Fraktionen der allgemeinen Formel (III)
worin m so variieren kann, daß es Fraktionen des Molekulargewichts von 9400 bis 22000 Dalton einschließt, und die spezifische Drehung [α]²&sup0;D zwischen -13º und -5º liegt.
Die auf den Zelloberflächen oder in extrazellulären Natritzen angeordneten Glycosamin-Glycane, und unter diesen insbesondere das Dermatansulfat, wechselwirken mit dem Heparin- Cofaktor II (HCII), um die proteolytische Wirkung des Trombins zu inhibieren, das an der Blutgerinnung beteiligt ist: siehe in diesem Zusammenhang D.M. Tollefsen in "The Metabolic Basis of Inherited Disease" (Scriver C.R., Beaudet A.L., Sly W.S. und Valle, Hrsg.), 6. Auflage, Seiten 2207-2218, Mc Graw-Hill, New York (1989). Ein Hexasaccharid, das Iduronsäure-2-sulfat, Ido(2-SO&sub3;&supmin;) enthält, erhalten durch Salpetersäure-Deaminierung eines partiell N-deacetylierten Dermatansulfates, wurde berichtet die Oligosaccharidsequenz des Dermatans mit der höchsten Affinität für den Heparin-Cofaktor II (HCII) zu sein (M.M. Maimone, DM. Tollefsen, J. Biol. Chem. 265 (30), 18263-18271 (1990)).
Es wurde nun überraschend gefunden, daß die besondere Sequenz, die im Dermatansulfat enthalten ist, von der Naimone und Tollefsen annahmen, das sie mit der aktiven Stelle für die Wechselwirkung mit HCII übereinstimmt, wesentlich komplexer als beschrieben ist, und daß diese hochsulfatisierte Sequenz in einem Cluster enthalten ist. Während man bis heute annahm, daß die disulfatisierten Disaccharide (1T4)-0-(2-O-Sulfo-α-L- idopyranosyluronsäure)-(1T3)-0-(2-acetamido-2-deoxy-β-D- galactopyranosyl-4-sulfat (IV)
und (1T4)-0-(α-L-Idopyranosyluronsäure)-(1T3)-0-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-galactopyranosyl-4,6-bis-0-sulfat (II') zufällig und diskontinuierlich in der Struktur des Dermatansulfats enthalten waren, wurde überraschend gefunden, daß die hochsulfatisierten Oligosaccharidsequenzen, erhalten durch ein Verfahren, das ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist, einmal aus dem strukturellen Kontext des Dermatansulfates isoliert, nicht länger irgendeine Wirkung auf den Heparincofaktor II besitzen, aber therapeutisch wertvolle pharmakologische Wirkungen in der Behandlung von entzündlichen, arthritischen, thrombotischen und atherosklerotischen Prozessen besitzen.
Man konnte nachweisen, daß diese Verbindungen in der Tat wirksam in der Inhibierung der Produktion freier Radikale durch Leukozyten, der Adhäsion von polymorphkernigen Leukozyten an das Endothehelium, der Trombozytenaggregation und der cytoplasmatischen Bewegung von Calcium in menschlichen Trombozyten sind, die mit PMNs, stimuliert durch ein chemotaktisches Mittel, coinkubiert wurden. Diese biologischen Wirkungen sind von therapeutischem Wert bei Erkrankungen des chronisch entzündlichen (athritischen) oder thrombotischen Typs und bei cardiovaskulären Erkrankungen im allgemeinen. Es wurde nachgewiesen, daß die pharmakologische Wirkung beträchtlich ist, und mindestens doppelt oder dreimal so groß ist, als die der anderen Oligosaccharide der Heparinfamilie, und dies war nicht zu erwarten, da, zumindest im Hinblick auf Heparin bekannt war, daß das Pentasaccharid der aktiven Stelle des Antitrombins (III) (ATIII) allein von pharmakologischer Bedeutung ist, insoweit es in eine langen Heparinpolysaccharidkette insertiert ist, und allein insoweit es blutgerinnungshemmende pharmakologische Wirkung besitzt.
Eine Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfaßt neue Oligosaccharide und sie enthaltende Fraktionen. Die Oligosaccharide der Erfindung enthalten Galactosamin-N-acetylat-4- sulfat (und teilweise auch 6-Sulfat) und L-Iduronsäure-2-sulfat mit mindestens einer möglichen Variante von D-Glucuronsäure-2- sulfat. Die Oligosaccharide der Erfindung besitzen eine Einheit von N-Acetylgalactosamin-4-sulfat auf der "nicht reduzierenden" Seite und einen 2,3,4-Trihydroxybutansäurerest, den Rest der Zerstörung der Uronsäure, in dem "reduzierenden" Ende durch Z bezeichnet. Die Oligosaccharide des Dermatansulfats, die den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden, besitzen eine Struktureinheit, die schematisch durch die Sequenz (1) dargestellt wird:
worin:
n = 0, 1 oder 2;
R&sub4; = SO&sub3;&supmin; oder H;
R&sub6; = H oder SO&sub3;&supmin;;
Z = der Zerstörungsrest der Uronsäure;
Q, S, U, W und Y = Galactosamine;
R, T, V und X = Reste von Iduronsäure-2-sulfat, wovon mindestens einer davon wahlweise einen Rest von Glucuronsäure-2- sulfat ist.
Die Oligosaccharide der Erfindung schließen die Strukturen ein, die durch Q, R, S, T, U, V, W, X, Y und Z symbolisiert werden. Ein Oligosaccharid der vorliegenden Erfindung wird durch die Sequenz QRSTUVWXYZ dargestellt. Andere Oligosaccharide bestehen aus den Sequenzen QRSTUXYZ, STUVWXYZ, und UVQXUZ, worin Q und Y entweder N-Acetylgalactosamin-4-sulfat oder N-Acetylgalactosamin-4,6-disulfat ist. Die genannten Oligosaccharidfraktionen des Dermatansulfats sind von einem Typ, der erhältlich ist durch das Verfahren, daß die folgende Reaktionen, wie im Diagramm 1 unten gezeigt, einschließt: Schema 1. Haupt-Disaccharidsequenzen des Dermatansulfats und Produkte des Säureabbaus
DS = Dermatansulfat
RO-DS = reduziert-oxidiertes Dermatansulfat
D-DS = abgebautes Dermatansulfat
- Dermatansulfat (DS) mit den in der WO 93/05074 beschriebenen Eigenschaften, das einen hohen Prozentsatz von Disulfatdisacchariden (IV) enthält, meßbar durch enzymatische Hydrolyse mit Chondroitinase ABC und Bewertung des entsprechenden ungesättigten Disaccharids ΔDi-diSB, und das durch ein ¹³C-NMR- Spektrum mit den charakteristischen Nebensignalen I*&sub1;(δ102), I*&sub2; (δ80), I*&sub3;(δ74), I*&sub3;(δ69,5), I*&sub5;(δ68,6) gekennzeichnet ist, wird der Oxidation mit Periodsäure in einem natürlichen Medium unterworfen;
- das erhaltene Oxidationsprodukt mit den C&sub2;-C&sub3;-Bindungen der nicht-sulfatisierten Uronsäuren, oxidiert zu Dialdehyden des Typs (V)
wird mit Natriumborhydrid reduziert, um ein Di(hydroxymethyl)derivat (VI) zu erhalten
- Das erhaltene Produkt, bezeichnet als "oxidiertes und reduziertes Dermatansulfat" (RO-DS) wird der kontrollierten sauren Hydrolyse unterworfen, bei der nur die Hydrolyse der Semi-Acetal-Bindungen zwischen den Uronsäuren mit den oxidierten C&sub2;-C&sub3; Bindungen (offen) und Aminozuckern stattfindet.
Nicht sehr kräftige Bedingungen würden zum Auftreten von mittellangen Kettenfragmenten ohne Gleichförmigkeit Anlaß geben; uberstarke Bedingungen würden zur Hydrolyse der gesamten Semi-Acetal-Bindungen zwischen den Zuckern und sicherlich auch zur Hydrolyse der Esterbindungen der Sulfatgruppen führen.
Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind daher die Bedingungen für die saure Hydrolyse, durchgeführt mit sauren (Polysulfon)harzen, sicherzustellen, so daß die Acidität und Ionenstärkebedingungen nur für die Hydrolyse der schwächeren Semi-Acetal-Bindungen geeignet sind, und die hochsulfatisierte Sequenz, die in dem Dermatansulfat enthalten sind, unverändert bleibt.

Beispiel 1

a) Herstellung von Dermatansulfat

Zerkleinere 65 kg Rinder-(oder Schweine-)Darmschleimhaut und gib dies in einen Reaktor mit 75 Liter Wasser. Erwärme auf 60ºC und gib 430 g Natriumchlorid und 150 g Papain 1:350 (Merck) hinzu. Korrigiere den pH auf 6,3 mit Natriumacetat. Halte die Masse unter Rühren für 4 Stunden bei 60ºC. Nach 3,5 Stunden liegt bereits keine weitere Entwicklung freier Aminosäuren in dem proteolytischen Prozeß vor. Erhitze die Nasse auf 78ºC für 10 Minuten und filtriere dann durch eine Filterpresse auf einem Filtrierhilfsmittel (Dicalite). 120 Liter des Filtrats werden erhalten. Filtriere die Lösung bei 45ºC in einer Chromatographiekolonne 10 x 80 cm, die Lewatite MP 5080 in Cl&supmin;-Form enthält. Entferne das Filtrat. Wasche das Harz mit 12 Liter 0,6 M NaCl-Lösung, dann eluiere mit 18 Liter 1,8 M NaCl-Lösung mit einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 BV/h (Bett-Volumen/h). Sammle die Lösung und konzentriere auf 5 Liter und auf 1 M NaCl durch reverse Osmose. Gib 0,6 Volumen Ethanol zur Lösung. Lasse für 10 Stunden bei 5ºC stehen. Filtriere. Zu dem Filtrat gib weitere 7 Liter Ethanol hinzu. Ein Niederschlag des Rohdermatansulfates wird erhalten; sammle durch Filtration. Löse erneut den Feststoff in 1,5 Liter Wasser, das auf 0,5 M mit Kupferacetat gebracht wurde. Zu dieser Lösung gib 100 g Rameinchlorid (rameic chloride) und 3 Liter Ethanol. Beim Stehenlassen bildet sich ein Niederschlag, der durch Filtration gesammelt wird, für eine lange Zeit mit Ethanol gewaschen wird, in 0,5 l Wasser angesäuert mit Essigsäure auf pH 5,5 erneut gelöst wird und über eine chromatographie-Kolonne 4 x 25 cm, die Chelex 100 (Biorad) in der H&spplus;-Form enthält, gegeben wird. Die Lösung, erhalten aus der Kolonne, wird mit NaOH auf pH 6,2 der Salzbildung unterworfen und gefriergetrocknet. 39,6 g reines Dermatansulfat werden erhalten. Die folgenden Analysen wurden an dem Dermatansulfat durchgeführt:
- Molekulargewicht (MW, durch HPLC über Protein Pack 125-300 Kolonnen, mobile Phase 0,125 M Na&sub2;SO&sub4; und 2 mM NaH&sub2;PO&sub4; bei pH 6 auf der Polynom dritten Grades-Calibrierungskurve, erhalten mit Molekulargewichtsstandards);
- Schwefelprozentsatz, Uronsäureprozentsatz, SO&sub3;&supmin;/COO&supmin; (durch ein potentiometrisches Verfahren entsprechen Mascellani et al., Il Farmaco Ed. Pr. 43, 165 (1988));
- Disaccharidzusammensetzung gemäß Yoshida et al. (Anal. Biochem. 177, 327 (1989));
- ¹³C-NMR;
- in-vitro Aktivität auf HCII bewertet durch chromogenetisches Verfahren mit Stachrom D.S. Kit (Diagnostica Stago enthaltend CBS 34,47-Substrate) entsprechend Dupoury et al., Thromb. Haemost., 60, 2, 236 (1988)) gegen WHO-Heparin vierter Standard bei 193,4 IU/mg;
- in vivo-antithrombotische Wirkung, bewertet durch das vena cava-Ligatur-Model in Ratten entsprechend Rayers et al., Thromb. Res. 18, 699 (1980).
Das erhaltene DS besaß die folgenden Eigenschaften: MWp 25.600 d (MWw = 28.500, MWn = 23.600, D = 1,21); Schwefel 5,94; Uronsäuren 33 %; SO&sub3;&supmin;/COO&supmin; = 1,09; [α]²&sup0;D = -60º; Disaccharid Zusammensetzung: ΔDiOS = 0,9 %; ΔDi6S = 2,7 %; ΔDi4S = 84,7 %; ΔDi-2,6diS = 0,3 %; A Di-2,4diS 9,2 %; Δ Di-4,6diS = 2,0 %; Aktivität auf Heparin Co-Faktor II, a-HCII = 245 U/mg; ED50 = 1,02 mg/kg i.v. Das DS besaß das ¹³C-NMR Spektrum in Fig. 1.

b) Herstellung des reduzierten-oxidierten Dermatansulfates

Löse 100 g Dermatansulfat, erhalten gemäß a) in einem Liter Wasser, und gib langsam 800 ml 0,5 M-Lösung von NaIO&sub4; zu. Laß die Lösung für 4 Stunden rühren, und kühle dann in einem thermostatischen Bad bei 10ºC, bring mit N NaOH den pH auf 8 und gib sehr langsam unter Rühren 80 g NaBH&sub4; über einen Zeitraum von 4 Stunden zu. Zur selben Zeit verdünne mit Essigsäure, so daß der pH im Bereich von 7,5 bis 8,5 bleibt. Lasse für eine Nacht stehen, bringe den pH auf 4 mit 8 N HCl um die Zerstörung des überschüssigen NaBH&sub4; durch Rühren für eine Stunde bei Raumtemperatur zu begünstigen. Bring dann den pH mit NaOH auf 5,5. Fälle das Produkt zweimal mit 3 Volumen Ethanol, entsprechend 6 Litern pro einmal. Nach Filtrieren und Trocknen werden 80 g oxidiertes und reduziertes Dermatansulfat (RO.DS) erhalten und als OP723 kodiert. Das RO.DS besaß die folgenden Eigenschaften: MW = 15200; Schwefel 5,9 %, Uronsäuren 32,4 %; SO³&supmin;/COO&supmin; = 1,1; [α]²&sup0;D = -8ºC.

c) Fraktionierung des RO-DS durch Molekulargewicht

5 g des OP723 genannten Produktes, erhalten oben, wurden durch Gelpermeation an Ultrogel AcA54 (IBF), enthalten in einer 5 x 84 cm Kolonne, fraktioniert.
Die Chromatographie wurde in 1N NaCl mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Minute durchgeführt. Die Effluenten wurden mit einem UV-Detektor aufgezeichnet, der mit einer kontinuierlichen Fließzelle ausgestattet war. 20 ml-Fraktionen wurden gesammelt, und 7 Pools von ungefähr 150-200 ml wurden jeweils hergestellt. Die Sammlung der Fraktionen in Poolen wurde durchgeführt auf der Basis der Extinktionswerte, die mit dem Detektor aufgezeichnet wurden.
Die Fraktionen wurden in einem Rotationsverdampfer eingeengt auf ein Volumen zwischen 80 und 120 ml. Das ausgefallene Natriumchlorid wurde durch Filtration entfernt. Die Lösungen, mit Essigsäure auf pH 5,3 gebracht, wurden mit 2 Volumen Ethanol behandelt. Der ölige Niederschlag wurde in Wasser erneut gelöst und zweimal mehr mit Ethanol und Aceton ausgefällt; falls erforderlich wurden die erhaltenen Produkte mit Trisacryl CF 05 M (IBF) in einer 5 x 38 cm Kolonne mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/Minute entsalzt. Die erhaltenen Lösungen wurden eingeengt, und die Produkte wurden erneut mit Ethanol ausgefällt. Es wurde gefunden, daß die gesamten Fraktionen im AgNO&sub3;-Test frei von Natriumchlorid waren. Die Produkte, die als LL 108 codiert wurden, wurden erhalten, und sind in Tabelle 1 gezeigt. Die physikochemischen Eigenschaften der verschiedenen Fraktionen sind auch angegeben. Tabelle 1

Bemerkungen:

- MW = Molekulargewicht, bewertet durch HPLC an Protein Pak 300-125 Kolonnen (Waters), mobile Phase 0,125 M Na&sub2;SO&sub4; und 2mM NaH&sub2;PO&sub4; bei pH 6 an der Einstellungskurve des Polynoms dritter Ordnung, erhalten mit Molekulargewichtsstandards.
- SO&sub3;&supmin;/COO&supmin;, erhalten durch das potentiometrische Verfahren (Il Farmaco Ed.Pr 43, 165 (1988)).
Die A-HCII-Wirkung auf den zweiten Heparincofaktor in U/mg, berechnet durch das chromogenetische Verfahren mit dem Stachrom-Kit (Diagnostica Stago) gegen den vierten WHO Standard von Heparin bei 193.4 IU/mg. Das 13C-NMR Spektrum der LL 108/5- Fraktion ist in Fig. 2 angegeben. Die Wirkungen auf den Heparincofaktor II sind in Fig. 3 angegeben. Diese Wirkung wurde entsprechend eines raschen kolorimetrischen Assays des Dermatansulfates bestimmt; Stachrom D.S., an CBS 34,47-Substrat (Dupouy D. et al., Thromb. Haemost., 60, 2, 236, 1988). Die Fraktion 5 wird dem enzymatischen Angriff mit Chondroditinase ABC (E.C.4.2.2.4) unterworfen, und die nachfolgende HPLC- Bewertung zeigt als überwiegenden Peak denjenigen der ΔDi-diSb zugeordnet ist. Wie bekannt ist, wird nur die intakte Struktur des Dermatansulfats oberhalb einer bestimmten Molekulargröße durch das Enzym Chondroitinase ABC erkannt.
Es ist ersichtlich aus Tabelle I und Fig. 3, daß einige RO-DS- Fraktionen im Molekulargewichtsbereich zwischen 6000 und 11000 eine überraschende Wirkung auf HCII besitzen. Diese Fraktionen sind, wie in den Analysen der Aufbau-Disacchariden gezeigt, besonders reich an disulfatisierten Disacchariden (ΔDi-diSb).

d) Erhalt der Fraktion (I) durch kontrollierte saure Hydrolyse

2,4 g eines Produktes, ähnlich demjenigen erhalten in der LL 108/5 Fraktion von Beispiel 1, wurden mit 9 ml stark saurem Kationenaustauschharz AG50 W-X4 (BioRad) in der Form von H + (mit 1,1 mäq/ml Austausch) und 135 mg NaCl in 24 ml destilliertem Wasser behandelt. Die Masse wurde unter Rühren bei 37ºC für 40 Stunden gelassen. Es wird filtriert. Die Lösung wird mit 80% starkem Ethanol durch Stehenlassen für eine Nacht bei 4ºC ausgefällt. Der Niederschlag wird gesammelt, in 4 ml Wasser erneut gelöst und mit Ethanol bei 4ºC erneut gefällt. Der Niederschlag wird gesammelt, erneut gelöst und erneut gefällt bei R.T. mit 75 % starkem Ethanol. Das erhaltene Produkt wird als GC 80/4 codiert,. Aus der Integration der Signale des ¹H-NMR Spektrums (Fig. 4) und des C-NMR Spektrums (Fig. 5) wird die Sequenz (X) (mit p 2) des Schemas 1 bewiesen.

Beispiel 2

200 mg der Fraktion LL 108/5 des Beispiels 1 wurden in 10 ml 0,lN HCL in einem Teströhrchen mit einer geschlossenen Kappe in einem Wasserbad bei 60ºC gelöst. Proben von 2,5 ml wurden bei 0,5, 2, 4 und 6 Stunden entnommen. Die entnommenen Lösungen wurden mit NaOH bei pH 7 neutralisiert und dann durch HPLC auf ihre Molekulargewichte hin analysiert. Die Profile in Fig. 6 wurden erhalten. Das Erscheinen während der Hydrolyse diskreter Molekulargewichte von 2900, 2300 und 1670 Dalton ist deutlich. Dieses Beispiel zeigt, daß die Hydrolysedauer ein bedeutender Parameter zum Zwecke des Erhalts des Oligosaccharide der Erfindung ist. Mit einer überschüssigen Hydrolysedauer tritt deutlich die Zerstörung der genannten Oligosaccharide auf.

Beispiel 3

13,12 g RO-DS, erhalten in Beispiel l.b werden in 656 ml Wasser gelöst, zu dem 80 ml stark saures Harz AG 50 W-X8 in H&spplus;- Form (Biorad) bei 100 bis 200 mesh hinzugegeben. Die Reaktionsnasse wird in einem Wasserbad bei 60ºC gerührt. 3,75 g NaCl werden auch hinzugegeben. Der pH fällt, bis er sich bei 1,1 stabilisiert hat. Die Reaktionsmasse wird für eine Gesamtdauer von 2 Stunden erhitzt. Zum Schluß wird die Lösung vom Harz abfutriert. Das Harz wird mit 200 ml destilliertem Wasser gewaschen, und die gesamte Lösung bei pH 7 mit NaOH neutralisiert. Die Lösung wird in einem Rotationsverdampfer auf 70 ml und eine NaCl-Molarität von ungefähr 1M eingeengt. Sie wird dann durch Gel-Filtration an Ultrogel AcA202 (IBF) in einer 5 x 90 cm- Kolonne bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Minute fraktioniert. Eine 1 M NaCl-Lösung wird als mobile Phase verwendet.
20 ml Fraktionen wurden gesammelt. Leervolumen wurde weggegossen. Die Eluenten wurden mit einem Spektrophotometer, ausgerüstet mit einer kontinuierlichen Fließkammereinstellung, bei 205 nm aufgezeichnet. Die Fraktionen von 13 bis 30 (360 ml, A), von 31 bis 44 (280 ml, B) von 45 bis 60 (320 ml, C) und von 61 bis 67 (140 ml, D) wurden vereinigt.
Pool A wurde auf 55 ml eingeengt und mit Trisacryl GF 05 M (IBF) in einer 5 x 38 cm-Kolonne entsalzt.
Die Fraktionen A&sub1; und A&sub2; wurden gesammelt und gefriergetrocknet. Pool B wurde auf 50 ml eingeengt und mit Trisacryl GF 05 M entsalzt. Die Fraktionen B&sub1;, B&sub2;, B&sub3; wurden gesammelt und gefriergetrocknet.
Auch Pool C wurde eingeengt und entsalzt. Er liefert nach Gefriergetrocknung, die Fraktionen C&sub1;, C&sub2;, C&sub3;.
Tabelle II zeigt die Ausbeuten, die experimentellen Molekulargewichte, berechnet durch HPLC an Protein Pak 60-125 Kolonnen (Waters), spezifische Drehungen und experimentelle Werte von SO&supmin;&sub3;/COO&supmin;. Tabelle II Oligosaccharide wurden durch Zerstörung von Dermatansulfat der Erfindung erhalten. Experimentelle Werte.
Die Fraktionen A&sub2; und B&sub2; lieferten das 13C-NMR Spektrum, gezeigt in den Fig. 7 und 8. Das ¹H-NMR Spektrum der A&sub2;- Fraktion ist auch in Fig. 9 gegeben. Das NMR-Spektrum und die weiteren experimentellen Beobachtungen stimmten mit den Oligosaccharidstrukturen, angegeben in Formel (X) und spezifiziert in Tabelle 3, überein.
worin p die in Tabelle 3 angegebenen Werte bezeichnet. Tabelle 3 Die theoretischen Werte der Oligosaccharidnatriumsalze

Beispiel 4

Biologische Wirkung

Die Fraktionen B&sub2; und B&sub3;, erhalten in Beispiel 3, zeigten eine geringe Wirkung auf HCII (85,21 ± 9,8 und 32,9 ± 10,5 U/mg), die von 3 bis 8 mal weniger war als die Aktivität auf der RO-DS Fraktionen aus denen sie stammten.
Diese Fraktionen zeigten sich auf der anderen Seite als sehr aktiv bei den Inhibierungstests auf die cytoplasmatische Bewegung von Calcium.
Die Wirkung der Oligosaccharide der vorliegenden Erfindung auf die Trombozytenaggregation in einer gemischten cellulären Suspension von Trombozyten (10&sup8;/ml) und polymorphkernigen Leukozyten (PMN) (5 x 10&sup6;/ml) wurden durch Präinkubation der Proben mit verschiedenen Konzentrationen der Verbindungen (1- 100 µg/ml) inkubiert. Die cellulären Suspensionen wurden danach mit dem chemotaktischen Peptid N-Formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP) (1 µM) stimuliert. Wie in Tabelle IV gezeigt, führen alle untersuchten Verbindungen zu dosisabhängiger Inhibierung der Trombozytenaggregation, vermittelt durch PMNs aktiviert durch fMLP; semimaximale Inhibierung wurde beobachtet bei Konzentrationen im Bereich von 1-10 µg/ml für die Oligosaccharidfraktion B&sub2;, B&sub3; und A&sub2;.
Die Wirkung auf die Oligosaccharide der vorliegenden Erfindung auf die cytoplasmatischen Bewegungen des Trombozyten- Ca wurde durch Vorinkubieren der gemischten cellulären Suspensionen der Trombozyten und der PMNS mit verschiedenen Dosierungen der Verbindungen (1-100 µg/ml) bewertet. Die Proben wurden nacheinander mit fMLP (1 mM) stimuliert. Im Falle der Aggregation wurde dieser Parameter der Trombozytenaktivierung auch dosisabhängig durch alle untersuchten Verbindungen (Tabelle IV) inhibiert. Die Oligosaccharide B&sub2;, B&sub3; und A&sub2; inhibierten vollständig die cytoplasmatischen Bewegungen von Ca²&spplus; in Konzentrationen von ungefähr 50 µg/ml, während für Dermatansulfat von Beispiel 1 und Heparin, als Referenz, die komplette Inhibierung bei Konzentrationen erreicht wurde, die höher als 200 µg/ml lagen. Tabelle IV Tabelle IV (Fortsetzung)

Beispiel 5

100 kg Schweinehaut wurden zerkleinert und zu 100 l einer 0,5 M NaCl-Lösung gegeben. Der pH wurde auf 7,0 mit Natriumhydroxid eingestellt. 400 g proteolytisches Enzym genannt Maxatase wurden hinzugegeben. Die Reaktionsmasse wurde in einem Reaktor für 8 Stunden bei 60ºC gerührt. Sie wird auf 80ºC erhitzt und in einer Flüssig-Flüssig-Separationszentrifuge zentrifugiert. Die Fettphase, ungefähr 35 kg, wurde verworfen. Die wäßrige Phase wird über ein Dicalite-Filtrierhilfsmittel filtriert. Das Filtrat wurde mit einer Chromatographiekolonne (interner Durchmesser: 10 cm, 125 cm Höhe) enthaltend 10 l Lewatit MP 50 A (Bayer), ein makroporöses stark anionisches Austauschharz aktiviert in der Form von Cl&supmin; filtriert. Das Filtrat wurde verworfen. Das Harz wurde mit 3 Volumen 0,65 NaCl Lösung gewaschen. Das Produkt wurde aus dem Harz mit 2 Volumen 2,0 NaCl eluiert. Die erhaltene Lösung wurde eingeengt und durch inverse Osmose bis zu 1 Nolarität NaCl entsalzt. Das Dermatansulfat wurde mit 2 Volumen Methanol ausgefällt, gesammelt und getrocknet. 67,9 g des Produktes, annähernd rein, wird erhalten. Das Produkt, weiter gereinigt, ergibt das Produkt, das mit OPD 950-965 codiert wurde, das die folgenden Eigenschaften besitzt: Schwefel = 5,63 %, Uronsäuren = 32,74 %, SO&sub3;/COO&supmin; = 1,04, [α]²&sup0;D = 65,50, Disaccharidzusammensetzung, erhalten durch enzymatischen Angriff und Abtrennung durch HPLC: ΔDiOS = 0,6 %, ΔDi6S = 1,0 %, ΔDi4S = 90 %, ΔDi2,4diS = 7,2 %, ΔDi4,6dis = 1,2 %, ¹³C-NMR Spektrum, neben charakteristischen Signalen bei
δ 177.05 (CO-CR&sub3;), δ 175.79 (CO-IdoAp6), δ 104.52 (IdoApl), δ 103.52 (GalpNAc 1), δ 81.69 (IdoAp 4), δ 77.44 (GalpNAc 4), δ 76.87 (GalpNAc 3), δ 76.02 (GalpNAc 5), δ 72.72 (IdoAp 3), δ 70.98 (IdoAp 2, 5), δ 62.48 (GalpNAc 6), δ 54.45 (GalpNAc 2), δ 24.05 (CO- CH&sub3;), zeigt das folgende Nebensignal: I*&sub1; (δ102), I*&sub2; (δ80), I*&sub4; (δ74), I*&sub3; (δ69,5), I*&sub5; (δ68,5) entsprechend Iduronsäure-2- sulfat und auch Signale bei δ105,3 (GlucAp 1), 675,4 (GlucAp 3), δ74,0 (GlucAp 2) entsprechend Glucuronsäure.
Das Produkt OPD 950-965 wird mit NaIO&sub4; oxidiert, mit NaBH&sub4; wie in Beispiel 1b beschrieben reduziert. Das Derivat kodiert als RO-DS wird erhalten. 20 g dieses Derivates wurden in 1000 ml 0,1 M HCl für 2 Stunden wie in Beispiel 2 beschrieben hydrolisiert. Die Lösung wird abgekühlt, mit NaOH neutralisiert und auf 50 ml durch den Rotationsverdampfer eingeengt. Die Lösung wird an Trisacryl GF 05 M (IBF) in einer Chromatographie- Kolonne (Innendurchmesser: 5 cm, 38 cm Höhe) entsalzt. Die die Kolonne verlassende Flüssigkeit wird durch den U.V. Detektor, eingestellt auf 205 nm, überwacht. Ein Elutionspeak wird gesammelt, und der Schwanz, der hauptsächlich die Verbindungen x und XII enthält (siehe Schema 1) wird verworfen. Die Lösung wird auf 50 ml eingeengt, und die Oligosaccharide durch molekulare Ausschlußchromatographie an AcA 202 (IBF) in einer Kolonne von 90 cm Höhe (i.d. Durchmesser 5 cm) getrennt. 1 M NaCl wird als mobile Phase verwendet.
Den Operationsverfahren von Beispiel 3 wurde gefolgt. Die Fraktionen, die in Tabelle V berichtet sind, wurden erhalten. TAB.V. OLIGOSACCHARIDE AUS SCHWEINEHAUT-DERMATANSULFAN

Bemerkungen

* Ausbeute: Rüchstand an Ausgangs-DS
** P: Zahl der Disaccharide, wie in Verbindung X in Schema I angegeben
*** Molekulargewichte, berechnet durch HPLC wie in Tabelle 1, Bemerkungen, beschrieben
**** HCII Wirkung, bestimmt durch Stachrom Kit (Stago) in Wasser im Vergleich mit DS von Beispiel 1 der WO 93/05074, die Aktivität davon (162.0+/-9,4 U/mg) wurde durch eine Kalibrierungskurve unter Verwendung eines vierten Int.I-Standard mit 193,4 U/mg bewertet.
Die Fraktion P2 in dem ¹³C-NMR Spektrum zeigt alle Signale, die in Fig. 8 berichtet sind. Daneben zeigt sie Signale bei δ73,8 (GluAp 2), δ75,3 (GluAp 3), δ105,3 (GluAp 1), die für die Glucuronsäure, die in dem Oligosaccharidfragment in 30 % Menge der Uronsäure anwesend ist, relevant ist.
100 mg der Fraktion P2 wurden fraktioniert durch starke Anionenaustausch-HPLC (S.A.X. HPLC) auf 10 µ Spherisorb 7,5 x 300 mm Kolonne (Sep Phase U.K.) mit einer mobilen Phase, die aus ansteigenden Konzentration von NaCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute bestand. Die gesammelten Fraktionen wurden entsalzt und gefriergetrocknet. Ihre Eigenschaften sind in Tabelle VI angegeben. Tabelle IV Oligosaccharide von Schweinehaut DS, abgetrennt durch SAX HPLC

Bemerkungen

% Ausbeute: berechnet aus dem Ausgangsdermatansulfat
Die ¹³C-NMR- und ¹H-NMR-Spektren der Fraktion 113P2/1M bestätigen, daß dessen Struktur des Heptasaccharid + Rest sich allein aus Iduronsäure-2-sulfat und N-Acetylgalactosamin-4- sulfat zusammensetzte.

Claims

1. Oligosaccharide von Dermatansulfat, die pharmakologisch wirksam sind, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel (I)

die auch die Sequenzen STUVWXYZ, UVQXUZ und SRQXYZ umfassen, worin

n = 0, 1 oder 2;

R&sub4; = SO&sub3;&supmin; oder H;

R6 = H oder SO&sub3;;

Z = Abbaurest von Uronsäure;

Q, S, U, W und Y = Galactosamine;

R, T, V und X = Reste von Iduronsäure-2-sulfat, wobei jedoch mindestens einer von diesen möglicherweise ein Rest von Glucuronsäure-2-sulfat mit einem SO&sub3;/COO&supmin;-Verhältnis zwischen 1,65 und 2,0 ist.

2. Oligosaccharid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe die besteht aus QRSTUXYZ, QRSTUVWXYZ, QRSTUVWVWXYZ; worin Q, R, S, T, U, V, W, X, Y und Z wie oben definiert sind.

3. Oligosaccharide nach den Ansprüchen 1 und 2, gekennzeichnet durch das ¹³C-NMR-Spektrum der Figuren 5, 7 und 8, ein SO&sub3;&supmin;/COO&supmin;-Verhältnis zwischen 1,65 und 2,0 und ein Molekulargewicht das zwischen 3500 und 1000 Dalton liegt.

4. Verfahren zur Herstellung der Oligosaccharide nach den Ansprüchen 1 bis 3, das die folgenden Schritte umfaßt:

a) Dermatansulfat (DS), das einen hohen Prozentsatz von Disulfatdisacchariden der Formel (IV) enthält,

meßbar durch enzymatische Hydrolyse mit Chondroitinase ABC und Bewertung des entsprechenden ungesättigten Disaccharids Di-diSB und gekennzeichnet durch ein ¹³C-NMR- Spektrum mit den charakteristischen Nebensignalen I*&sub1; (δ102), I*&sub2; (δ 80), I*&sub4; (δ 74), I*&sub3; (δ 69,5), I*&sub5; (δ 68,6), wird der Oxidation mit einer 0,5 M Lösung von Periodsäure in einem neutralen Medium unterworfen:

b) das erhaltene Oxidationsprodukt, das die C&sub2;-C&sub3;-Bindungen der gesamten nichtsulfatisierten Uronsäuren zu Dialdehyden des Typs (V) oxidiert hat,

wird mit Natriumborhydrid zu einem Di(hydroxymethyl)derivat (VI) reduziert

c) das erhaltene Produkt, das als "oxidiertes und reduziertes Dermatansulfat" (RO-DS) bezeichnet wird, wird der kontrollierten sauren Hydrolyse unterworfen, die lediglich zur Hydrolyse der Semiacetal-Bindungen zwischen den Uronsäuren mit den oxidierten C&sub2;-C&sub3;-Bindungen (offen) und Aminozuckern führt, wobei die Hydrolyse durch ein "Puffer"-System durchgeführt wird, das aus Polysulfonsäureharz in der H&spplus;-Form besteht, in Gegenwart einer Salzkonzentration, so daß der optimale Hydrolyse-pH zwischen 1 und 2 und die optimale Reaktionsdauer zwischen 0,5 und 3 Stunden liegt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die erhaltenen Oligosaccharidfraktionen durch molekulare Ausschlußchromatographie und falls nötig durch Anionenaustauschchromatographie getrennt werden.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung die als aktiven Bestandteil ein oder mehrere Oligosaccharide des Dermatansulfats nach den Ansprüchen 1 bis 3 enthält.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6 zur Verwendung als Antiarthritikum, entzündungshemmendes Mittel und Thrombozytenaggregationshemmer.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 6 für die parenterale oder orale oder topische Verabreichung in der Form von injizierbaren sterilen Lösungen oder Suspensionen, komprimierten Kapseln, Sirups oder Cremes oder Salben.