JP3881011B2 - 受容体ポテンシエーターの使用 - Google Patents

Description

発明の要旨
本発明は、一般に、以降ＮＥＲと称される新規組換え体ヒトステロイドホルモン受容体を使用するスクリーニング手段を使用する受容体のポテンシエーター（増強因子）を検出する方法に関する。化合物ＴＯＦＡ（５−（テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸）は、ＮＥＲを使用する上記スクリーニング手段を通して、受容体に非依存的に作用せずに、他の受容体、とくにＧ−タンパク結合受容体のリガンドのポテンシエーターであることが分かった。
ＴＯＦＡのようなＮＥＲ受容体を活性化する化合物は、神経成長因子（ＮＧＦ）の作用を増強し、そしてアルツハイマー疾患の処置に有用である。これらの化合物は、高眼圧症を処置する際のムスカリン様作用薬の作用を増強するのにも有用である。さらに、ＮＥＲ受容体を活性化する化合物は、精神病、特に精神分裂病を処置する際、およびジストニア、遅発性ジスキネジアおよびジル・ド・ラ・テューレット症候群のような運動不全を処置する際のドーパミンＤ１アンタゴニスト（拮抗物質）の作用を増強するのにも有用である。さらにＮＥＲ活性化因子は、眼の流体力学的不全において、また頭蓋内圧が増した患者において、ドーパミン作用薬により誘発される眼内圧の進行を防ぐ能力を有している。
新規組換え体ステロイドホルモン受容体ＮＥＲは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により製造された。ヒトＮＥＲ相補的ＤＮＡの完全な配列、ＣＯＳ安定発現系を含む発現系、およびＣＯＳ発現系を用いたアッセイも記載されている。さらに、本発明は、ＮＥＲ受容体の機能性リガンドを同定する方法にも関する。
発明の背景
レチノイド、ステロイドおよび甲状腺ホルモンおよび他の可能な分子は、ステロイド受容体スーパーファミリーのタンパク質に結合することにより、それらの生物学的作用を生み出す。これらの受容体は、特定のＤＮＡ配列と相互作用し、遺伝子発現を調節する（総説として、ＪＭ Ｂｅｒｇ，Ｃｅｌｌ ５７：１０６５−１０６８（１９８９）、ＲＭ Ｅｖａｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８９９−８９５（１９８８）、Ｍ Ｂｅａｔｏ，Ｃｅｌｌ ５６：３３５−３４４（１９８９）参照）。これらの受容体の配列の解析および機能の研究は、高度のアミノ酸残基の保存を示す２つの重要な領域を明らかにした。受容体の中で最も高いレベルの類似性は、亜鉛原子を結合して、ＤＮＡの同族のステロイド応答因子と相互作用する２つの「亜鉛フィンガー」を形成する９つのシスチン残基を含む領域に見られる（Ｊ Ｍｉｌｌｅｒら，ＥＭＢＯ Ｊ ４：１６０９−１６１４（１９８５）、ＲＭ Ｅｖａｎｓ，Ｃｅｌｌ ５２：１−３（１９８８））。ほとんど保存されない第２領域は、ホルモンとの相互作用に関わるリガンド結合ドメインである（Ｊ．Ｃａｒｌｓｔｅｄｔ−Ｄｕｋｅら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９：４２６０−４２６４（１９８２）。Ｊ．Ｃａｒｌｓｔｅｄｔ−Ｄｕｋｅら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：４４３７−４４４０（１９８７）。）。最近の研究では、さらなる機能は転写調節に関係するタンパク質−タンパク質相互作用のようなこれらの受容体の他のドメインによるものとされている（Ｒ Ｓｃｕｌｅら，Ｃｅｌｌ ６２：１２１７−１２２６（１９９０）。ＨＦ Ｙａｎｇ，Ｃｅｌｌ ６２：１２０５−１２１５（１９９０）、ＪＭ Ｈｏｌｌｏｗａｙら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：８１６０−８１６４（１９９０）。）。ＤＮＡ結合ドメインでのアミノ酸保存が、ステロイド受容体スーパーファミリーの新規構成員の同定に導いてきた。
例えば、ｈＥＲ１およびｈＥＲ２は、エストロゲン受容体のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡプローブで、ｃＤＮＡライブラリーを低ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーションすることによりクローン化された（Ｇｉｇｕｅｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３３１：９１−９４（１９８８））。同様のアプローチによって、レチノイン酸受容体およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）が発見された（ＩＩｓｓｅｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３４７：６４５−６５０（１９９０）。ＤＪ Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら，Ｎａｔｕｒｅ ３４５：２２４−２２９（１９９０））。最近、アフリカツノガエルの核ホルモン受容体スーパーファミリーの３つの新規構成員が開示された（Ｃ Ｄｒｅｙｅｒ，Ｃｅｌｌ ６８：８７９−８８７（１９９２）。）。さらに、Ｅｖａｎｓらの米国特許第４９８１７８４号には、レチノイン酸受容体の同定および新規リガンドの同定用のハイブリッド受容体を作るためのキメラ構築物の使用が開示されている。しかし、上記文献は本発明をなんら開示も示唆もしていない。
ＴＯＦＡ（５−（テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸）が、ｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸合成での律速段階であるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼを、ｉｎ ｖｉｖｏで、高い用量、すなわち食物の０．１５％で阻害することにより、脂肪酸合成を阻害することが報告されている。

［例えばアルビーニの「脂肪酸合成を阻害すると、ハムスターでの腎臓の低密度リポタンパク質分泌が減少する。」Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３３：８４３−８５１（１９９２）。Ｒｉｂｅｎｅａｕ−ＧｙｏｎおよびＧｉｌｌｅｓ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．６２：３０９−３１２（１９７６）。ＨａｌｖｏｒｓｏｎおよびＭｃＣｕｎｅ，「単離脂肪細胞における５−（テトラデシルオキシ）−２−フロリックアシドによる脂肪酸合成の阻害」、Ｌｉｐｉｄｓ １９（１１）：８５１−８５６（１９８４）、Ｏｔｔｏら，「脂肪酸酸化に対する５−（テトラデシルオキシ）−２−フオリックアシドの逆効果」Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４２（１）、２３−３１（１９８５）。Ｐａｒｋｅｒら，「５−（テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸および関連の低脂血脂肪酸様アルキルオキシアリールカルボン酸」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０：７８１−７９１、１９７７参照］。本発明は、１つの実施態様で、Ｇ−結合受容体のリガンドの活性を増強し、内在的に産生されたホルモンまたは神経伝達物質の活性を増強する低用量のＴＯＦＡの使用を包含する。
Ｐｏｗｅｌｌら，（「ステロイド受容体ファミリーのオルファンのドーパミン活性化」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１５４６−４８（１９９１）、および「ステロイドホルモン受容体のドーパミン作動性およびリガンド非依存的活性化」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６３６−３９（１９９１））は、ドーパミンがリガンド非依存性の機構により、ステロイドホルモン受容体によって仲介された転写を活性化することを報告した。しかし、ドーパミンとは違い、ＴＯＦＡおよびＮＥＲの活性化因子は、それら自身は使用される用量レベルではドーパミン作動性活性を示さない。
ドーパミン受容体は、７つの膜貫通ドメインを有し、ヘテロ三量体のＧタンパク質を介して膜貫通シグナル伝達を仲介する膜タンパク質である。受容体は、中枢神経系に主として局在するが、腎臓のような末梢の臓器、食道下部、および噴門ならびに腸間膜動脈も特異的結合部位を介してドーパミンに応答する。（Ｓｔｒａｎｇｅ，「ドーパミン受容体：構造および機能」、Ｐｒｏｇ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９９：１６７−７９、１９９３、ストランジの「中枢神経系でのドーパミン受容体の新知見」、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２２（３）：２２３−２３６、１９９３。）分子クローニングは、この受容体ファミリーが５つの遺伝子Ｄ１−Ｄ５よりなり、アデニル酸シクラーゼの活性を調節することを明らかにした。Ｄ１およびＤ５ドーパミン受容体は、アデニル酸シクラーゼ活性を刺激する一方で、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４受容体は、この酵素を阻害する。（ＳｅｅｍａｎおよびＶａｎ−Ｔｏｌ，「ドーパミン受容体の薬理学」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．６（４）：６０２−６０８、１９９３。Ｋｅｂａｂｉａｎ，「多様性ドーパミン受容体および医薬への使用」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．５（４）：５１４−５１８、１９９２。Ｋｅｂａｂｉａｎ，「脳内ドーパミン受容体、２０年の歩み」、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１８（１）：１０１−１０４、１９９３。Ｓｉｂｌｅｙら，「ドーパミン作動性受容体の分子神経生物学」、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３５：３９１−４１５、１９９３。）
ドーパミン性作動剤およびそれらのアンタゴニストは、運動不全、その他の神経精神科学的障害、悪心、およびある種のホルモン障害を処置する役割を果たす。
ドーパミンＤ１受容体は、アデニル酸シクラーゼに結合される。公知のドーパミンＤ１アンタゴニストとしては、ＳＣＨ２３３９０（８−クロロ−２，３，４，５−テトラヒドロ−３−メチル−５−フェニル−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−オール ヘミマレート）：

が挙げられる。ドーパミンＤ１アンタゴニストについては、アルツハイマー疾患の処置でその役割が示された。記憶増強剤を試験するためのアッセイである放射状迷路試験（radial-arm maze test）で、内側コリン作動性経路病巣が、記憶喪失の証拠を生み、およびＳＣＨ２３３９０による長期処置が病巣誘導障害動作を回復させることを示した。（ＭｃＧｕｒｋら，「ドーパミン作動性薬が、コリン作動性内側経路を含む病巣により引き起こされた放射状迷路の動作障害を回復させる」、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．５０（１）：１２９−１３５、１９９２）。
ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストはジル・ド・ラ・テューレット症候群、ジストニアおよび遅発性ジスキネジアのような運動不全の治療にも有用である。ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストは、精神病、さらに特定的には精神分裂病を治療するのにも有用である。
ジル・ド・ラ・テューレット症候群、または遺伝性多発性チック症は、子供時代に軽いチック（tic）をともなって始まるが、呼吸および声帯のチックを含む多発性で複雑な動作に進展する。患者の５０％に、醜語症（汚言）、不随意の糞便発言が起こる。チックおよび醜語症は、肉体的にそして社会的に無能力であるとされるのに十分重篤でありうる。ジル・ド・ラ・テューレット症候群は、一般に０．５〜４０ｍｇ／日のハロペリドールで処置される。ハロペリドールの用量は、発声障害、パーキンソン症候群およびアカシジア（静坐不能）のような副作用のために制限される。クロニジン０．１〜０．６ｍｇ／日もある患者には有効であるかもしれないが、高血圧の副作用により制限される。本発明は、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストを増強することにより、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストの投与を減らしながらジル・ド・ラ・テューレット症候群を処置することを可能にする。
失調症は、筋肉緊張での変調から生じる継続運動の持続した異常体位および破壊により特徴づけられる。一般に、失調症は、トリヘキシフェニジル６〜３０ｍｇ／日、ベンズトロピン３〜１４ｍｇ／日およびドーパミン消耗薬レゼルピン０．１〜０．６ｍｇ／日のような高い用量の抗コリン性作動薬で処置される。
遅発性ジスキネジアは、頬−舌−顔面の筋肉、まれに四肢の舞踏病状運動により特徴づけられる。稀に、病巣または一般化さえされた失調症が見うけられる。遅発性ジスキネジアは、若年精神分裂病患者に共通の方法で長時間与えられた高い用量のフェノチアジンにより起こる可能性がある。患者が年配であれば、特に女性で脳に障害がある者であればそれだけ、遅発性ジスキネジアの発生率が高い。薬が中断されたときに問題は消えず、運動不全の標準的治療に対抗する。抗コリン性作動薬は遅発性ジスキネジアを完全に一掃できる。フェノチアジンの一般的で長期化した投与で発生率が増加した。増強により、ＴＯＦＡのようなＮＥＲ受容体活性化因子である投与されたドーパミンＤ１受容体アンタゴニストの作用は、遅発性ジスキネジアの予防に有用である。
公知ドーパミンＤ１受容体作用薬としては、ＳＫＦ３８３９０（１−フェニル−７，８−ジヒドロキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンズアゼピン）：

が挙げられる。
ドーパミンＤ１受容体作用薬はパーキンソン病を処置するのに有用である。
ハロペリドールは、ドーパミンＤ２受容体の好ましい遮断剤である。他のドーパミンＤ２受容体調節因子としては、ジヒドロエルゴクリプチンおよびブロモクリプチンが挙げられる。

ムスカリン様受容体は、天然にアセチルコリンを結合する。

植物アルカロイドムスカリンもムスカリン様コリン作動性受容体を活性化する。

ムスカリン様受容体は、胃腸および尿管の蠕動、腺分泌の促進、瞳孔狭窄、末梢血管拡張および心拍の整復に関与した節後神経節副交感神経終末で生じる。ムスカリン様受容体は、Ｇタンパク結合受容体でもあり、それを刺激すると、ｃＧＭＰの増加の原因となる。ピロカルピンは公知ムスカリン様作動薬である。

他には、カルバコール、メタコリン、ベタンコール、アレコリンおよびオキソトレモリンが挙げられる。

ムスカリン様作動薬は、高眼圧の処置に、特に緑内障で有用であり、胃腸管および膀胱を刺激して、術後緊張減退を軽くする。
神経成長因子ＮＧＦは、交感神経および感覚ニューロンの成長のため、また成人の脳細胞でのニューロンの生存力のために必要とされる。ＮＧＦ治療は、即時初期応答遺伝子--オルファンステロイドホルモン受容体Ｎｕｒ７７の発現を誘導する。（Ｄａｖｉｓら，「Ｎｕｒ７７による転写活性化、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーの１員を誘導しうる成長因子」Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５（６）：８５４−８５９、１９９１。Ｈａｚｅｌら，「膜脱分極時および成長因子処置時にＮｕｒ７７はＰＣ１２細胞において示差的に改変される」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１（６）：３２９３−３２４６、１９９１。Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ，「神経成長因子はグルココルチコイド受容体遺伝子に相同な遺伝子を誘導する」Ｎｅｕｒｏｎ １（３）：１８３−１８８、１９９３。）。ニューロンの維持でのその役割のため、また神経の成長を刺激する能力のため、ＮＧＦは、アルツハイマー疾患の処置に重要である可能性がある。（Ｏｌｓｏｎ，「栄養因子および細胞移植技術に基づいた脳治療戦略での修復法」Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ ５８：３−７、１９９３）。アルツハイマー疾患でのＮＧＦの潜在的利益も、アルツハイマー患者でのＮＧＦの頭蓋内浸出液を伴う記憶改善の最近の例示により示唆される。つまり、ＮＧＦはアルツハイマー疾患のコリン作動劣勢に対抗することができるように思われる。（Ｓｅｉｇｅｒら，「アルツハイマー患者に対する精製された神経成長因子の頭蓋浸出液」Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：２５５−２６１、１９９３）。
発明の詳細な説明
本発明の１つの実施態様は、ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲに関し、上記受容体は他のヒト受容体タンパク質を含有しない。
１つのクラスでは、この実施態様はヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲに関し、上記受容体は他のヒトタンパク質を含有しない。
このクラスの範囲内で、この実施態様は、骨肉腫のようなヒト細胞由来のヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲに関し、上記受容体は他のヒトタンパク質を含有しない。
第２のクラスでは、この実施態様は、アミノ末端からカルボキシ末端へ描かれた以下の４６１のアミノ酸配列（配列番号：２）：

またはその変性変異体を包含するタンパク質に関し、ここでこのタンパク質は、他のヒト受容体タンパク質を含有しない。
第２の実施態様は、ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲ相補的ＤＮＡをコードするＤＮＡ配列に関し、ここでＤＮＡ配列は、他のヒトＤＮＡ配列を含有しない。
当業界で習熟した者が認めるとおり、特定のアミノ酸を翻訳するコドンの組に実質的な量の縮重がある。したがって、本発明は、１つのコドン（または複数のコドン）が別のコドンに置き換えられ、それでＤＮＡ配列により翻訳されたアミノ酸配列が変化しない代替塩基配列をも含む。この明細書において、１つまたはそれ以上のこのような置換コドンをもつ配列は縮重変異として定義される。ロイシンの代わりにバリン、リジンの代わりにアルギニン、そしてグルタミンの代わりにアスパラギンのような、当業界で習熟した者が機能性になんら影響を示さないと予測する突然変異（個々のアミノ酸の交換）も含まれる。
本発明の第２の実施態様の１つのクラスは、５’から３’末端に描かれる相補的ＤＮＡの以下のヌクレオチド配列（配列番号：１）に関する。

本発明の第３の実施態様は、ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲの全部または一部を発現する系に関する。
本発明のこの第３の実施態様の１クラスは、
ａ）ＰＪ３ＮＥＲＩのような発現ベクター、および
ｂ）ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲタンパク質をコードする塩基配列、
を含むプラスミドのような発現構築物、よりなる。
第３の実施態様のこのクラスの範囲内で、ステロイドホルモン受容体ＮＥＲは、上で示されるとおり相補的ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）よりなる。
本発明のこの第３の実施態様の第２のクラスは、サルの腎臓セルライン（ＣＯＳ）のような適切な宿主細胞でヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲの過渡的発現の系に関し、その系は、ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲ ｃＤＮＡを発現するベクターよりなる。
一般的に使用される広範なセルラインが本発明の使用に適することは、当業界で習熟した者に十分に明らかである。種々の種から得られた適切なセルラインは、ヒト、ウシ、ブタ、サル、およびげっ歯類、あるいは酵母や細菌株のセルラインを含むが、これらに限定されない。
本発明の第４の実施態様は、ステロイドホルモン受容体ＮＥＲについて試験サンプルの結合アフィニティーを測定するための全ての上述の真核生物または原核生物の発現系を使用する方法に関する。
ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲ ｃＤＮＡをコードするＤＮＡ配列の単離に続いて、ＮＥＲ ｃＤＮＡをコードするＤＮＡ配列中のＤＮＡ結合ドメイン領域を、別のステロイドホルモン受容体タンパク質、例えばグルココルチコイド（ＧＲ）受容体タンパク質、甲状腺受容体タンパク質、ミネラルコルチコイド受容体タンパク質またはレチノイン酸受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列から取り出されたＤＮＡ結合ドメイン領域で置換することによりキメラ遺伝子を作ることができる。次に、（１）発現プラスミドで行われるのが好ましいキメラ受容体遺伝子、および（２）これもプラスミドで行われるのが好ましいＣＡＴ遺伝子またはホタルルシフェラーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子、で適切な受容体欠損宿主細胞をトランスフェクションさせる。全ての場合に、レポーター遺伝子は、ホルモン応答エレメントが、使用されたＤＮＡ結合ドメインにより活性化されてキメラ受容体遺伝子になる能力のある作動性ホルモン応答エレメント（ＨＲＥ）（野生型であるかまたは工学的に作られたもの）に機能的に結合される。（例えば、キメラレポーター遺伝子がグルココルチコイド受容体コーディングＤＮＡ由来のＤＮＡ結合ドメイン領域を含む場合、ＨＲＥはその後野生型、工学的に作られたもの、または合成ＧＲＥ、すなわちＧＲ受容体タンパク質のＤＮＡ結合領域の作動性部分により活性化されることができるものであるべきである。）次に、キメラ遺伝子によってコードされたキメラタンパク質のリガンド結合ドメイン領域と結合する能力のある１つまたはそれ以上のリガンド（類）を含有する試験サンプルで、トランスフェクトされた宿主細胞をチャレンジする。リガンドがキメラ受容体タンパク質と機能的に複合できる程度を決定するために、レポーター遺伝子によりコードされたタンパク質のタンパク質レベルの変化をモニターすることによりレポーター遺伝子の誘導を観察する。（例えば、ルシフェラーゼがレポーター遺伝子である場合、ルシフェラーゼの産生は受容体調節遺伝子転写を示す。）最後に、あるリガンド（類）がレポーター遺伝子の転写を誘導できることが分かった場合、このリガンド（類）は当初のサンプルＤＮＡ配列によりコードされた受容体タンパク質に結合できることが結論づけられる。レポーター遺伝子の発現を誘導するリガンドと比較して、当初のＤＮＡ配列によりコードされた受容体タンパク質の結合特性を試験することにより、この結論をさらに確認できる。
さらに第４の実施態様は、ステロイドホルモン受容体ＮＥＲを活性化するための試験サンプルのアフィニティーを測定する方法に関し、この方法は、
（ａ）ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲｃＤＮＡをコードするＤＮＡ配列のＤＮＡ結合ドメイン領域の部分を、公知リガンド応答性受容体タンパク質由来のＤＮＡ結合ドメイン領域の作動性部分で置換することによりキメラ遺伝子を構築すること、
（ｂ）（ｉ）段階（ａ）から得られたキメラ遺伝子、および（ｉｉ）ホルモン応答エレメントが、段階（ａ）のキメラ遺伝子によりコードされた受容体タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン領域により活性化される能力がある作動性ホルモン応答エレメントに機能的に結合したレポーター遺伝子、
を適切な受容体欠損宿主細胞に導入すること、
（ｃ）段階（ａ）のキメラ遺伝子によりコードされたキメラ受容体タンパク質を用いて、リガンド結合活性について、評価されるべき試験サンプルを用いて段階（ｂ）由来の感染宿主細胞をチャレンジすること、
（ｄ）レポーター遺伝子によりコードされたタンパク質のタンパク質レベルの変化をモニターすることにより、レポーター遺伝子の導入を検定すること、
よりなる。
この実施態様の１つのクラスは、適切な受容体欠損宿主細胞としてサルの腎臓セルライン（ＣＯＳ）を使用する方法に関する。さらに、ＣＯＳ宿主セルラインを、プラスミドでトランスフェクトできる。そのプラスミドは、
（ａ）ＰＪ３ＮＥＲＩのような発現ベクター、および
（ｂ）ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲタンパク質をコードする塩基配列、
を含む。
前述の第４の実施態様は、ＴＯＦＡのような化合物を同定するのにさらに有用であり、これらの化合物は、ドーパミンＤ１受容体およびムスカリン様受容体のような他の受容体についてのリガンドの作用を増強する。この実施態様は、機能を身体的に制御する新規ホルモン系のリガンドを同定するのにも有用である。前述の具体例の別の用途は、ＮＥＲ受容体を活性化する化合物を、最も特定的にはそれらを必要とする被験動物に投与することよりなる、Ｇタンパク結合受容体の調節因子活性を増強することである。
さらに、本発明のこの実施態様の別のクラスは、その化合物（またはその化合物類の内のいずれか１つ）がＮＥＲ受容体を調節するかどうかを決定するために化合物または化合物の混合物を評価するためのリガンド依存性スクリーニングアッセイよりなる。リガンド依存性スクリーニングアッセイは、転写がＮＥＲ受容体の制御下にあるＮＥＲ受容体とレポーター遺伝子を同時発現することにより行われる。このようなレポーター遺伝子は、ＭＭＴＶプロモーターがＮＥＲ受容体の制御下にあるように改変されているＭＭＴＶルシフェラーゼレポーター遺伝子であってよい。ＮＥＲステロイドホルモン受容体ｃＤＮＡおよび適切なレポーター遺伝子を含有するプラスミドは、ＣＯＳまたは他の適切な細胞に移入することができる。トランスフェクション後、そして１８〜４８時間後にリガンドまたは抽出物を添加し、細胞を洗浄し、細胞抽出物を製造し、そしてレシフェラーゼ活性について分析する。ある種の実施例で、大量の組織培養皿でのバッチモードにより、トランスフェクションが行われる。１８時間後、細胞を洗浄し、多穴プレートに接種する。細胞を固定した後、リガンドを加え、そしてレシフェラーゼ活性を１日または２日後試験する。全化合物または抽出物を乾燥させ、そして１００−１０００倍の濃度の貯蔵溶液としてエタノールまたはＤＭＳＯのようなそれらに適切な溶媒に溶かす。
概して、本発明は、そのタンパク質配列または遺伝子配列の先行知見なしに、ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を単離する方法を記載する。ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲｃＤＮＡを単離するのにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用した。
ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲｃＤＮＡの完全な配列を決定し、そしてそのコードタンパク質配列を推定した。他のものの中で、このような配列情報は新規ステロイドホルモン作動薬およびアンタゴニストを開発する過程で有用である。
クローン化ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲｃＤＮＡを発現するのに発現系を使用した。ヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲのリガンド結合特性を測定するのにＣＯＳ（サル腎臓セルライン）発現系を使用することができる。
アッセイのプロトコールは、アンタゴニストによりステロイドホルモン受容体ＮＥＲの活性化を決定するために、不均一に発現したヒトステロイドホルモン受容体ＮＥＲを使用する。
一般的に、本発明はステロイドホルモン受容体スーパーファミリーの新規構成員に関する。ＤＮＡ配列から推定されたアミノ酸配列（塩基２４５〜１０２７）は、このファミリーの受容体のＤＮＡおよびリガンド結合ドメインの両方の特徴的特性を示す。配列分析は、核受容体のＤＮＡおよびリガンド結合ドメインを特徴づける保存アミノ酸残基を含む４６１アミノ酸のタンパク質を推定した。
本発明は、ヒト骨細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離されたステロイド受容体様遺伝子ファミリーの新規構成員であるＮＥＲに関する。ＮＥＲは、典型的ステロイド受容体のＤＮＡおよびリガンド結合ドメインの保存配列を含む４６１アミノ酸のポリペプチドをコードする。最良の相同性は、異なるレチノイン酸受容体：α、βおよびγで、ＤＮＡα、γ結合ドメインで５５％であり、リガンド結合ドメインで３８〜４０％で共有される。試験した全細胞および組織で２．３ｋｂの一本鎖転写体を検出した。レポーター遺伝子のリガンド依存性転写活性化を仲介するこれらの構築物の能力を試験した。
新規構成員が一定に同定されるとき、サイズにおいて核受容体遺伝子ファミリーを拡張する。ここで、ヒト骨肉腫細胞由来の新規配列のクローニングを報告する。ＮＥＲと名付けられたこの遺伝子は、４６１のアミノ酸のポリペプチドをコードし、ＤＮＡおよびリガンド結合ドメインの両方の典型的な保存配列を含む。推定されたタンパク質のアミノ末端は、高度に安定化され且つ複合化された２次構造を導入するかもしれない高含量のプロリンおよびセリン残基を含む。高含量のプロリン残基も、ＣＴｆ／Ｎ１、ｆｏｓ、ｊｕｎ．ｐ５３、ＯＣＴ−２およびＳＲＦのような転写活性を伴う他の核受容体およびその他の分子に見られた（ＭｉｔｃｈｅｌおよびＴｊｉａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５、３７１−３７８１頁（１９８９）。Ｍｅｒｍｏｄら，１９８９）。
推定上のタンパク質の大きさおよび異なるドメインの空間分布は、甲状腺、ビタミンＤおよびレチノイン酸受容体サブグループで見られる配列に似ている（Ｌａｚａｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６、７７７１−７７７４頁、１９８９）。推定されたリガンド結合ドメインでの配列相同性は、このサブグループの構成員と３３〜４０％同一性の範囲にある一方で、リガンド結合ドメインがエストロゲン、グルココルチコイド、アンドロゲンおよびプロゲステロンを含むステロイド受容体サブグループの関連のドメインと比較した場合に、２５％より低い相同性が測定された。上述のとおり、リガンド結合ドメインの最高の相同性は、レチノイン酸受容体であった。この相同性であるレチノイン酸ＲＡＲ２で４０％であり、７９％の相同性よりかなり低く、それ以外ではＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγの間で見られる。しかし、配列類似の程度は、わずか２７％同一で他のレチノイン酸受容体と共有されるレチノイン酸受容体ＲＸＲの最近発見された新規形態から明らかなとおり、リガンドの特性を常に表示できるわけではない（Ｏｒｏら，Ｎａｔｕｒｅ、３４７、２９８−３０１頁、１９９０）。したがって、配列相同性の知見に基づいて、任意の公知リガンドを帰属させるかまたは排除することは不可能である。ほとんどの他の核受容体とのＤＮＡ結合ドメインでの相同性は、およそ５０％である。最高の相同性は、エストロゲンおよびレチノイン酸受容体に対し、それぞれ５６％、および５３−５５％であると決定された。しかし、これらのレベルは、他の受容体との相同性よりわずかに高いのみだった。このドメインで、異なるレチノイン酸受容体（α、βおよびγ型）の間で共有される相同性は、９５％より高いということに注目する価値がある。そしてこの領域での他のレチノイン酸受容体に対するＲＸＲの相同性でさえ、６０％を超える。
骨肉腫セルラインからクローン化された場合、ＮＥＲのｍＲＮＡは、異なる組織および全試験セルラインに広範に分布される。
確認しにくいリガンドの探索を容易にするために、ＮＥＲ遺伝子のリガンド結合ドメインに結合したエステロゲン受容体のＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッド受容体遺伝子を構築した。このような戦略が、ＰＰＡＲ受容体についてのリガンドを同定するうえで好結果であったことが立証された。ＩｓｓｅｎｍａｎｎおよびＧｒｅｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ、３４７、６４５−６４９頁（１９９０）。
ＮＥＲ受容体についての推定上のリガンドを探索するために、キメラ受容体ＧＲ／ＮＥＲを作製した。このキメラ受容体は、不均一な応答性ＤＮＡ配列の転写のリガンド依存性活性化を示す能力がある。ＤＮＡ結合ドメインを含むマウスのグルココルチコイド受容体（ｍＧＲ）のアミノ末端部分を、核受容体ＮＥＲの推定上のリガンド結合ドメインに融合させて、予測上のキメラ受容体ＧＲ／ＮＥＲを形成した。ｈＮＥＲ受容体のアミノ酸残基Ａｒｇ¹⁵⁵およびＧｌｕ¹⁵⁶をコードするｃＤＮＡ配列（シナーらのＮＥＲ、ステロイドホルモン核受容体ＧＥＮＥをコードする遺伝子ファミリーの新規構成員（印刷中））をＸｈｏ Ｉ制限部位に変換し、その部位は、その後ＤＮＡ結合ドメインをコードするＧＲｃＤＮＡ配列とのライゲーションに使用した。したがって、ＮＥＲ受容体のアミノ酸残基Ａｒｇ¹⁵⁵およびＧｌｕ¹⁵⁶をアミノ酸残基Ｓｅｒ¹⁵⁵およびＨｉｓ¹⁵⁶に変換した。
ＭＭＴＶプロモーターの制御下でそのルシフェラーゼｃＤＮＡが転写されるレポーター遺伝子ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼを用いるリガンド依存性トランスアクチベーションアッセイにキメラを使用した。
メルク・ケミカル・コレクションからの脂肪酸にトポロジー的に類似する化合物の特異的スクリーニングを介して、ＮＥＲ受容体のリガンドとしてＴＯＦＡを同定した。レデレラボラトリーズで開発された類似性デスクリプターに基づく（Ｒａｙｍｏｎｄ Ｅ．Ｃｈａｒｈａｒｔ、Ｄｅｎｎｉｓ Ｈ．Ｓｍｉｔｈ、Ｒ．Ｖｅｎｋａｔａｒａｇｈａｖａｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５、２５：６４−７３）が、部分的荷電のような追加のデスクリプターを含むサイモンカールスレイによる未公表の研究の成果であるメルクの形状的類似性（ＴＯＰＯＳＩＭ）プログラムを使用することにより、メルク・ケミカル・ストラクチャー・データベースから化合物を選択した。トランスアクチベーションアッセイで試験するために約２５０の化合物を選択した。ＴＯＦＡは、ＧＲ／ＮＥＲ、ＧＲ／ＮＵＣおよびＧＲ／ＰＰＡＲハイブリッド受容体により仲介された発現を、用量依存式に刺激した。ＴＯＦＡと比較して、リガンドＷｙ１４６４３およびオレイン酸は、それらの予測される受容体特異性を維持し、ＧＲ／ＮＥＲ受容体にはよらずＧＲ／ＰＰＡＲおよびＧＲ／ＮＵＣにより仲介された発現を活性化した。しかし、天然ＮＵＣＩおよびグルココルチコイド受容体の同時トランスフェクション後、ＭＭＴＶレシフェラーゼ受容体遺伝子の発現を刺激しないので、ＴＯＦＡは転写の一般的な刺激因子としては作用しなかった。ＴＯＦＡが、ＭＭＴＶレシフェラーゼレポーター遺伝子のみで、または発現がＳＶ４０の初期プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子のみで、トラスフェクトされた細胞内のレシフェラーゼの発現を刺激しなかったという事実により、さらにＴＯＦＡの特異的作用は説明された。
ＮＥＲ受容体についてのこれらのリガンド依存性転写アッセイおよび結合アッセイは、ＴＯＦＡよりさらに強力であるもの、またはＧタンパク結合受容体の活性化に対するよりよい選択性を示すものを含めて追加の化合物を同定するのに使用できる。
ＴＯＦＡは、関連のないＮＵＣおよびＮＥＲ受容体のリガンド結合ドメインにより仲介される転写を活性化することが分かった。したがって、ＴＯＦＡが、ドーパミンとＣＯＵＰ−ＴＦ受容体とドーパミンとの相互作用に類似のリガンド非依存性様式でこれらの受容体と間接的に相互作用することは可能である（Ｐｏｗｅｒら，「ステロイド受容体スーパーファミリーのオルファンのドーパミン活性化」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２（５０１２）：１５４６−１５４８、１９９１。Ｐｏｗｅｒら，「ステロイドホルモン受容体のドーパミン作動性およびリガンド非依存性活性化」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（５０３８）、１６３６−１６３９、１９９１。Ｐｏｗｅｒら，「ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーの活性化における新知見」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１３（８）：３１８−３２３、１９９２。）。ＴＯＦＡとＤ１ドーパミン作動系の間の相互作用についての情報を得るために、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのドーパミン受容体作動薬ドーパミン、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストＳＣＨ２３３９０、およびＴＯＦＡの間のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの相互作用を試験した。Ｐｏｗｅｒら（上記文献）によりドーパミンでＣＶ１細胞を処理することがステロイドホルモン受容体により仲介された転写を活性化することについて開示された報告と対照的に、ドーパミンでＣＶ１細胞を処理すると、ＧＲ／ＮＥＲにより仲介された転写を刺激しなかった。さらに、Ｄ１ドーパミン受容体を発現しないＣＯＳ細胞で、ＴＯＦＡはＧＲ／ＮＥＲキメラ受容体により仲介された転写を活性化した。さらに、ドーパミンはＣＯＳ細胞ではなくＣＶ１細胞でＧＲ／ＮＥＲにより仲介された転写を抑制した。ＳＣＨ２３３９０を用いた処理は、転写を増加させ、そしてドーパミンにより誘導された転写の抑制を軽減した。ＴＯＦＡとドーパミン作動系の間に雑音はあるが、これらの結果は、ドーパミンによるステロイドホルモン受容体の刺激について示唆されたものと異なる分子機構を介してＴＯＦＡが受容体を活性化することを示す。ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＯＦＡとＤ１ドーパミン作動系との間の相互作用についての情報を得るために、ラットでＤ１アンタゴニストにより誘導されたカタレプシーを用いてドーパミン受容体アンタゴニスト、ＳＣＨ２３３９０およびＴＯＦＡの間のｉｎ ｖｉｖｏの相互作用を試験した。ＴＯＦＡでの前処置は、ＳＣＨ２３３９０カタレプシーを少なくとも２５倍まで顕著に増加させた。ムスカリン様コリン作動性受容体の作動薬であるピロカルピンにより誘導されたカタレプシーをＴＯＦＡ前処置により約３倍まで増強した。しかし、Ｄ２ドーパミン受容体アンタゴニスト ハロペリドールにより誘導されたカタレプシーは、ＴＯＦＡ前処置によっては影響されなかった。
本発明は、受容体のポテンシエーター、特にドーパミンＤ１受容体アンタゴニストの、そしてムスカリン様受容体のポテンシエーターを見つけ出す方法にも関する。この方法は、新規組換え体ヒトステロイドホルモン受容体、ＮＥＲを用いたスクリーニング手段を使用する。
本発明の方法に使用されるリガンドスクリーニングアッセイを、以下に記述する：
リガンド依存性転写スクリーニングアッセイは、ＮＥＲ受容体と、転写がＮＥＲ受容体の制御下にあるレポーター遺伝子とを同時発現することにより行われる。このようなレポーター遺伝子は、ＭＭＴＶプロモーターがＮＥＲ受容体の制御下にあるように改変されているＭＭＴＶ−レシフェラーゼレポーター遺伝子であるのが好ましい。ＮＥＲステロイドホルモン受容体ｃＤＮＡおよび適切なレポーター遺伝子を含むプラスミドをＣＯＳまたは他の適切な細胞にトランスフェクトする。トランスフェクション後、そして１８〜４８時間後にリガンドまたは抽出物を加え、細胞を洗浄し、細胞抽出物を作製し、そしてレシフェラーゼ活性について分析する。あるいは、多量の組織培養皿でバッチモードでトランスフェクションを行ってもよい。１８時間後、細胞を洗浄し、そして多穴プレートに接種した。細胞を固定した後、リガンドを加え、そして１日または２日後レシフェラーゼ活性を試験する。全化合物または抽出物を乾燥させ、そして１００−１０００倍濃度の貯蔵溶液としてエタノールまたはＤＭＳＯのようなそれらに適切な溶媒に溶かす。
さらに、この発明は、ドーパミンＤ１受容体を阻害するポテンシエーターとしてのＴＯＦＡ（５−テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸）および薬学上許容しうるそれらの塩およびエステルの使用、並びにムスカリン様受容体の使用にも関する。ＴＯＦＡはＮＥＲを使用する上記スクリーニング手段を通して見出された。ＴＯＦＡは、ＮＥＲを活性化し、かつ他の受容体のリガンドのポテンシエーターである。しかし、ＴＯＦＡは、そのリガンドがＴＯＦＡによって増強される受容体に非依存的には作用しない。
ＴＯＦＡは、それらの細胞内シグナル伝達経路を介した細胞表面の受容体機構との相互作用の新規機構を通して作用するようである。神経伝達受容体での直接的影響を回避することにより、直接的受容体活性薬の作用を弱体化する受容体のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションについての変更が回避されるので、ポテンシェーターＴＯＦＡの使用には、明確な臨床的利点がある。
ＴＯＦＡはドーパミンＤ１アンタゴニストＳＣＨ２３３９０が有用である疾患の治療に特に有用である。例えば、ＳＣＨ２３３９０には、コカインの依存特性を回避し、コカイン、アンフェタミンまたは他のＣＮＳ刺激剤の多用から生じる毒性効果を遮断するかまたは回避するうえで有用でありうる。（ＬｏｍａｘおよびＤａｎｉｅｌ，「ラットでのコカインおよび体温：ドーパミンＤ１アンタゴニストの効果」、Ｐｒｏｃ．ＷｅｓｔＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｏｃ．３４：５−９、１９９１。また、Ｗｉｔｋｉｎら，「リスザルのスケジュール制御行為についてのコカインおよびドーパミン受容体サブタイプ選択的作動薬を用いたハロペリドールおよびＳＣＨ２３３９０の相互作用」、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｂｅｒｌ．１０４（４）：４５２−４３１、１９９１。）さらに、ＴＯＦＡは、抗精神病薬で処置する間に進行するものを含め精神分裂病および行動不全の治療をする上でＳＣＨ２３３９０の作用を増強するのに有用でもありうる。さらに、ＴＯＦＡは、目の流動力学的不全症で（Ｖｉｒｎｏら，「ドーパミン、ドーパミン作動薬および高眼圧」、Ｉｎｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１６（４−５）：３４９−３５３、１９９２参照。）、および頭蓋内圧が増加した患者で（ＢｏｙｓｏｎおよびＡｌｅｘａｎｄｅｒの「脳脊髄液の正味の産生がＳＣＨ２３３９０により減少される」、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２７（６）：６３１−６３５、１９９０参照。）のドーパミン作動薬により誘導された眼内圧の進行を回避する際にＳＣＨ２３３９０の作用を増強する上で有用である。
ＴＯＦＡは、アルツハイマー疾患の治療でＳＣＨ２３３９０の作用を増強するのに有用でもある。
さらに、ＴＯＦＡは、ＰＣ１２細胞でのＮＧＦの分化作用を顕著に増強し、そしてコリン作動性受容体刺激剤（ピロカルピン）のｉｎ ｖｉｖｏ作用を増強するので、ＴＯＦＡは、正常な加齢に関連するもの、またアルツハイマー疾患のような年齢関連疾患でコリン作動性欠陥と関連した記憶不全を治療するのにも有益に使用されうる。
ＴＯＦＡが脂肪酸合成の潜在的阻害剤であることが知られているが、この作用は、それを通してＴＯＦＡがこれらの受容体を活性化する共有機構であるとは思われない。Ｋａｗａｇｕｃｈｉａ Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、東京、（１９８２）、９２、７−１２の脂肪酸合成の潜在的阻害剤である別の化合物セルレニンは、ＴＯＦＡの増強作用を真似るものでなく、それにより、脂肪酸合成それ自体の阻害はキメラ受容体の活性化およびドーパミン受容体シグナル伝達経路での雑音に応答可能でないということを示すさらなる証拠を加える。
要約すると、新規構成員のステロイドホルモン受容体スーパーファミリーを同定した。これらの機能の同定は、新規ホルモンの調節系への研究の見込みを提供する。
本発明の化合物の薬学上許容しうる塩は、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛のような陽イオンから、またはアンモニニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチル−グルタミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェニエチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、および水酸化テトラメチルアンモニウムのような塩基から形成されるものを包含する。これらの塩は、例えば遊離酸を適切な有機または無機塩基と反応させることにより標準法により製造できる。
ＴＯＦＡのエステルは、ＴＯＦＡを乾燥有機溶媒、好ましくはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に、０−３０℃で溶解し、そして適切に置換したイソウレアで８−２４時間、−１５℃に冷却しつつ処理し、そしてウレアを濾過することにより製造できる。濾液を減圧下で濃縮して所望のエステルを得る。特に本発明の適切なエステルとしては、
（ａ）Ｃ_1-5アルキル、または
（ｂ）（ｉ）フェニル、または
（ｉｉ）メチル、メトキシ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆまたはヒドロキシで置換されたフェニル、で置換されたＣ_1-5アルキル、が挙げられる。
しかし、他の薬学上許容しうるエステルを使用してもよい。
錠剤、カプセル（各々除放性および持続放出処方を含む）、丸剤、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ、懸濁物、シロップおよびエマルジョンのような経口投与形態でＴＯＦＡのようなＮＥＲの活性化因子を投与することができる。同様に、薬学界で通常の技術を有する者に十分よく知られた形態を使用して、静脈（濃縮塊および輸液の両方）、腹腔内、皮下、または筋肉内形態で投与することもできる。有効であるが毒性のない量の所望の化合物を抗男性ホルモン剤として使用することができる。
ＮＥＲの活性化因子を利用する用量管理は、対象の型、種、年齢、体重、性別および治療状況、処置されるべき症状の重篤度、投与の経路、対象の腎臓および肝臓の機能、および使用される特定の化合物またはそれらの塩を含む種々の因子にしたがって選択される。通常に習熟した医師または獣医は、必要とされるＮＥＲの活性化因子の有効量を決定し、処方して、ドーパミンＤ１アンタゴニストまたはムスカリン様作動薬の作用を増強するかまたは、ＮＧＦの産生およびその作用を刺激することが十分できる。
作用を示すために使用される場合、本発明の経口用量は、ＮＥＲ活性化因子の約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、特に１日当たり０．１〜５０ｍｇの間の範囲にある。組成物は、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０および５０．０ｍｇの有効成分を含有する錠剤の形態で提供されることが好ましい。都合よく、ＴＯＦＡは、単回１日用量で、またはそれより少なく投与されてよいか、または総１日用量は１日２回、３回または４回の分割用量で投与されてもよい。さらに、ＴＯＦＡは、適切な鼻腔ビヒクルの局所使用を介して、またはその業界で通常の技術をもつものによく知られた経皮性皮膚パッチのそれらの形態を使用し経皮経路を介して鼻腔内形態で投与されてもよい。経皮伝搬系の形態で投与されるために、もちろん用量投与は、用量管理を通して断続的であるよりむしろ継続的である。他の好ましい局所的製品としては、有効成分の濃度が０．１％〜１５％（ｗ／ｗまたはｗ／ｖ）の範囲にあるクリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレーおよびゲルが挙げられる。
本発明の方法では、ＴＯＦＡは、活性増強成分を形成することができ、そして、一般的には投与の目的形態に関して適切に選択された適切な薬学上の希釈剤、賦形剤または担体（正確にはここで「担体」材料と称される）と混合して投与される。それは、経口の錠剤、カプセル、エリキシル、シロップおよびその他であり、そして常套の薬学上の基準と矛盾しない。
例えば、錠剤またはカプセルの形態での経口投与については、活性剤成分を、エタノール、グリセロール、水およびその他のような経口で非毒性の薬学上許容しうる不活性な担体と混合できる。さらに、所望であるか必要であれば、適切なバインダー、滑剤、崩壊剤および着色剤も、この混合物に組み込むことができる。適切なバインダーとしては、スターチ、ゼラチン、グルコースまたはべーターラクトースのような天然の糖、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガントまたはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成のガム、カルボキシルメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスおよびその他が挙げられる。この用量形態に使用される滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよびその他が挙げられる。崩壊剤としては、スターチ、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムおよびその他が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ＴＯＦＡのようなＮＥＲの活性化因子は、小さな単ラメラ小胞体、大きな単ラメラ小胞体および多重ラメラ小胞体のようなリポソーム送達系の形態で投与されてもよい。リポソームは、種々のリン脂質から形成でき、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含む。
ＴＯＦＡのようなＮＥＲの活性化因子は、化合物分子が結合する個々の担体としてモノクローナル抗体の使用により送達されてもよい。ＴＯＦＡは、標的となりうる薬の担体として水溶性ポリマーと結合していてもよい。このようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンを挙げることができる。さらに、ＴＯＦＡは、薬の制御放出を達成するのに有用な生物分解可能なポリマーの１種、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、オリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋または両親媒性保護コポリマーと結合してもよい。
最も好ましくは、ＴＯＦＡのようなＮＥＲの活性化因子を、ピロカルピン、ＳＣＨ２３３９０、ジヒドロエルゴクリプチン、ブロモクリプチン、メタコリン、カルバコール、ベタンコール、アレコリンおよびオキソトレモリン、最も好ましくは、ピロカルピンおよびＳＣＨ２３３９０のような、それ自身がＧ結合受容体の作動性またはアンタゴニズムを示す化合物と組み合わせて投与する。
ここで使用される場合、「投与」の語は、ＮＥＲ活性化因子および増強された剤の併用および逐次投与の両方に該当する。このような増強剤の例としては、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストおよびムスカリン様受容体作動薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このようなドーパミンＤ受容体アンタゴニストの例示としては、ＳＣＨ２３３９０、ジヒドロエルゴクリプチン、およびブロモクリプチンがあり、そしてこのようなムスカリン様受容体作動薬の例示としては、ピロカルピン、メタコリン、カルバコール、ベタンコール、アレコリンおよびオキソトレモリンがある。ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストの用量は、０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。ムスカリン様受容体作動薬の用量は、１〜２％溶液で上昇した眼内圧を処置するのに局所的に投与されてもよく、または０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で経口にまたは非経口に投与されてもよい。
ここで使用される場合、「ステロイドホルモン受容体スーパーファミリー」は、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、プロゲステロン、エストロゲン、エストロゲン関連物、ビタミンＤ３、甲状腺、ｖ−ｅｒｂ−Ａ、レチノイン酸およびＥ７５（ドロソフィリア）受容体からなる関連受容体の種に該当する。ここで使用される場合、「ステロイドホルモン受容体」は、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーの範囲内の構成員に該当する。
ここで使用される場合、「リガンド」は、ホルモンまたは成長物質のような誘導物質を意味する。細胞の内側で、リガンドは受容体タンパク質に結合し、それによってリガンド受容体複合体を作り、すぐに適切なホルモン応答エレメントに結合することができる。単一のリガンドは、複数の受容体を有しうる。
本明細書で使用される場合、「ポテンシエーター」の用語は、第２の剤の作用または機序のを増強する剤または機序を意味する。「増強量」なる語は、被験動物において増強作用を生じるために、投与されるべきポテンシエーターの量に該当する。
「薬学上有効な量」の語は、研究者または臨床医により追求されてきた組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を引き出す薬または薬学上の剤の量を意味する。
本明細書で使用される場合、「発現構築物」は、（１）遺伝子エレメントまたは遺伝子発現で調節の役割を示すエレメント、例えばプロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、そしてタンパク質に翻訳された構造配列またはコード配列、および（３）適切な転写開始および停止配列、の集合よりなる転写単位を含むプラスミドまたはベクターに該当する。「組換え体発現系」は、発現構築物と適切な宿主微生物の組合せを意味する。ここで使用される場合、「受容体」の語は、細胞表面または細胞構造内で特異的な分子構造を示す結合または認識部位に該当し、これは薬または毒素を含めた神経伝達物質または他の化合物による刺激への生理学的応答を起こす。
ここで使用される場合、「Ｇ結合受容体」の語は、活性化される際に、その細胞質表面にＧＴＰ（Ｇタンパク質）を結合し、アデニル酸シクラーゼで活性化受容体と結合する膜タンパク質に結合される受容体に該当する。「アデニル酸シクラーゼ結合受容体」は、活性化される際に、酵素アデニル酸シクラーゼを直接活性化する受容体に該当する。
以下の実施例は、本発明を例示する目的で示され、本発明の範囲または思想に限定を設けるものとして解釈されるべきではない。
実施例１
プライマー設計
典型的な核受容体のＤＮＡおよびリガンド結合ドメインの共通配列を認識するように縮重ＤＮＡプライマーを設計した。５’プライマーＥＳ１１（配列番号６）は、ＤＮＡ結合ドメインの保存アミノ酸ＣＥＧＣＫＡ（Ｇ）（配列番号７）に基づいた縮重オリゴマー５’ＴＧＴＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＡ（Ｇ／Ａ）Ｇ（Ｃ／Ｇ）Ｃであった。第２の５’プライマーＥＳ１２（配列番号８）ＴＧＴＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＡ（Ｇ／Ａ）Ｇ（Ｃ／Ｇ）ＣＴＴＣＴＴＣは、ＣＥＧＣＫＡ（Ｇ）配列に続く２つの保存フェニルアラニン残基に相当するその３’末端に６つの追加ヌクレオチドを含む。アンチセンスプライマーＥＳ１５（配列番号９）ＡＡ（Ｇ）Ａ（Ｃ，Ｔ，Ｇ）ＣＣＡ（Ｃ，Ｔ，Ｇ）ＧＧＩＡＩＩＩＩＣ（Ｔ）ＴＴＴ（Ａ，Ｇ，Ｃ）ＧＣ（Ｇ）ＴＴは、典型的な受容体のリガンド結合ドメインの半保存的アミノ酸配列ＦＡＫｘｘＰＧＦ（配列番号１０）に相補的であるように設計された。非保存アミノ酸（ｘｘ）に相当するヌクレオチドは、イノシン（Ｉ）残基で置換された。
ＰＣＲ増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用するために、核受容体スーパーファミリーの構成員により共有される２つの保存セグメントのアミノ酸配列にしたがって縮重オリゴヌクレオチドを合成した（ＲＭ Ｅｖａｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８９９−８９５（１９８８）。）。ＤＮＡ結合ドメインのセグメントにしたがって５’末端プライマー、ＥＳ１１およびＥＳ１２を設計した。レチノイン酸受容体サブファミリーおよびビタミンＤ受容体のリガンド結合ドメイン中の保存アミノ酸配列にしたがって３’末端でのプライマーＥＳ１５を作製した。この保存領域は、２つの非保存アミノ酸残基を含有することから、イノシンヌクレオチドがこのプライマーの部分として使用された。骨肉腫細胞ＳＡＯＳ−２／Ｂ１０のｍＲＮＡから作られたヒトｃＤＮＡをプライマーＥＳ１１およびＥＳ１５で増幅し、増幅の第１回目の後種々のサイズの多重ＤＮＡ断片を生じた。入れ子（nested）プライマーＥＳ１２および同じ３’末端プライマーＥＳ１５を使用しながら反応の一部分を増幅の第２回目にかけた。
製造者推奨（ベデスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）にしたがってモロニー逆転写酵素ＲＴＨにより、骨肉腫細胞ＳＡＯＳ−２／Ｂ１０細胞から単離された２μｇ総ＲＮＡからランダムプライムドｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｃＤＮＡ反応液（２５μＬ）を３００ｍＬ水中に希釈し、そして９５℃で５分間熱変性させ、そして氷上ですばやく冷却した。アンプリタークキットおよびＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン−エルマー−シータス）を用いた増幅反応に、ｃＤＮＡ（２．５μＬ）および第１プライマー対ＥＳ１１およびＥＳ１５（各々０．５μＭ）を使用した。
プライマーＥＳ１１は、以下の配列（配列番号３）：

（ここで、Ｒは、ＡまたはＧを表し、そして
Ｓは、ＣまたはＧを表す。）
を示し、
そしてプライマーＥＳ１５は、以下の配列（配列番号５）：

（ここで、Ｎは、（１１、１４および２６位で）ＡまたはＣまたはＧまたはＴを表し、Ｎは、（１７、１９、２０、２１および２２位で）イノシンを表し、Ｒは、ＡまたはＧを表し、Ｓは、ＣまたはＧを表し、そしてＹは、ＣまたはＴを表す。）
を示す。
以下の増幅サイクルを行った：９４℃で１．５分間変性、６５℃で３分間アニーリング、７２℃で５分間伸長で３サイクル、９４℃で１分間変性、６０℃で３分間アニーリング、７２℃で５分間伸長で１５サイクル、および９４℃で１分間変性、５７℃で３分間アニーリング、７２℃で５分間伸長で２０サイクル。
１回目の増幅の完了後、５μＬの反応液を第２のプライマー対：部分的な入れ子オリゴマーＥＳ１２および同じ３’末端プライマーＥＳ１５（各々０．５μＭ）を含む増幅反応緩衝液に添加した。
プライマーＥＳ１２は、以下の配列（配列番号４）：

（ここで、Ｒは、ＡまたはＧを表し、および
Ｓは、ＣまたはＧを表す。）
を示す。
１回目の増幅サイクルに使用された同じプログラムで２回目の増幅を行った。５％ポリアクリルアミドゲルで増幅産物を分離し、臭化エチジウムにより染色した。ＤＮＡ産物をゲルから単離し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、そして平滑末端ライゲーションによりＰＵＣ１８ベクター中にクローン化した。ＰｖｕＩＩ酵素を用いるプラスミドＤＮＡの消化によりクローンを同定した。シーケナーゼ酵素キット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用するジデオキシ鎖終止法による２本鎖ＤＮＡシーケンシングによりＤＮＡ挿入を解析した。
この増幅は、各々２７０ｂｐおよび３２０ｂｐの２つの主要なＤＮＡ断片を生じた。
実施例２
ｃＤＮＡのクローニングおよびシーケンシング
ＰＣＲ増幅から得られた断片をプラスミド中へクローン化し、シーケンシングした。ＤＮＡ配列により推定されたアミノ酸残基は、両方のＤＮＡ断片がステロイドホルモンスーパーファミリーに属する真性で新規な受容体をコードし得たことを示した。完全なｃＤＮＡクローンを得るために、ヒト骨肉腫ＳＡＯＳ−２／Ｂ１０細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングをするのに２７０ｂｐのＮＥＲの増幅ｃＤＮＡ断片を使用した。全ての高度に陽性化されたクローンは同一であり、増幅ＮＥＲ ＤＮＡ断片と適合する配列であった。
ヒトオリゴ−ｄＴｃＤＮＡライブラリーは、ランムダ・ライブラリアン・クローニング・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を使用した骨肉腫ＳＡＯＳ−２／Ｂ１０細胞から単離された構築ＲＮＡであった。クローン化増幅産物（ＮＥＲ）の［³²Ｐ］標識ＤＮＡプローブを用いたプラークスクリーニングにより、数種の陽性クローンを同定した。ハイブリダイゼーション条件は、Ａ Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５９：７４１１−７４１５（１９８４）に記載されるとおりであった。ｃＤＮＡ挿入体を、クローニングベクターＰＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。ＤＮＡ配列データが利用できるようになったとき合成された１連のオリゴヌクレオチドを使用してジデオキシシーケンシング法により両方の株の完全なＤＮＡ配列を決定した。
ＮＥＲのクローニング
ＥＳ１１およびＥＳ１５プライマーを用いてＳａｏｓ−２／Ｂ１０骨肉腫セルラインのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡを増幅して、４０回目の増幅の後に多重断片を得た。５パーセントの最初の増幅反応液を、ＥＳ１２およびＥＳ１５オリゴマーを用いてさらに３０回の増幅にかけた。ＥＳ１１を置換するプライマーＥＳ１２は６ヌクレオチドより長く、そして３’末端で２つの保存フェニルアラニン残基をコードし、したがって増幅反応液に対し、さらなるレベルの特異性を導く。２回目の増幅段階で、２つ以外の全てのＤＮＡ断片が排除された。２つの断片、ｎｕｃ−Ｉ、３２０ｂｐ、およびＮｅｒ、２７０ｂｐをサブクローン化し、シーケンシングした。シーケンス解析は、両方のＤＮＡ断片がステロイドホルモン受容体遺伝子の典型的なＤＮＡ結合ドメインと似ているが、公知の配列のいずれとも一致しないことを明らかにした。
驚くべきことに、その領域から誘導されたＥＳ１５プライマーの使用により推定され得たとおり、２つの断片のうちのいずれもリガンド結合ドメインの配列を含むものはなかった。その配列にわずか５３％の相同性を共有するが、５’ＥＳ１２オリゴマーが両方の方向で反応を開始させたことは後に分かった。
新規の推定上の核受容体ＮＥＲについての全長ｃＤＮＡクローンを得るために、ＮＥＲ増幅ＤＮＡ断片を用いてＳａｏｓ−２／Ｂ１０細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。数種のクローンを同定し、ｐＵＣ１８ベクターにクローン化した。最大のクローンの１つである２ｋｂのｎｕｃ−２−１０３を十分に解析し、ヌクレオチド配列および推定上のアミノ酸配列を決定した。
ＮＥＲクローンのシーケンシングは、４６１のアミノ酸のポリペプチドをコードする長いオープンリーディングフレームを明らかにした。推定されたタンパク質は、その構造の点で典型的なステロイド様受容体に似ている。位置８７−１５４で、ＤＮＡ結合ドメインとして役割を果たすことが可能な推定上の「２重亜鉛フィンガー」構造を同定した。リガンド結合ドメインを特徴づけるアミノ酸配列は、タンパク質のカルボキシル末端に向かって配置され、そして甲状腺またはレチノイン酸受容体でのように空間を占めた。他の公知受容体配列と推定されたタンパク質の配列を比較すると、ＤＮＡ結合ドメインが５０−５６％相同性を全ステロイド様受容体と共有することを明らかにした。このドメインでの最高のスコアは、エステロゲン受容体については５６％、レチノイン酸ガンマー受容体およびミネラルコルチコイド受容体については５５％、およびレチノイン酸Ａおよびグルココルチコイド受容体については５４％であった。ほとんど保存されないリガンド結合ドメインは、３つの型のレチノイン酸受容体であるＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγと３８−４０％、ビタミンＤ受容体と３８％、そして甲状腺ホルモン受容体と３３％の最高の相同性レベルを示した。このドメインでのエステロゲン、アンドロゲン、グルココルチコイドおよびミネラルコルチコイドのリガンド結合ドメインに対する相同性は著しく低かった。ＲＸＲレチノイン酸受容体型Ｘは、このドメインで中間値である２８％相同性を示した。
ＮＥＲのアミノ酸末端（アミノ酸１−８７）が高含量の１７個のプロリン残基および１０個のセリンを含むことは注目にあたいする。
実施例３
ノーザンブロット分析
グアニジンチオシアネートを使用することにより、または塩酸グアニジン法により、種々の組織または列記のセルライン由来のＲＮＡを作製した（ＧＧＡ Ｎｅｍｅｔｈら，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８３：３０１−３０４（１９８９）。ＪＭ Ｃｈｉｒｇｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８：５２９４−５２９９（１９７９））。（ＫＭ Ｒｏｓｅｎら，Ｆｏｃｕｓ １２、２３−２４（１９９０））により記載されたとおり、ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動によって、ＲＮＡサンプルを分析した。Ｎ−ハイボンド（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．）にブロットすることによりＲＮＡを移し、（Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５９：７４１１−７４１５（１９８４）。ＫＭ Ｒｏｓｅｎら，Ｆｏｃｕｓ １２：２３−２４（１９９０））により記載されるとおり、ＮＥＲの³²Ｐ−標識ｃＤＮＡでハイブリダイゼーションした。
総ＲＮＡをラットまたはヒヒの組織から抽出し、フリッシュら（１９８９）により記載されたとおり常套の方法によるＮｅｒ−Ｉの³²Ｐ標識プローブを用いて電気泳動およびブロットハイブリダイゼーションにかけた。
骨肉腫Ｓａｏｓ−２／Ｂ１０細胞由来のＲＮＡをＮＥＲ標識化ＤＮＡプローブを用いて解析すると、およそ２．３ｋｂの一本鎖転写物が明らかになった。同様のＲＮＡ転写物を試験された全てのセルラインで検出した。異種のものから単離されたＲＮＡの間で、ｍＲＮＡ分子のサイズについてのばらつきは観察されなかった。ノーザンハイブリダイゼーションにより、ＮＥＲ遺伝子発現の組織分布を調べた。試験された全てのラットの組織または細胞にＮＥＲ ＲＮＡ転写物を検出した。成体ヒヒの組織から単離されたＲＮＡで同様の結果が得られた。
推定上の新規核受容体ＮＥＲの部分をコードする標識化増幅ＤＮＡを用いてＳａｏｓ−２／Ｂ１０ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすると、数種の陽性ｃＤＮＡクローンを生じた。この陽性クローンの配列解析から、ＮＥＲ受容体についての予測全長ｃＤＮＡクローンに加えて、ＤＮＡ配列が予測ＮＥＲの推定上の受容体と異なっている２つのクローンを得た。ｐＥ１００１と称する１つのクローンの配列は、公知レチノイン酸受容体型アルファー（ＲＡＲα）の配列と一致した（Ｇｉｇｕｅｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３３１、９１−９４頁、１９８７）。第２のクローン（ｐＥ１００５）の配列解析は、新新規レチノイン酸受容体Ｘ（ＲＸＲα）として公表し、特徴づけられた新規核受容体の特性を示した（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら，Ｎａｔｕｒｅ ３４５、２２４−２２９頁、１９９０）。つまり、これらの結果は、ＮＥＲ受容体のｃＤＮＡがステロイドホルモン核受容体の１種の公知および新規な構成員を同定するためのアッセイの道具として利用できることを表す。
実施例４
ＴＯＦＡによるＧＲ／ＮＥＲ、ＧＲ／ＮＵＣおよびＧＲ／ＰＰＡＲハイブリッド受容体の活性化
ＮＥＲ受容体についての推定上のリガンドを同定するために、誘導可能なホルモンの応答可能なエレメントを含むレポーター遺伝子の転写を誘導するＮＥＲの潜在力が試験された。数種の応答可能なエレメントである甲状腺／レチノイン酸、エストロゲン、ビタミンＤおよびグルココルチコイド／プロゲステロンエレメントを試験した。ＣＶ−１およびＬ細胞でのトランスフェクション実験は、ＣＡＴレポーター遺伝子のリガンド依存の導入はないことを示した。リガンドについての研究を促進するために、ハイブリッド受容体を構築した。
リガンド依存性転写アッセイは以下に記載のとおりであった。Ｓｃｈｍｉｄｔら，「ペルオキシソーム増殖因子および脂肪酸により活性化されるステロイドホルモン受容体スーパーファミリーの新たな構成員の同定」、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６（１０）：１６３４−４１、１９９２、およびＢｏｉｅら，「ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のエナンチオ選択的活性化」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（８）：５５３０−４、１９９３で、ＧＲ／ｍＰＰＡＲおよびＧＲ／ＮＵＣキメラ受容体の構築について記載されているおとり同一の発現プラスミド背景で同様のハイブリッド受容体ＧＲ／ＮＥＲ、ＧＲ／ＮＵＣおよびＧＲ／ＰＰＡＲを実質的に作製した。
簡潔に言うと、ＤＮＡ結合ドメインを含むマウスのグルココルチコイド受容体（ｍＧＲ）のアミノ末端部分を核受容体ＮＥＲ、ｈＮＵＣ−Ｉ（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９２）、ｍＰＰＡＲ（ＩｓｓｅｎｍａｎｎおよびＧｒｅｅｎ、１９９０）の推定上のリガンド結合ドメインに融合させて、予測のキメラ受容体ＧＲ／ＮＥＲ、ＧＲ／ＮＵＣおよびＧＲ／ＰＰＡＲを形成した。ＧＲ／ＮＵＣおよびＧＲ／ＰＰＡＲハイブリッド受容体について記載されているとおり、ＧＲ／ＮＥＲキメラ受容体を構築した（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９２、およびＢｏｉｅら）。ＮＥＲ受容体のアミノ酸Ａｒｇ¹⁵⁵およびＧｌｕ¹⁵⁶をコードするｃＤＮＡ配列をＸｈｏ Ｉ制限部位に変換し、それは、ＤＮＡ結合ドメインをコードしたＧＲ ｃＤＮＡ配列にライゲーションするために後で使われた。その結果、ＮＥＲ受容体のアミノ酸残基Ａｒｇ¹⁵⁵およびＧｌｕ¹⁵⁶をアミノ酸残基Ｓｅｒ¹⁵⁵およびＨｉｓ¹⁵⁶で置換した。
ＳＶ４０基本発現ベクターの制御下で、ヒトＮＵＣＩ受容体（ｐＪ３ＮＵＣＩ）のｃＤＮＡおよび天然型マウスグルココルチコイド受容体（ｐＳＶ２ＷＲＥＣ）を発現させた（Ｓｃｈｍｉｄｔら，１９９２。Ｂｏｉｅら，１９９３。）。レポーター遺伝子は、ＭＭＴＶプロモーターに結合したグルココルチコイドホルモン応答エレメント（ＧＲＥ）の２つのタンデムリピート（反復配列）によりホタルのルシフェラーゼの発現を調節するプラスミドｐＪＡ３５８だった（Ｂｏｉｅら，１９９３）。
記載のとおりＣＯＳおよびＣＶ１細胞の一過性トランスフェクションを行った（Ｓｃｈｍｉｄｔ，１９９２）。細胞を、活性炭処理した牛血清を補充した無フェノールレッド培地で１２穴の皿の中に載せた（１ｍＬに１．５×１０⁵）。次の日に、リン酸カルシウム沈殿として、０．１２ｍＬのＤＮＡ（１０μｇ／ｍＬ）（５μｇ受容体ＤＮＡおよび５μｇレポータープラスミド）をその細胞に加えた。トランスフェクション３０分後に、その細胞にリガンドを加えた。次の日（１８時間）、その細胞を洗浄し、新たなリガンドを加えた。２４時間後、細胞抽出物を作製し、ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン）を用いてルシフェラーゼ酵素活性についてアッセイした。３重に各トランスフェクションを行い、オートクリニルマット（ＡｕｔｏＣｌｉｎｉｌｕｍａｔ）（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｎａｓｈｕａ、Ｎ．Ｈ．）を用い、２重に各サンプルのルシフェラーゼ活性を測定した。
トランスフェクトされた細胞を、ＴＯＦＡを、２μＭ、１０μＭ、２０μＭおよび５０μＭで、オレイン酸を５０μＭ、および３００μＭで処理した。その結果を以下の表１に表す。

ＴＯＦＡは、用量依存的にＧＲ／ＮＵＣ、ＧＲ／ＰＰＡＲおよびＧＲ／ＮＥＲハイブリッド受容体により仲介される発現を刺激する。ＴＯＦＡと対照的に、リガンドＷｙ１４６４３およびオレイン酸は、それらの予測される受容体の特異性を維持し、ＧＲ／ＰＰＡＲおよびＧＲ／ＮＵＣにより仲介される発現を活性化したが、ＧＲ／ＮＥＲキメラにより仲介されるものは活性化しなかった。しかし、ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子およびグルココルチコイド受容体と相互作用しない天然型ＮＵＣＩの同時インフェクション後に、ＴＯＦＡは、ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を刺激しないので、転写の一般的刺激因子としては作用しなかった。ＴＯＦＡがＭＭＴＶ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子でのみ、またはその発現がＳＶ４０のプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子でのみインフェクトされた細胞でのルシフェラーゼの発現を刺激しないという事実により、ＴＯＦＡの特異的作用がさらに示された。
実施例５
脂肪酸阻害剤によるＧＲ／ＰＰＡＲの活性化
実施例４に記載されるとおり、ＣＯＳ細胞中でＧＲ／ＰＰＡＲにより仲介されるリガンド転写アッセイを行った。ＴＯＦＡおよびセルレニンを用いて０．１、１、１０および１００μＭで細胞を処理した。１０μＭ以上のセルレニンの濃度では細胞に毒性を示した。
最初にＴＯＦＡは脂肪酸合成の阻害因子として開発された（パーカーら、１９７７）。その後、ＴＯＦＡと構造的に関係のない脂肪酸合成の阻害因子であるセルレニンが、ＴＯＦＡにより誘導された転写の活性化性状をまねることができるかかどうかを試験した。脂肪酸合成を阻害する濃度で、セルレニンは
ＧＲ／ＰＰＡＲにより仲介された転写を刺激しなかった。これらの結果は、脂肪酸合成の阻害自体が、この受容体ファミリーに対するＴＯＦＡの作用に起因していないようであることを示唆する。
結果を以下の表２に表す。

実施例６
ＣＶ１細胞内でのドーパミンおよびＴＯＦＡによるＧＲ／ＮＥＲの活性化
ＴＯＦＡが、ＰＰＡＲファミリー（ＮＵＣ−１およびＰＰＡＲ）および関連のないＮＥＲ受容体の構成員のリガンド結合ドメインによって仲介された転写を活性化することが分かった。その後、ＣＶ１細胞内のこれらの受容体により仲介された転写を刺激して生じるドーパミンとＣＯＵＰ−ＴＦおよびプロゲステロン受容体との相互作用（Ｐｏｗｅｒら，１９９１、１９９１、１９９２）に類似するリガンド非依存的様式で、ＴＯＦＡが、これらの受容体と間接的に相互作用できる可能性がある。したがって、ｃＡＭＰレベルの上昇をドーパミンでの処理に対する応答を得ることにより測定すると同様にして、機能性ドーパミンＤ１受容体を発現するＣＶ１細胞内でＴＯＦＡおよびドーパミンによるＧＲ／ＮＥＲの活性化を試験した。ＴＯＦＡはＣＶ１細胞中のＧＲ／ＮＥＲキメラによって仲介されたルシフェラーゼの発現を刺激した。
実施例４に記載されるとおり、ＣＯＳ細胞の代わりにＣＶ１細胞を使用してリガンド依存性転写アッセイを行った。トランスフェクトされたＣＶ１細胞を、指示さた濃度で、ドーパミン、ＴＯＦＡで、またはＴＯＦＡおよびドーパミンの組合せで処理し、ルシフェラーゼ活性について試験した。
結果を以下の表３に表す。結果は、ＣＯＵＰ−ＴＦおよびプロゲステロン受容体での作用から予測されるとおり、ドーパミンがＧＲ／ＮＥＲにより仲介された転写を刺激しなかったことを示す。対照的に、ドーパミンがＧＲ／ＮＥＲキメラ受容体により仲介される転写を抑制したことが分かる。さらに、それは、ＴＯＦＡにより転写の刺激を部分的に阻害した。ＧＲ／ＮＥＲが、有為なレベルのドーパミンＤ１受容体を発現しないＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトされたときは、この抑制は見られなかった。これらの結果は、ドーパミン受容体シグナル伝達経路およびＮＥＲ受容体経路の間に雑音があることを示す。

実施例７
ＣＯＳ−７細胞でのドーパミンおよびＴＯＦＡによるＧＲ／ＮＥＲの活性化
実施例４に記載のとおり、リガンド依存性転写アッセイを行った。トランスフェクトされたＣＯＳ細胞をドーパミン、ＴＯＦＡで、またはＴＯＦＡおよびドーパミンの組合せで、指示された濃度で処理して、ルシフェラーゼ活性について試験した。
結果を以下の表４に表す。

実施例８
ＧＲ／ＮＥＲでのルシフェラーゼ発現の活性化の際のドーパミンＤ１受容体アンタゴニストＳＣＨ２３３９０の作用
ドーパミンによるルシフェラーゼ発現の抑制をさらに特徴づけるために、Ｄ１ドーパミン受容体アンタゴニストＳＣＨ２３３９０が、ドーパミンにより誘導された抑制を妨げるかどうかを試験した。実施例４に記載されるおとり、ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐＪＡ３５８）およびＧＲ／ＮＥＲキメラ受容体を用いてＣＶ１細胞を同時インフェクトした。ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストＳＣＨ２３３９０の量を増加させながら、５０μＭドーパミンを用いて、または用いずに細胞を処理した。
以下の表５に示される結果は、ＳＣＨ２３３９０を用いた処理がドーパミンにより起こったルシフェラーゼ発現の阻害を逆転できることを示す。さらに、Ｄ１ドーパミンアンタゴニストＳＣＨ２３３９０は、ＧＲ／ＮＥＲにより仲介された転写を刺激した。さらにこれは、ＮＥＲ受容体およびドーパミン受容体シグナル伝達経路の間の潜在的相互作用を確認する。

実施例９
ＴＯＦＡによるＰＣ１２細胞の神経突起の分化の刺激
神経系でのＴＯＦＡの影響をさらに研究するために、ＰＣ１２細胞の分化におけるＴＯＦＡの作用を試験した。９５％の空気と５％ＣＯ₂の水で飽和した雰囲気で、３７℃で一夜かけて１０％ウマ血清、５％子牛血清、５０ｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍＬペニシリンを補充したＲＰＭＩ培地中のコラーゲン被覆プレートまたは皿上に、およそ１００−２００／ｍｍ²の密度で、ＰＣ１２細胞をプレートに載せた。１．５％血清、１００ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含有する新たなＲＰＭ^Iに培地を取り替えて、指示された濃度のＴＯＦＡまたは等量のビヒクル（ＤＭＳＯ）を最終濃度０．１％ＤＭＳＯにした。
処理の間の異なる時点で、細胞を写真撮影するかまたは１０％ホルマリンで固定した。ＴＯＦＡまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理して４日後、形態を調べた。バイオクアントイメージングシステムの助けをかりて神経突起を有する細胞の数、および神経突起の平均長さを測定した。ＴＯＦＡでの処理のみでは、ＰＣ１２細胞での神経突起の成長を誘導しなかった（データは示されず）。しかし、以下の表６に示されるとおり、ＮＧＦだけでも、神経突起を有する細胞の数で１５％の増加を誘導し、これらの成長は２０μｍの平均長に達した。ＮＧＦおよびＴＯＦＡで処理すると、神経突起を有する細胞の含有率は７８％に増加した。１０μＭ ＴＯＦＡの濃度で、最大の神経突起生成が観察された。ＴＯＦＡの追加は、用量関連的に発達した神経突起の長さをも増加させた。

ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）または種々の濃度のＴＯＦＡで、１００ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦの存在下で、４日間細胞を処理し、その後、１０％ホルマリンで固定した。８つの穴から得た少なくとも８０の細胞を各グループについて解析した。結果を平均値±ＳＥＭとして示した。^aｐ＜０．０１対ダネット試験によるビヒクル。
実施例１０
ドーパミンＤ１受容体アンタゴニスト（ＳＣＨ２３３９０）誘導カタレプシーに対するＴＯＦＡの作用
０．４ｍｇ／ｋｇ ＴＯＦＡでまたは担体（Ｓ．Ｃ．）で、ラットを前処理した。２４時間後、ドーパミンＤ１アンタゴニストであるＳＣＨ２３３９０ ０．５ｍｇ／ｋｇでラットを試験し、そしてカタレプシーの持続期間（duration）を観察した。
改変したバー法により、カタレプシーを測定した（ＵｎｄｉｅおよびＦｒｉｅｄｍａｎ、１９８８）。直径１．１ｃｍ、長さ５０ｃｍのスチール製バーを、可動表面の１０ｃｍ上の高さに吊るした。そのバーの周りの台の３面を茶色の厚紙で仕切り、台の表面上のライニングは、厚紙壁と同じ色であるように選択された。動物の後脚を台の上に自由に載せ、尾を後ろに垂らし、そして前脚をバーの上に載せた。ラットがバーの上にいた時間の長さを記録して、現在の打ち切り時点１２０ｓまで記録した。以下の行動：（１）台の上に２つの前脚を載せたまま動物が逃げた、（２）動物が両方の後脚でバーの上に登るかまたは越えた、（３）動物がバーにそってまたはの周りでの動きを始めたかのいずれかが観察されれば、時間を数えた。続いて、各々がバーに５ｓ首尾よく終えるのを１のスコアであるとして、時間の読みをスコアに移した。各観察時で、１群の動物全てについてのカタレプシースコアを平均し、その観察時間でのその群の平均スコアを得た。さらに、全ての観察時での各動物についてのスコアを加えてその動物についての総スコアを得た。この最後の群の数の平均は、群の平均総スコアと称された。
ｗｉｎｅｒ Ｂ．Ｊ．：、実験的設計での統計則（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ）により概説された統計的手段に従ってコンピュータによりカタレプシースコアを解析した。ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１０−４２８頁、１９７１。一般的に、付与された一対較について、処理群の間の差異を検出するための２つの尾のダネットまたはスチューデントのｔ試験により行われる適切な解析で観察にかけた。
データを以下の表７に示す。

上で示されたデータは、ＴＯＦＡ前処理がＳＣＨ２３３９０で誘導されたカタレプシーの持続期間を少なくとも２５倍まで明らかに増加させたことを示す。
実施例１１
ムスカリン様受容体作動薬（ピロカルピン）誘導カタレプシーに対するＴＯＦＡの作用
０．４ｍｇ／ｋｇ ＴＯＦＡでまたは担体（Ｓ．Ｃ．）でラットを前処理した。２４時間後、ムスカリン様コリン作動性受容体の作動薬であるピロカルピン１６ｍｇ／ｋｇでラットを試験し、実施例１１に記載されるとおりにカタレプシーの持続期間を観察した。
データを以下の表８に示す。

上で示されたデータは、ＴＯＦＡ前処理がピロカルピンで誘導されたカタレプシーの持続期間を３倍まで明らかに増加させたことを示す。
実施例１２
ドーパミンＤ２受容体アンタゴニスト（ハロペリドール）薬誘導カタレプシーに対するＴＯＦＡの作用
０．４ｍｇ／ｋｇ ＴＯＦＡでまたは担体（Ｓ．Ｃ．）でラットを前処理した。２４時間後、ドーパミンＤ２受容体のアンタゴニストであるハロペリドール０．１ｍｇ／ｋｇでラットを試験し、実施例１０に記載されるとおりにカタレプシーの持続期間を観察した。
データを以下の表９に示す。

上で示されたデータは、ＴＯＦＡ前処理がハロペリドールで誘導されたカタレプシーの持続期間を有意には増加させなかったことを示す。
上述の明細書は、例示する目的で提供された実施例とともに本発明の範囲を教示するものであるが、本発明の実施は、以下の請求の範囲およびその均等物の範囲内で、ここに記載された手段およびプロトコールの通常の変形、一致、変更、欠失、または追加の全てを包含することが理解されるだろう。
配列表
（２）配列番号：１についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０３０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列：配列番号：１：

（２）配列番号：２についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：４６１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセテイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列：配列番号：２：

（２）配列番号：３についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列：配列番号：３：

（２）配列番号：４についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列：配列番号：４：

（２）配列番号：５についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列：配列番号：５：

Claims (16)

1. Ｇタンパク結合受容体の調節因子の活性を増強するために有用な医薬の製造における、５−（テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸の使用。
2. 医薬が、神経成長因子ＮＧＦの作用を増強するために有用な医薬または、アルツハイマー疾患、運動不全、精神病、悪心または高眼圧の治療のための医薬である、請求項１に記載の５−（テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸の使用。
3. 精神病が精神分裂病である請求項２に記載の使用。
4. 運動不全が、失調症、遅発性ジスキネジア、およびジル・ド・ラ・トゥレット症候群から選択される請求項２に記載の使用。
5. ５−（テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸をドーパミンＤ１受容体アンタゴニストとともに使用する、アルツハイマー疾患、運動不全または悪心の治療に有用な医薬の製造における、請求項２に記載の５−（テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸の使用。
6. ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストがＳＣＨ２３３９０：
   

   

   である請求項５に記載の使用。
7. ５−（テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸をムスカリン受容体作動薬とともに使用する、高眼圧の治療のための医薬の製造における、請求項２に記載の５−（テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸の使用。
8. ムスカリン性受容体作動薬が、ピロカルピン、メタコリン、カルバコール、ベタネコール、アレコリンおよびオキソトレモリンから選択される請求項７に記載の使用。
9. ムスカリン性受容体作動薬が、ピロカルピンである請求項８に記載の使用。
10. ５−（テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸が、Ｇタンパク結合受容体との固有活性を有しない請求項１〜９に記載の使用。
11. ５−（テトラデシルオキシ）−２−フランカルボン酸および薬学上許容しうる担体を含有するＧタンパク結合受容体の調節因子の活性を増強するための医薬組成物。
12. さらに、Ｇタンパク結合受容体の調節因子を包含する請求項１１に記載の医薬組成物。
13. Ｇタンパク結合受容体の調節因子が、（ａ）ドーパミンＤ１受容体アンタゴニスト、および（ｂ）ムスカリン性受容体作動薬から選択される請求項１２に記載の医薬組成物。
14. Ｇタンパク結合受容体の調節因子が、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニストＳＣＨ２３３９０：
    

    

    である請求項１３に記載の医薬組成物。
15. Ｇタンパク結合受容体の調節因子が、ピロカルピン、メタコリン、カルバコール、ベタネコール、アレコリンおよびオキソトレモリンから選択されるムスカリン性受容体作動薬である請求項１３に記載の医薬組成物。
16. ムスカリン性受容体作動薬が、ピロカルピンである請求項１５に記載の医薬組成物。