DE3854604T2

DE3854604T2 - Antientzündungsmittel und zusammensetzungen.

Info

Publication number: DE3854604T2
Application number: DE3854604T
Authority: DE
Inventors: David Cullis-Hill; Peter Ghosh
Original assignee: Arthropharm Pty Ltd
Current assignee: Arthropharm Pty Ltd
Priority date: 1987-03-19
Filing date: 1988-03-21
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2008-03-22
Also published as: US5145841A; AU604542B2; ATE129254T1; EP0356435B1; AU1545688A; EP0356435A4; US5470840A; DE3854604D1; JPH02502547A; WO1988007060A1; JP2511829B2; EP0356435A1; CA1327354C

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen und Zusammensetzungen zur Behandlung von Arthritis und verwandten inflammatorischen Zuständen. Insbesondere betrifft die Erfindung neue Metallkomplexe eines Xylanpolysulfats, Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten, und die Verwendung solcher Komplexe zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.

Stand der Technik

Arthritis und andere verwandte inflammatorische Zustände sind im allgemeinen schwächende, schmerzvolle Krankheiten, die die Gelenke eines bedeutenden Teils der menschlichen und anderer tierischen Populationen betreffen. Als ein Ergebnis des weit verbreiteten Auftretens solcher Krankheiten ist ein beträchtliches medizinisches Bemühen darauf gerichtet worden, Therapien zu erstellen und aufzufinden, die es ermöglichen, wenigstens einige der damit verbundenen Schmerzen zu lindern und eine Regression des Leidens bewirken.
Als ein Ergebnis dieser Arbeit sind viele Verbindungen gefunden worden, die bei der Behandlung solcher inflammatorischer Krankheiten mit variierenden Erfolgsgraden, die beim Lindern der Krankheitsschmerzen und der Wiederherstellung der betroffenen Gelenke zur normalen Funktion erzielt wurden, verwendbar sind.
Eine der ersten Verbindungen, die verwendet wurde, um inflammatorische Erkrankungen zu behandeln, von der man herausfand, daß sie eine schmerzlindernde Wirkung besitzt, war Salicylsäure. Man fand heraus, daß diese Verbindung unglücklicherweise für den Gastrointestinaltrakt äußerst reizend ist. Demzufolge wurden viele Derivate der Salicylsäure auf antiinflammatorische Aktivität hin bewertet, was zu der Entdeckung von Aspirin als einer wirksamen und relativ sicheren antiinflammatorischen Verbindung führte.
Seit der Entdeckung von Aspirin sind viele andere Verbindungen hergestellt worden, von denen man behauptet, daß sie wirksamer als Aspirin seien. Diese schließen solche Verbindungen wie Phenylessigsäure, dargestellt durch Ibuprofen, und kürzlich entdeckte Verbindungen wie Naproxen und Sulindac ein. Eine starke antiinflammatorische Wirksamkeit ist mit den Kortikosteroiden (z. B. Hydrokortison, Dexamethason, Prednisolon, Methylprednisolon, Betamethason, Paramethason und Triamcinolon) als deren wasserlösliche und unlösliche Derivate erzielt worden, und diese werden auch oft verschrieben.
Jedoch bei allen diesen Verbindungen und Zusammensetzungen im Stand der Technik, während sie zufriedenstellende analgetische, antiinflammatorische Eigenschaften dadurch zeigen, daß sie in den meisten Fällen Gelenkschmerzen bis zu einem gewissen Ausmaße lindern, ist jegliche vorteilhafte Wirkung, die sie beim Wiederherstellen der Gelenkfunktion haben, gewöhnlich nur vorübergehend.
Weiterhin kann eine Langzeittherapie mit den Verbindungen und Zusammensetzungen im Stand der Technik, während eine fortdauernde Schmerzlinderung bei vielen Leidenden bereitgestellt wird, zu einem Zusammenbruch und Fehlfunktion der Bindegewebe, insbesondere Gelenkknorpel führen, welches in der Tat das Problem verschärfen kann. Beispiele dieses Phänomens sind beschrieben bei: Newman und Ling, Lancet 6. Juli, 11-14, 1985; Watson, Rheum. Rehab., 15, 26-30, 1976; McKenzie, Horsburgh, Ghosh und Taylor Ann. Rheum. Dis. 35, 487-417, 1976; Burkhardt und Ghosh Seminars in Arthritis and Rheumatism; Suppl. 1, 17, 1-34, 1987. Kortikosteroide gehören, während sie noch häufig als antiinflammatorische Mittel bei Behandlungen im Gelenk bei schweren Arthropathien verwendet werden, zu den stärksten Inhibitoren des Bindegewebswachstums, der Reparatur und Biosynthese von Matrixkomponenten (siehe Silbermann et al., Bone and Mineral 2, 87-106, 1987; Rimza, AM. J. Dis, Child. 132, 806-810, 1978; Canalis, Endocrinology, 112, 931-939, 1983; Reynolds, Exp. Cell. Res. 41, 174-189, 1966; Oikarinen, Biochem. Pharmacol, 26, 875-879, 1977, Silbermann et al., Growth, 47, 77-96, 1983, Saarni, Biochem. Pharmacol, 26, 1961-1966, 1977 Olah, und Kostenszky, Acta. Biol. Acad. Sci. Hung. 27, 129-134, 1976). Viele klinische Berichte, die erschienen sind, verdammen die Langzeitanwendungen dieser Mittel, berichtet von Neustadt in "Osteoarthritis, Diagnosis and Management", Kapitel 19, Hrsg. Moskowitz, Howell, Goldberg, Mankin, W.B. Saunders and Co. 1984).
In letzter Zeit ist eine umfangreiche Forschung durchgeführt worden, um die verursachenden Mechanismen von Arthritis und anderen inflammatorischen Erkrankungen aufzuklären. In dieser Arbeit sind Untersuchungen der normalen Gelenkfunktion und die Erkennung pathologischer Merkmale, die mit der Krankheit assoziiert sind, eingeschlossen gewesen.
Als ein Ergebnis der vorher erwähnten Arbeit ist Hyaluronat als eine der bedeutenden Nichtproteinkomponenten identifiziert worden, die in der Synovialflüssigkeit von Tiergelenken vorhanden ist, und es ist herausgefunden worden, daß dieses weitgehend für die rheologischen Eigenschaften der Synovialflüssigkeit verantwortlich ist, wobei diese Eigenschaften von der Konzentration und der molekularen Größe des Hyaluronats abhängig sind. Es sollte betont werden, daß Hyaluronat ein natürlich vorkommendes Glykosaminoglykan ist, das in vielen Geweben zusätzlich zur Synovialflüssigkeit in den Tierkörpern vorhanden ist.
Als eine Konsequenz dieses letzteren Ergebnisses ist die Arbeit darauf gerichtet worden, die Rolle des Hyaluronats bei normaler Gelenkfunktion und den Änderungen, die, wenn es welche gibt, in erkrankten Gelenken auftreten, zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser letzteren Arbeit haben zu dem Vorschlag geführt, daß die Gabe von aus gesunden Geweben erhaltenem Hyaluronat in erkrankte Gelenke ein Wiederherstellen der normalen Gelenkfunktion und die Linderung des Schmerzes, der mit den erkrankten Gelenken verbunden verbunden ist, unterstützen kann.
Jedoch scheint es, daß die Ergebnisse von solchen Behandlungen in der Vergangenheit enttäuschend gewesen sind, da das frisch eingebrachte Hyaluronat selbst durch die freien Radikale der inflammatorischen Zellen und deren Enzyme in dem Gelenk schnell abgebaut werden, wodurch seine vorteilhaften Eigenschaften verloren gehen.
Dieses Ergebnis legt auch nahe, daß es sogar, wenn Hyaluronat im richtigen molekularen Größenbereich zu erkrankten Gelenken gegeben wurde, wahrscheinlich ist, daß nur eine vorübergehende Linderung erfolgen würde, wenn das Hyaluronat dem Gelenk nicht auf einer kontinuierlichen Basis zur Verfügung gestellt würde.
Außerdem ist durch die Erfinder hier in vitro gefunden worden, daß das von Zellen, die aus arthritischen synovialen Gelenken stammen, synthetisierte Hyaluronat eine kleinere molekulare Größe als das normalerweise sekretierte hat. Diese Ergebnisse legen nahe, daß, um die Normalität der Funktion wiederherzustellen, die Produktion von Hyaluronat in den Gelenken gesteuert werden sollte, um sicherzustellen, daß das hergestellte Hyaluronat im richtigen molekularen Größenbereich vorliegt.
In Übereinstimmung mit der Entdeckung der Verringerung der molekularen Größe von Hyaluronat in erkrankten Gelenken als auch dem schnellen Zusammenbruch und Verlust der normalen Größe des Hyaluronats, wenn es in pathologische Gelenke eingebracht wurde, und dem Vorteil, der erzielt werden sollte, wenn man die Synthese des Hyaluronats im richtigen molekularen Größenbereich steuert, haben die Erfinder hier überraschenderweise gefunden, daß dadurch, daß man Hyaluronat mit Verbindungen kombiniert, welche die Wanderung von inflammatorischen Zellen in das Gelenk, die Freisetzung von inflammatorischen Mediatoren, freien Radikalen und proteolytischen Enzymen aus diesen Zellen supprimieren, die Integrität und Biosynthese von Hyaluronat erhalten werden kann.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Multivalentes- Metallion-Komplex eines polysulfatierten Xylans, worin das multivalente Ion ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Ca²&spplus;, Mg²&spplus;, Cu²&spplus; und Zn²&spplus;;
worin, auf einer molaren Basis, die Substitution monovalenter Ionen durch das multivalente Metallion im Bereich von 1-100% liegt; und
worin der Multivalentes-Metallion-Komplex des polysulfatierten Xylans erhältlich ist durch das Verfahren, das die essentiellen Schritte umfaßt von:
a) Behandeln des Xylans mit Chlorsulfonsäure in trockenem Pyridin;
b) Gießen der Reaktionsmischung auf Eis;
c) Neutralisieren der erhaltenen Lösung mit Alkalimetallhydroxid;
d) Ausfällen des rohen polysulfatierten Xylans als einen Sirup durch die Zugabe von Ethanol;
e) Abtrennen des polysulfatierten Xylans und Wiederauflösen des abgetrennten polysulfatierten Xylans in Wasser;
f) Unterwerfen der erhaltenen Lösung einer Serie von Ethanol/Wasser-Ausfäll/Wiederauflöseschritten entsprechend den Schritten d) und e);
g) Dialysieren der Lösung des polysulfatierten Xylans gegen Wasser, um ein nicht dialysierbares, salzfreies polysulfatiertes Xylan zu erhalten;
h) Bilden eines monovalenten Salzes davon durch Lyophilisierung, wobei das monovalente Salz das Natriumsalz, Kaliumsalz oder Ammoniumsalz ist, und
i) Umwandeln des monovalenten Salzes des polysulfatierten Xylans von Stufe h) in den Multivalentes-Metallion-Komplex des polysulfatierten Xylans durch ein Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
I) Durchfließenlassen einer Lösung des monovalenten Salzes des polysulfatierten Xylans von Stufe h) durch eine Kationenaustauschersäule, um das polysulfatierte Xylan in seine Säureform umzuwandeln, und Neutralisieren der Säureform des polysulfatierten Xylans durch Zugabe einer Lösung des multivalenten Metallsalzes zu einer Lösung davon;
II) Durchfließenlassen einer Lösung des monovalenten Salzes des polysulfatierten Xylans von Stufe h) durch eine Kationenaustauschersäule, um das polysulfatierte Xylan in seine Säureform umzuwandeln, und Durchfließenlassen der Lösung der Säureform des polysulfatierten Xylans durch eine Kationenaustauschersäule, die in die kationische Form des multivalenten Metalls umgewandelt worden ist; und
III) Durchfließenlassen einer Lösung des monovalenten Salzes des polysulfatierten Xylans von Stufe h) durch eine Kationenaustauschersäule, die in die kationische Form des multivalenten Metalls umgewandelt worden ist.
Bevorzugt wird das multivalente Ion aus Ca²&spplus; und Zn²&spplus; ausgewählt. Weiterhin wird ein Komplex wie zuvor definiert bevorzugt, worin das monovalente Salz des polysulfatierten Xylans polymeres 1 : 4-β-D-xylopyranose-2 : 1-(4-O-methyl-αglucuronyl)-polysulfatester-Natriumsalz ist und ein Durchschnittsmolekulargewicht von 6.000 Dalton und einen Schwefelgehalt von etwa 16% besitzt.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Komplexes gemäß der Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Arthritis und verwandten inflammatorischen oder degenerativen Gelenkerkrankungen und eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Arthritis und verwandten inflammatorischen oder degenerativen Gelenkerkrankungen, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und einen Komplex gemäß der Erfindung umfaßt.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Komplexes gemäß der Erfindung für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Tumoren als auch für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Virusinfektionen.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 - Wirkungen von Xylanpolysufat (SP54®) und Arteparon® in verschiedenen Konzentrationen auf die in vitro Biosynthese von Hyaluronsäure durch humane synoviale Fibroblasten.
Fig. 2 - Wirkungen von (A) Hyaluronsäure (HA) allein, (B) Xylanpolysufat (SP54®) allein und (C) einer Kombination von HA und SP54 auf die in vitro Biosynthese von HA durch humane synoviale Fibroblasten.
Fig. 3 - Aus den ¹³C-NMR Daten werden die Positionen der Zink [A] und Calcium [B] Atome in den mit dem Xylanpolysulfat gebildeten Komplexen als schwarze Kugeln gezeigt. Anzumerken ist, daß in dem Zinkkomplex [A] sich das Metall in der Lücke zwischen den Pentosanringen befindet, wohingegen in [B] das Calcium eine Position zwischen den C-3 und den C-5 Positionen des Zuckerringes und nahe den Sulfatgruppen einnimmt.
Fig. 4 - Sephadex G-25 Chromatographie von DH40G unter Verwendung von HEPES Puffer (50 nM) bei pH 7,0. Die Fraktionen wurden auf sulfatierte Polysaccharide unter Verwendung des Farndale et al. Tests (Connective Tissue Research, 9, 247-249, 1982) untersucht, Zink wurde durch Atomabsorptionsspektroskopie bestimmt und ist in ug/ml ( ) gezeigt.
Fig. 5 - Inhibition der humanen Granulozytenelastase (HGE) durch Xylanpolysulfat (Sp54®) ( ), DH40J ( ) und DH40Y ( ). Die IC50 (ug/ml) werden für diese drei Arzneimittel gezeigt.
Fig. 6 - Inhibition der humanen Granulozytenelastase (HGE) durch Xylanpolysulfat (Sp54®) ( ), DH40J ( ), ZnSO&sub4; ( ) und ZnSO&sub4; + SP54® in dem Verhältnis (1 : 0 : 18) ( )
Fig. 7 - Antikoagulanswirkung von Heparin ( ) Xylanpolysulfat (SP54®) ( ), DH40J ( ), DH50 ( ) und DH80 (X) gegen Meerschweinchenplasma.
Fig. 8 - Antikoagulationsfähigkeit von Heparin ( ), Xylanpolysulfat (SP54®) ( ), DH40G ( ) und DH40J ( ) gegen Meerschweinchenplasma.
Fig. 9A - Wirkung von Heparin ( ), SP54® ( ), SP54® + Zn&spplus;&spplus; in dem Verhältnis (1 : 0,176) oder (1 : 0,22) ( ),
DH40J ( ), DH40Y ( ) oder ZnSO&sub4; (X) auf die Prothromoinzeit von normalem humanem Plasma.
Fig. 9B - Antikoagulanswirkung von Heparin ( ) Xylanpolysulfat (SP54®) ( ), Dextranpolysulfat (DS5000) ( ), Dextranpolysulfat (DS5000) + ZnSO&sub4; in den Verhältnissen (1 : 0,47) ( ), Dextranpolysulfat (DS5000)-Zn Chelatkomplex ( ) und ZnSO&sub4; ( ) gegen Meerschweinchenplasma.
Fig. 10 - Schematische Darstellung der verwendeten Verfahren, um die inhibitorischen Wirkungen der Arzneimittel auf die IL-1 (in Macrophagen Überständen) vermittelte in vitro Degradation von Knorpel zu bewerten. ³&sup5;-Sulfat wurde verwendet, um Proteoglykane in Knorpeln von Kaninchengelenken zu markieren. Thioglykolat wurde verwendet, um eine Akkumulation von aktivierten Makrophagen in der peritonealen Höhle des Kaninchens zu stimulieren.
Fig. 11 - Wirkungen von DH40G oder der Salinekontrolle auf die IL-1 vermittelte Degradation von Kaninchenknorpel in vitro. In der Kontrollgruppe:
( ) = Knorpel allein inkubiert
( ) = Knorpel + 5 · 10&sup4; Makrophagen
( ) = Knorpel + 1 : 10 Verdünnung von Makrophagenkulturmedium In der DH40G Gruppe waren die experimentellen Bedingungen die gleichen wie bei den Kontrollen, es wurden aber 200 ug/ml des Arzneimittels verwendet.
Fig. 12 - Proteoglykangehalt (bestimmt durch Uronsäure) von Gelenkknorpeln, implantiert in Lufttaschen einer Ratte, behandelt mit (1) physiologischer Saline ( ), (2) Pepton ( ), und (3) Pepton + DH40J ( ) Behandlung für sieben Tage mit 10 mg/kg/Tag.
** zeigt statistische Abweichung von arzneimittelfrei behandelter Gruppe (2) (P < 0,001)
Fig. 13 - 4,0 M-GuHCl Extrahierbarkeit von Proteoglykanen aus Gelenkknorpel, entnommen aus Lufttaschen der Ratte nach Behandlung mit (1) physiologischer Saline ( ), (2) Pepton ( ) und (3) Pepton + DH40J ( ) Behandlung mit 10 mg/kg/Tag für sieben Tage. ** zeigt statistische Abweichung von arzneimittelfrei behandelter Gruppe (2) (p < 0.005).
Fig. 14 - Aggregation (als Prozentwert der Gesamtmenge) von Proteoglykanen, extrahiert aus Gelenkknorpeln, implantiert in Lufttaschen der Ratte, behandelt mit (1) physiologischer Saline ( ), (2) Pepton ( ), und (3) Pepton + DH40J ( ) Behandlung mit 10 mg/kg/Tag für sieben Tage. ** zeigt statistische Abweichung von arzneimittelfrei behandelter Gruppe (2) (p < 0.001).
Fig. 15 - Wirkungen von Xylanpolysulfat (SP54®) ( ), DH40J ( ), ZnSO&sub4; ( ) und SP54® + ZnSO&sub4; in den Verhältnissen von (1,0 : 0,2) ( ) auf die DNA-Synthese einer humanen synovialen Fibroblastenlinie, die aus der Gelenkflüssigkeit eines osteoarthritischen Gelenkes stammt.
Fig. 16 - Wirkungen von Xylanpolysulfat (SP54®) ( ), DH40J ( ) und DH40Y ( ) auf die in vitro Proteoglykansynthese von Kaninchengelenk-Chondrocyten. Die Werte sind als Mittelwerte ± SD, n = 4 gezeigt. * zeigt statistisch signifikant verschiedene Werte von SP54® (p < 0,01) an.
Fig. 17 - Wirkungen von Hydrokortison in verschiedenen molaren Konzentrationen (M) auf die in vitro Biosynthese von Hyaluronsäure einer synovialen Fibroblastenzellinie, die aus einem OA Gelenk stammt.
= Mittel = SD
Fig. 18 - Wirkungen verschiedener Konzentrationen (ug/ml) von DH40J auf die in vitro Biosynthese von Hyaluronsäure durch eine synoviale Fibroblastenlinie, die aus OA Gelenken stammt.
= Mittel = SD
Anzumerken ist: bei 0,10 ug/ml war DH40J ungefähr zweimal mehr stimulierend als SP54® in der gleichen Konzentration.
Fig. 19 - Kombinierte Wirkungen von Hydrokortison (mit 10&supmin;&sup6; M) und Xylanpolysulfat (SP54®) in verschiedenen Konzentrationen auf die in vitro Biosynthese von Hyaluronsäure durch eine synoviale Fibroblastenlinie, die aus OA Gelenken stammt.
= Mittel = SD
Anzumerken ist: bei 0,25 ug/ml war die Biosynthese von HA, supprimiert durch Hydrokortison, fast aber nicht vollständig auf den Kontrollwert wieder hergestellt.
Fig. 20 - Kombinierte Wirkungen von Hydrokortison (mit 10&supmin;&sup8; M) und Xylanpolysulfat (SP54®) in verschiedenen Konzentrationen auf die in vitro Biosynthese von Hyaluronsäure durch eine synoviale Fibroblastenlinie, die aus OA Gelenken stammt.
= Mittel = SD
Anzumerken ist, daß bei Konzentrationen zwischen 0,1-1,0 ug/ml SP54® sogar in Gegenwart von Hydrokortison die Synthese auf die Kontrollwerte vollständig wieder hergestellt wurde.
Fig. 21 - Kombinierte Wirkungen von Hydrokortison (mit 10&supmin;&sup8;) und DH40J in verschiedenen Konzentrationen auf die in vitro Biosynthese von Hyaluronsäure (HA) durch synoviale Fibroblasten, die aus OA Gelenken stammen.
= Mittel = SD
Anzumerken ist: 0,25 ug/ml DH40J stellte die Biosynthese von HA auf normale Werte wieder her.
Von polysulfatierten Polysacchariden wie Heparin und solchen, abgeleitet von Chondroitin, Keratan, Dermatan, Chitin, Dextran (Polyglukosen), Xylan (Polypentosen), Stärke, Amylopektin, Zellulose, Amylose, Alginsäure, Pektin, Inulin und Hyaluronsaure ist gezeigt worden, daß sie eine Vielfalt von biologischen Aktivitäten haben. Anzumerken ist, daß Heparin das einzige natürlich vorkommende polysulfatierte Polysaccharid ist. Die äußerst breit untersuchten Aktivitäten beinhalten die Inhibition von sauren und neutralen Proteinasen (z. B. humane Granulozytenelastase, HGE) und lysosomale Hydrolasen (z. B. Hyaluronidase), antivirale (z. B. Herpes Simplex), antiinflammatorische und antikoagulierende Aktivität.
In einigen Fällen hat die Wirksamkeit der biologischen Aktivität eines besonders polysulfatierten Polysaccharides zu seiner kommerziellen Entwicklung geführt. Ein Beispiel ist Arteparon® (Warenzeichen des Luitpold-Werks), welches vorwiegend aus polysulfatierten Chondroitin besteht. Diese Verbindung ist als antiarthritisches Arzneimittel verwendet worden.
Ein anderes Beispiel ist SP54® (Warenzeichen der Benechemie GmbH), welches ein Polysulfatnatriumsalz ist. Diese Verbindung hat eine weite Anwendung als ein antithrombotisches, antiartheriosklerotisches und antihyperlipämisches Mittel gefunden.
SP54® (Warenzeichen der Benechemie GmbH) ist das Natriumsalz eines semi-synthetischen polysulfatierten Xylosids mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 6.000 Dalton und einem Schwefelgehalt von über 16%. Seit den frühen 1960ern ist diese Verbindung bekannt ein synthetisches Heparinoid und ein antithrombotisches Mittel zu sein. Die statistische Strukturformel wird unten gezeigt.
worin R für die -SO&sub3;Na Gruppe steht.
Deren Eigenschaften werden in einer Veröffentlichung von Halse, Th, beschrieben, mit dem Titel: "Aktivierung der Fibrinolyse und Thrombolyse durch Polysaccharidschwefelsaureester" Arzneim.-Forsch 12, 574 (1962). Bei dieser Verbindung wurde auch gefunden, daß sie antiinflammatorische Eigenschaften hat, wie von Kalbhen, DA, in Pharmacology 9, 74 (1973) berichtet.
Daß SP54 die PMN Elastase und andere Enzyme inhibiert, ist seit einiger Zeit bekannt gewesen, und es ist bekannt, daß die PMN Elastase ein potentieller Zerstörer des Bindegewebes einschließlich des Gelenkknorpels ist. Demzufolge haben Wissenschaftler versucht, die Mechanismen der Inhibition aufzuklären, mit der Absicht, die mögliche Rolle antiinflammatorischer und antirheumatischer Arzneimittel wie auf Proteinase gerichtete Inhibitoren zu entdecken. Ein Beispiel einer solchen Untersuchung ist das von Baici et al in Biochem. Pharmacol. 30, 703 (1981) berichtet. In dieser letzteren Veröffentlichung wurde gezeigt, daß SP54® ein potenter Inhibitor proteolytischer und hydrolytischer Enzyme ist.
Weiterhin haben Andrews et al in Chem. Biol. Interactions 47, 157 (1983) gezeigt, daß SP54® an Gelenkknorpel und Bindegewebe bindet.
Ohne von einer Theorie gebunden zu sein, glauben die Erfinder, daß SP54® durch Schützen des Gelenkknorpels und anderen Bindegewebes vor dem Zusammenbruch im pathologischen Zustand als auch stimulierend bei deren Reparatur und Wiederherstellung der normalen Funktion wirken könnte.
Arteparon® ist ein Mucopolysaccharidpolyschwefelsäureester, hergestellt von der Luitpold GmbH. Genauer ist es ein heterogenes semisynthetisches Glykosaminoglykanpolysulfat, in welchem die sich wiederholende, überwiegende (ungefähr 93%) Disaccharideinheit glykosidisch an Galactosamin gebundene Hexuronsäure ist. Ungefähr vier der freien Hydroxylgruppen der sich wiederholenden Disaccharideinheit von Arteparon sind mit Sulfatgruppen verestert, wobei sich ein Schwefelgehalt von ungefähr 13 Gew.-% ergibt. Das handelsübliche Erzeugnis hat ein Molekulargewicht von ungefähr 10.000 Dalton.
Diese Wirkung wird durch die Daten in Fig. 1 erläutert, wo gesehen werden kann, daß SP54 und Arteparon® die Biosynthese von Hyaluronsäure (HA) in humanen OA synovialen Fibroblasten in einer Konzentrationsweise stimulieren. Es sollte betont werden, daß während die stimulierende Wirkung von Arteparon auf die HA Biosynthese bekannt ist (Verbruggen und Veys), Acta Rhumatol Belg. 1, 75-92, 1977), die von SP54 vorher nicht berichtet worden ist. Eine jüngere Publikation von Smith und Ghosh in Rheumatology International 7, 113-122, 1987 zeigt, daß hochmolekulargewichtige (> 3,0 · 10&sup6; Dalton) HA auch die de novo HA Synthese durch synoviale Fibroblasten stimuliert, und die Erfinder hier haben gefunden, daß diese Wirkung durch die Zugabe von Arteparon® oder SP54® zu der hochmolekulargewichtigen HA Zubereitung verstärkt wird. Dieses wird in Fig. 2 erläutert, wo gesehen werden kann, daß die Zugabe einer Kombination aus hochmolekulargewichtigen HA und SP54 zu synovialen Zellen in der Kultur zu einer stärkeren Synthese von HA führt, als wenn jedes Mittel allein verwendet wurde.
Die Substanzen SP54® und Arteparon® sind wirksame Inhibitoren von Proteasen, welche Gelenkknorpel zerstören. Sie supprimieren auch den Zugang inflammatorischer Zellen wie PMN Zellen, die, wie vorher erwähnt wurde, für den Hyaluronatzusammenbruch verantwortlich sind, in das Gelenk. Die Erfinder glauben, daß SP54 und Arteparon auf diesem Weg die Normalisierung von Gelenkhyaluronat und Gelenkknorpel schützen und fördern und in Kombination mit hochmolekulargewichtigen Hyaluronat, welches die rheologischen Eigenschaften, die für eine wirksame biomechanische Funktion notwendig sind, bereitstellt, zusammenwirkt.
Obwohl von dem vorher erwähnten polysulfatierten Polysacchariden eine Vielzahl von klinischen Anwendungen gefunden wurden, hat deren grundlegende strukturelle Ähnlichkeit als lineare Polyanionen zu einem Profil biologischer Aktivitäten geführt, welches von den meisten Mitgliedern dieser chemischen Familie geteilt wird. Natürlicherweise schwanken jedoch die biologischen Aktivitäten von jedem der Mitglieder in einer nicht notwendigerweise vorhersagbaren Weise.
Weiter muß verstanden werden, daß, während ein solches Spektrum an biologischen Aktivitäten von beträchtlichem wissenschaftlichem Interesse sein kann, in Fällen, wo die biologischen Aktivitäten einer Verbindung stören, eine solche Verbindung als ein Mittel, welches für therapeutische Zwecke verwendet wird, schädlich sein könnte.
Ein Beispiel ist, daß bei der Behandlung von Arthritis der Patient allgemein tägliche Dosen eines geeigneten Arzneimittels über mehrere Monate oder Jahre verabreicht bekommt, und, sollte das verwendete Arzneimittel auch Blutgerinnungsmechanismen supprimieren, d. h. antithrombotische, fibrinolytische oder thrombozytopenische Aktivität haben, können Hämorrhagien, die einer akuten Verletzung folgen, oder Menache auftreten.
In Bezug auf die polysulfatierten Polysaccharide ist bei einer Anzahl von Verbindungen gezeigt worden, daß sie eine wirksame antithrombotische oder Antikoagulansaktivität haben, welche deshalb die Verwendung solcher Verbindungen, insbesondere bei Langzeittherapien des oben ausgeführten Typus, begrenzten.
Die Selektivität der biologischen Wirkung der polysulfatierten Polysaccharide ist daher wünschenswert und ist durch Variieren des Grades und der Position der Sulfatsubstitution am Polysaccharidring erzielt worden.
Für das Molekulargewicht der polysulfatierten Polysaccharide ist auch gezeigt worden, daß es eine Bestimmungsgröße der biologischen Aktivität ist. So ist von Ricketts in Biochem. J. 51, 129-133 (1952) berichtet worden, daß bei den Dextranpolysulfaten die hochmolekulargewichtigen Analoga toxischer als die niedrigmolekulargewichtigen Spezies waren. Es wurde auch gefunden, daß der Grad an Sulfatierung eine wichtige Bestimmungsgröße bei der Antikoagulansaktivität war. Weiterhin ist gezeigt worden, daß die Antikoagulanseigenschaften der Heparine von der molekularen Größe der verwendeten Fraktionen abhängig sind. (Casu, B, in Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 43, 51-134, 1985).
In einem jüngeren Artikel, publiziert in Archives Internationales de Pharmacodyanamie de Therapie, 282 (2) 196-208 (1986), zeigten die Autoren, daß ein hochmolekulargewichtiges Analogon von SP54® (SR 24751) und SP54® durch Verbessern des Proteoglykaneinbaus in die extrazelluläre Matrix in vitro aktiv war. Jedoch war eine niedrigmolekulargewichtige Fraktion von SP54® (SR 25491) und Arteparon® (registriertes Warenzeichen der Luitpold-Werk GmbH) inaktiv.
Es wird bevorzugt, daß das in den Kombinationen verwendete Hyaluronat ein Molekulargewicht hat, welches innerhalb des gefundenen normalen Größenbereichs in dem Gelenk des Tieres liegt, das behandelt werden soll. In dem Fall, wo Menschen behandelt werden, ist eine bevorzugte Quelle des Hyaluronats die, die aus Synovialflüssigkeit vom Rind durch ein Verfahren, die in der PCT-Anmeldung von D. Cullis-Hill, PCT/AU86/00129 offenbart ist, erhalten wurde.
Wie bereits erwähnt sind Kortikosteroide äußerst wirksame antiinflammatorische Mittel mit weit verbreiteter Anwendung sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin. Die Einschränkung dieser nützlichen Eigenschaft sind die supprimierenden Wirkungen dieser Arzneimittel auf den Bindegewebsmetabolismus, was selbst äußerst schädlich für die so behandelten Gelenke und Gewebe sein kann. In dieser Beziehung haben die Erfinder gefunden, daß bei Verwendung von Kombinationen antiinflammatorischer Kortikosteoride und sulfatierter Polysaccharide so wie Xylanpolysulfat, Arteparon®, Dextransulfaten, Dermatanpolysulfat, Chitosanpolysulfat und ähnlichen die degenerativen Wirkungen der Kortikosteroide abgeschwächt werden können.
Zum Beispiel ist es bekannt, daß die wöchentliche Verabreichung von Hydrokortison ins Gelenk über acht Wochen den Verlust von Proteoglykanen (PGs) in Gelenken von so behandelten Kaninchen induzieren wird (Oegema und Behrens, Archives of Biochemistry and Biophysics, 206, 277-284, 1981). Die Erfinder haben haben jedoch gefunden, daß wenn dieses Glukokortikoid in Kombination mit den erfindungsgemäßen polysulfatierten Polysacchariden verabreicht wird, die Degradation und der Verlust der Proteoglykane aus Gelenkknorpeln verhindert werden kann.
Die Ergebnisse, die für Hydrokortison (50 mg) und Pentosanpolysulfat (5 mg) erhalten wurden, wenn Kaninchen ins Gelenk verabreicht, bezogen auf Hydrokortison (50 mg) allein, sind in Tabelle 1 gezeigt. Wie gesehen werden kann, verminderte die Hydrokortison-SP54® Kombination den Verlust von Hexuronat (ein Maß des Proteoglykangehaltes), stellte die PG-Extrahierbarkeit wieder her und verstärkte die de novo Biosynthese von Matrix ³&sup5;S-markierten PGs (spezifische Aktivität)
Solche inflammatorischen Gelenkerkrankungen, welche wirksam mit der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, beinhalten Arthritis, Tendinitis und Bursitis. Unter wirksamer Behandlung wird verstanden, daß der mit der Krankheit verbundene Schmerz verringert wird und eine normale Gelenkfunktion wiederhergestellt wird.
Das bevorzugte Verfahren der Verabreichung der Zusammensetzung der Erfindung erfolgt durch direkte Injektion in die geeigneten pathologischen Gewebe z. B. die Synovialraum eines arthritischen Gelenkes. In solchen Fällen würde der Träger normale, sterile, physiologische Saline sein. Jedoch haben die Erfinder auch gefunden, daß die erfindungsgemäße Zusammensetzung, wenn in höheren Konzentrationen verwendet, Tabelle 1 ANALYSE VON GELENKKNORPEL AUS REIFEN KANINCHEN NACH 8WÖCHIGER BEHANDLUNG DURCH VERABREICHUNG INS GELENK VON KORTISON ODER KORTISON-SP54-KOMBINATION, BEZOGEN AUF ARZNEIMITTELFREI BEHANDELTE TIERE Parameter Gruppe 1 (G1) arzneimittelfreie Kontrollen (n=4) Gruppe II (G2) Cortison behandelte Gelenke (n=4) Gruppe 3 (G3) Cortison + SP54 behandelte Gelenke (n=4) statistische Analyse* Hexuronsäure (UA) (ug/mg Trockengewicht) Mittel ± SD 4M Gu HCl, PG Extrahierbarkeit ³&sup5;S-PG spezifisch * Analyse der Varianz unter Verwendung des Student-t-Test. P< 0,05 = statistisch signifikant
systemisch verwendet werden kann (intramuskulär, subkutan, intravenös lokal).
Die tatsächliche Menge an Hyaluronat oder Kortikosteroid und Verbindung, die in der Lage ist, die Integrität des behandelten Bindegewebes zu erhalten, kann abhängig von der Größe der Tierspezies, die behandelt werden soll, der Pathologie des Gewebes oder Gelenkes oder dem zu behandelnden Gewebe oder dem Gelenk, breit variieren.
In einem Beispiel der Erfindung wurde gefunden, daß in den Hunden eine Injektion, die 5 mg Natriumhyaluronat und 5 mg SP54 enthielt, gelöst in 1 ml steriler Saline, injiziert in die steifen Gelenke oder die metacarpalen Gelenke der von traumatisch induzierter oder inflammatorischer Arthritis gepeinigten Tiere, zur Genesung der Funktion innerhalb von 5 Tagen nach der Verabreichung führte.
Im Fall des Pferdes jedoch, konnten 25 mg von Hyaluronat in 2 ml einer sterilen Saline in Kombination mit 25, 50 oder 100 mg SP54 verwendet werden, abhängig von dem Gelenk oder Gewebe, in das injiziert werden sollte.
Für Kortikosteroid/Pentosanpolysulfat-Kombinationen sind hervorragende klinische Ergebnisse bei lahmen Rennwindhunden mit 5,0 mg des Pentosanpolysulfats und 20 mg des Kortikosteroids, nur einmal als eine einmalige Injektion in das betroffene Gelenk verabreicht, erhalten worden. Wenn intramuskulär verabreicht, wurden 50 mg von Pentosanpolysulfat mit 80 mg Hydrokortison oder Methylprednisolonacetat verwendet.
Natürlicherweise würde erwartet werden, daß andere Alkalimetallsalze als das Natriumsalz (SPS®) eine gleiche Wirksamkeit haben würden.
Obwohl die Erfinder hier gefunden haben, daß die polysulfatierten Polysaccharide verwendbar sind in Zusammensetzungen, beinhaltend entweder Kortikosteroide oder Hyaluronsäure oder wasserlösliche Salze davon, haben die Erfinder hier weiterhin gefunden, daß, wenn die polysulfatierten Polysaccharide in besonderen Komplexen vorhanden sind, die Suppression der Blutgerinnungsmechanismen durch die polysulfatierten Polysaccharide stark vermindert ist, während die antiarthritische, antiinflammatorische Aktivität verstärkt ist. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Polysaccharid ist Xylanpolysulfat, bevorzugt SP54®.
Die besonderen Komplexe werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus Ca²&spplus;, Mg²&spplus;, Cu²&spplus; und Zn²&spplus; Komplexen besteht.
Am bevorzugtesten unter diesen ist der Zinkkomplex.
Die Erfinder wissen von der australischen Patentanmeldung 24412/84 (Sanofi et al), in welcher besondere Xylansulfate offenbart sind, von denen behauptet wird, daß sie eine allgemein verstärkte antithrombotische und Antikoagulansaktivität verglichen mit Heparin haben. Das Wesentliche dieser Erfindung ist die Auswahl besonderer Molekulargewichtsfraktionen und Grade der Sulfatierung des SP54. Weiter wird angemerkt, daß die Erfinder darlegen, daß Zusammensetzungen der Erfindung beim Behandeln rheumatoider Arthritis, Arthrose und Osteoarthristis verwendbar sein können. Jedoch sind solche Eigenschaften in keiner Weise quantifiziert, da von SP54 bekannt ist, solche Aktivität zu haben, ist der Vorschlag, daß die Zusammensetzungen dieser Erfindung bei einer solchen Therapie verwendbar sein können, kaum überraschend.
Die Erfinder wissen auch von der US 4465666 (Lukas et al) und der EP 12115 (Lukas et al), in denen Zusammensetzungen, die Zinkionen und saures sulfatiertes Polysaccharid oder Polymer, ausgewählt aus Heparindextransulfat und Polyvinylsulfat, enthalten, offenbart werden. Es wird auch offenbart, daß andere saure sulfatierte Polysaccharide wie Chondroitinsulfat, Karragheen, sulfatiertes Polypentosan, sulfatierte Dextrane und sulfatierte Polyglykosen verwendet werden können. Weiterhin wird auch gelehrt, daß pharmazeutisch annehmbare Salze wie das Kalium und Natriumsalz dieser sauren sulfatierten Polysaccharide wirksam sind.
Zum Beispiel wird die Herstellung von Calciumsalzen sulfatierter Polysaccharide, solche wie Chitin, Zellulose, Stärke, Xylan, Dermatan und Keratan in der EP-A1-0 116 251 beschrieben. Mg, Ca, Zn und Ba-Salze von Chondroitin und Zellulose werden in der US-4,623,539 beschrieben. Weiterhin werden Komplexe von Chondroitinsulfat und Cetylpyridiniumchlorid in der GB-A-2.055.872 beschrieben. Andere Komplexe aus Dermatansulfat und Magnesium und Dimethyl-Ethyl-Cetylammonium werden in der EP-A-0 238 994 offenbart.
Jedoch offenbart der Stand der Technik nicht die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, noch wird vorgeschlagen, daß solche Verbindungen die durch die Erfinder hier gefundene Verwendbarkeit haben würden.
Die Erfinder hier haben gezeigt, daß aufgrund der ungewöhnlich starken Affinität des Metalles in diesen Komplexen der Erfindung für bestimmte, in den Kohlenwasserstoffringen der Polysaccharide vorhandenen Sulfatester und Sauerstoffatome das Metall die Konformation und Steifigkeit der Polymerkette ändert, wodurch es deren biologische Aktivität beeinflußt.
Diese biologische Aktivität tritt nur auf, wenn die Komplexe gemäß den hier beschriebenen Verfahren oder deren Äquivalente hergestellt werden, da sie gut definierte Verbindungen sind, wie durch Mikroanalyse und ¹³C-NMR Spektroskopie gezeigt ist. Außerdem ergab einfaches Mischen von Zinkionen und sulfatiertem Polysaccharid in einer Vielzahl von Verhältnissen (wie beschrieben bei der US 4465666 und der EP 12115 (Lukas et al), als ein Mittel, antivirale Aktivität zu verleihen) nicht die biologische Aktivität der in dieser Erfindung beschriebenen Metallkomplexe, wie durch die drei Beispiele gezeigt wird, die in dem Abschnitt beschrieben werden, der auf die biologischen Aktivitäten folgt.
Erklärungen der antiviralen Aktivität der von Lukas et al hergestellten Mischungen könnten den hochmolekulargewichtigen Polymeren, die sie verwenden, zuzuschreiben sein, z. B. wurden die Dextransulfate MG 8 · 10&sup4; - 2 · 10&sup6; als Beispiele angegeben, wobei in der vorliegenden Erfindung Polymere mit MGs von 30.000 oder weniger verwendet wurden (z. B. Xylanpolysulfate 3-10.000 Da). Es sollte auch betont werden, daß sehr große Verhältnisse von polysulfatierten Polysacchariden zu Zink von Lukas et al verwendet wurden, welche größtenteils weit im Überschuß zu denen vorliegen, die in den beanspruchten reinen Verbindungen vorkommen.
Die Erfinder glauben, daß die divalenten Metall - Ca²&spplus;, Mg²&spplus;, Cu²&spplus;, Zn²&spplus;-Komplexe neu und nicht naheliegende Verbindungen sind. Weiterhin ist gefunden worden, daß der Zinkkomplex allein bei der Behandlung von Arthritis und verwandten entzündlichen Gelenkerkrankungen wirksam ist. Die Erfinder glauben, daß die anderen Komplexe eine ähnliche Eigenschaft haben.
Die Erfinder haben auch gefunden, daß die einzigartige biologische Aktivität des polysulfatierten Xylans, die durch Chelatisierung mit solchen divalenten Metallen induziert wird, nicht auf die 100%ige Substitution der verfügbaren Stellen durch diese Substituenten beschränkt ist. Somit haben sie auf einer Gewicht/molaren Basis gefunden, daß solche divalenten Metallsubstitutionen monovalenter Ionen in dem Bereich von 1% bis 100% auch Konformationsänderungen bei dem polysulfatierten Xylan induzieren kann, wobei dessen biologische Aktivität beeinflußt wird. Beispiele für 8,5%, 83% und 100% Substitution von Natriumionen durch Zinkionen in den sulfatierten Xylanen werden als typische Beispiele für diese Wirkung angegeben.
Die ¹³C-NMR Daten, abgeleitet von den drei Zink- Xylanpolysulfat-Durchdringungskomplexen 8,5% Zn (DH40G), 83% Zn (DH40J) und 100% (DH40Y), zeigten, daß sich, wenn die Menge an chelatisiertem Zink ansteigt, die Bindung verstärkt. Davon können wir ableiten, daß die Steifigkeit der Konformation der Komplexe in der Reihenfolge DH40G (8,5% Zink) < DH40J (83% Zink) < DH40Y (100% Zink) stieg, und von den biologischen Daten her erscheint es, daß die vollständige Substitution aller Na&spplus; durch Zink zu einer Konformation führen kann, die sehr steif ist.
Als eine Folge davon liefert die Bildung dieser Metallpolysulfatierten Xylankomplexe verwendbare Mittel, ausgewählte Metalle in die Gewebe des Körpers zu transportieren, da im Gegensatz zu bekannten Salzen der polysulfatierten Polysaccharide wie Natrium, Kalium oder Ammonium, die, wenn in Wasser gelöst, in die entsprechenden Ionen dissoziieren, die Komplexe der vorliegenden Erfindung in einem wäßrigen oder physiologischen Medium nicht dissoziieren.
Zink und im geringeren Ausmaße Mg&spplus;&spplus; scheinen aufgrund deren Ionenradii und elektronischen Konfiguration anhand der hier beschriebenen ¹³C-NMR spektroskopischen Studien Positionen in der polysulfatierten Xylankette einzunehmen, welche sehr verschieden zu denen der größeren Ca&spplus;&spplus;, Cu&spplus;&spplus; Atome sind. Die von diesen jeweiligen Komplexen angenommenen Konformationen werden in Fig. 3 (A) und (B) gezeigt, wo offensichtlich ist, daß im Fall des Xylanpolysulfatkomplexes Zink eine Position einnimmt, in der der Sauerstoff der glykosidischen Bindung und die Sauerstoffe der Schwefelsäureester in den 2 und 3' Positionen der benachbarten Ringe damit wirksam Wechselwirkungen haben können. Es sind diese Wechselwirkungen zu mehreren Seiten und die Fähigkeit des Zinks, in den verfügbaren Raum zwischen den Ringen zu passen, was diese Komplexe energetisch günstig und so stabil macht. Bedeutenderweise ist die biologische Aktivität der Zinkkomplexe verschieden von denen der mit anderen Metallen (siehe Abschnitt über biologische Aktivitäten) gebildeten Metallkomplexe.
Die Verbindungen der Erfindung haben besondere Verwendbarkeit bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis und verwandten inflammatorischen Gelenkzuständen als auch bei Krebs und Wundheilung. Bei diesen Verbindungen erwartet man auch, daß sie antiviral sind.
Die Erfinder glauben, daß diese Verwendbarkeit von der Fähigkeit der Verbindungen der Erfindung stammt, die Freisetzung und die Wirkung von Serinproteinasen z. B. der humanen Granulozytenelastase (HGE), dem Plasminogenaktivator und aus Tumor stammende Elastase zu inhibieren. Die Bedeutung dieser Inhibition besteht darin, daß bei Osteo- und rheumatoider Arthritis die Proteoglykane von Gelenkknorpeln aufgrund übermäßigen Abbaus durch Proteinasen verringert sind. Anzumerken ist, daß Proteoglykane der extrazellulären Matrix die Elastizitätseigenschaft verleihen und daher grundlegend für die biomechanische Leistungsfähigkeit dieser Gewebe sind.
In allen Geweben ist die Tumorzellmetastase abhängig von dem Zusammenbruch der extrazellulären Matrix, um Proliferation und Migration der neoplastischen Zellen an andere Orte zu ermöglichen. Eine proliferierende Tumormasse benötigt zum Überleben auch eine gute Blutversorgung, und der Zusammenbruch der Matrix, um eine Durchdringung mit Blutgefäßen zu erlauben, ist auch eine Voraussetzung für die Tumorverbreitung innerhalb des Wirtsgewebes. Tumorzellen und aktivierte Endothelzellen der Blutkapillaren erreichen dieses Ziel durch die Freisetzung von Enzymen, welche direkt und indirekt die extrazelluläre Matrix abbauen können. Von besonderer Bedeutung sind die von Tumorzellen verwendeten Serinproteinasen (so wie der Plasminogenaktivator und elastaseähnliche Enzyme), um vom Blut tranportierte Zymogene z. B. Plasminogen und normale, latente Enzyme von Bindegewebszellen z. B. Metalloproteinasen (Kollagenase, Proteoglykanasen usw.) und Serinproteinasenzymogene zu aktivieren, welche direkt und indirekt die Bestandteile der extrazellulären Matrix abbauen können. Die erfindungsgemäßen Komplexe sind wirksame Inhibitoren der Serinproteinasen, welche von Säugetiertumorzellinien hergestellt werden, und haben somit potentielle Verwendbarkeit als Antikrebs/antimetastatische Mittel.
Zur gleichen Zeit haben die Erfinder gezeigt, daß die Verbindungen der Erfindung weniger wirksame Antikoagulanzien als Xylan in einer unkomplexierten Form sind. Deshalb ist, die mit der Behandlung solcher inflammatorischer Gelenkerkrankungen verbundene Langzeittherapie vorausgesetzt, diese Verringerung der Antikoagulansaktivität von bedeutendem Vorteil.
Außerdem ist gefunden worden, daß die Verbindungen der Erfindung in der Lage sind, die Mitose und DNA-Synthese bei einer Vielzahl von Bindegewebszellinien zu stimulieren (z. B. Fibroblasten, Chondrozyten, Fibrochondrozyten), und sie sind zusammen mit ihrer Fähigkeit, die Biosynthese der Matrixkomponenten (Proteoglykan, Hyaluronat und Kollagen) zu unterstützen, von enormen Vorteil bei der Heilung und Reparatur von geschädigten Geweben. Beispiele für diese verwendbaren biologischen Eigenschaften werden gegeben.

Herstellung von Polysulfatpolysacchariden-Metallkomplexen

Diese werden hergestellt aus polysulfatierten Polysacchariden, welche aus handelsüblichen Quellen erhalten werden können, z. B. die Dextransulfate MG 5000 oder 8000, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., U.S.A., Pentosanpolysulphat (SP54®) Benechemie, Arzneimittel, München F.R.G.
Trockenes, im Handel erhältliches Xylan (aus Lärchenholz oder Haferspelzen, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, U.S.A.), oder aus anderen Quellen isoliert, wie beschrieben bei Whistler und Richards in "Hemicellulose in the Carbohydrates" 2nd Ed. Vol. IIA (1970) Hrsg. Pigman & Horton, Academic Press, wird durch Zugeben zu gekühlter Chlorsulfonsäure in trockenem Pyridin unter schnellem Rühren unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens von Ricketts in Biochem. J. 51, 129-133 (1952) sulfatiert. Die Xylan-Chlorsulfonsäure-Pyridinmischung wurde bei 65ºC für sechs Stunden gehalten, gekühlt und unter heftigem Schütteln auf zerstoßenes Eis gegossen. Eine starke (40% w/v) NaOH-Lösung wurde dann zugegeben, bis die Lösung pH 7 erreichte. Die Lösung wurde filtriert und Ethanol zugegeben, um das rohe, polysulfatierte Xylan als einen Sirup abzuscheiden. Der Sirup wurde abgetrennt, wieder in Wasser gelöst und einer Reihe von Ethanol/Wasser-Ausfällungen unterworfen, um einen fertigen Sirup zu ergeben, der in Wasser gelöst (pH = 2,0) und gegen Wasser dialysiert wurde. Das nicht dialysierbare, salzfreie, polysulfatierte Xylan wurde dann durch Lyophilisation als das Natriumsalz erhalten. Dieses Sulfatierungsverfahren ist im Grunde das, was bei Ricketts (ibid) für die Herstellung der Natriumsalze der Dextranpolysulfate beschrieben ist. Die Fraktionierung der sulfatierten Xylane in die gewünschten molekularen Größen wurde dann durch Lösen des Natriumsalzes in einem Puffer mit hoher Ionenstärke aus 0,5 M NaCl erzielt, und durch Unterwerfen der Lösung einer Gelfiltrationschromographie unter Verwendung einer Sephadex G75 oder Sephacryl G200 Säule. Alternative Fraktionierungsverfahren beinhalten High-performance-liquidchromatography, Membranfiltration oder Hohlfasertechniken z. B. unter Verwendung des Amicon RA 2000 Systems mit einem Ausschlußfilter von 10.000 MG oder Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung des Verfahrens, das bei Doctor und Sauls in Thrombosis Research 30, 573-578 (1983) beschrieben ist.

(B) Umwandlung des sulfatierten Xylans in Metallchelatkomplexe Beispielhafte Herstellung von DH40Y (100% Zinksubstitution, DH40J (83% Substitution) und DH40G (8,5% Substitution)

Verfahren 1

Das Natriumsalz von Xylanpolysulfat (wie oben hergestellt oder als SP54® im Handel erworben) (50,0 Gramm) wurde in 100 ml destiliertem Wasser gelöst und über eine Kationenaustauschersäule, wie Dowex 50W-X2 (20-50 mesh), welche vorher in die saure Form (H&spplus;) überführt worden war, gegeben. Ausreichend Harz wurde verwendet, um einen vollständigen Austausch der Natriumionen des Xylanpolysulfates durch H&spplus; sicherzustellen. Für 50,0 Gramm SP54® waren 500 Gramm Harz ausreichend. Die Fraktionen wurden unter Verwendung einer pH-Elektrode bezüglich des pH und auf sulfatiertes Polysaccharid unter Verwendung des Verfahrens von Farndale, Sayers und Barret in Connective Tissue Research 2, 247-248 (1982) überwacht. Die freie Säure eluierte von der Säule in den ersten 200 ml, diese Fraktionen wurden vereinigt und ein Aliquot durch Neutralisation mit einer äquivalenten molaren Menge eines Zinksalzes direkt in den Zinkkomplex überführt. Unter Verwendung eines basischen Zinksalzes (z. B. Zn-Acetat) kann der Endpunkt dieser Neutralisation auch potentiometrisch bestimmt werden.
Die gemischten Natrium-Zink-Xylanpolysulfatkomplexe (DH40G und DH40J) wurden durch Zugabe der entsprechenden Menge einer Lösung, die die Zn&spplus;&spplus; und Na&spplus; Ionen in den erforderlichen Verhältnissen enthalten, zu der freien Xylanpolysulfatsäure-Lösung erhalten. Wieder wurden die Acetatsalze dieser Metalle verwendet, da die Änderung des pH bei der Neutralisation leichter zu verfolgen war. Jede Kombination von Salzen kann in jedem Verhältnis durch dieses Verfahren hergestellt werden, aber in einigen Fällen fallen die Salze der polysulfatierten Polysaccharide aus. Dieses geschah bei den Ba&spplus;&spplus; und Pb&spplus;&spplus; Komplexen des Xylanpolysulfats und bei Dextranpolysulfaten. Im Gegensatz dazu waren die Zn&spplus;&spplus; Komplexe hochgradig wasserlöslich.

Verfahren 2

Die freie Säureform des Xylanpolysulfats, hergestellt wie in Verfahren 1 beschrieben, wurde über eine Kationenaustauschersäule gegeben (z. B. Dowex 50W-X2 oder Duolite C25), welche für den Austausch in die Kationenform (Zn&spplus;&spplus;, Mg&spplus;&spplus;, Cu&spplus;&spplus;, Ca&spplus;&spplus;) überführt worden war. Der metallsulfatierte Xylankomplex wurde von der Säule mit destilliertem Wasser eluiert und die Fraktionen unter Verwendung des in Verfahren 1 beschriebenen Farndale, Sayers und Barret Verfahrens überwacht.

Verfahren 3

Ein Kationaustauscherharz, erzeugt in der H&spplus; Form, wurde durch Äquilibrieren mit mindestens zwei Bettvolumina des Metallsalzes (z. B. ZnSO&sub4;, CuSO&sub4;, MgSO&sub4;, CaSO&sub4;) in die Metallionenform überführt. Vollständige Überführung wurde erzielt, wenn keine H&spplus; mehr von der Säule eluiert wurden. Nicht ausgetauschte Metallionen wurden dann vollständig von der Säule gewaschen. Bei diesem Schritt ist es wesentlich, sicher zu sein, daß keine freien H&spplus; Formen auf dem Harz verbleiben. Das Natriumsalz der sulfatierten Polysaccharide wurde dann über die Säule gegeben, wobei man die Fraktionen mit destilliertem Wasser eluierte, während man auf polysulfatierte Polysaccharide (Farndale et al ibid) und das Metall unter Verwendung geeigneter Tests (z. B. Cu&spplus;&spplus; spektroskopisch, Zn&spplus;&spplus; durch Atomabsorptionspektroskopie) überwachte. Die Metallopolysulfatierten Polysaccharidkomplexe können dann aus den gesammelten vereinigten Fraktionen durch Lyophilisation oder Ethanolfällung isoliert werden. Jedoch fällt bei dem letzteren Verfahren der benötigte Komplex oft als Öl aus und macht Umrühren und Kühlung erforderlich, damit die Kristallisation induziert wird.

Nachweis der Komplexbildung

(a) Atomabsorptionsspektroskopie

Frühere Analysen des Natriumsalzes von Pentosanpolysulfaten (z. B. SP54®) hatten gezeigt, daß sogar unter erschöpfenden Bedingungen die maximale Sulfatierungssubstitution mit einem Durchschnitt von 1,8 Estern pro sich wiederholender Einheit erhalten wurde. Die Gründe dafür sind unklar, da aber diese Moleküle aus natürlichen Quellen hergestellte polydisperse Systeme sind, kann die Zahl der für die Substitution verfügbaren Hydroxylgruppen unterschiedlich sein. Jedoch ist es für die Zwecke der Analyse üblich, das in der empirischen Formel zu berücksichtigen. So würde die empirische Formel von DH40Y, welche das vollständig substituierte Zink-Xylanpolysulfatderivat war, (C&sub5;H&sub4;O9,2S1,8Zn0,9)n sein, wobei n = 17 ist, wobei man das experimentell bestimmte mittlere Durchschnittsmolekulargewicht (MG) von 5564 erhält.
Wie anhand Tabelle 2 gesehen werden kann, ist der experimentell abgeleitete Zn-Wert von 17,9% in vernünftiger Übereinstimmung mit dem errechneten Wert von 17,2%, wobei man im Gedächtnis haben muß, daß die empirische Formel für diese natürlichen abgeleiteten Polymere weniger genau als für vollständig synthetische Moleküle ist. Die gemischten Salzsysteme (Zn&spplus;&spplus;/Na&spplus;) DH40J und DH40G wurden auf den Zn-Gehalt untersucht und aus diesen Werten die empirische Formel berechnet (siehe Tabelle 2).

(b) Gelfiltrationschromographie

Eine saure gewaschene (um gebundenes Zink zu entfernen) vorkalibrierte Sephadex G25-Säule (20 cm · 0,6 cm) wurde für 24 Stunden mit 50 mM Hepes/NaOH Puffer pH 7,0 äquilibriert. 1 ml einer DH40G-Lösung, hergestellt in dem Elutionspuffer (1,0 mg/ml), wurde auf die Säule mit einer Flußrate von 10 ml/Stunde gegeben. Die gesammelten Fraktionen wurden auf sulfatiertes Xylan unter Verwendung des Farndale Tests, wie beschrieben in Connective Tissue Res. 9, 247-248 (1982), und auf Zink unter Verwendung von Atomabsorptionsspektroskopie überwacht. Wie anhand Fig. 4 offensichtlich ist, eluierte der größte Teil des Zinks in den Leervolumenfraktionen (V&sub0;) der Gelfiltrationssäule, was auch mit dem Absorptionsmaximum an sulfatiertem Xylan, gemessen mit dem Farndale Test, übereinstimmt. Unter den verwendeten Elutionsbedingungen wären nichtassoziierte Zinkionen bei Vt von der Säule eluiert.

(c) NMR Studien

¹³C-NMR Proton entkoppelte Spektren (50,1 MHz) wurden von SP54 und Metallkomplexen in D&sub2;O auf einem Jeol FX-200 FT Spektrometer erhalten. Die Proben wurden als 10%ige (w/v) wäßrige Lösung gelöst. Nur Milli-Q deionisiertes Wasser wurde verwendet, um eine fremde Kationenkontamination der Proben zu Tabelle 2 Zn-Analyse abgeleitet aus Atomabsorptionsspektroskopie Verbindung Untereinheit der empirischen Formel Untereinheit ber. gefunden Substitution siehe unten * Die molekularen Zn/Na-Verhältnisse wurden aus den experimentell abgeleiteten Werten bestimmt.
vermeiden. Lösungen PD = 7,0 enthielten als internen Standard (in einem koaxialen Rohr) Acetonitril. Die Probentemperatur betrug 37ºC, die spektrale Breite 10 KHz und es wurden 16K Datenpunkte verwendet. Die chemische Verschiebung der Ringkohlenstoffatome wurde relativ zum internen Standard bestimmt und wurde als Teile pro Million (ppm) dargestellt. Unterschiede zwischen den Werten der chemischen Verschiebung wurden in Herz-Einheiten ( Hz) ausgedrückt.
Wie anhand Tabelle 3 offensichtlich ist, sind die ¹³C-chemischen Verschiebungen der Kohlenstoffe im Pentosering von SP54®, dem Natriumsalz des Xylanpolysulfats, von denen, die bei divalenten Metallkomplexen erhalten werden, verschieden. Diese Unterschiede wurden bei der Verwendung der Hz Werte, die aus der Differenz zwischen der chemischen Verschiebung eines besonderen Kohlenstoffs in SP54® und dem gleichen Kohlenstoff des Metallkomplexes abgeleitet wurden (Tabelle 4), leichter eingeschätzt. Bei dem vollständig substituierten Zinkkomplex DH40Y kann gesehen werden, daß der größte Anstieg in der Verschiebungsdifferenz ( Hz) bei den Kohlenstoffen 4, 2 und 5 erfolgt, wo Elektronenentschirmung erfolgt. Im Gegensatz dazu werden die Kohlenstoffe 1 und 3 (-ve Verschiebung) relativ zu den gleichen Atomen von SP54® abgeschirmt. Diese Daten zeigen, daß das Zinkatom in DH40Y in einer Position sein muß, die nahe (< 4 Å) den Kohlenstoffatomen 4, 2 und in geringerem Ausmaße 5, aber weiter weg von den Kohlenstoffen 1 und 3 ist. Die Größe dieser Verschiebungen war abhängig von dem Grad an Zinksubstitution in dem Komplex, wo, wie in Tabelle 4 gezeigt, die 83% (DH40J) und 8,5% (DH40G) niedrigere Hz hatten. Aus diesen Ergebnissen können wir schließen, daß, je mehr Stellen in den Pentosanpolysulfatmolekülen mit Zinkatomen besetzt sind, sich die Konformation ändert, wobei die Bindung fester gemacht Tabelle 3 ¹³C-NMR Werte der chemischen Verschiebung (PPM) für Natriumxylanpolyphosphat (SP54®) und einiger divalenter Metallkomplexe Verbindungen Verschiebung des Ringkohlenstoffs Tabelle 4 Änderung der chemischen Verschiebung ( Hz) der Ringkohlenstoff 13C Resonanz von Na Xylanpolysulfat (SP54®) verursacht durch fortschreitende Ersetzung von Na durch Zn. Mg. Ca und Cu Verbindung Δ Hz von Ring C bezogen auf SP54 Achtung: -ve Verschiebung = abgeschirmt + Ve-Verschiebung = entschirmt
wird.
Während der Magnesiumkomplex von Xylanpolysulfat ähnliche Tendenzen in der chemischen Verschiebung zu den Zinkderivaten zeigte, waren die Änderungen weniger ausgeprägt, was anzeigt, daß das "molekulare Passen" und die atomaren Wechselwirkungen weniger wirksam als in dem Zn&spplus;&spplus; Komplex waren.
Unter Verwendung der in Tabelle 4 gezeigten Informationen und Molekülmodellen eines Teils der Xylanpolysulfatkette ist es möglich, vorherzusagen, daß die Stellen höchstwahrscheinlich durch Zink- und Magnesiumatome besetzt sind. Das ist im Diagramm in Fig. 3(A) gezeigt, wo die Elektronendonation der an den 2 und 3' Positionen benachbarter Ringe gebundenen Sulfatsauerstoffe als auch die einsamen Elektronpaare an der 1-4 sauerstoffglykosidischen Bindung und des Pentoseringsauerstoffs alle zur Stabilisierung (Chelatisierung) des Metallkomplexes beitragen.
Auf der anderen Seite waren bei den Calcium und Kupferkomplexen mit Xylanpolysulfat (DH50 und DH80) (Tabelle 4) die Kohlenstoffatome des Pentoserings, welche durch die Metalle beeinflußt wurden, sehr verschieden. Bei diesen Metallkomplexen wurden die Kohlenstoffe 1, 2 und 4 stark abgeschirmt, wohingegen die Kohlenstoffe 3 und 5 entschirmt wurden. Dieses zeigt, daß die Metallatome bei DH50 und DH80 fest in Positionen nahe den Kohlenstoffen 3 und 5 angeordnet sind (gegenüberliegende Positionen relativ zu Zink). Eine solche Situation würde, wie in Fig. 3(B) gezeigt, eintreten, und es wird behauptet, daß in diesen Komplexen die Sulfatester in den Pentosepositionen 2 und 3 des gleichen Ringes als auch Elektronen des glykosidischen Ringsauerstoffs an der Chelatisierung beteiligt sind. Da die Spektren von DH50 und DH80 mit steigender Temperatur schärfer werden, wird geschlossen, daß die Chelierung mit der molekularen Bewegung steigt.
Es ist klar offensichtlich aus den in Tabelle 4 und in Fig. 3 gezeigten Daten, daß die durch multivalente Elemente beim Bilden des Komplexes mit dem sulfatierten Xylan eingenommene Position kritisch von dem Ionenradius des Atomes und seiner Elektronenkonfiguration abhängt. Während die Konformation und Flexibilität des sulfatierten Xylans auch zur Stabilität des Metallkomplexes beiträgt, ist es wichtig, anzumerken, daß die vorliegenden Experimente anzeigen, daß die so gebildeten Chelate insgesamt bevorzugte Konformationen haben können, welche verschieden von denen monovalenter Salze (d. h. Na&spplus;, K&spplus;, NH&sub4;&spplus; usw.) sind.
Es ist diese Konformationsänderung und Darbietung der funktionellen Gruppen für Rezeptorstellen an Enzymen und Zelloberflächen, die die multivalenten Komplexe gegenüber den monovalenten Spezies so unterschiedlich machen. Beispiele solcher Änderungen werden in dem Abschnitt biologischer Aktivität gegeben.
Die Bindungsstärke (Dissoziationskonstante) der Zinkxylanpolysulfatkomplexe DH40Y und DH40J wurden relativ zu Natrium (SP54®) auch mit ¹³C-NMR untersucht (Tabelle 5).
Zugabe von NaCl zu einer Lösung aus SP54® in Wasser verursachte insgesamt eine Verringerung der Werte in der ¹³C chemischen Verschiebung (Tabelle 5). Diese entstehen durch eine Konformationsänderung der Moleküle aufgrund der vergrößerten Flexibilität. Wie in Tabelle 5 gesehen werden kann, erfolgen die dominantesten Änderungen bei 1,25 M NaCl. Im Gegensatz dazu waren die Änderungen in der chemischen Verschiebung bei DH40Y weniger stark durch die NaCl-Zugabe beeinflußt, was eine kleine Konformationsänderung bei Vorhandensein konkurrierender Na&spplus; Ionen anzeigt. Das legt nahe, daß die Zinkionen sogar bei 1,25 M NaCl nicht leicht von ihren Positionen am polysulfatiertem Xylan ersetzt wurden.

Biologische Eigenschaften der polysulfatierten Xylanmetallkomplexe

(A) Inhibition der humanen Granulozytenelastase (HGE) durch Xylanpolysulfatmetallkomplexe

Die Aufgaben dieser Experimente bestanden darin, zu bestimmen:
(1) die relative inhibitorische Aktivität von einigen der hergestellten Metallxylanpolysulfatkomplexe; und
(2) zu zeigen, daß die durch diese Komplexe hervorgerufene inhibitorische Aktivität nicht durch einfaches Mischen verschiedener Anteile von Xylanpolysulfat-Natriumsalz mit Zinkionen (siehe Lukas et al U.S. 4465666, EP 12115) hervorgerufen wird.
Die durchgeführten Experimente waren wie folgt
(a) HGE, hergestellt gemäß dem Verfahren von Andrews et al (Chem. Biological Int. 47, 157, 1983), wurde verwendet, um die synthetischen spezifischen Substrate für dieses Enzym abzubauen
- (Succinyl-Dialanyl-Valyl Nitroanalid (SAAVNA)). Die Inhibition wurde über einen Konzentrationsbereich bestimmt und der Wert der 50% Inhibitionskonstante (IC&sub5;&sub0;) als die Arzneimittelkonzentration (ug/ml) bestimmt, welche eine 50%ige Inhibition von 1,0 ug HGE unter Verwendung eines Puffers aus 0,2 mM Phosphat/0,1% BSA/0,0255 Triton X100/5% DMSO pH 7,4 bei 37ºC hervorruft.
Die Inhibitionskurven der HGE für SP54®, DH40J, und DH40Y sind in Fig. 5 gezeigt. Wie gesehen werden kann, waren beide Zinkkomplexe wirksamer als SP54®. Das galt auch für DH40G. Tabelle 5 Einfluß von Natriumchlorid auf die Änderung in den Werten (Δ Hz) der ¹³C-chemischen Verschiebung für die Ringkohlenstoffe von Natriumxylanpolyphosphat (SP54®) und Xylanpolyphosphat- Zink-Komplexen (DH40-Serien) Verbindungen Ringkohlenstoff Molarität von NaCl
Jedoch waren die Cu (DH80), Mg (DH70) und Ca (DH50) Xylanpolysulfatkkomplexe von ähnlicher Wirkung wie SP54® (Tabelle 6).
Dieses legt nahe, daß die von den Zinkxylanpolysulfat Komplexen eingenommene Konformation in der Lage war, wirksamer mit HGE Wechselwirkungen zu machen als SP54®. Von DH40J wurde gefunden, daß es der wirksamste HGE Inhibitor ist (Tabelle 6).

(b) Inhibitorische Wirksamkeit von DH40J Xylanpolysulfat (SP54®) Zinksulfat (ZnSO&sub1;) und Mischungen von (SP54® + ZnSO&sub1;) auf HGE

In diesen Experimenten wurde die inhibitorische Aktivität von DH40J, PPS als SP54® und ZnSO&sub4; und Mischungen von SP54® und ZnSO&sub4; in verschiedenen Verhältnissen gegen HGE unter Anlegen der gleichen Bedingung wie in (a)untersucht, ausgenommen daß eine andere Enzympräparation verwendet wurde. Wie in Fig. 6 gesehen werden kann, war DH40J über den Konzentrationsbereich von 0,03 ug bis 1,0 ug ein wirksamerer Inhibitor als PPS und PPS + Zn&spplus;&spplus;, gemischt in den Verhältnissen von 1 : 0,18, welches das ungefähre Verhältnis dieser Verbindungen in DH40J ist. Eine Vielzahl von Zn&spplus;&spplus;- zu SP54®-Verhältnissen wurde auf deren Fähigkeit getestet, die HGE zu inhibieren.
Wie anhand Tabelle 7 offensichtlich ist, war die HGE Inhibition bei allen untersuchten Verhältnissen in dem Bereich von 1 : 0,1 bis 1 : 1 zu der von SP54® allein nicht wesentlich verschieden und in keinem der Beispiele mit der durch DH40J hervorgerufenen inhibitorischen Wirkung vergleichbar. Tabelle 6 DER EINFLUSS DER KATIONENCHELATBILDUNG VON XYLANPOLYSULFAT (SP54) AUF DIE INHIBIERUNG DER HUMANEN GRANULOZYTENELASTASE (HGB) Kode Kation Kommentar Substitution unlöslich * Die HGE-Inhibition wird als die Inhibitorkonzentration (ug/ml) ausgedrückt, die eine 50% Inhibition von 1 ug HGE/ml ergibt, unter Verwendung von 0,2 mM SAAVNA als Substrat in 50 mM Phosphat/0,1% BSA/0,0255 Triton X100/5% DMSO pH 7,4 bei 37ºC # DH40(J) ist der wirkungsvollste HGE-Inhibitor Tabelle 7 WIRKUNG VON DH40 SP54 ZINKSULFAT UND SP54 + ZINKSULFAT AUF DIE INHIBIERUNG DER HUMANEN GRANULOZYTENELASTASE INHIBITOR VERHÄLTNIS SP54: Zinkionen im Gewicht % Unterschied zu SP54

(B) Wirkungen von Xylanpolysulfatmetallkomplexen auf die Blutgerinnungswege

Xylanpolysulfat (SP54®) ist ein wirksamer Inhibitor der Gerinnung und wird im Handel als ein "synthetisches Heparin", d. h. ein Heparinoid, verkauft. Ein Hauptziel der vorliegenden Untersuchungen war es, die Konformation des polysulfatierten Xylans zu ändern, um die Antikoagulansfähigkeit dieser Makromoleküle zu verringern, aber deren andere biologischen Eigenschaften zu erhalten. Wie aus Fig. 7 offensichtlich ist, wurde dieses erfolgreich durch das zinkpolysulfatierte Xylan erzielt, dargestellt durch die DH40 Reihen, wo fortschreitende Ersetzung von Na&spplus; durch Zink, um den Komplex zu bilden, die Antikoagulansaktivität verringerte. Da die Kalium- (DH50) und Kupfer (DH80) Xylanpolysulfatkomplexe gleich wirksam wie die unsubstituierten Ausgangsnatriumsalze waren, muß angenommen werden, daß die von den Ca&spplus;&spplus; und Cu&spplus;&spplus; Komplexen (siehe Fig. 8) eingenommene Komformation doch in der Lage war, mit Serinproteinasen der Gerinnungskaskade Wechselwirkungen zu machen.
Um zu bestätigen, daß die in den polysulfatierten Xylanen hervorgerufene einzigartige biologische Aktivität aufgrund der synthetisierten Verbindungen existierte und nicht durch einfaches Mischen von Zn&spplus;&spplus; und einem polysulfatierten Xylan in Lösung reproduziert werden konnte, wurden verschiedene Mischungen hergestellt und als Antikoagulans getestet. Wie in Fig. 9A gesehen werden kann, zeigten DH40J und DH40Y, bezogen auf SP54, eine verringerte Koagulansaktivität, bestimmt als die Prothrombinzeit unter Verwendung von normalem humanem Plasma. Signifikanterweise waren Lösungen, hergestellt in den gleichen Verhältnissen aus Zn&spplus;&spplus; und SP54 wie DH40J (0,176 : 1) und DH40Y (0,22 : 1), ähnlich dem SP54, aber sehr verschieden von DH40J und DH40Y. Ähnliche Ergebnisse wurden für die entsprechenden Zink-Dextranpolysulfatkomplexe (siehe Fig. 9B) erhalten.

(C) Wirkungen von DH40G auf den IL-1 vermittelten Abbau von Knorpel in vitro (Fig. 10 und 11)

Fell und Jubb [Arthritis & Rheum. 20, 1359, (1977)], die Kokulturen von Knorpel und synovialen Gewebeexplantaten verwendeten, waren die ersten, die berichten, daß ein Faktor aus dem Synovium Chondrozyten anregte, ihre eigene Knorpelmatrix abzubauen. Dieser Faktor wurde "Catabolin" genannt und wurde danach von Saklavala und Mitarbeitern gereinigt [Biochem. J. 199, 705, (1981)] und man zeigte, daß er zu der Interleukin-1 oder IL-1 Familie der Monokine gehört. Es ist auch gezeigt worden, daß die synovialen Zellen vom Typ A der synovialen Linie bona fide Makrophagen sind. Es ist leicht, sich Ereignisse oder eine Situation vorzustellen, die im Gelenk entsteht, bei der die synovialen Zellen des Gelenkes sogar nur geringfügig stimuliert werden können, um IL-1 zu produzieren. Interleukin-1 ist in der Synovialflüssigkeit von entzündeten Gelenken gefunden worden. Eine über die normalen Level geringfügige, den Knorpel durchströmende Ausschüttung von IL-1 könnte daher mit der Zeit zu einer Störung des Gelenkknorpelmetabolismuses und den Verlust von PGs als einem früh auftretenden Ereignis in der Matrix führen. Dieses könnte letztendlich zu einem erodierten und degenerierten Knorpel und der klassischen Pathologie von Osteoarthritis führen.
Deshalb wurde ein in vitro Modell auf der Annahme entwickelt, daß IL-1 vermittelte Autolyse von Gelenkknorpel ein wichtiger Bestandteil der Pathologie von Osteoarthritis war.
Schnitte eines in vivo mit ³&sup5;SO&sub4; vormarkierten Kaninchengelenkknorpels wurden mit einfach aus dem Peritoneum erhaltenen Macrophagen kokultiviert. Die Makrophagen produzieren IL-1, welches die Chondrozyten stimuliert, ihre Matrix abzubauen und ³&sup5;SO&sub4; markierte GAGs in das Kulturmedium freizusetzen. Potentielle antiarthritische Arzneimittel so wie das DH40 wurden unter Verwendung dieses Modells auf jede Neigung getestet, die IL-1 vermittelte Knorpeldegeneration zu inhibieren. Fig. 10 erläutert das Prinzip des verwendeten Verfahrens.

Verfahren

Weißen Neuseeland-Kaninchen, 6-8 Wochen alt, wurden eine Woche vor Tötung intramuskulär 3 mCi H&sub2; ³&sup5;SO&sub4; injiziert. Ähnlichen Tieren wurden 48 Stunden vor Tötung intraperitoneal 25 ml Thioglykolatmedium injiziert, um Makrophagen anzusammeln. In einem typischen Experiment wurde der Knorpelspender getötet und Knorpel aus dem Kniegelenk einschließlich der Patella mit einer #11 Skalpellklinge herausgeschnitten. Die erhaltenen Explantate, die in der Größe unterschiedlich waren, wurden für drei Tage in 10% FCS-haltigem Hams F12 Medium kultiviert. Die Explantate wurden dann zweimal mit serumfreien Medium gewaschen und einzeln in Kavitäten von 24 Kavitätenzellkulturplatten überführt. Am gleichen Tag wurde der Makrophagenspender getötet, und die Makrophagen durch peritoneales Waschen und Zentrifugation gesammelt. Die Testverbindungen wurden zu den geeigneten Kavitäten zugegeben und schließlich wurden 5 · 10&sup4; Makrophagen pro Kavität zugegeben. Das Endvolumen waren 250 ul serumfreies Hams F12 Medium pro Kavität. Nach drei Tagen Inkubation wurden die Kulturen beendet. Die Überstände wurden gesammelt und die Kavitäten mit 200 ul Saline gespült, welche zu dem Überstand zugegeben wurde. Die Zählereignisse pro Minute von ³&sup5;SO&sub4; markierten Proteoglykanen stellten in diesen Proben den PG Verlust aus der Knorpelmatrix aufgrund von Abbau dar. Die Explantate selbst wurden durch Papainverdauung solubilisiert und von jedem wurde ein Aliquot durchgezählt, um die nicht abgebauten, noch in der Knorpelmatrix verbliebenen PGs zu messen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse eines typischen Experimentes sind in Fig. 11 gezeigt, wo gesehen werden kann, daß DH40 wirksam bei dem Supprimieren des IL-1 vermittelten PG-Verlustes aus dem Gelenkknorpel war, wenn entweder direkt verwendet (Makrophagen konditioniertes Medium, MCM) oder wenn mit peritonealen Exsudatzellen (PEC) kokultiviert.

(D) Studien der relativen Wirkungen von DH40G und Xylanpolysulfat (SP54) auf den Verlust von Proteoglykanen aus Knorpel in einem experimentellen Arthritismodell Einführung

Dieses Modell wurde ursprünglich von Sin, M.Y., et al J. Path. 142, 23 (1984) und Sedgwick A.D. et al Ann. Rheum. Dis. 43, 418 (1984) beschrieben und stellt ein bequemes und repoduzierbares Verfahren zum Bewerten der Wirkungen von Arzneimittel auf den Knorpelmetabolismus in vitro dar. Dieses Modell wurde verwendet, um den Einfluß von SP54® und DH40J, wenn in die Lufttasche der Ratte mit 10 mg/kg gegeben, auf den durch einen Einstrom inflammatorischer Zellen der Tasche induzierten Verlust von Knorpelproteoglykanen (PGs) zu untersuchen.

Materialien und Verfahren

Die Lufttaschen wurden auf dem Rücken von 200 gm Wistarratten durch die anfängliche Injektion von 20 ml steriler Luft erzeugt. Die Reinjektion an jedem zweiten Tag erhielt die Höhlenaufblähung. Die aseptisch aus den Kniegelenken von 10 Wochen alten weißen Neuseeland-Kaninchen entnommenen Gelenkknorpel (AC) wurden in die gebildeten 7 Tage alten Lufttaschen der Ratte implantiert. Die in Saline verdünnten Arzneimittel (10 mg/kg) wurden, beginnend an dem Tag der Knorpelimplantation, täglich in die Lufttaschen gegeben. An eine Kontrollgruppe wurde Saline verabreicht. Die Entzündung der Lufttaschen wurde, beginnend mit dem Tag der Knorpelimplantation, durch Injektion von 10 ml sterilem 3% Pepton an jedem zweiten Tag in die Tasche erzielt. Die Tiere wurden 7 Tage später getötet und Lufttaschenflüssigkeit (APF) und AC wurden für die Analyse gesammelt. Die Zellen in der APF wurden mit Kristallviolett gefärbt und eine Gesamtzellenzahl bestimmt. Eine differenzielle Zellzählung wurde durch Zytozentrifugation und Anfärben mit Giemsa durchgeführt. Implantierte AC (8-10 mgs) wurden mit Papain verdaut und der PG-Gehalt wurde durch Analyse auf Hexuronsäure und sulfatiertes Glykosaminoglykan GAG) bestimmt. PGs in den verbliebenen AC wurden mit 4M GuHCl mit Proteaseenzyminhibitoren extrahiert. Die Extrahierbarkeit von PGs und deren Fähigkeit, mit exogener Hyaluronsäure (HA) 20%) zu aggregieren, wurde durch Chromatographie über Sepharose CL-2B bestimmt. Ein Teil der AC Oberfläche wurde nach einer Dehydrierung der Probe in p.a. Aceton, Trocknen am kritischen Punkt und Goldbeschichtung mittels S.E.M. untersucht.

Ergebnisse

Sowohl SP54® als auch DH40G schienen gleich wirksam zu sein, den Verlust von Proteoglykanen implantierter Gelenkknorpel bei diesem Taschenmodell zu verhindern. Vor kurzem jedoch wurde gefunden, daß der von DH40G verhinderte Verlust von Proteoglykanen (PGs) (gemessen über Uronsäure) (Fig. 12), die PG-Extrahierbarkeit (Fig. 13) und die Aggregation (Fig. 14) von in die Tasche implantiertem Knorpel, wo die Zahl an inflammatorischen Zellen hoch war, erhielt.
Einige Hinweise auf die Wirkungsmechanismen dieser Arzneimittel wurden durch die histologische Untersuchung von aus der Tasche entfernten Knorpeln gegeben. Es wurde gefunden, daß die Zahl der an den Knorpel von Arzneimittel behandelten Proben adhärierenden inflammatorischen Zellen bedeutend weniger als bei Kontrollknorpeln war. Da die Enzyme und Mediatoren der Knorpelzerstörung von den inflammatorischen Zellen in den Knorpel freigesetzt werden, muß die Verminderung ihrer Zahl an der Knorpeloberfläche als eine direkt vorteilhafte Wirkung betrachtet werden.

(E) Wirkungen von Xylanpolysulfat (PPS) DH40J, ZnSO&sub4; und ZnSO&sub4; + PPS auf die DNA Synthese einer humanen synovialen Fibroblastenlinie in vitro

Die Reparatur des Bindegewebes einschließlich des Knorpels bei Osteoarthritis (OA) erfordert DNA Synthese und die Proliferation (Mitose) von Zellen in der Gewebematrix. Viele nichtsteroidale antiinflammatorische Arzneimittel (NSAIDs) und Kortikosteroide supprimieren diesen wichtigen zellulären Vorgang und können die Genesung beeinträchtigen. Bei der Komplexierung des Xylanpolysulfats mit den multivalenten Metallen wurde gefunden, daß es die DNA Synthese über einen sehr niedrigen Konzentrationsbereich der Arzneimittel stimuliert.
Wie aus Fig. 15 offensichtlich ist, stimulierte DH40J bei Konzentrationen bis zu 100 ug/ml die in vitro Biosynthese von DNA in aus OA Gelenken stammenden synovialen Fibroblasten in einem größeren Ausmaße als Xylanpolysulfat (SP54®). Außerdem konnten, wie in allen anderen Experimenten versucht, Lösungen, die Zinkionen und das Xylanpolysulfat in Anteilen, die denen vergleichbar sind, die in den hergestellten polysulfatierten Metallkomplexen vorliegen, enthalten, diese starke Wirkung auf die zelluläre makromolekulare Synthese nicht reproduzieren.

(F) Wirkungen von SP54®, DH40J und DH40Y auf die Proteoglykanbiosynthese von Kaninchengelenkchondrozyten

Wie oben diskutiert, wird in chronischer OA und verwandten Zuständen die extrazelluläre Matrix einem übermäßigen Katabolismus unterworfen. Gewebezellen müssen replizieren und neue Matrix produzieren, um zu überleben und die Funktion zu erhalten. Während viele Arzneimittel einschließlich antiinflammatorischer Mittel diesen Vorgang supprimieren können, ist es bekannt (Burkhardt & Gosh Seminars in Arthritis & Rheumatism 17, Suppl. 1 3-34, 1987), daß die polysulfatierten Polysaccharide das nicht tun. Es war daher von einigem Interesse, herauszufinden, daß die Metallkomplexe dieser Arzneimittelklasse wirksamere Stimulatoren der Proteoglykansynthese als das Natriumsalz sind. Die Ergebnisse für SP54® DH40J und DH40Y werden in einem Beispiel gezeigt (siehe Fig. 16).

Die Verwendung von Xylanpolysulfat und des Metallxylanpolysulfats in Kombination mit Kortikosteroiden. um die inhibitorischen Wirkungen der letzteren auf die Zellmitose und makromolekulare Biosynthese aufzuheben

Von Kortikosteroiden ist bekannt, daß sie die Mitose von Bindegewebszellen und die Biosynthese von Matrixkomponenten, z. B. von Kollagen, Proteoglykanen und Hyaluronsäure (HA) supprimieren. Diese Makromoleküle sind wesentlich für die normalen körperlichen Funktionen und die Gesundheit.
In dieser Studie wurde gezeigt, daß SP54® und in einem größerem Ausmaße DH40J die schädlichen Wirkungen von Hydrokortison auf die Biosynthese von Hyaluronsäure (HA) synovialer Fibroblasten in vitro verhindern konnten. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Figuren zusammengefaßt.
Fig. 17 - zeigt, daß mit steigender Konzentration an Hydrokortison die HA Biosynthese fortschreitend inhibiert wird. Fig. 18 - zeigt die Konzentrationswirkungen von DH40J auf die HA Biosynthese durch synoviale Fibroblasten.
Fig. 19 - zeigt die partielle Wiederherstellung der HA Synthese durch synoviale Fibroblasten durch SP54, wenn die Zellen 10&supmin;&sup6; M Hydrokortison ausgesetzt werden.
Fig. 20 - zeigt die vollständige Wiederherstellung auf die Kontrollwerte, hervorgerufen durch SP54, wenn die verwendete Konzentration an Hydrokortison auf 1 · 10&supmin;&sup8; M reduziert wurde.
Fig. 21 - wie in Fig. 22, aber das DH40J anstelle von 10&supmin;&sup6;M Hydrokortison verwendet wurde.
Fig. 22 - wie Fig. 22, aber das DH40 anstelle von 10&supmin;&sup8; M Hydrokortison verwendet wurde.
Obwohl Bezug auf die Verwendbarkeit der Verbindungen der Erfindung zum Behandeln von Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis genommen worden ist, können andere Krankheitszustände nützlich behandelt werden, eingeschlossen Bursitis, Tendinitis, Tendovaginitis und verwandte Entzündungen von Weichgewebe; Wunden und das Heilen von Verbrennungen; Hautreparatur, Akne und andere dermatologische akute Fehlfunktionen; örtliche Anwendung für oberflächliche Thrombose, Hämatome, Ulcus Crusis, Erweichen von Narben; örtlich antiviral und Pancreatitis, Emphysem und bakterieller Einstrom, wo vermehrt proteolytische Aktivität auftritt.

Claims

1. Ein Multivalentes-Metallion-Komplex eines polysulfatierten Xylans, worin das multivalente Ion ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Ca²&spplus;, Mg²&spplus;, Cu²&spplus; und Zn²&spplus;;

worin, auf einer molaren Basis, die Substitution monovalenter Ionen durch das multivalente Metallion im Bereich von 1-100% liegt; und

worin der Multivalentes-Metallion-Komplex des polysulfatierten Xylans erhältlich ist durch das Verfahren, das die essentiellen Schritte umfaßt von:

a) Behandeln des Xylans mit Chlorsulfonsäure in trockenem Pyridin;

b) Gießen der Reaktionsmischung auf Eis;

c) Neutralisieren der erhaltenen Lösung mit Alkalimetallhydroxid;

d) Ausfällen des rohen polysulfatierten Xylans als einen Sirup durch die Zugabe von Ethanol;

e) Abtrennen des polysulfatierten Xylans und Wiederauflösen des abgetrennten polysulfatierten Xylans in Wasser;

f) Unterwerfen der erhaltenen Lösung einer Serie von Ethanol/Wasser-Ausfäll/Wiederauflöseschritten entsprechend den Schritten d) und e);

g) Dialysieren der Lösung des polysulfatierten Xylans gegen Wasser, um ein nicht dialysierbares, salzfreies polysulfatiertes Xylan zu erhalten;

h) Bilden eines monovalenten Salzes davon durch Lyophilisierung, wobei das monovalente Salz das Natriumsalz, Kaliumsalz oder Ammoniumsalz ist, und

i) Umwandeln des monovalenten Salzes des polysulfatierten Xylans von Stufe h) in den Multivalentes-Metallion-Komplex des polysulfatierten Xylans durch ein Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

I) Durchfließenlassen einer Lösung des monovalenten Salzes des polysulfatierten Xylans von Stufe h) durch eine Kationenaustauschersäule, um das polysulfatierte Xylan in seine Säureform umzuwandeln, und Neutralisieren der Säureform des polysulfatierten Xylans durch Zugabe einer Lösung des multivalenten Metallsalzes zu einer Lösung davon;

II) Durchfließenlassen einer Lösung des monovalenten Salzes des polysulfatierten Xylans von Stufe h) durch eine Kationenaustauschersäule, um das polysulfatierte Xylan in seine Säureform umzuwandeln, und Durchfließenlassen der Lösung der Säureform des polysulfatierten Xylans durch eine Kationenaustauschersäule, die in die kationische Form des multivalenten Metalls umgewandelt worden ist; und

III) Durchfließenlassen einer Lösung des monovalenten Salzes des polysulfatierten Xylans von Stufe h) durch eine Kationenaustauschersäule, die in die kationische Form des multivalenten Metalls umgewandelt worden ist.

2. Ein Komplex wie in Anspruch 1 beansprucht, worin das multivalente Ion aus Ca²&spplus; und Zn²&spplus; ausgewählt wird.

3. Ein komplex wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, worin das monovalente Salz des polysulfatierten Xylans polymeres 1 : 4-β-D-xylopyranose-2 : 1-(4-O-methyl-α-glucuronyl)-polysulfatester- Natriumsalz ist und ein Durchschnittsmolekulargewicht von 6.000 Dalton und einen Schwefelgehalt von etwa 16% besitzt.

4. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Arthritis und verwandten inflammatorischen oder degenerativen Gelenkerkrankungen.

5. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Behandeln von Arthritis und verwandten inflammatorischen oder degenerativen Gelenkerkrankungen, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und einen Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

6. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Tumoren.

7. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Virusinfektionen.