DE69530933T2

DE69530933T2 - Verwendung von 5-(tetradecyloxy)-2-furan carbonsäure für die behandlung von alzheimer krankheit oder psychosis

Info

Publication number: DE69530933T2
Application number: DE69530933T
Authority: DE
Inventors: Eitan Friedman; Katharine M. Holloway; A. Gideon RODAN; Azriel Schmidt; L. Robert VOGEL
Original assignee: PENNSYLVANIA MED COLLEGE; Merck and Co Inc; Medical College of Pennsylvania
Current assignee: PENNSYLVANIA MED COLLEGE; Merck and Co Inc; Medical College of Pennsylvania
Priority date: 1994-10-27
Filing date: 1995-10-24
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2015-10-25
Also published as: JP3881011B2; WO1996013257A1; JPH10509139A; CA2200886A1; US5607967A; AU3970095A; EP0786995A4; ES2198447T3; DE69530933D1; EP0786995A1; EP0786995B1; ATE241354T1; AU705987B2

Description

Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist das Ergebnis eines Verfahrens zur Auffindung von Potentiatoren von Rezeptoren unter Anwendung eines Screening-Verfahrens, bei welchem der neue rekombinante Human-Stereoidhormon-Rezeptor verwendet wird, der im folgenden NER genannt wird. Die Verbindung TOFA (5-(Tetradecyloxy)-2-furancarbonsäure) wurde mit dem obigen Screening-Verfahren unter Einsatz von NER befunden, ein Potentiator von Liganden für andere Rezeptoren, insbesondere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, zu sein, ohne irgendeine unabhängige Wirkung auf die Rezeptoren zu haben.
Verbindungen, welche den NER-Rezeptor aktivieren, wie z. B. TOFA, potenzieren die Wirkungen von Nervenwachstumsfaktor (NGF) und können zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit und einer Psychose, insbesondere Schizophrenie, geeignet sein. Ferner sind Verbindungen, welche den NER-Rezeptor aktivieren, auch zur Potenzierung der Wirkungen von Dopamin-D1-Antagonisten bei der Behandlung von Psychosen, insbesondere Schizophrenie, und bei der Behandlung von Bewegungsstörungen, wie z. B. Dystonie, Dyskinesia tarda und Gilles-de-la-Tourette-Syndrom, von Nutzen.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung funktioneller Liganden des NER-Rezeptors.
Hintergrund der Erfindung
Retinoide, Steroid- und Schilddrüsenhormone und möglicherweise andere Moleküle entfalten ihre biologischen Wirkungen durch Bindung an Proteine der Steroid-Rezeptor-Superfamilie. Diese Rezeptoren wechselwirken mit spezifischen DNA-Sequenzen und modulieren die Genexpression (hinsichtlich Überblicke siehe J. M. Berg, Cell 57: 1065–1068 (1989); R. M. Evans, Science 240: 899–895 (1988); M. Beato, Cell 56: 335–344 (1989)). Sequenzanalyse und funktionelle Studien dieser Rezeptoren offenbarten zwei wichtige Regionen, welche einen hohen Konservierungsgrad von Aminosäureresten aufweisen. Das höchste Maß an Ähnlichkeit unter den Rezeptoren wird in einer Region gefunden, welche 9 Cysteinreste enthält, die Zinkatome binden, um zwei „Zinkfinger" zu bilden, welche mit den zugehörigen Stereoid-Responseelementen von DNA wechselwirken (J. Miller et al., EMBO J. 4: 1609–1614 (1985); R. M. Evans, Cell 52: 1–3 81988)). Die zweite Region, welche weniger konserviert ist, ist die ligandenbindende Domäne, die für die Wechselwirkung mit dem Hormon verantwortlich ist. (J. Carlstedt-Duke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4260– 4264 (1982); J. Carlstedt-Duke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4437–4440 (1987)). Kürzliche Studien haben anderen Domänen dieser Rezeptoren weitere Funktionen zugeschrieben, wie z. B. Protein-Protein-Wechselwirkung, welche eine Rolle bei der transkriptionalen Regulation spielt (R. Scule et al., Cell 62: 1217–1226 (1990); H.F. Yang, Cell 62: 1205–1215 (1990); J. M. Holloway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8160–8164 (1990)). Die Aminosäurekonservierung in der DNA-bindenden Domäne führte zur Identifizierung neuer Mitglieder der Steroid-Rezeptor-Superfamilie.
Beispielsweise wurden hER1 und hER2 durch niedrig-stringente Hybridisierung von cDNA-Banken mit einer DNA-Sonde, die für die DNA-bindende Domäne des Estrogen-Rezeptors kodiert, kloniert (Giguere et al., Nature 331: 91–94 (1988)). Ähnliche Vorgehensweisen führten zur Entdeckung der Retinsäure-Rezeptoren und des Peroxisom-Proliferator-Aktivator-Rezeptors (PPAR) (I. Issemann et al., Nature 347: 645–650 (1990); D. J. Mangelsdorf et al., Nature 345: 224–229 (1990)). Kürzlich wurden drei neue Mitglieder der Kernhormon-Rezeptor-Superfamilie von Xenopus offenbart (C. Dreyer, Cell 68: 879–887 (1992)). Ferner offenbart das US-Patent Nr. 4,981,784 von Evans et al. die Identifizierung eines Retinsäure-Rezeptors und die Verwendung chimärer Konstrukte, um Hybridrezeptoren zur Identifizierung neuer Liganden herzustellen. Jedoch offenbaren die obigen Referenzen die vorliegende Erfindung weder noch legen sie diese nahe.
TOFA (5-(Tetradecyloxy)-2-furancarbonsäure)
Von TOFA (5-Tetradecyloxy)-2-furancarbonsäure) wurde berichtet, daß sie die Fettsäuresynthese durch Inhibierung der Acetyl-CoA-Carboxylase, des geschwindigkeitsbestimmenden Schritts bei der de novo-Fettsäuresynthese, in vivo in hohen Dosen, d. h. 0,15% der Diät, hemmt (Siehe z. B. Arbeeny, „Inhibition of fatty acid synthesis decreases renal low density lipoprotein secretion in the hamster", J. Lipid Res. 33: 843–851, (1992); Ribeneau-Gyon und Gilles, FEBS Lett. 62: 309–312, (1976); Halvorson und McCune, „Inhibition of fatty acid synthesis in isolated adipocytes by 5-(tetradecyloxy)-2-furoric acid," Lipids 19(11): 851– 856, (1984); Otte et al., „Reciprocal effects of 5-(tetradecyloxy)-2-fuoric acid on fatty acid oxidation," Arch. Biochem. Biophys. 242(1): 23–31, (1985); Parker et al., „5-(tetradecyloxy)-2- furancarboxylic acid und related hypolipidemic fatty acid-like alkyloxyarylcarboxylic acids," J. Med. Chem. 20: 781–791, 1977). Die vorliegende Erfindung umfaßt in einer Ausführungsform die Verwendung von niedrig-dosierter TOFA, um die Aktivität von Liganden G-gekoppelter Rezeptoren zu potenzieren und die Aktivität von endogen gebildeten Hormonen oder Neurotransmittern zu potenzieren.
Powell et al. („Dopamin activation of an orphan of the steroid receptor family", Science 252: 1546–48, (1991), und „Dopaminergic and ligand independent activation of steroid hormone receptors", Science 254: 1636–39, (1991)) berichteten, daß Dopamin die durch Steroidhormon-Rezeptoren vermittelte Transkription durch einen ligandenunabhängigen Mechanismus aktiviert. Jedoch haben TOFA und Aktivatoren von NER im Gegensatz zu Dopamin nicht selbst eine dopaminerge Aktivität bei dem eingesetzten Dosierungsniveau.
Dopamin-Rezeptoren sind Membranproteine, die sieben Transmembrandomänen aufweisen und die Transmembran-Signalübertragung über die heterotrimeren G-Proteine vermitteln. Die Rezeptoren sind hauptsächlich im Zentralnervensystem lokalisiert, jedoch sprechen periphere Organe, wie z. B. die Niere, untere Speiseröhre und Arterien des Herzens und Mesenteriums ebenfalls über spezifische Bindungsstellen auf Dopamin an (Strange, „Dopamine receptors: structure and function", Prog. Brain Res., 99: 167–79, 1993; Strange, „New insights into dopamine receptors in the central nervous system," Neurochem. Int. 22(3): 223–236, 1993). Eine molekulare Klonierung offenbarte, daß diese Rezeptorfamilie aus 5 Genen, D1–D5, besteht, welche die Aktivität von Adenylatcyclase modulieren. Die D1- und D5-Dopamin-Rezeptoren stimulieren die Adenylatcyclase-Aktivität, während die D2-, D3- und D4-Rezeptoren dieses Enzym inhibieren (Seeman und Van-Tol, „Dopamine receptor pharmacology," Curr. Opin. Neurol. Neurosurg. 6(4): 602–608, 1993; Kebabian, „Multiple dopamine receptors and their implications in medicine", Curr. Opin. Neurol. Neurosurg. 5(4): 514–518, 1992; Kebabian, „Brain dopamine receptors: 20 years of progress", Neurochem. Res. 18(1): 101–104, 1993; Sibley et al., „Molecular neurobiology of dopaminergic receptors", Int. Rev. Neurobiol. 35: 391–415, 1993.)
Dopaminerge Agentien und deren Antagonisten dienen zur Behandlung von Bewegungsstörungen, anderen neuropsychiatrischen Störungen, Übelkeit und bestimmten Hormonstörungen.
Dopamin-D1-Rezeptoren sind an Adenylatcyclase gekoppelt. Bekannte Dopamin-D1-Antagonisten umfassen SCH23390 (8-Chlor-2,3,4,5-tetrahydro-3-methyl-5-phenyl-1H-3-benzazepin-7-ol-hemimaleat):
Dopamin-D1-Antagonisten haben eine Rolle bei der Behandlung von Alzheimer-Krankheit demonstriert. Bei dem Test mit einem radial verzweigten Labyrinth, einem Assay, der zum Testen von gedächtnisstärkenden Mitteln verwendet wird, ergeben Läsionen des mittleren cholinergen Signalwegs Hinweise auf Gedächtnisverlust und eine chronische Behandlung mit SCH23390 stellte die läsions-induziert beeinträchtigte Leistung wieder her (McGurk et al. „Dopaminergic drugs reverse the impairment of radial-arm maze performance caused by lesions involving the cholinergic medial pathway," Neuroscience, 50(1): 129–135, 1992).
Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonisten eignen sich auch zur Behandlung von Bewegungsstörungen, wie z. B. Gilles-de-la-Tourette-Syndrom, Dystonie und Dyskinesia tarda. Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonisten eignen sich auch zur Behandlung von Psychosen, insbesondere Schizophrenie.
Das Gilles-de-la-Tourette-Syndrom oder hereditäre Krankheitsbild multipler Tics beginnt in der Kindheit mit einfachen Tics, schreitet jedoch zu multiplen komplexen Bewegungen, einschließlich respiratorischer und stimmlicher Tics, fort. Bei 50% der Patienten tritt Coprolalie, unfreiwillige Äußerung von Fäkalausdrücken, auf. Die Tics und Coprolalie können schwer genug sein, um eine physische und soziale Behinderung darzustellen. Das Gilles-de-la-Tourette-Syndrom wird im allgemeinen mit Haloperidol, 0,5 bis 40 mg/Tag, behandelt. Die Dosis an Haloperidol ist durch Nebenwirkungen wie Dysphonie, Parkinsonismus und Akathisie begrenzt. Clonidin, 0,1 bis 0,6 mg/Tag, kann ebenfalls bei einigen Patienten wirksam sein, wird jedoch durch die Nebenwirkung von Hypotonie beschränkt. Die vorliegende Erfindung erlaubt durch Potenzierung der Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonisten die Behandlung des Gilles-de-la-Tourette-Syndroms mit einer verringerten Verabreichung von Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonisten.
Dystonie ist gekennzeichnet durch anhaltende anomale Körperhaltungen und Unterbrechungen einer stattfindenden Bewegung, die sich aus Änderungen des Muskeltonus ergibt. Dystonie wird im allgemeinen mit hoch dosierten Anticholinergika, wie z. B. Trihexyphenidyl, 6 bis 30 mg/Tag, Benztropin, 3 bis 14 mg/Tag, und Reserpin, einem dopamin-entziehenden Arzneimittel, 0,1 bis 0,6 mg/Tag, behandelt.
Dyskinesia tarda ist gekennzeichnet durch choreaähnliche Bewegungen der buccal-lingualfacialen Muskeln, weniger häufig der Extremitäten. Selten ist eine fokale oder sogar allgemeine Dystonie zu beobachten. Dyskinesia tarda kann durch hohe Dosen von Phenothiazinen verursacht werden, die über einen langen Zeitraum gegeben werden, eine häufige Praxis bei jungen Schizophrenen. Bei älteren Patienten, insbesondere Frauen und solchen mit einer Gehirnverletzung, tritt Dyskinesia tarda häufiger auf. Das Problem scheint nicht zu verschwinden, wenn das Arzneimittel abgesetzt wird und wiedersteht Standardbehandlungen für Bewegungsstörungen. Anticholinergika können Dyskinesia tarda verschlimmern. Die Häufigkeit nahm mit dem allgemeinen und verlängerten Einsatz von Phenothiazinen zu. Durch Potenzierung der Wirkung von verabreichten Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonisten eignen sich NER-Rezeptor-Aktivatoren wie TOFA zur Verhütung von Dyskinesia tarda.
Bekannte Dopamin-D1-Rezeptor-Agonisten umfassen SKF 38390 (1-Phenyl-7,8-dihydroxy-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin):
Dopamin D1-Rezeptor-Agonisten eignen sich zur Behandlung der Parkinson-Krankheit.
Haloperidol ist ein bevorzugter Blocker von Dopamin-D2-Rezeptoren. Andere Dopamin-D2-Rezeptor-Modulatoren umfassen Dihydroergocriptin und Bromocriptin.
TOFA wurde durch gezieltes Screening von Verbindungen, die topologisch Fettsäuren ähnlich sind, aus der Merck Chemical Collection als Ligand des NER-Rezeptors identifiziert. Die Verbindungen wurden aus der Merck Chemical Structure Database ausgewählt unter Verwendung des Programms für topologische Ähnlichkeit von Merck (TOPOSIM), welches das Ergebnis unveröffentlichter Arbeit von Simon Kearsley ist, welche auf den Ähnlichkeitsparametern basiert, die bei den Lederle Laboratories entwickelt wurden (Raymond E. Charhart, Dennis H. Smith, R. Venkataraghavan, J. Chem. Inf. Comg. Science, 1985, 25: 64– 73), jedoch zusätzliche Parameter, wie z. B. die Partialladung, einschließt. Etwa 250 Verbindungen wurden zum Test in den Transaktivierungs-Assays ausgewählt. TOFA stimulierte die durch die GR/NER-, GR/NUC- und GR/PPAR-Hybridrezeptoren vermittelte Expression in dosisabhängiger Weise. Im Gegensatz zu TOFA behielten die Liganden Wy14643 und Ölsäure ihre erwartete Rezeptorspezifität und aktivierten die Expression, die durch die GR/PPAR- und GR/NUC-, nicht jedoch die GR/NER-Rezeptoren, vermittelt wurde. Jedoch wirkte TOFA nicht als allgemeiner Stimulator der Transkription, da sie die Expression des MMTV-Luciferase-Reportergens nach Cotransfektion der nativen NUCI- und Glucocorticoid-Rezeptoren nicht stimulierte. Die spezifische Wirkung von TOFA wurde weiter durch die Tatsache demonstriert, daß TOFA die Expression von Luciferase in Zellen, die nur mit dem MMTV-Luciferase-Reportergen transfiziert worden waren oder mit einem Reportergen, bei dem die Expression unter der Kontrolle des frühen Promotors von SV40 stand, nicht stimulierte.
Diese ligandenabhängigen Transkriptionsassays und die Bindungsassays für den NER-Rezeptor können dazu verwendet werden, um weitere Verbindungen zu identifizieren, einschließlich solcher, welche wirkungsvoller als TOFA sind oder eine bessere Selektivität für die Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren aufweisen.
Es wurde festgestellt, daß TOFA die durch die ligandenbindende Domäne der nicht verwandten NUC- und NER-Rezeptoren vermittelte Transkription aktivierte. Es ist somit möglich, daß TOFA mit diesen Rezeptoren indirekt in einer ligandenunabhängigen Weise, ähnlich der Wechselwirkung von Dopamin mit dem COUP-TF-Rezeptor (Power et al., Dopamin activation of an orphan of the steroid receptor superfamily, Science 252 (5012): 1546–48, 1991; Power et al., Dopaminergic and ligand independent activation of steroid hormone receptors, Science 254 (5038): 1636–39, 1991; Power et al., New insights into activation of the steroid hormone receptor superfamily, Trends Pharmacol. Sci. 13(8): 318–323, 1992), wechselwirken könnte. Um Informationen hinsichtlich der Wechselwirkung zwischen TOFA und dem dopaminergen D1-System zu erhalten, testeten wir die in vitro- und in vivo-Wechselwirkung zwischen dem Dopamin-Rezeptor-Agonisten Dopamin, dem Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonisten SCH23390 und TOFA in vivo und in vitro. Im Gegensatz zu den von Power et al. (oben) offenbarten Berichten, daß die Behandlung von CV1-Zellen mit Dopamin die durch Steroidhormon-Rezeptoren vermittelte Transkription aktiviert, stimulierte die Behandlung von CV1-Zellen mit Dopamin, die durch GR/NER vermittelte Transkription nicht. Darüber hinaus aktivierte TOFA die durch den chimären GR/NER-Rezeptor vermittelte Transkription in COS-Zellen, welche den D1-Dopamin-Rezeptor nicht exprimieren. Ferner unterdrückte Dopamin die durch GR/NER vermittelte Transkription in CV1-Zellen, jedoch nicht in COS-Zellen. Die Behandlung mit SCH23390 erhöhte die Transkription und verringerte die Suppression der Transkription, die durch Dopamin induziert wurde. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß es eine Kreuzkommunikation zwischen TOFA und dem dopaminergen System gibt. TOFA aktiviert die Rezeptoren über einen anderen molekularen Mechanismus als er für die Stimulierung von Steroidhormon-Rezeptoren durch Dopamin vorgeschlagen wurde. Um Informationen hinsichtlich der Wechselwirkung zwischen TOFA und dem dopaminergen D1-System in vivo zu erhalten, testeten wir die in vivo-Wechselwirkung zwischen dem Dopamin-Rezeptor-Antagonisten SCH23390 und TOFA unter Verwendung der durch die D1-Antagonisten in Ratten induzierten Katalepsie. Eine Vorbehandlung mit TOFA erhöhte die SCH23390-Katalepsie deutlich um mindestens das 25fache. Die durch Pilocarpin, einen Agonisten des muskarinergen cholinergen Rezeptors, induzierte Katalepsie wurde durch eine TOFA-Vorbehandlung um etwa das dreifache potenziert. Jedoch wurde die durch den D2-Dopamin-Rezeptor-Antagonisten Haloperidol induzierte Katalepsie durch die TOFA-Vorbehandlung nicht beeinflußt.
Es wird auch ein Verfahren zur Auffindung von Rezeptor-Potentiatoren, insbesondere Potentiatoren von Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonisten, offenbart. Bei diesem Verfahren wird ein Screening-Verfahren unter Verwendung des neuen rekombinanten Human-Steroidhormon-Rezeptors NER eingesetzt.
Der im vorliegenden Verfahren verwendete Liganden-Screening-Assay ist im folgenden beschrieben:
Ligandenabhängige Transkriptions-Screening-Assays werden durchgeführt durch Coexpression des NER-Rezeptors und eines Reportergens, wobei die Transkription unter der Kontrolle des NER-Rezeptors steht. Ein solches Reportergen ist vorzugsweise das MMTV-Luciferase-Reportergen, bei dem der MMTV-Promotor modifiziert ist, um unter der Kontrolle des NER-Rezeptors zu stehen. Die Plasmide, welche cDNA für den NER-Steroidhormon-Rezeptor und das geeignete Reportergen enthalten, werden in COS- oder andere geeignete Zellen transfiziert. Liganden oder Extrakte werden nach der Transfektion und 18 bis 24 Stunden später zugesetzt, die Zellen werden gewaschen, Zellextrakte werden präpariert und einem Assay hinsichtlich Luciferase-Aktivität unterworfen. Alternativ kann die Transfektion in diskontinuierlichem Modus in großen Gewebekulturschalen durchgeführt werden. Nach 18 Stunden werden die Zellen gewaschen und damit Platten mit mehreren Vertiefungen beimpft. Nach dem Absetzen der Zellen werden die Liganden zugegeben und die Luciferase-Aktivitäten 1 oder 2 Tage später getestet. Alle Verbindungen oder Extrakte werden getrocknet und in ihrem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Ethanol oder DMSO, als 100–1000fach konzentrierte Stammlösungen gelöst.
Ferner betrifft diese Erfindung die Verwendung von TOFA (5-Tetradecyloxy)-2-furancarbonsäure) und pharmazeutisch annehmbaren Salzen und Estern davon als Potentiator der Inhibierung des Dopamin-D1-Rezeptors. TOFA wurde durch das obige Screening-Verfahren unter Einsatz von NER aufgefunden. TOFA aktiviert NER und ist ein Potentiator von Liganden für andere Rezeptoren. Jedoch hat TOFA keine unabhängige Wirkung auf Rezeptoren, deren Liganden durch TOFA potenziert werden.
TOFA scheint durch einen neuen Mechanismus der Wechselwirkung mit Zelloberflächenrezeptor-Mechanismen über deren intrazelluläre Signalwege zu wirken. Die Verwendung des Potentiators TOFA bietet klare klinische Vorteile, da durch die Umgehung direkter Wirkungen auf die Neutransmitter-Rezeptoren eine Änderung der Herauf- und Herunterregulationen von Rezeptoren, welche oft die Wirkung von Arzneiwirkstoffen mit direkter Aktivität gegenüber Rezeptoren beeinträchtigen, vermieden wird.
TOFA eignet sich besonders zur Behandlung von Krankheiten, für die der Dopamin-D1-Antagonist SCH23390 geeignet ist. So eignet sich TOFA zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit oder einer Psychose, insbesondere Schizophrenie. Beispielsweise verhütet SCH23390 die suchterzeugenden Eigenschaften von Kokain und kann zum Schutz vor oder zur Verhütung der toxischen Wirkungen, welche sich aus einer Überdosis von Kokain, Amphetaminen oder anderen ZNS-Stimulantien ergeben, von Nutzen sein (Lomax und Daniel, „Cocaine and body temperature in the rat: effect of dopamine D1 antagonists", Proc. West Pharmacol. Soc. 34: 5–9, 1991; und Witkin et al., „Interaction of haloperidol and SCH23390 with cocaine and dopamine receptor subtype-selective agonists on schedule-controlled behaviour of squirrel monkeys", Psychopharmacolocty Berl. 104(4): 452–431, 1991.) Ferner kann sich TOFA auch eignen zur Potenzierung der Wirkungen von SCH23390 bei der Behandlung von Schizophrenie und Bewegungsstörungen, einschließlich derjenigen, welche sich während einer Behandlung mit antipsychotischen Arzneiwirkstoffen entwickeln. Darüber hinaus eignet sich TOFA zur Potenzierung der Wirkungen von SCH23390 bei der Verhinderung der Entwicklung eines Augeninnendrucks, der durch Dopamin-Agonisten bei hydrodynamischen Augenerkrankungen induziert wird (siehe Virno et al., „Dopamine, dopaminergic drugs and ocular hypertension", Int. Ophthalmol. 16(4– 5): 349–353, 1992), und bei Patienten mit einer Erhöhung des interkranialen Drucks (siehe Boyson und Alexander, „Net Production of cerebrospinal fluid is decreased by SCH23390", Ann. Neurol. 27(6): 631–635, 1990).
TOFA eignet sich auch zur Potenzierung der Wirkungen von SCH 22390 bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit.
Nachdem ferner TOFA deutlich die Differenzierungswirkung von NGF in PC12-Zellen potenziert und die in vivo-Wirkung des cholinergen Rezeptor-Stimulans (Pilocarpin) potenziert, kann TOFA auch vorteilhafterweise bei der Behandlung von Gedächtnisstörungen, die mit einem cholinergen Defizit assoziiert sind, sowohl dem mit dem normalen Alterungsprozeß verbundenen als auch bei altersbezogenen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit, eingesetzt werden.
Obwohl TOFA bekanntermaßen ein potenter Inhibitor der Fettsäuresynthese ist, ist es unwahrscheinlich, daß diese Wirkung der gemeinsamen Mechanismus ist, durch den TOFA diese Rezeptoren aktiviert. Cerulenin, eine weitere Verbindung, welche ein wirkungsvoller Inhibitor der Fettsäuresynthese ist, Kawaguchia, A., et al., J. Biochem. Tokyo, (1982) 92, 7– 12, ahmt die potenzierenden Wirkungen von TOFA nicht nach und liefert weitere Hinweise zur Demonstration, daß die Inhibierung der Fettsäuresynthese per se nicht für die Aktivierung der chimären Rezeptoren und die Kreuzkommunikation mit dem Dopamin-Rezeptor-Signalweg verantwortlich ist.
Zusammenfassend, wir haben ein neues Mitglied der Steroidhormon-Rezeptor-Superfamilie identifiziert. Die Identifizierung dieser Funktionen kann uns Einsicht in ein neues hormonell reguliertes System geben.
Die pharmazeutisch annehmbaren Salze der Verbindung dieser Erfindung schließen diejenigen ein, die von Kationen, wie z. B. Natrium, Kalium, Aluminium, Calcium, Lithium, Magnesium, Zink, und von Basen, wie z. B. Ammonium, Ethylendiamin, N-Methylglutamin, Lysin, Arginin, Ornithin, Cholin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Chlorprocain, Diethanolamin, Procain, N-Benzylphenethylamin, Diethylamin, Piperazin, Tris(hydroxymethyl)aminomethan und Tetramethylammoniumhydroxid, gebildet werden. Diese Salze können nach Standardverfahren hergestellt werden, z. B. durch Umsetzung der freien Säure mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Base.
Ester von TOFA können hergestellt werden durch Lösen der TOFA in einem trockenen organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Tetrahydrofuran (THF), bei 0–30°C und Behandlung mit dem geeigneten substituierten Isoharnstoff für 8–24 Stunden, Kühlen auf –15°C und Filtration des Harnstoffs. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck konzentriert, um den gewünschten Ester zu ergeben. Besonders geeignete Ester der vorliegenden Erfindung schließen ein:

(a) C_1-5-Alkyl oder
(b) C_1-5-Alkyl, substituiert mit
(i) Phenyl oder
(ii) Phenyl, substituiert mit Methyl, Methoxy, Cl, Br, I, F oder Hydroxy;

TOFA kann in solchen oralen Dosierungsformen wie Tabletten, Kapseln (jeweils einschließlich Formulierungen zur zeitlich festgelegten Freisetzung und verzögerten Freisetzung), Dragees, Pulver, Granulat, Elixiere, Tinkturen, Suspensionen, Sirupe und Emulsionen verabreicht werden. Gleichermaßen können sie auch in intravenöser (sowohl Bolus als auch Infusion), intraperitonealer, subkutaner oder intramuskulärer Form verabreicht werden, alles Einsatzformen, die Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannt sind.
Der Dosierungsplan unter Einsatz von TOFA wird gemäß einer Vielfalt von Faktoren ausgewählt, die Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischen Zustand des Patienten, die Schwere des zu behandelnden Zustands, den Verabreichungsweg, die Nieren- und Leberfunktion des Patienten und die eingesetzte spezielle Verbindung oder deren Salz einschließen. Ein durchschnittlicher Arzt oder Veterinärmediziner kann die wirksame Menge an TFA, welche erforderlich ist, um die Wirkungen des Dopamin-D1-Antagonisten zu potenzieren, unschwer bestimmen und verschreiben.
Orale Dosierungen der vorliegenden Erfindung, bei Anwendung für die angegebenen Wirkungen, werden im Bereich zwischen etwa 0,01 bis 100 mg/kg TOFA, vorzugsweise 0,1 bis 50 mg pro Tag, liegen. Die Zusammensetzungen werden vorzugsweise in Form von Tabletten bereitgestellt, die 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0 und 50,0 mg aktiven Bestandteil enthalten. Vorteilhafterweise kann TOFA in einer einzigen Tagesdosis oder weniger häufig verabreicht werden oder die Gesamttagesdosis kann in aufgeteilten Dosen von zwei-, drei- oder viermal täglich verabreicht werden. Ferner kann TOFA in intranasaler Form über die topische Anwendung geeigneter intranasaler Vehikel oder über transdermale Routen verabreicht werden, wobei diejenigen Formen von transdermalen Hautpflastern eingesetzt werden, die Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Zur Verabreichung in Form eines transdermalen Abgabesystems wird die Verabreichung der Dosierung natürlich eher kontinuierlich als intermittierend während des Dosierungsplans stattfinden. Andere bevorzugte topische Präparate umfassen Cremes, Salben, Lotionen, Aerosol-Sprays und Gele, worin die Konzentration an aktivem Bestandteil im Bereich von 0,1% bis 15%, Gew./Gew. oder Gew./Vol., liegen würde.
Bei den Verwendungen der vorliegenden Erfindung bildet TOFA den aktiven potenzierenden Bestandteil und wird typischerweise in Mischung mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Exzipienten oder Trägern (hier zusammen als „Träger"-Materialien bezeichnet) verabreicht, die in geeigneter Weise hinsichtlich der vorgesehenen Verabreichungsform, d. h. orale Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirupe und dgl., ausgewählt sind und in Einklang mit herkömmlicher pharmazeutischer Praxis stehen.
Beispielsweise kann für die orale Verabreichung in Form einer Tablette oder Kapsel die aktive Wirkstoffkomponente mit einem oralen, nicht-toxischen, pharmazeutisch annehmbaren inerten Träger wie Ethanol, Glycerin, Wasser und dgl. kombiniert werden. Darüber hinaus können gewünschtenfalls oder erforderlichenfalls geeignete Bindemittel, Gleitmittel, Desintegratoren und Färbemittel ebenfalls in die Mischung korporiert werden. Geeignete Bindemittel umfassen Stärke, Gelatine, natürliche Zucker wie Glucose oder Beta-Lactose, Maissüßstoffe, natürliche und synthetische Gummiarten wie Akaziengummi, Tragant oder Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglycol, Wachse und dgl. Gleitmittel, die in diesen Dosierungsformen eingesetzt werden, umfassen Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid und dgl. Desintegratoren umfassen, ohne Beschränkung, Stärke, Methylcellulose, Agar, Bentonit, Xanthangummi und dgl.
TOFA kann auch in Form von Liposomen-Abgabesystemen, wie z. B. kleinen unilamellaren Vesikeln, großen unilamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln, verabreicht werden. Liposomen können von einer Vielfalt von Phospholipiden gebildet werden, die Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholine beinhalten.
TOFA kann auch durch den Einsatz von monoklonalen Antikörpern als individuelle Träger, an welche die Verbindungsmoleküle gekoppelt sind, verabreicht werden. TOFA kann auch mit löslichen Polymeren als zielgerichtete Arzneiwirkstoffträger gekoppelt werden. Solche Polymere können Polyvinylpryrrolidon, Pyran-Copolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspartamidphenol oder Polyethylenoxidpolylysin, substituiert mit Palmitoylresten, einschließen. Ferner kann das TOFA an eine Klasse von biologisch abbaubaren Polymeren gekoppelt werden, die zur Erzielung einer kontrollierten Freisetzung eines Arzneiwirkstoffs geeignet sind, beispielsweise Polymilchsäure, Polyepsiloncaprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanoacrylate und vernetzte oder amphipatische Block-Copolymere von Hydrogelen.
Am meisten bevorzugt wird TOFA in Kombination mit Verbindungen verabreicht, welche selbst einen Agonismus oder Antagonismus von G-gekoppelten Rezeptoren zeigen, wie z. B. Pilocarpin, SCH23390, Dihydroergocriptin, Bromocriptin, Metacholin, Carbachol, Bethanechol, Arecolin und Oxotremorin, am meisten bevorzugt Pilocarpin und SCH23390.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Verabreichung" sowohl auf eine gleichzeitige als auch sequentielle Verabreichung von TOFA und den potenzierten Agentien. Beispielhafte Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonisten sind: SCH23390, Dihydroergocriptin und Bromocriptin. Dosierungen von Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonisten liegen im Bereich von 0,001 bis 20 mg/kg, am meisten bevorzugt 0,1 bis 5 mg/kg.
Wie hier verwendet, bezieht sich „Steroidhormon-Rezeptor-Superfamilie" auf die Klasse verwandter Rezeptoren, die Glucocorticoid-, Mineralocorticoid-, Progesteron-, Estrogen-, Estrogen-Verwandte-, Vitamin D₃-, Schilddrüsen-, -v-erb-A-, Retinsäure- und E75-(Drosophila) -Rezeptoren einschließt. Wie hier verwendet, bezieht sich „Steroidhormon-Rezeptor" auf Mitglieder innerhalb der Steroidhormon-Rezeptor-Superfamilie.
Wie hier verwendet, bedeutet „Ligand" einen Inducer, beispielsweise ein Hormon oder eine Wachstumssubstanz. Innerhalb einer Zelle bindet der Ligand an ein Rezeptorprotein und bildet dadurch einen Ligand-Rezeptor-Komplex, welcher wiederum ein geeignetes Hormon-Responseelement binden kann. Einzelne Liganden können mehrere Rezeptoren haben.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „Potentiator" ein Agens oder einen Mechanismus, welches(r) die Wirkungen eines zweiten Agens oder Mechanismus verstärkt.
Der Begriff „potenzierende Menge" bezieht sich auf die Menge an Potentiator, welche verabreicht werden muß, um die potenzierende Wirkung bei einem Individuum hervorzurufen.
Der Begriff „pharmakologisch wirksame Menge" soll diejenige Menge eines Arzneiwirkstoffs oder eines pharmazeutischen Agens bedeuten, welche die biologische oder medizinische Reaktion eines Gewebes, Systems, Tiers oder Menschen hervorrufen wird, die von einem Forscher oder Kliniker erwünscht ist.
Wie hier verwendet, bezieht sich „Expressionskonstrukt" auf ein Plasmid oder einen Vektor, umfassend eine Transkriptionseinheit; die eine Anordnung von (1) einem genetischen Element oder genetischen Elementen mit einer regulatorischen Rolle bei der Genexpression, beispielsweise Promotoren oder Enhancer, (2) einer strukturellen oder kodierenden Sequenz, welche in mRNA transkribiert und in Protein translatiert wird, und (3) geeigneten Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen umfaßt.
„Rekombinantes Expressionssystem" bedeutet eine Kombination eines Expressionskonstrukts und eines geeigneten Wirtsmikroorganismus. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Rezeptor" auf eine Bindungs- oder Erkennungsstelle mit einer speziellen Molekülkonfiguration auf einer Zelloberfläche oder innerhalb einer Zellstruktur, welche eine physiologische Reaktion auf Stimulation durch einen Neurotransmitter oder eine andere Chemikalie, einschließlich eines Arzneiwirkstoffs oder eines Toxins, verursacht.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „G-gekoppelter Rezeptor" auf einen Rezeptor, welcher bei Aktivierung an ein Membranprotein gekoppelt ist, welches GTP (G-Protein) an dessen zytoplasmatischer Oberfläche bindet und den aktivierten Rezeptor an Adenylatcyclase koppelt. „Adenylatcyclase-gekoppelter Rezeptor" bezieht sich auf einen Rezeptor, der bei Aktivierung direkt das Enzym Adenylatcyclase aktiviert.
Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung gegeben.
BEISPIEL 1
Aktivierung von GR/NER- GR/NUC- und GR/PPAR-Hybridrezeptoren durch TOFA
Zur Identifizierung des mutmaßlichen Liganden für den NER-Rezeptor wurde das Potential von NER zur Induktion der Transkription eines Reportergens, welches induzierbare, auf Hormone ansprechbare Elemente enthält, untersucht. Es wurden mehrere ansprechbare Elemente getestet: die Schilddrüsen/Retinsäure-, Estrogen-, Vitamin D- und Glucocorticoid/Progesteron-Elemente. Die Transfektionsexperimente in CV-1- und L-Zellen offenbarten keine ligandenabhängige Induktion des CAT-Reportergens. Zur Erleichterung der Suche nach einem Liganden wurden Hybrid-Rezeptormoleküle konstruiert.
Die ligandenabhängigen Transkriptionsassays waren wie im folgenden beschrieben:
Ähnliche Hybridrezeptoren, GR/NER, GR/NUC und GR/PPAR, vor identischen Expressionsplasmid-Hintergründen wurden im wesentlichen hergestellt wie für die Konstruktion der chimären GR/mPPAR- und GR/NUC-Rezeptoren in Schmidt et al., „Identification of a new member of the steroid hormone receptor superfamily that is activated by a peroxisome proliferator and fatty acids", Mol. Endocrinol., 6(10): 1634–41, 1992, und in Boie et al., „Enantioselective activation of the peroxisome proliferator-activated receptor", J. Biol. Chem. 268(8): 5530–4, 1993, beschrieben.
In Kürze, der aminoterminale Abschnitt des Maus-Glucocorticoid-Rezeptors (mGR), welcher die DNA-bindende Domäne einschließt, wurde mit den mutmaßlichen ligandenbindenden Domänen des nuklearen Rezeptors NER, hNUC-I (Schmidt et al., 1992), mPPAR (Issenmann und Green, 1990) fusioniert, um die jeweiligen chimären Rezeptoren GR/NER, GR/NUC und GR/PPAR zu bilden. Der chimäre GR/NER-Rezeptor wurde konstruiert wie für die GR/NUC- und GR/PPAR-Hybridrezeptoren (Schmidt et al., 1992; Boie et al.) beschrieben. Die cDNA-Sequenzen, welche für die Aminosäuren Arg¹⁵⁵ und Glu¹⁵⁶ des NER-Rezeptors kodieren, wurden in die Xhol-Restriktionsstelle überführt, welche später für die Ligierung mit den GR-cDNA-Sequenzen, die für die DNA-bindende Domäne kodierten, eingesetzt wurde. So wurden die Aminosäurereste Arg¹⁵⁵ und Glu¹⁵⁶ des NER-Rezeptors in die Aminosäurereste Ser¹⁵⁵ und His¹⁵⁶ überführt.
Die cDNA des Human-NUCI-Rezeptors (pJ3NUCI) und des nativen Maus-Glucocorticoid-Rezeptors (pSV2wREC) wurden unter der Kontrolle von Expressionsvektoren auf SV40-Basis (Schmidt et al., 1992; Boie et al., 1993) exprimiert. Das Reportergen war das Plasmid pJA358, worin die Expression von Glühwürmchen-Luciferase durch zwei Tandem-Repeats des Glucocorticoidhormon-Responseelements (GRE), verknüpft mit dem MMTV-Promotor (Boie et al., 1993), reguliert wird.
Eine vorübergehende Transfektion von COS- und CV1-Zellen erfolgte wie beschrieben (Schmidt, 1992). Zellen wurden ausplattiert (1,5 × 10⁵ in 1 ml) in 12-Mulden-Schalen in Medium ohne Phenolrot, das mit aktiviertem, aktivkohle-behandeltem fötalem Kalbsserum ergänzt war. Am nächsten Tag wurden 0,12 ml DNA, 10 μg/ml (5 μg Rezeptor-DNA und 5 μg Reporterplasmid), als Calciumphosphat-Präzipitat den Zellen zugegeben. Liganden wurden den Zellen 30 Minuten nach der Transfektion zugegeben. Am nächsten Tag (18 Stunden) wurden die Zellen gewaschen und frische Liganden zugegeben. 24 Stunden später wurden Zellextrakte präpariert und unter Anwendung des Luciferase-Assay-Systems (Promega Madison, WI) einem Assay hinsichtlich Luciferase-Enzymaktivität unterworfen. Jede Transfektion wurde dreifach durchgeführt und die Luciferase-Aktivität einer jeden Probe als Doppelbestimmung mit Hilfe des AutoClinilumats (Berthold Nashua, N. H.) gemessen.
Die transfizierten Zellen wurden mit TOFA bei 2 μM, 10 μM, 20 μM und 50 μM und Ölsäure bei 50 μM und 300 μM behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten dargestellt.
Tabelle 1 Aktivierung von GR/NUC-, GR/PPAR-, GR/NER-, NUC-I- und GR-Rezeptoren durch TOFA
TOFA stimulierte die durch GR/NUC-, GR/PPAR- und GR/NER-Hybridrezeptoren vermittelte Expression in dosisabhängiger Weise. Im Gegensatz zu TOFA behielten die Liganden Wy14643 und Ölsäure ihre erwartete Rezeptorspezifität und aktivierten die durch GR/PPAR und GR/NUC, jedoch nicht durch die GR/NER-Chimäre, vermittelte Expression. Jedoch wirkte TOFA nicht als allgemeiner Stimulator der Transkription, da sie nach Cotransfektion von nativem NUCI, welcher nicht mit dem MMTV-Luciferase-Reportergen wechselwirkt, und von Glucocorticoid-Rezeptoren nicht die Expression des MMTV-Luciferase-Reportergens stimulierte. Die spezifische Wirkung von TOFA wurde weiter demonstriert durch die Tatsache, daß TOFA nicht die Expression von Luciferase in Zellen stimulierte, die nur mit dem MMTV-Luciferase-Reportergen oder mit einem Reportergen, in dem die Expression unter der Kontrolle des Promoters von SV40 stand, transfiziert worden waren.
BEISPIEL 2
Aktivierung von GR/PPAR durch Fettsäure-Inhibitoren
Der Ligand-Transkriptionsassay, vermittelt durch GR/PPAR in COS-Zellen, wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Die Zellen wurden mit TOFA und Cerulenin bei 0,1, 1, 10 und 100 μM behandelt. Konzentrationen von Cerulenin oberhalb von 10 μM waren für die Zellen toxisch.
TOFA wurde ursprünglich als Inhibitor der Fettsäuresynthese entwickelt (Parker et al., 1977). Wir testeten deshalb, ob Cerulenin, ein Inhibitor der Fettsäuresynthese, welcher strukturell nicht mit TOFA verwandt ist, das Transkriptionsaktivierungsprofil, welches durch TOFA induziert wurde, nachbilden kann. Bei Konzentrationen, welche die Fettsäuresynthese inhibieren, stimulierte Cerulenin die durch GR/PPAR vermittelte Transkription nicht. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Inhibierung der Fettsäuresynthese als solche wahrscheinlich nicht für die Wirkung von TOFA auf diese Rezeptorfamilie verantwortlich ist.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten dargestellt.
Tabelle 2 Aktivierung des chimären GR/PPAR-Rezeptors durch Fettsäure-Inhibitoren
BEISPIEL 3
Aktivierung von GR/NER durch Dopamin und TOFA in CV1-Zellen
TOFA wurde befunden, die durch die ligandenbindende Domäne der Mitglieder der PPAR-Familie (NUC-I und PPAR) und des nicht-verwandten NER-Rezeptors vermittelte Transkription zu aktivieren. Es ist somit möglich, daß TOFA indirekt mit diesen Rezeptoren in einer ligandenunabhängigen Weise wechselwirken könnte, ähnlich der Wechselwirkung von Dopamin mit den COUP-TF- und Progesteron-Rezeptoren (Power et al., 1991, 1991, 1992), welche das Ergebnis einer Stimulation der durch diese Rezeptoren in CV1-Zellen vermittelten Transkription ist. Wir testeten deshalb die Aktivierung von GR/NER durch TOFA und Dopamin in CV1-Zellen, welche funktionelle Dopamin-D1-Rezeptoren exprimieren, wie gemessen durch die Erhöhung der cAMP-Niveaus als Reaktion auf die Behandlung mit Dopamin. TOFA stimulierte die Expression von Luciferase, welche durch die GR/NER-Chimäre in CV1-Zellen vermittelt wurde.
Die ligandenabhängigen Transkriptionsassays wurden durchgeführt wie in Beispiel 4 beschrieben, wobei CV1-Zellen anstelle von COS-Zellen verwendet wurden. Die transfizierten CV1-Zellen wurden mit Dopamin, TOFA oder mit einer Kombination von TOFA und Dopamin in den angegebenen Konzentrationen behandelt und hinsichtlich Luciferase-Aktivität getestet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten dargestellt. Die Ergebnisse zeigen an, daß Dopamin die durch GR/NER vermittelte Transkription nicht stimulierte, wie aufgrund seiner Wirkungen auf COUP-TF- und Progesteron-Rezeptoren erwartet. Im Gegensatz dazu finden wir, daß Dopamin die durch den chimären GR/NER-Rezeptor vermittelte Transkription unterdrückte. Ferner inhibierte es teilweise die Stimulation der Transkription durch TOFA. Diese Suppression wurde nicht beobachtet, wenn GR/NER in COS-7-Zellen transfiziert wurde, welche keine signifikanten Niveaus der Dopamin-D1-Rezeptoren exprimieren. Diese Ergebnisse zeigen an, daß es eine Kreuzkomminikation zwischen dem Dopamin-Rezeptor-Signalweg und dem NER-Rezeptor-Signalweg gibt.
Tabelle 3 Aktivierung von GR/NER in CV1-Zellen
BEISPIEL 4
Aktivierung von GR/NER durch Dopamin und TOFA in COS-7-Zellen
Die ligandenabhängigen Transkriptionsassays wurden durchgeführt wie in Beispiel 4 beschrieben. Die transfizierten COS-Zellen wurden mit Dopamin, TOFA oder mit der Kombination von TOFA und Dopamin in den angegebenen Konzentrationen behandelt und hinsichtlich Luciferase-Aktivität getestet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten dargestellt.
Tabelle 4 Aktivierung von GR/NER in COS-7-Zellen
BEISPIEL 5
Wirkung von SCH23390, einem Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonisten, auf die Aktivierung der Luciferase-Expression in GR/NER
Zur weiteren Charakterisierung der Suppression der Luciferase-Expression durch Dopamin testeten wir, ob ein D1-Dopamin-Rezeptor-Antagonist, SCH23390, die durch Dopamin induzierte Suppression verhindern kann. CV1-Zellen wurden mit dem MMTV-Luciferase-Reportergen (pJA358) und dem chimären GR/NER-Rezeptor wie in Beispiel 4 beschrieben cotransfiziert. Die Zellen wurden mit einer zunehmenden Menge des Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonisten SCH23390 mit oder ohne 50 μM Dopamin behandelt.
Die in Tabelle 5 unten dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Behandlung mit SCH23390 die Inhibierung der durch Dopamin verursachten Luciferase-Expression rückgängig machen kann. Darüber hinaus stimulierte der D1-Dopamin-Antagonist SCH23390 die durch GR/NER vermittelte Transkription. Dies bestätigt weiter die potentielle Wechselwirkung zwischen den NER-Rezeptor- und Dopamin-Rezeptor-Signalwegen.
Tabelle 5 Wirkung von SCH23390 auf die durch den chimären GR/NER-Rezeptor vermittelte Transkription
BEISPIEL 6
Stimulierung der Neuriten-Differenzierung von PC12-Zellen durch TOFA
Zur weiteren Untersuchung des Einflusses von TOFA auf das Nervensystem testeten wir die Wirkung von TOFA auf die Differenzierung von PC12-Zellen. PC12-Zellen wurden mit einer Dichte von etwa 100–200/mm² auf collagen-beschichteten Platten oder Schalen in RPMI-Medium, ergänzt mit 10% Pferdeserum, 5% fötalem Kalbsserum, 50 g/ml Streptomycin, 50 E/ml Penicillin, in einer wassergesättigten Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO₂ bei 37°C über Nacht ausplattiert. Das Medium wurde durch frisches RPMI ersetzt, das 1,5% Serum, 100 ng/ml NGF und die angegebene Konzentration von TOFA oder ein äquivalentes Volumen an Vehikel (DMSO) enthielt, was eine Endkonzentration von 0,1% DMSO ergab.
Zu verschiedenen Zeitpunkten während der Behandlung wurden die Zellen photographiert oder mit 10%igem Formalin fixiert. Die Morphologie wurde nach 4 Tagen Behandlung mit TOFA oder Vehikel (DMSO) untersucht. Die Anzahl der neuriten-tragenden Zellen und die durchschnittliche Länge der Neuriten wurde mit Hilfe des Bioquant-Bildgebungssystems bestimmt. Die Behandlung mit TOFA alleine induzierte keinen Neuriten-Auswuchs in PC12- Zellen (Daten nicht gezeigt). Jedoch, wie in Tabelle 6 unten gezeigt, induzierte NGF alleine eine 15%ige Erhöhung der Anzahl von neuriten-tragenden Zellen und diese Auswüchse erreichten eine mittlere Länge von 20 μm. Die Behandlung mit NGF und TOFA erhöhte den Prozentsatz der neuriten-tragenden Zellen auf 78%. Maximale Neuritenbildung wird bei einer Konzentration von 10 μM TOFA beobachtet. Die Zugabe von TOFA erhöhte auch die Länge der entwickelten Neuriten in dosisabhängiger Weise.
Tabelle 6 Wirkung von TOFA auf die Differenzierung von PC-12-Zellen
Zellen wurden mit Vehikel (0,1% DMSO) oder verschiedenen Konzentrationen von TOFA in Gegenwart von 100 ng/ml NGF für 4 Tage behandelt und dann mit 10%igem Formalin fixiert. Mindestens 80 Zellen aus 8 Mulden wurden in jeder Gruppe analysiert. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ±SEM dargestellt.
^ap < 0,01 gegenüber Vehikel gemäß Dunnetts-Test.
BEISPIEL 7
Wirkung von TOFA auf die von einem Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonisten (SCH23390) induzierte Katalepsie
Ratten wurden mit 0,4 mg/kg TOFA oder mit Träger (s.c.) vorbehandelt. 24 Stunden später wurden die Ratten mit 0,5 mg/kg SCH23390, einem Dopamin-D1-Antagonisten, herausgefordert und die Dauer der Katalepsie wurde überwacht.
Die Katalepsie wurde durch eine Modifizierung des Balken-Verfahrens (Undie und Friedman, 1988) bestimmt. Ein Stahlbalken, 1,1 cm Durchmesser und 50 cm Länge, wurde in einer Höhe von 10 cm oberhalb der Arbeitsfläche aufgehängt. Drei Seiten der Arbeitsbank um den Balken wurden mit braunem Karton abgeteilt und die Verkleidung der Arbeitsbankoberfläche wurde so ausgewählt, daß sie dieselbe Farbe wie die Kartonwände hatte. Die hinteren Gliedmaßen des Tieres wurden frei auf der Arbeitsbank plaziert, der Schwanz zum Rücken ausgelegt und die vorderen Gliedmaßen über dem Balken plaziert. Die Länge der Zeit, die eine Ratte auf dem Balken blieb, wurde bis zu einem vorgegebenen Ausschlußzeitpunkt von 120 Sekunden registriert. Die Zeit wurde nach Beobachtung einer der folgenden Aktionen gezählt: (1) das Tier kam herunter, plazierte seine beiden Vorderpfoten auf der Arbeitsbank, (2) das Tier kletterte auf den Balken oder über den Balken mit beiden hinteren Gliedmaßen, (3) das Tier begann eine Bewegung entlang des Balkens oder um den Balken. Anschließend wurden die Zeitablesungen in Werte übersetzt, wobei ein Wert von 1 für alle vollständig beendeten 5 Sekunden auf dem Balken vergeben wurde. Für jede Beobachtungszeit wurden die Katalepsie-Werte für alle Tiere in einer Gruppe Bemittelt, um den Mittelwert der Gruppe bei dieser Beobachtungszeit zu ergeben. Ferner wurden die Werte für jedes Tier bei allen Beobachtungszeiten addiert, um die Gesamtbewertung für dieses Tier zu ergeben. Der Mittelwert dieser letzten Gruppe von Zahlen wurde der Mittlere Gesamtwert der Gruppe genannt.
Katalepsie-Werfe wurden mit einem Computer gemäß den von Winer, B. J.: Statistical principles in experimental design, McGraw-Hill, New York, S. 10–428, 1971, ausgeführten statistischen Verfahren analysiert. Im allgemeinen wurden für einen gegebenen Satz von Vergleichen die Beobachtungen einer geeigneten Varianzanalyse unterworfen, gefolgt von zweiendigen Dunnett- oder Student's-t-Tests, um Unterschiede zwischen Behandlungsgruppen nachzuweisen.
Die Daten sind in Tabelle 7 unten gezeigt:
TABELLE 7 Wirkung von TOFA auf eine SCH23390-induzierte Katalepsie
Die oben dargestellten Daten zeigen, daß die TOFA-Vorbehandlung die Dauer der SCH23390-induzierten Katalepsie um mindestens das 25fache erhöhte.
BEISPIEL 8
Wirkung von TOFA auf eine durch einen Dopamin-D2-Rezeptor-Antagonisten Arzneiwirkstoff (Haloperidol) induzierte Katalepsie
Ratten wurden mit 0,4 mg/kg TOFA oder mit Träger vorbehandelt (s.c.). 24 Stunden später wurden die Ratten mit 0,1 mg/kg Haloperidol, einem Antagonisten des Dopamin-D2-Rezeptors, herausgefordert und die Dauer der Katalepsie wurde wie in Beispiel 10 beschrieben überwacht.
Die Daten sind in der folgenden Tabelle 8 gezeigt:
TABELLE 8 Wirkung von TOFA auf eine haloperidol-induzierte Katalepsie
Die oben dargestellten Daten zeigen, daß die TOFA-Vorbehandlung die haloperidol-induzierte Katalepsie nicht signifikant beeinflußte.

Claims

Verwendung von 5-(Tetradecyloxy)-2-furancarbonsäure oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit oder einer Psychose.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Psychose Schizophrenie ist.
Produkt, umfassend 5-(Tetradecyloxy)-2-furancarbonsäure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen pharmazeutisch annehmbaren Ester davon und einen Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonisten zur gleichzeitigen oder sequentiellen Verabreichung.
Produkt nach Anspruch 3, worin der Dopamin-D1-Rezeptor-Antagonist SCH 23390 ist.