DE68917040T2

DE68917040T2 - Heparinderivate und Verfahren zu deren Herstellung.

Info

Publication number: DE68917040T2
Application number: DE68917040T
Authority: DE
Inventors: Raul Roberto Alpino; Marinella Fantuz; Maria Rita Milani; Silvano Piani; Gianfranco Tamagnone
Original assignee: Alfa Wasserman SpA
Current assignee: Alfa Wasserman SpA
Priority date: 1988-06-10
Filing date: 1989-05-19
Publication date: 1995-01-12
Anticipated expiration: 2009-05-20
Also published as: NO892366L; NZ229212A; AU3512889A; IL90411A0; DK173818B1; JPH0739442B2; IT1234508B; NO892366D0; NO174259C; DE68917040D1; EP0347588A1; FI892850A; EP0347588B1; IE64830B1; IL90411A; DE347588T1; PT90817A; IT8803504A0; FI892850A0; PT90817B

Description

Es werden neue Heparinderivate beschrieben, die eine antithrombotische Aktivität besitzen, und ebenfalls verringerte Hämorrhagie- und Anticoagulanswirkungen zeigen. Sie werden durch Behandlung von Heparinen von verschiedenem Ursprung in basischem Medium gegebenenfalls in Anwesenheit von Alkalimetallsalzen und eines Reduktionsmittels erhalten.
Die gemäß dieser Behandlung erhaltenen Heparinderivate zeigen besondere chemisch-physikalische Eigenschaften, wie neue Signale bei etwa 53 und 54 ppm in dem ¹³C-NMR-Spektrum und eine Erhöhung in dem spezifischen Drehvermögen, verglichen mit den als Ausgangsmaterial verwendeten Heparinen, auf Werte zwischen +50º bis +90º.
Durch diese Strukturmodifizierungen wird eine Verbesserung der biologischen Eigenschaften des Heparins erhalten, wobei im wesentlichen die antithrombotische Aktivität erhalten bleibt, während die Hämorrhagiewirkung in vivo und die Anticoagulansaktivität in vitro herabgesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Heparinderivate mit antithrombotischer Aktivität, die ebenfalls verringerte Hämorrhagie- und Anticoagulanswirkungen zeigen, und die durch Behandlung von Heparinen unterschiedlichen Ursprungs in basischem Medium, gegebenenfalls in Anwesenheit von Alkalimetallsalzen, und eines Reduktionsmittels erhalten werden.
Es ist bekannt daß heparinartige Strukturen in verschiedenen Arten durch Behandlung in basischem Medium variiert werden können.
In der europäischen Patentpublikation EP 0 133 078 beschreibt Mardiguian J.S. die Depolymerisation des Heparins zu Oligosaccharidfraktionen, welche 4 bis 20 Saccharideinheiten enthalten, durch Behandlung des Benzylesters des Heparins mittels einer organischen oder anorganischen Base bei einer 0,1- und 0,6-molaren Konzentration bei einer Temperatur zwischen 20ºC und 80ºC. Mit dieser Depolymerisation geht die Bildung einer Doppelbindung in den Stellungen 4 und 5 der Uronsäure einher, die durch UV-Absorption bei 230 nm nachweisbar ist.
Hirano S. et al Conn. Tissue Res., 3, 73-79, 1975 beschreiben die Depolymerisation von Heparin und anderen Glycosaminglycanen in starkem basischem Medium unter Verwendung von 2- bis 10-molaren Konzentrationen von Natrium- oder Bariumhydroxid bei Temperaturen über 80ºC. Auf diese Weise bekommen sie eine starke Depolymerisation, auf die eine Spaltung der glycosidischen Bindung zwischen der Stellung 1 der Glycosamineinheiten und der Stellung 4 der benachbarten Uroneinheiten folgt, weiterhin geht mit einer solchen Depolymerisation die Bildung einer Doppelbindung in den Stellungen 4 und 5 der Uronsäure einher, die mittels einer Absorption-bei 225 bis 230 nm im UV-Spektrum nachweisbar ist.
Sampson P. und Meyer K., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 68 2329-2331, 1971 erreichen eine Strukturmodifizierung in der Glucosamineinheit mit der Bildung von 3,6-Anhydroglucosamin durch Behandlung von Heparin mit 1N Natriumhydroxid in Anwesenheit von Natriumborhydrid bei 80ºC während 7 Stunden, die entsprechend den Autoren das Ergebnis des Sulfatersatzes an der Uronsäure durch Epoxidbildung ist.
Ogren S. und Lindahl U., Biochem. J. 125 (4) , 1119-1129, 1971 beschreiben Untersuchungen über den Abbau von Heparin unter Verwendung einer Endopolysacchari dase.
Die erfindungsgemäßen Heparinderivate unterscheiden sich vollständig von denen, die in der Literatur beschrieben werden. In der Tat zeigen sie nicht die chemisch physikalischen Eigenschaften der Verbindungen, die von Mardiguian J.S. und Hirano S. et al. erhalten werden, was durch das durchschnittliche Molekulargewicht, welches im wesentlichen unverändert bleibt, gezeigt werden kann, wodurch das Fehlen der Depolymerisation bewiesen wird. Weiterhin tritt bei 225 bis 230 nm im UV-Spektrum keine Absorption auf, und es treten in dem ¹³C-NMR keine Peaks auf, die den Resonanzen der Doppelbindung entsprechen. Was ein Anzeichen für das Fehlen der Doppelbindung in den Stellungen 4 und 5 der Uronsäure ist. Weiterhin zeigen sie noch nicht einmal die chemisch physikalischen Eigenschaften der Verbindungen, die von Sampson P. und Meyer K. isoliert wurden, da die ¹³C-NMR-Spektren der erfindungsgemäB erhaltenen Verbindungen unveränderte Lage besitzen und die Intensität des Signals des Kohlenstoffatoms in der Stellung 6 des Glucosamins unverändert ist, und das Intensitätsverhältnis zwischen dem 6-sulfatierten Kohlenstoffatom und dem 6-desulfatierten Kohlenstoffatom, das sich bei der Bildung von 3,6-Anhydroglucosamin durch die Teilnahme des 6-sulfatierten Kohlenstoffatoms bei der Bildung des Anhydroderivats ändern sollte, ist unverändert.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Heparinderivate, die Signale in dem ¹³C-NMR-Spektrum bei 53 und 54 ppm unter Verwendung von D&sub2;O als Lösungsmittel und Natrium-3-trimethylsilylpropansulfonat als Vergleich, ein spezifisches Drehvermögen [α]D²&sup0; zwischen +50º und +90º in 1%iger wäßriger Lösung, Schwefelgehalte zwischen 8% und 11% gemäß dem potentiometrischen Verfahren und ein Sulfat/Carboxylverhältnis zwischen 1,50 und 2,20 entsprechend dem potentiometrischen Verfahren besitzen.
Die chemische Modifizierung der Heparinstruktur wird-gemäß einem Verfahren erhalten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine wäßrige Lösung des Heparinmaterials mit einer Alkali- oder Erdalkalimetallbase in einer Konzentration zwischen 0,01N und 1N in Anwesenheit eines Alkali- oder Erdalkalimetallsalzes in einer Konzentration zwischen 0 und 1N, gegebenenfalls in Anwesenheit einer katalytischen Menge des Reduktionsmittels Natriumborhydrid während einer Zeit zwischen 0,5 und 24 Stunden bei einer Temperatur zwischen 35ºC und 70ºC behandelt wird, das Reaktiongemisch gegebenenfalls durch Percolation durch ein Ionenaustauschharz oder durch Dialyse gereinigt wird, und die Verbindungen mit der so modifizierten Struktur mit der Zugabe von 2 bis 4 Volumina eines Alkohols, der 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält, bei neutral em pH ausgefällt werden.
Die Reaktion wird während einer Zeit zwischen 0,5 und 24 Stunden bei einer Temperatur zwischen etwa 35ºC und etwa 70ºC durchgeführt.
Alkali- oder Erdalkalimetallbasen und -salze werden bevorzugt verwendet, insbesondere solche von Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium und Barium. Die Hydroxide von Natrium, Kalium und Barium sind die Basen, die bevorzugt verwendet werden. Die Acetate und Chloride von Natrium, Kalium, Barium, Calcium und Magnesium und die Sulfate von Natrium, Kalium und Magnesium sind die Salze, die bevorzugt verwendet werden können.
Das Modifizierungsverfahren der Heparinstruktur erfolgt unter Auflösen des Heparinmaterials in einer 0,01N bis 1N wäßrigen Lösung einer Alkali- oder Erdalkalimetallbase gegebenenfalls in Anwesenheit eines Alkalioder Erdalkalimetallsalzes bei einer Konzentration, die niedriger oder gleich 1N ist und einer katalytischen Menge eines Reduktionsmittels und in dem die Lösung bei einer Temperatur zwischen 35ºC und 70ºC während einer Zeit zwischen 0,5 und 24 Stunden bei einer konstanten Temperatur gehalten wird.
Am Ende der Reaktion wird die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt, auf neutralen pH eingestellt und gegebenenfalls beispielsweise mit lonenaustauschharzen oder durch Dialyse gereinigt und schließlich wird das modifizierte Heparinderivat durch Zugabe von 2 bis 4 Volumina, bevorzugt 2,5 Volumina eines Alkohols, welcher 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält, wie beispielsweise von Ethylalkohol, ausgefällt
Die modifizierten Heparine, welche nach diesem Verfahren erhalten werden, zeigen besondere chemisch physikalische Eigenschaften,die sich von denen der Heparine, die bei den bekannten Alkalibehandlungen erhalten werden, vollständig unterscheiden. Dies ist auf die Reaktionsbedingungen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zurückzuführen, da die Werte der Parameter hauptsächlich die Basenkonzentration, die Temperatur und die mögliche Anwesenheit eines Salzes sich signifikant von den früher verwendeten Bedingungen unterscheiden.
Die Strukturänderungen der neuen Heparinderivate gehen hauptsächlich aus der Stellung und der relativen Intensität der Resonanzen in dem ¹³C-NMR-Spektrum und ebenfalls aus dem elektrophoretischen Verhalten aus der Erhöhung der Werte der spezifischen Drehung und aus der Abnahme des Schwefelgehalts und des Sulfat/Carboxylverhältnisses sowie aus dem unveränderten Carboxylgehalt hervor.
Die weiteren charakteristischeren Anderungen in der Struktur der neuen Heparinderivate wurden aufgrund der starken Anderungen, die in dem ¹³C-NMR-Spektrum auftreten, untersucht. Diese Variationen beziehen sich auf spezifische Zonen des Spektrums und umfassen sowohl das Auftreten von neuen Peaks als auch die Modifizierung anderer Peaks. Von besonderer Wichtigkeit ist das Auftreten von zwei neuen Signalen bei 53 und 54 ppm und die Verschiebung der Peaks, die dem Kohlenstoffatom 1 der Iduron- und Glucosamineinheit in der Zone zwischen 92 ppm und 102 ppm entspricht. Ein Vergleich der ¹³C-NMR-Spektren der neuen Verbindungen und der Ausgangsverbindungen ermöglicht die Aussage, daß einige Zonen des Spektrums unverändert sind und daß als Folge einige Teile der Heparinstruktur überhaupt nicht modifiziert wurden. Insbesondere wurden die Signale, die der Stellung 6 der sulfatierten oder desulfatierten Glucosamineinheit zuzuordnen sind, nicht modifiziert. Weiterhin sind die Peaks, die der Stellung 2 der Glucosamineinheit zuzuordnen sind, sulfatiert oder acetyliert, die der Carboxygruppe der Iduronsäure und den Einheiten der Glucuronsäure, die in dem Heparin durchschnittlich 20% der Uronreste ausmachen, zuzuordnen sind, unverändert.
Die chemisch-physikalischen Eigenschaften der neuen Heparinderivate zeigen, daß eine stärkere Modifizierung auftritt, je drastischer die Reaktionsbedingungen sind, was aus den beigefügten Beispielen hervorgeht. Daher bewirkt eine Anderung der Parameter bei der Reaktion die Herstellung von Verbindungen, die in ihrer Struktur mehr oder weniger stark modifiziert sind.
Die Stärke der chemischen Modifizierung kann aus dem Verhältnis zwischen der Summe der Integrale der Peaks bei 53 und 54 ppm und der Summe der Integrale der Peaks des Kohlenstoffatoms in der Stellung 6 der Glucosamineinheit bei 62,5 und 69 ppm berechnet werden, wobei die letzteren aus beliebiger Basis ausgewählt werden, da ihre Intensität stabil bleibt und da sie in einem Bereich des Spektrums auftreten, der frei ist von anderen Peaks. Parallel zu der Erhöhung der Resonanzen bei 53 und 54 ppm tritt eine Erhöhung der Drehkraft bei 589 nm (D-Linie von Natrium) auf, und daher kann die Messung der spezifischen Drehkraft direkt für die Bewertung des Grads der chemischen Modifizierung, die in der Heparinstruktur auftritt, verwendet werden. Da in dem Reaktionsmedium optisch aktive Reagentien nicht verwendet werden, kann die Messung der Drehkraft direkt für die Prüfung des Verlaufs der Reaktion verwendet werden. Die Verhältnisse der Integrale der Peaks in dem ¹³C-NMR-Spektrum und die Erhöhung des spezifischen Drehvermögens, bezogen auf die Ausgangsverbindung, sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 BEISPIEL Fläche der Peaks bei 53 und 54 ppm Unterschied zwischen dem spezifischen Drehvermögen der modifizierten und der Ausgangsheparine [α]D²&sup0; Fläche der Peaks bei 62,5 und 69 ppm
Diese modifizierten Heparine zeichnen sich weiterhin dadurch aus, daß sie ein unterschiedliches elektrophoretisches Verhalten als die Ausgangsverbindungen besitzen, daß durch eine größere Mobilität in Barium-Acetatpuffer 0,1M bei pH 5,8 [P. Oreste, G. Torri, J. Chrom. 195, 398, (1980)] charakterisiert ist, und daß sie einen Schwefelgehalt zwischen 8% und 11%, ein Sulfat-Carboxyl-Verhältnis zwischen 1,50 und 2,20 und ein spezifisches Drehvermögen [α]D²&sup0; zwischen +50º und +90º besitzen, was aus der folgenden Tabelle 2 hervorgeht, in der in Klammern die Werte der entsprechenden Ausgangsverbindungen angegeben werden. Tabelle 2 BEISPIEL % Sulfate Sulfat/Carboxylverhältnis [α]D²&sup0;
Die neuen erfindungsgemäßen Heparinderivate besitzen eine ausgeprägte antithrombotische Aktivität zusammen mit einer niedrigeren Anticoagulanswirkung, bezogen auf die Ausgangsheparine. Ihre biologische Aktivität wurde durch viele typische Tests der Heparine festgestellt, insbesondere wurden Tests bezüglich dem Anti-Xa-Faktor, der APTT, der Blutungszeit und dem Schutz vor experimenteller Thrombose durchgeführt. Die APTT-Aktivität wurde gemäß dem Verfahren von Larrieu M.J. und Weiland G., Rev. Hematol., 12, 199, (1957) beschrieben. Die Anti-Xa-Aktivität wurde gemäß dem Verfahren von Yin E.T. und Wessler S., Biochem. Biophys. Acta, 201, 387, (1970) beschrieben.
Jede geprüfte Verbindung wurde in Plasma, das aus fastenden Ratten entnommen wurde, gelöst, dann erfolgten proportionale Verdünnungen, um die Konzentrationen zu erhalten, die für das Verfahren erforderlich waren. Zehn Bestimmungen erfolgten für beide Aktivitäten von jeder Verbindung, und die Menge, die eine stark signifikante Anderung in dem entsprechenden Test ergibt, wurde in mcg/ml berechnet. Insbesondere wurde die Aktivität von jedem Produkt als Konzentration in mcg/ml ausgedrückt, die die APTT-Zeit verdoppelt und den Anti-Xa-Wert um 30% erhöht. Die bei den beiden Tests erhaltenen Werte (vergleiche Tabelle 3) bestätigen, daß die neuen Verbindungen eine Verringerung in der Anticoagulanswirkung besitzen.
Die Blutungszeit erfolgte in der Ratte gemäß dem Verfahren, das von Dejana E. et al, Thromb. Haemost., 48, 108, 1982 beschrieben wird. Die Ergebnisse wurden so angegeben, daß Prozent der Zeit der Blutungsverlängerung in den Ratten, die mit den neuen Heparinen behandelt wurden, im Vergleich zu der Blutungszeitverlängerung in Ratten, die mit den entsprechenden Ausgangsheparinen, die als 100% angesehen wurden, behandelt wurden berechnet wurde. Alle neuen erfindungsgemäßen Derivate mit modifizierter Heparinstruktur zeigen eine Abnahme, oft eine starke, der Blutungszeit verglichen mit den entsprechenden Ausgangsheparinen. Die antithrombotische Aktivität wurde gemäß dem venösen Thrombostasetest, der von Reyers S. et al. Thromb. Res. 18, 699-74, 1980 beschrieben wird, bestimmt. Der Schutz, der durch die neuen Verbindungen erhalten wurde, wurde in Prozent berechnet, indem der antithrombotische Schutz, den die Ausgangsheparine zeigen, mit 100 angenommen wurde.
Die so erhaltenen Ergebnisse zeigen eine wesentliche Aquivalenz der beiden Reihen der Heparine hinsichtlich dieses Tests bei der antithrombotischen Aktivität.
Die Werte der oben beschriebenen biologischen Tests, werden in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt, wo die Anti-Xa- und die APTT-Werte der entsprechenden Ausgangsheparine in Klammern angegeben werden. Tabelle 3 BEISPIEL Anti-Xa-Aktivität Menge der Verbindung, welche den Anti-Xa-Wert um 30% erhöht (mcg/ml) APTT-Aktivität Menge der Verbindung, welche die APTT-Zeit verdoppelt (mcg/ml) Blutungs zeit % Verlängerung im Vergleich mit dem Heparin Ausangs material % Antithrombotischer Schutz im Vergleich mit dem Heparin Ausgangs material
Aufgrund der oben angegeben pharmakologischen Eigenschaften sind die neuen Heparinderivate für die Behandlung thrombotischer Pathologien und Krankheiten nützlich. Die bevorzugten Verabreichungswege sind die parenteralen und subkutanen in Form steriler wäßriger Lösung, die gegebenenfalls ebenfalls einige Salze enthalten können, damit die Lösungen isotonisch werden und die gegebenenfalls Konservierungsmittel enthalten können. Der Dosisbereich hängt von dem verwendeten pharmazeutischen Präparat-und dem Zustand des Patienten ab. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Menge an erfindungsgemäßem Heparinderivate äquivalent zwischen 5000 und 20.000 Einheiten des Anti-Xa-Faktors (U.A.Xa). Diese Menge wird ein- oder mehrmals täglich verabreicht.
Als Ausgangssubstrate können Heparinmaterialien verschiedenen Ursprungs verwendet werden. Beispielsweise können im Handel erhältliche Heparine und Heparine, die durch Reinigung solcher im Handel erhältlicher Heparine erhalten wurden, wie auch Heparine mit niedrigem Molekulargewicht, die nach an sich bekannten Depolymerisationsverfahren erhalten wurden, verwendet werden, um die erfindungsgemäßen modifizierten Heparine herzustellen. Im folgenden wird die Herstellung der Heparinausgangsmaterialien, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, angegeben.

Natriumheparin-ALFA 87-78

25 Gramm im Handel erhältliches Natriumheparin werden in 2000 ml Wasser gelöst und in etwa 30 Minuten in eine Lösung gegossen, welche 111,2 g Calciumacetatmonohydrat in 2000 ml Wasser, 57 ml Essigsäure und 600 ml Ethylalkohol enthält, wobei die Temperatur bei etwa 8º bis 10ºC gehalten wird. Die erhaltene Suspension wird nach 15 Stunden bei 5ºC filtriert und zu dem Filtrat werden 1000 ml Ethylalkohol gegeben. Nach 3 Stunden bei 5ºC wird der erhaltene Niederschlag abfiltriert. Der Niederschlag wird dann in 200 ml Wasser gelöst. Der pH der Lösung wird mit 1N Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt, und dann wird mit 100 ml der Natriumform Dowex 50W X8-Harz und mit 70 ml Wasser 20 Minuten behandelt. Die Lösung und das Harz werden in eine Chromatographiesäule ( = 1,6 cm, h = 10 cm), welche 80 ml des gleichen Harzes enthält, gegeben. Die Lösung wird percoliert und dann wird mit destilliertem Wasser eluiert, bis das Gesamtvolumen der Lösung 400 ml beträgt. Zu der Lösung werden 12 g Natriumacetattrihydrat und 1000 ml Ethylalkohol gegeben. Der Niederschlag wird filtriert und im Vakuum getrocknet, wobei 19,2 g gereinigtes Natriumheparin erhalten werden, welches als ALFA 87-78 bezeichnet wird und die folgenden chemisch-physikalischen Eigenschaften aufweist.:
S = 10,09%, Sulfat/Carboxylverhältnis = 2,13,
[α]D²&sup0; = +43º (C = 1% in H&sub2;O)
¹³C-NMR-Spektrum (ppm): 177,3; 104,7; 102,0; 99,4; 80,0;
78,6; 72,3; 71,9; 69,0; 62,5; 60,6.

Natriumheparin-ALFA 87-81

Es wurde gemäß dem gleichen Reinigungsverfahren, welches für ALFA 87-78 verwendet wurde, erhalten, wobei 50 g des gleichen im Handel erhältlichen Heparins als Ausgangsmaterial verwendet wurden.
36,5 Gramm gereinigtes Heparin wurden erhalten, welches die folgenden chemisch-physikalischen Eigenschaften besitzt:
S = 10,56%; Sulfat/Carboxylverhältnis = 2,20
[α]D²&sup0; = +47º (C = 1% in H&sub2;0)
¹³C-NMR-Spektrum (ppm): 177,3; 104,7; 102,0; 99,5; 80,1; 78,6; 72,4; 72,0; 69,1; 62,7; 60,7.

Im Handel erhältliches Natriumheparin

Es ist ein Heparin mit den folgenden chemisch-physikalischen Eigenschaften:
S = 11,0%; Sulfat/Carboxylverhältnis = 2
[α]D²&sup0; = +44º (C = 1% in H&sub2;0)
¹³C-NMR-Spektrum (ppm): 177,4; 104,6; 101,9; 99,8; 79,9; 78,6; 72,2; 71,8; 69,0; 62,6; 60,6.

Natriumheparin LMW ALFA 86-02 mit niedrigem Molekulargewicht

Das Natriumheparin mit niedrigem Molekulargewicht LMW ALFA 86-02 wurde durch Depolymerisation mit Wasserstoffperoxid in Anwesenheit von Kupfer(III)-Ionen entsprechend dem Verfahren, wie es in der internationalen Patentpublikation WO 86/06729 beschrieben wird, hergestellt.
Es besitzt die folgenden chemisch-physikalischen Eigenschaften: durchschnittliches Molekulargewicht: 4200 Dalton
S = 11,40%; Sulfat/Carboxylverhältnis = 2,27
[α]D²&sup0; = +45º (C = 1% in H&sub2;0) ¹³C-NMR-Spektrum (ppm): 177,4; 104,6; 101,9; 99,8; 79,9; 78,6; 72,6; 72,2; 71,9; 69,1; 62,7; 60,7.

Natriumheparin LMW ALFA 87-193 mit niedrigem Molekulargewicht

Das Natriumheparin LMW ALFA 87-198 mit niedrigem Molekulargewicht wurde durch Depolymerisation gemäß dem Verfahren, das für LMW 86-02 verwendet wurde, hergestellt.
Es besitzt die folgenden chemisch-physikalischen Eigenschaften:
S = 11,60%; Sulfat/Carboxylverhältnis = 2,32
[α]D²&sup0; = +47º (C = 1% in H&sub2;0)
¹³C-NMR-Spektrum (ppm): 177,7; 104,8; 102,0; 99,6; 80,2; 78,6; 72,4; 71,9; 69,2; 62,7; 60,6.
Die Bestimmung der Werte für die spezifische Drehung 20 erfolgt in wäßrigem Medium bei einer Konzentration von 1%.
Die Bestimmung des Sulfat/Carboxylverhältnisses erfolgte auf potentiometrischem Weg.
Die Bestimmung des Schwefelprozentgehalts erfolgte sowohl nach dem potentiometrischen Verfahren als auch nach dem Schoeniger-Verfahren.
Die ¹³C-NMR-Spektren wurden bei 75,47 MHz mit einem Varian-CFT-75- Spektrometer unter Verwendung von D&sub2;0 als Lösungsmittel und Natrium-3-trimethylsilylpropansulfonat als Vergleichsinnenstandard gemessen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

1,8 Gramm Heparin ALFA 87-81 wurde in 45 ml einer wäßrigen Lösung, welche 0,4 g Natriumhydroxid (0,225 N), 2,3 g Natriumacetat (0,625 N) und 10 mg Natriumborhydrid enthielt, gegeben. Die erhaltene Lösung wurde bei 60ºC während 3,5 Stunden in Thermostaten gehalten, dann auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Eisessig neutralisiert, und dann wurden 2,5 Volumen Ethanol zugegeben. Der Niederschlag wurde abfiltriert, auf dem Filter mit einem Gemisch aus 6:1 Ethanol/Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 1,7 Gramm Produkt erhalten, das ¹³C-NMR-Spektrum zeigt charakteristische Signale bei den folgenden δ (ausgedrückt als ppm): 177,3; 104,3; 101,9; 99,4; 98,4; 97,2; 96,8; 79,7; 79,1; 78,5; 72,1; 71,8; 71,2; 68,8; 62,4; 60,6; 60,3; 54,1; 53,1.

Beispiel 2

1,8 Gramm Heparin ALFA 87-78 wurden zu 45 ml einer wäßrigen Lösung, welche 0,4 g Natriumhydroxid (0,225 N), 2,3 g Natriumacetat (0,625 N) und 10 mg Natriumborhydrid enthielt, gegeben. Die Lösung wurde bei 60ºC 15 Stunden im Thermostat gehalten und nach dem Abkühlen mit Essigsäure neutralisiert. Es wurde dann durch eine Säule ( = 1,2 cm, h = 8 cm), welche Dowex-1 x 2 - Chloridform als anionisches Harz enthielt, durchlaufen gelassen. Das Percolat und die Waschlösung wurden vereinigt und mit 2,5 Volumen Ethanol versetzt. Der Niederschlag wurde abfiltriert, auf dem Filter mit einem 6:1 Ethanol/Wassergemisch gewaschen und getrocknet. Es wurden 1,65 Gramm Produkt erhalten, welches ein ¹³C-NMR-Spektrum besitzt, das charakteristische Signale bei den folgenden δ (ausgedrückt als ppm) aufweist: 177,4; 104,6; 101,8; 98,6; 97,2; 96,8; 79,6; 79,1; 78,9; 72,2; 71,5; 71,2; 68,8; 62,5; 60,3; 54,1; 53,1.

Beispiel 3

1,8 Gramm Heparin ALFA 87-78 wurden zu 120 ml einer wäßrigen Lösung, welche 4,8 g (1 N) Natriumhydroxid enthielt, gegeben. Die Lösung wurde bei 60ºC während 3,5 Stunden in Thermostaten aufbewahrt, mit Essigsäure neutralisiert und eine Nacht gegenüber fließendem Wasser und während 6 Stunden gegenüber destilliertem Wasser dialysiert. Zu der Lösung wurden dann 3,5 g Natriumacetat zugegeben. Die Lösung wurde mit Essigsäure neutralisiert und dann wurden 2,5 Volumen Ethanol zugegeben. Der Niederschlag wurde filtriert, mit einem 6:1 Ethanol/Wassergemisch gewaschen und getrocknet. Es wurden 1,7 g Produkt erhalten, das ein ¹³C-NMR-Spektrum besitzt, das charakteristische Peaks bei den folgenden δ (ausgedrückt als ppm) aufweist: 177,4; 104,6; 101,7; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,7; 79,1; 78,6; 73,5; 72,5; 72,3; 72,1; 71,5; 68,8; 62,6; 60,4; 60,2; 54,0; 53,1.

Beispiel 4

4 Gramm Heparin ALFA 87-81 werden zu 120 ml einer wäßrigen Lösung, die 4,8 g (1 N) Natriumhydroxid, 6,2 g (0,625 N) Natriumacetat und 25 mg Natriumborhydrid enthält, gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 60ºC während 3,5 Stunden im Thermostat gehalten, dann mit Essigsäure neutralisiert und 24 Stunden gegenüber fließendem Wasser dialysiert und durch eine Säule ( = 1,6 cm, h = 15 cm), die mit Dowex 1 x 4 Chloridform als anionisches Harz gefüllt ist, gegeben. Das Eluat und die Waschlösungen werden mit 4 g Natriumacetat und 2,5 Volumen Ethanol versetzt. Der Niederschlag wird filtriert und auf dem Filter mit einem 6:1 Ethanol/Wassergemisch gewaschen und getrocknet.
3,55 g des Produkts werden erhalten, das ein ¹³C-NMR-Spektrum besitzt, das die charakteristischen Peaks bei den folgenden δ (ausgedrückt als ppm) aufweist: 177,4; 104,5; 101,8; 99,4; 98,7; 97,1; 79,5; 78,6; 73,5; 71,8; 68,8; 62,4; 60,3; 54,0; 53,1.

Beispiel 5

1,8 g Heparin LMW-ALFA 86-02 werden zu 50 ml einer wäßrigen Lösung, welche 0,08 g (0,04 N) Natriumhydroxid, 2,6 g (0,625 N) Natriumacetat und 10 mg Natriumborhydrid enthält, gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 60ºC während 210 Minuten in Thermostaten gehalten, dann wird es auf Raumtemperatur gekühlt und durch eine Säule ( = 1,2 cm, h = 10 cm) welche mit anionischem Harz Dowex 1X4, OH&supmin;-Form gefüllt ist und dann durch eine Säule ( = 1,2 cm, h = 10 cm), welche mit kationischem Harz Dowex 50 WX8, H&spplus;-Form gefüllt ist, gegeben. Das Eluat und die Waschlösungen werden vereinigt und mit einer wäßrigen Lösung aus 2N Natriumhydroxid neutralisiert und dann mit 4 g Natriumacetat und 2,5 Volumen Ethanol versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird mit einem 6:1 Ethanol/Wassergemisch gewaschen und getrocknet. Es werden 1,4 g Produkt erhalten, das ein ¹³C-NMR-Spektrum besitzt, welches charakteristische Peaks bei den folgenden δ (ausgedrückt als ppm) zeigt: 177,4; 104,6; 101,9; 99,4; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,9; 78,6; 72,3; 71,9; 68,8; 62,6; 60,3; 54,1; 53,1.

Beispiel 6

10 g Heparin LMW-ALFA 87-198 werden zu 300 ml einer wäßrigen Lösung, welche 2,7 g (0,225 N) Natriumhydroxid enthält, gegeben. 15 g (0,625 N) Natriumacetat und 60 mg Natriumborhydrid werden zugegeben. Die Lösung wird bei 60ºC während 50 Minuten im Thermostat gehalten, auf Raumtemperatur abgekühlt, auf 500 ml mit destilliertem Wasser verdünnt und zuerst durch eine Säule ( = 2 cm, h = 15 cm), die anionischem Harz Dowex 1 x 2, OH&supmin;-Form gefüllt ist und dann durch eine Säule ( = 2 cm; h = 15 cm), die mit einem kationischen Harz Dowex 50 W X 8, H&spplus;-Form gefüllt ist, gegeben. Das Eluat und die Waschlösung werden mit einer wäßrigen Lösung aus 4 N Natriumhydroxid neutralisiert und dann mit 20 g Natriumacetat und 2,5 Volumen Ethanol versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird mit einem 6:1 Ethanol/Wassergemisch gewaschen und getrocknet. 9,1 g Produkt werden erhalten, das ein ¹³C-NMR- Spektrum besitzt, welches die folgenden charakteristischen Peaks bei den folgenden δ (ausgedrückt als ppm) zeigt: 177,4; 104,6; 101,9; 99,8; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,8; 78,6; 72,2; 71,8; 68,9; 62,5; 60,3; 54,1; 53,1.

Beispiel 7

15 g im Handel erhältliches Natriumheparin werden zu 600 ml einer wäßrigen Lösung gegeben, welche 5,4 g (0,225 N) Natriumhydroxid, 30 g (0,625 N) Natriumacetat und 120 mg Natriumborhydrid enthält. Die Lösung wird bei 42ºC während 4 Stunden in Thermostaten aufbewahrt, auf Raumtemperatur gekühlt und mit Essigsäure neutralisiert. Die Lösung wird eine Nacht gegenüber fließendem Wasser dialysiert und dann durch eine Säule ( = 2,8 cm; h = 15 cm), die mit anionischem Harz Dowex 1X2, Chloridform gefüllt ist, gegeben. Das Eluat und die Waschlösungen werden mit 10 g Natriumacetat versetzt, mit einer 2 N wäßrigen Lösung aus Natriumhydroxid auf pH 7 eingestellt, und dann werden 2,5 Volumen Ethanol zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wird mit einem 6:1 Ethanol/Wassergemisch gewaschen und getrocknet. Es werden 13,9 g Produkt erhalten, die ein ¹³C-NMR-Spektrum besitzen, das charakteristische Peaks bei den folgenden & (ausgedrückt als ppm) zeigt: 177,3; 104,6; 101,9; 99,8; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,9; 78,6; 72,2; 71,8; 69,0; 62,5; 60,3; 54,1; 53,1.

Beispiel 8

Eine Ampulle für die parenterale Verwendung enthält:
- Heparin, modifiziert gemäß Beispiel 1 10,000 U.A.Xa
- F.U. Natriumchlorid F.U. 5 mg
- B.P. Benzylalkohol 8 mg
- bidestilliertes steriles Wasser 1 ml

Claims

1. Neues Heparinderivat, gekenzeichnet durch Signale im 130-NMR-Spektrum bei 53 und 54 ppm unter Verwendung von D&sub2;O als Lösungsmittel und Natrium-3-trimethylsilylpropansulfonat als Referenz, ein spezifisches Drehungsvermögen [α]D²&sup0; zwischen +50º und +90º in einer l%igen wässrigen Lösung, einen Schwefelgehalt zwischen 8% und 11% gemäß der potentiometrischen Methode und ein Sulfat-/Carboxylgruppen-Verhältnis zwischen 1,50 und 2,20 gemäß der potentiometrischen Methode.

2. Verfahren zur Herstellung eines neuen Heparinderivats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das eine wässrige Lösung von Heparinmaterial mit einer Base eines Alkali- oder Erdalkalimetallsalzes bei einer Konzentration zwischen 0,01 N und 1 N in Gegenwart eines Alkalioder Erdalkalimetalls bei einer Konzentration zwischen 0 und 1 N, fakuitativ in Gegenwart einer kataiytischen Menge des Reduktionsmittels Natriumborhydrid, für einen Zeitraum zwischen 0,5 und 24 Stunden bei einer Temperatur zwischen 35ºC und 70ºC behandelt wird, gegebenenfalls das Reaktionsgemisch durch Perkolation durch ein Ionenaustauscherharz oder durch Dialyse gereinigt wird und die Verbindungen mit der so modifizierten Struktur durch Zugabe von 2 bis 4 Voluminen eines 1 bis 3 Kohlenstof fatome enthaltenden Alkohols bei neutral ein pH-Wert ausgefällt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Base aus Natrium-, Kalium- und Bariumhydroxiden ausgewählt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Salze aus Natrium-, Kalium-, Barium-, Calcium- und Magnesiumchloriden und -acetaten und Natrium-, Kalium- und Magnesiumsulfaten ausgewählt werden.

5. Arzneimittel, umfassend das neue Heparinderivat von Anspruch 1.

6. Verwendung der Verbindungen von Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von thrombotischen Krankheiten.