DE69932834T2

DE69932834T2 - Neue Peptide

Info

Publication number: DE69932834T2
Application number: DE69932834T
Authority: DE
Inventors: James Richard Woolloongabba LEWIS; Francis Paul Moggill ALEWOOD; Andrew Iain Taringa SHARPE
Original assignee: Xenome Ltd
Current assignee: Xenome Ltd
Priority date: 1998-10-02
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2019-10-02
Also published as: NZ510813A; PT1117682E; EP1117682A1; AUPP627498A0; US20090275498A1; EP1117682A4; US20050054827A1; CY1110381T1; JP4447783B2; ES2268885T3; EP1117682B1; DE69932834D1; JP2010046088A; ATE336501T1; US7326682B2; US20120277166A1; US6794361B1; US7994128B2; DK1117682T3; JP2002526098A

Description

Die Erfindung betrifft neue Peptide und Derivate davon, die als Inhibitoren für neuronale Amintransporter von Neurotransmittern wie Noradrenalin, Serotonin, Dopamin, Glutaminsäure und Glycin nützlich sind. Sie ist weiterhin auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Peptide enthalten, Nucleinsäuresonden, die zum Auffinden von aktiven Analogen dieser Peptide nützlich sind, Assays zum Auffinden von Verbindungen mit neuronale Noradrenalintransporter inhibierender Wirkung und die Verwendung dieser Peptide bei der Prophylaxe oder Behandlung von Zuständen wie Inkontinenz, kardiovaskulären Störungen und Befindlichkeitsstörungen gerichtet.
Die Meeresschnecken der Gattung Conus (Kegelschnecken) nutzen eine ausgeklügelte biochemische Strategie, um ihre Beute zu fangen. Als Räuber von Fischen, Würmern oder anderen Mollusken injizieren die Kegelschnecken in ihre Beute ein Gift, das eine Mischung aus kleinen biologisch wirksamen Peptiden enthält. Diese Toxinmoleküle, die als Conotoxine bezeichnet werden, greifen in die Neurotransmission ein, indem sie sich auf eine Vielzahl von Rezeptoren und Ionenkanälen richten. Das Gift einer einzigen Conus-Spezies kann mehr als 100 verschiedene Peptide enthalten. Die Conotoxine werden auf der Basis ihrer physiologischen Ziele in Klassen eingeteilt.
Zurzeit sind zehn Klassen beschrieben. Die ω-Conotoxin-Klasse von Peptiden zielt ab und blockiert spannungsempfindliche Ca²⁺-Kanäle, wodurch die Freisetzung von Neurotransmittern inhibiert wird. Die α-Conotoxine (siehe WO-A-98/22126) und ψ-Conotoxine zielen auf Nikotin-ACh-Rezeptoren ab und blockieren diese, wodurch eine Blockierung der Ganglien und eine neuromuskuläre Blockierung verursacht wird. Peptide der μ-Conotoxin-Klasse blockieren spannungsempfindliche Na⁺-Kanäle, wodurch Muskel- und Nervenaktionspotentiale inhibiert werden. Die δ-Conotoxine zielen auf die spannungsempfindlichen Na⁺-Kanäle ab und verzögern deren Inaktivierung, wodurch die neuronale Erregbarkeit verstärkt wird. Die κ-Conotoxin-Klasse von Peptiden zielt auf spannungsempfindliche K⁺-Kanäle ab und blockiert diese, weshalb ebenfalls die neuronale Anregbarkeit verstärkt wird. Die Conopressine sind Vasopressinrezeptor-Antagonisten und die Conantokine sind NMDA-Rezeptor-Antagonisten. In jüngerer Zeit sind der Prototyp einer neuen γ-Conotoxin-Klasse, die auf einen spannungsempfindlichen unspezifischen Kationenkanal abzielt, und einer neuen σ-Conotoxin-Klasse, die am 5HT₃-Rezeptor antagonistisch wirkt, beschrieben worden.
Nun ist festgestellt worden, dass eine neue Conotoxin-Klasse existiert, die anschließend als χ-Conotoxin-Klasse bezeichnet wird, und welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie das Vermögen hat, neuronale Amintransporter zu inhibieren.
Weiterhin ist festgestellt worden, dass Verbindungen, welche die Neurotransmitter-Wiederaufnahme inhibieren, bei der Behandlung von Störungen der unteren Harnwege wie Harninkontinenz, Detrusorinstabilität und interstitieller Cystitis nützlich sind. Eine solche Verbindung ist "Imipramin", das zusätzlich dazu, dass es die Noradrenalinwiederaufnahme inhibiert, gezeigt hat, dass es auf die Blockade des Calciumkanals wirkt und eine anticholinerge und eine lokalanästhetische Wirkung und eine Anzahl anderer Effekt aufweist. Weitere Verbindungen, die in der Lage sind, die Noradrenalinwiederaufnahme zu inhibieren, sind im US-Patent 5 441 985 beschrieben. Von diesen Verbindungen wird behauptet, dass sie gegenüber Imipramin eine geringere anticholinerge Wirkung haben.
Bei den erfindungsgemäßen Peptiden wird diese Inhibierung der Neurotransmitter-Wiederaufnahme durch selektives Inhibieren eines neuronalen Neurotransmittertransporters wie des Noradrenalintransporters, der arbeitet, um von der Synapse freigesetztes Noradrenalin schnell zurück in die Neuronen zu entfernen, erreicht.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind die ersten Peptide, welche die Wirkung haben, einen Amintransporter zu inhibieren. Alle anderen bisher charakterisierten Conotoxinpeptide zielen auf Ionenkanäle oder Rezeptoren auf Zelloberflächen ab.
Entsprechend einem erfindungsgemäßen Merkmal wird ein isoliertes, synthetisches oder rekombinantes χ-Conotoxinpeptid mit dem Vermögen, einen neuronalen Amintransporter zu inhibieren, bereitgestellt.
Vorzugsweise ist der neuronale Amintransporter der neuronale Noradrenalintransporter.
Das χ-Conotoxinpeptid kann ein von einer Kegelschnecke isoliertes, natürlich vorkommendes Peptid oder ein Derivat davon sein.
Vorzugsweise ist das χ-Conotoxinpeptid χ-MrIA bzw. χ-MrIB oder ein Derivat davon. χ-MrIA und χ-MrIB können aus dem Gift der Mollusken jagenden Kegelschnecke, Conus marmoreus, isoliert werden.
Sie sind beide Peptide mit einer Länge von 13 Aminosäureresten und enthalten 2-Disulfid-Bindungen; die Peptide zeigen die größte Homologie zu Mitgliedern in der α-Conotoxin-Klasse, die als Nikotin-ACh-Rezeptor-Antagonisten wirken.
Die Aminosäuresequenzen von χ-MrIA und χ-MrIB sind wie folgt:
χ-MrIA NGVCCGYKLCHOC SEQ ID Nr. 1
χ-MrIB VGVCCGYKLCHOC SEQ ID Nr. 2.
Der C-Terminus kann eine freie Säure oder amidiert sein.
In diesen Sequenzen bedeutet "O" 4-Hydroxyprolin (Hyp). Dieser Aminosäurerest resultiert aus der posttranslationalen Modifikation des codierten Peptids und wird nicht direkt von der Nucleotidsequenz codiert.
Vorzugsweise ist das χ-Conotoxinpeptid ein selektiver Inhibitor des neuronalen Noradrenalintransporters. Dabei bedeutet die hier benutzte Bezeichnung "selektiv", dass die Wirksamkeit des Peptids als ein Inhibitor neuronaler Noradrenalintransporter beträchtlich größer als irgendeine andere Wirkung an den α₁-Adrenozeptoren ist.
Im US-Patent 5 441 985 ist mitgeteilt, dass Inhibitoren der Noradrenalinwiederaufnahme, die eine zu vernachlässigende anticholinerge Wirkung haben, bei der Behandlung von Störungen der unteren Harnwege besonders nützlich sind. Dabei ist festgestellt worden, dass χ-MrIA auch keinen nachweisbaren anticholinergen Effekt hat.
Dementsprechend wird in einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ein isoliertes, synthetisches oder rekombinantes χ-Conotoxinpeptid mit dem Vermögen, einen neuronalen Noradrenalintransporter selektiv zu inhibieren und dabei keinen oder einen zu vernachlässigenden anticholinergen Effekt zu haben, bereitgestellt.
Weiterhin ist festgestellt worden, dass χ-MrIA keine Wirkung als Natriumkanalblocker oder als Inhibitor des Dopamintansporters hat. Das Fehlen dieser zusätzlichen pharmakologischen Wirkungen, die üblicherweise mit anderen Inhibitoren des Noradrenalintransporters verknüpft sind, bei χ-MrIA und bei bevorzugten erfindungsgemäßen Peptiden, macht diese Peptide zu nützlichen pharmakologischen Mitteln.
Die erfindungsgemäßen χ-Conotoxinpeptide können natürlich vorkommende Peptide wie χ-MrIA und χ-MrIB oder Derivate natürlich vorkommender Peptide sein.
Dabei bezieht sich die Bezeichnung "Derivat", die hier im Zusammenhang mit natürlich vorkommenden χ-Conotoxinpeptiden wie χ-MrIA und χ-MrIB benutzt wird, auf ein Peptid, das sich von natürlich vorkommenden Peptiden durch eine oder mehrere Aminosäuredeletionen, -additionen, -substitutionen oder -seitenkettenmodifizierungen unterscheidet. Derivate, die nicht das Vermögen haben, den neuronalen Noradrenalintransporter zu inhibieren, liegen nicht innerhalb des Erfindungsumfangs.
Substitutionen umfassen Aminosäureveränderungen, bei welchen eine Aminosäure durch einen anderen natürlich vorkommenden oder nicht-konventionellen Aminosäurerest ersetzt wird. Solche Substitutionen können als "konservativ" bezeichnet werden, in welchem Fall ein in einem Polypeptid enthaltener Aminosäurerest durch eine andere natürlich vorkommende Aminosäure mit entweder in Bezug auf Polarität, Seitenkettenfunktionalität oder Größe ähnlichem Charakter, beispielsweise Ser↔Thr↔Pro↔Hyp↔Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, His↔Lys↔Arg, Asn↔Gln↔Asp↔Glu oder Phe↔Trp↔Tyr, ersetzt wird. Dabei ist festzustellen, dass einige nicht-konventionelle Aminosäuren auch ein geeigneter Ersatz für natürlich vorkommende Aminosäuren sein können. So sind beispielsweise Ornithin, Homoarginin und Dimethyllysin mit His, Arg und Lys verwandt.
Substitutionen, die sich innerhalb des Erfindungsumfangs befinden, können auch "nicht konservativ" sein, wobei ein Aminosäurerest, der in einem Peptid vorhanden ist, durch eine Aminosäure mit anderen Eigenschaften wie eine natürlich vorkommende Aminosäure aus einer anderen Gruppe (beispielsweise Substitution einer geladenen oder hydrophoben Aminosäure durch Alanin) oder alternativ bei welcher eine natürlich vorkommende Aminosäure mit einer nicht herkömmlichen Aminosäure substituiert wird.
Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise solche von einzelnen Resten, können aber auch von mehreren Resten, entweder gehäuft oder verteilt, sein.
Vorzugsweise sind die Aminosäuresubstitutionen konservativ.
Additionen umfassen die Addition von einem oder mehreren natürlich vorkommenden oder nicht herkömmlichen Aminosäureresten. Die Deletion umfasst die Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten.
Wie weiter oben festgestellt, umfasst die Erfindung Peptide, bei welchen eine oder mehrere der Aminosäuren Seitenkettenmodifizierungen unterworfen worden sind. Erfindungsgemäße Beispiele für Seitenkettenmodifizierungen umfassen Modifizierungen von Aminogruppen wie durch reduzierende Alkylierung durch Umsetzung mit einem Aldehyd und anschließende Reduktion mit NaBH₄; Amidierung mit Methylacetimidat; Acylierung mit Essigsäureanhydrid; Carbamoylierung von Aminogruppen mit Cyanat; Trinitrobenzylierung von Aminogruppen mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS); Acylierung von Aminogruppen mit Bernsteinsäureanhydrid und Tetrahydrophthalsäureanhydrid und Pyridoxylierung von Lysin mit Pyridoxal-5-phosphat und anschießende Reduktion mit NaBH₄.
Die Guanidingruppe der Argininreste kann durch Bildung heterocyclischer Kondensationsprodukte mit Reagentien wie 2,3-Butandion, Phenylglyoxal und Glyoxal modifiziert werden.
Die Carboxylgruppe kann durch Carbodiimidaktivierung über die O-Acylisoharnstoffbildung mit anschließender Derivatisierung, beispielsweise zu einem entsprechenden Amid, modifiziert werden.
Sulfhydrylgruppen können durch Verfahren wie Carboxymethylierung mit Iodessigsäure oder Iodacetamid; Perameisensäureoxidation zu Cysteinsäure; Bildung eines Disulfidgemischs mit anderen Thiolverbindungen; Umsetzung mit Maleimid, Maleinsäureanhydrid oder einem anderen substituierten Maleimid; Bildung von Quecksilberderivaten unter Verwendung von 4-Chlormercuribenzoat, 4-Chlormercuriphenylsulfonsäure, Phenylquecksilberchlorid, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol und anderen Quecksilberverbindungen und Carbamoylierung mit Cyanat bei alkalischem pH-Wert modifiziert werden. Eine Modifizierung von Cysteinresten darf das Vermögen des Peptids, die notwendigen Disulfidbindungen zu bilden, nicht beeinträchtigen. Auch ist es möglich, die Sulfhydrylgrupen des Cysteins durch Selenäquivalente derart zu ersetzen, dass das Peptid anstelle einer oder mehrerer Disulfidbindungen eine Diselenbindung bildet.
Tryptophanreste können modifiziert werden, beispielsweise durch Oxidation mit N-Brombernsteinsäureimid oder Alkylierung des Indolrings mit 2-Hydroxy-5-nitrobenzylbromid oder Sulfenylhalogeniden. Tyrosinreste andererseits können durch Nitratisierung mit Tetranitromethan verändert werden, um ein 3-Nitrotyrosinderivat zu bilden.
Die Modifizierung des Imidazolrings eines Histidinrestes kann durch Alkylierung mit Iodessigsäurederivaten oder N-Carbethoxylierung mit Diethylpyrocarbonat durchgeführt werden.
Der Prolinrest kann beispielsweise durch Hydroxylierung in der 4-Position modifiziert werden.
Eine Liste einiger Aminosäuren mit modifizierten Seitenketten und anderer unnatürlicher Aminosäuren ist in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1
Diese Modifikationstypen können von Bedeutung sein, um das Peptid zu stabilisieren, wenn es einem Lebewesen verabreicht oder als diagnostisches Mittel verwendet wird.
Weitere erfindungsgemäße Derivate umfassen ein Spektrum von Glykosylierungsvarianten von einem vollständig nicht glykosylierten Molekül bis zu einem modifizierten glykosylierten Molekül. Veränderte Glykosylierungsmuster können aus der Expression rekombinanter Moleküle in verschiedenen Wirtszellen resultieren.
Die erfindungsgemäßen χ-Conotoxine sind typischerweise am C-Terminus amidiert, wobei jedoch Verbindungen mit einem freien Carboxylterminus oder anderen Modifizierungen am C-Terminus auch innerhalb des Erfindungsumfangs liegen. Vorzugsweise sind die Peptide amidiert oder haben einen freien Carboxylrest am C-Terminus.
Vorzugsweise behalten die Derivate natürlich vorkommender χ-Conotoxinpeptide die Cys-Reste und charakteristische Disulfidbindungsmuster. Die Derivate können zusätzliche Cys-Reste enthalten, vorausgesetzt, dass sie während der Bildung der Disulfidbindungen geschützt werden.
Bei einer Modifizierung, um Derivate natürlich vorkommender χ-Conotoxinpeptide zu bilden, ist es nützlich, die Aminosäuresequenzen natürlich vorkommender aktiver Peptide zu vergleichen, um zu bestimmen, welche, falls überhaupt, der Reste zwischen aktiven Spezies erhalten bleiben. Die Substitution dieser konservierten Reste, obwohl sie nicht ausgeschlossen wird, ist weniger bevorzugt als Substitutionen nicht konservierter Reste.
Derivate, in welchen Ala einen oder mehrere Reste ersetzt, können zur Identifizierung des Pharmacophors verwendet werden. Vorzugsweise werden gleichzeitig nur eine oder zwei Aminosäuren durch Ala ersetzt. Zusätzliche neue Peptide können hergestellt werden, wenn geladene, polare oder hydrophobe Reste ersetzt werden, um die genauere Definierung des Typs von Wechselwirkungen zu unterstützen, die an der Bindung dieser pharmakologischen Peptidklasse an ihren Rezeptor beteiligt sind. Nicht-konservative Ersetzungen, in welchen die Ladung umgekehrt wird oder polare Reste hydrophobe Reste ersetzen, können weiterhin Reste identifizieren, die an der Bindung beteiligt sind. Alle diese Peptide haben das Potential, eine erhöhte Potenz oder größere Selektivität zu zeigen. Nicht native Aminosäureveränderungen können auch enthalten sein, um Potenz, Selektivität und/oder Stabilität zu verbessern.
Es ist am wahrscheinlichsten, dass exponierte Reste an der Rezeptorbindung beteiligt sind, und sie können systematisch ersetzt werden. Ein besonderer Schwerpunkt wird auf die Veränderung von Resten, die an der Bindung beteiligt sind, und von Resten, die sich unmittelbar auf dem Rand des Pharmacophors befinden, unter Verwendung längerer Seitenkettenformen oder nicht konservierter Veränderungen gelegt, um zusätzliche Bindungswechselwirkungen für eine erhöhte Potenz und/oder Selektivität herauszufinden. Eine Verkleinerung oder Vergrößerung von Schleifengrößen und dem Ende von MrIA oder MrIB modifiziert die Wirkung weiter.
Es ist festzustellen, dass sich MrIA und MrIB aus einem Ende (Reste 1 bis 3) und zwei Schleifen (Reste 6 bis 9 und 11 und 12) zusammensetzen, wobei jedoch die erfindungsgemäßen χ-Conotoxinpeptide und deren Derivate nicht auf diejenigen mit dieser speziellen Anordnung von Aminosäuren und Disulfidbindungen beschränkt sind.
Weitere Anordnungen sind möglich, und vorausgesetzt, dass das resultierende Peptid die erforderliche Wirkung hat, liegt dieses Peptid innerhalb des Erfindungsumfangs. Vorzugsweise werden die Peptide mindestens zwei Cysteinreste und mindestens eine Disulfidbindung oder besonders bevorzugt vier Cysteinreste und zwei Disulfidbindungen haben.
Das Verbindungsvermögen der Disulfidbindungen in diesen Peptiden kann A-B/C-D, A-C/B-D oder A-D/B-C sein, wobei Letzteres für MrIA und MrIB bevorzugt ist. Dabei bedeuten A, B, C und D den ersten, zweiten, dritten bzw. vierten Cys-Rest, der an der Bildung der Disulfidbindung beteiligt ist.
Diese Peptide können auch markiert und verwendet werden, um Bindungsassays zur Identifizierung neuer Moleküle, die an derselben Stelle wirken, aufzustellen. So kann beispielsweise ein markierter Ligand von MrIA und MrIB Tritium eingebaut oder radioaktives Iod oder dergleichen haben, das durch einen Tyr bzw. einen anderen geeigneten Rest befestigt ist. Durch einen Tyr-Scan durch das jeweilige Peptid wird eine geeignete Stelle für den Einbau des Tyr gefunden. Die Inhibierung der Bindung solcher markierter Peptide an Gewebehomogenate oder exprimierte Transporter durch Verbindungen oder Gemische wird die Identifizierung von neuen an dieser Stelle aktiven Peptiden, einschließlich Peptiden, die im Serum und in Nerven- und Muskelgewebe von Säugetieren, einschließlich menschlichen Geweben, vorhanden sind, erlauben. Der Assay wird auch die Identifizierung von Nicht-Peptidmolekülen erlauben, die ebenfalls an derselben Stelle wie MrIA und MrIB wirken und Nützlichkeit als oral aktive Formen dieser Peptide haben können. Markierte Peptide erlauben zusätzlich Autoradiographiestudien, um die Stelle der Peptidbindung in verschiedenen Geweben zu identifizieren.
Teile dieser Sequenzen können verwendet werden, um ESTR-Datenbanken zu durchsuchen, um in Säuretieren Peptide oder Proteine zu identifizieren, die verwandte Sequenzinformationen enthalten, die zum Identifizieren endogener Liganden verwendet werden können, die auf ähnliche Weise in Säugetieren wirken.
Die erfindungsgemäßen χ-Conotoxine können unter Anwendung von Standardpeptidsyntheseverfahren und anschließender oxidativer Bildung von Disulfidbindungen hergestellt werden. So können beispielsweise die geradkettigen Peptide durch ein Festphasenverfahren unter Anwendung der BOC-Chemie, wie von Schnoltzer et al. (1992) beschrieben, synthetisiert werden. Nach Entfernung der Schutzgruppe und Abspaltung von dem festen Träger werden die reduzierten Peptide unter Anwendung von präparativer Chromatographie gereinigt. Die auf gereinigten reduzierten Peptide werden in gepufferten Systemen, beispielsweise wie in Beispiel 2 beschrieben, oxidiert. Die oxidierten Peptide werden unter Anwendung der präparativen Chromatographie aufgereinigt.
Bezugnahmen, in welchen die Synthese von Conotoxinen beschrieben ist, umfassen Sato et al., Lew et al. und WO 91/07980.
Die χ-Conotoxine können auch unter Anwendung einer rekombinanten DNA-Technik hergestellt werden. Eine Nucleotidsequenz, die für die gewünschte Peptidsequenz codiert, kann in einen geeigneten Vektor insertiert und das Protein in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert werden. In manchen Fällen kann eine weitere chemische Modifizierung des exprimierten Peptids, beispielsweise eine C-terminale Amidierung, geeignet sein. Unter manchen Umständen kann es erwünscht sein, eine oxidative Bindungsbildung des exprimierten Peptids als eine chemische Stufe nach der Peptidexpression durchzuführen. Dieser kann eine Reduktionsstufe vorhergehen, um das entfaltete Peptid zu liefern. Der Fachmann kann leicht die geeigneten Bedingungen für Reduktion und Oxidation des Peptids ermitteln.
Erfindungsgemäß wird weiterhin ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für die Sequenz codiert oder zu dieser komplementär ist, die für ein wie weiter oben beschriebenes χ-Conotoxinpeptid codiert.
In einem anderen erfindungsgemäßen Merkmal wird eine Nucleinsäuresonde bereitgestellt, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die für eine Sequenz codiert oder zu dieser komplementär ist, die für das gesamte χ-Conotoxinpeptid oder einen Teil davon codiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nucleinsäuresonde eine Nucleotidsequenz, die für eine Sequenz codiert oder dieser komplementär ist, die für die in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 gezeigte Sequenz codiert.
Wie hierin benutzt, umfasst die Bezugnahme auf eine "Sonde" die Bezugnahme auf einen Primer, der für die Amplifikation oder auf eine Sonde, die bei der direkten Hybridisierung verwendet wird.
Ein noch anderes erfindungsgemäßes Merkmal richtet sich auf Antikörper zu den erfindungsgemäßen χ-Conotoxinpeptiden. Solche Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein und aus natürlich vorkommenden Antikörpern zu den Peptiden ausgewählt oder spezifisch zu den Peptiden unter Anwendung von Standardverfahren gezüchtet werden. In letzterem Fall kann es sein, dass die Peptide zunächst mit einem Trägermolekül verknüpft werden müssen. Die erfindungsgemäßen Antikörper sind besonders nützlich als therapeutische oder diagnostische Mittel.
Diesbezüglich können spezifische Antikörper verwendet werden, um nach erfindungsgemäßen Peptiden zu durchmustern. Verfahren für solche Assays sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise Sandwich-Assays und ELISA. Die Kenntnis von Peptidspiegeln kann für die Überwachung bestimmter therapeutischer Vorschriften von Bedeutung sein.
Weiterhin kann es möglich sein, antiidiotypische Antikörper unter Anwendung aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren herzustellen. Diese antiidiotypischen Antikörper und ihre Verwendung als therapeutische Mittel bilden ein weiteres erfindungsgemäßes Merkmal.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können DNA oder RNA sein. Liegt das Nucleinsäuremolekül in DNA-Form vor, kann es genomische DNA oder cDNA sein. RNA-Formen der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle sind im Allgemeinen mRNA.
Obwohl die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle im Allgemeinen in isolierter Form vorliegen, können sie integriert in, ligiert bzw. auf andere Weise fusioniert oder assoziiert mit anderen genetischen Molekülen wie Vektormolekülen, insbesondere Expressionsvektormolekülen, sein. Vektoren und Expressionsvektoren sind im Allgemeinen zur Replikation und, falls anwendbar, zur Expression in einer oder beiden von einer prokaryontischen Zelle oder einer eukaryontischen Zelle in der Lage. Vorzugsweise umfassen prokaryontische Zellen E. coli, Bacillus sp und Pseudomonas sp. Bevorzugte eukaryontische Zellen umfassen Hefe-, Pilz-, Säugetier- und Insektenzellen.
Dementsprechend betrifft ein wieder anderes erfindungsgemäßes Merkmal ein genetisches Konstrukt, das einen Vektorteil und ein Gen, das in der Lage ist, für ein erfindungsgemäßes Peptid zu codieren, umfasst.
Vorzugsweise ist der Genteil des genetischen Konstrukts operabel mit einem Promotor in dem Vektor derart verknüpft, dass der Promotor zur direkten Expression des Genteils in einer geeigneten Zelle in der Lage ist.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf solche genetischen Konstrukte und auf diese enthaltenden prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen.
Chimären von χ-Conotoxinen wie MrIA mit anderen Conotoxinen oder zusätzlich mit anderen Peptiden bzw. Proteinen können hergestellt werden, um die Aktivität in anderen Molekülen zu gestalten, in manchen Fällen, um ein neues Molekül mit einer zusätzlichen Funktionalität herzustellen. Dies wird vorzugsweise unter Verwendung des (der) Segmente(s) der Sequenz dieser Peptide getan, das (die) das Pharmacophor enthält (enthalten). Wenn das Pharmacophor diskontinuierlich ist, sollten die das Pharmacophor aufbauenden Segmente in dem neuen Konstrukt angeordnet werden, um eine Bindung an den Rezeptor zu erlauben. Chimären mit anderen Conotoxinen können zusätzliche Cys-Reste und zusätzliche Disulfidbindungen enthalten.
Es ist Conotoxinpeptiden innerhalb einer Wirkungsklasse gemeinsam, dass sie ein ähnliches Disulfidbindungsmuster mit Peptidschleifen zwischen den jeweiligen Cysteinresten haben. Bei χ-MrIA und χ-MrIB verknüpfen Disulfidbindungen den ersten und den vierten und den zweiten und den dritten Cysteinrest. Dieses Muster unterscheidet sich von dem Bindungsmuster, das bei α-Conotoxinpeptiden beobachtet wird. Trotz dieses Unterschiedes können chimäre Derivate hergestellt werden, indem eine Schleife eines χ-Conotoxinpeptids mit der Schleife substituiert wird, die eine Sequenz von einem anderen Peptid, einschließlich α-Conotoxin, umfasst.
Die Erfindung umfasst auch Dimere, Trimere usw. von χ-Conotoxinpeptiden sowie an andere Peptide gebundene χ-Conotoxinpeptide.
Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen χ-Conotoxinpeptide 10 bis 30 und besonders bevorzugt 11 bis 20 Aminosäuren.
Die vollständige Gensequenz von natürlich vorkommenden χ-Conotoxinpeptiden kann unter Anwendung einer kombinierten 5'-RACE- und 3'-RACE-Strategie, zusammen mit Klonieren und DNA-Sequenzieren, erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen χ-Conotoxinpeptide sind aktiv beim Inhibieren neuronaler Noradrenalintransporter. Erfindungsgemäß wird die Verwendung eines χ-Conotoxinpeptids als Inhibitor eines neuronalen Noradrenalintransporters und bei der Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen oder Störungen in Bezug auf welche die Inhibierung eines neuronalen Noradrenalintransporters mit einer wirksamen Behandlung verbunden ist, bereitgestellt. Eine solche Wirkung pharmakologischer Mittel ist verbunden mit der Wirkung bei Prophylaxe oder Behandlung von Erkrankungen oder Störungen des kardiovaskulären oder Harnwegssystems, von Befindlichkeitsstörungen oder bei der Behandlung oder Bekämpfung von Schmerzen bzw. Entzündungen.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Behandlung oder Verhütung von kardiovaskulären oder Harnwegsstörungen bzw. -erkrankungen oder Befindlichkeitsstörungen oder zur Behandlung bzw. Bekämpfung von Schmerzen oder Entzündungen, einschließlich der Stufe der Verabreichung einer wirksamen Menge eines isolierten, synthetischen oder rekombinanten χ-Conotoxinpeptids mit dem Vermögen, den neuronalen Noradrenalintransporter zu inhibieren, an ein Säugetier, bereitgestellt.
Beispiele für Erkrankungen oder Störungen des Harnwegssystems umfassen Harn- und Stuhlinkontinenz. Beispiele für kardiovaskuläre Erkrankungen oder Störungen umfassen Arhythmien verschiedenen Ursprungs und Schäden an den Herzkranzgefäßen. Beispiele für Befindlichkeitsstörungen umfassen Depressionen, Ängste und Süchte wie Rauchen. Beispiele für Schmerz umfassen chronischen, neuropathischen und Entzündungsschmerz.
Vorzugsweise braucht das Säugetier eine solche Behandlung, obwohl das Peptid auch prophylaktisch verabreicht werden kann.
Erfindungsgemäß wird auch eine Zusammensetzung bereitgestellt, die ein isoliertes, synthetisches oder rekombinantes χ-Conotoxinpeptid mit dem Vermögen, einen neuronalen Adrenalintransporter zu inhibieren, und einen Träger oder ein Verdünnungsmittel, der (das) pharmazeutisch verträglich ist, umfasst.
Vorzugsweise liegt die Zusammensetzung in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung vor.
Auch wird die Verwendung eines isolierten, synthetischen oder rekombinanten χ-Conotoxinpeptids mit dem Vermögen, einen neuronalen Noradrenalintransporter zu inhibieren, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prophylaxe von kardiovaskulären oder Harnwegsstörungen bzw. -erkrankungen oder Befindlichkeitsstörungen und für die Behandlung oder Bekämpfung von Schmerzen bzw. Entzündungen bereitgestellt.
Weiterhin ist festzustellen, dass der Noradrenalintransporter nicht nur von Nervenzellen, sondern auch von anderen Geweben, einschließlich Plazenta, Lungenendothelzellen und Gebärmutter, exprimiert wird. Die erfindungsgemäßen Peptide können auch beim Inhibieren dieser Noradrenalintransporter wirksam und bei der Behandlung von Störungen, an welchen diese Transporter beteiligt sind, nützlich sein.
Wie der Fachmann leicht erkennen wird, sind Verabreichungsweg und Charakter des pharmazeutisch verträglichen Trägers von dem Charakter des Zustandes und des zu behandelnden Säugetiers abhängig. Dabei wird angenommen, dass die Wahl eines bestimmten Trägers oder Abgabesystems und des Verabreichungswegs sich leicht vom Fachmann treffen lässt. Bei der Herstellung einer Formulierung, welche die aktiven Peptide enthält, sollte darauf geachtet werden, sicherzustellen, dass die Wirksamkeit des Peptids nicht in dem Verfahren zerstört wird, und dass das Peptid in der Lage ist, seine Wirkungsstelle zu erreichen, ohne zerstört zu werden. Unter gewissen Umständen kann es erforderlich sein, das Peptid durch aus dem Stand der Technik bekannte Mittel zu schützen, beispielsweise durch Mikroumkapselung. Auf ähnliche Weise sollte der Verabreichungsweg derart gewählt werden, dass das Peptid seine Wirkungsstelle erreicht.
Die pharmazeutischen Formen, die für eine injizierbare Verwendung geeignet sind, umfassen sterile injizierbare Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die zur sofortigen Verabreichung bestimmte Herstellung steriler injizierbarer Lösungen. Sie sollten unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und können vor Oxidation und der verschmutzenden Einwirkung von Mikroorganismen wie Bakterien oder Pilzen geschützt werden.
Der Fachmann kann leicht geeignete Formulierungen für die erfindungsgemäßen Peptide oder modifizierten Peptide unter Verwendung herkömmlicher Ansätze bestimmen. Das Auffinden bevorzugter pH-Wert-Bereiche und geeigneter Arzneimittelgrundlagen, beispielsweise Antioxidantien, ist Routine im Stand der Technik (siehe beispielsweise Cleland et al., 1993). Puffersysteme werden routinemäßig verwendet, um pH-Werte innerhalb eines gewünschten Bereiches bereitzustellen und umfassen Carbonsäurepuffer, beispielsweise Acetat, Citrat, Laktat und Succinat. Eine Vielfalt von Antioxidantien ist für solche Formulierungen erhältlich, einschließlich phenolischer Verbindungen wie BHT oder Vitamin E, Reduktionsmitteln wie Methionin bzw. Sulfit und Metallchelatbildnern wie EDTA.
Das Lösungs- oder Dispersionsmittel für die injizierbare Lösung oder Dispersion kann ein beliebiges der herkömmlichen Lösungsmittel- oder Trägersysteme für aktive Peptide und beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol), geeignete Mischungen davon und Pflanzenöle enthalten. Die richtige Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung einer Beschichtung wie aus Lecithin, durch Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße bei einer Dispersion und durch die Verwendung von Tensiden aufrechterhalten werden. Die Verhinderung der Einwirkung von Mikroorganismen kann erforderlichenfalls durch den Einschluss verschiedener Bakterizide und Fungizide, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure und Thimerosal, erreicht werden. In vielen Fällen ist es bevorzugt, Mittel zur Einstellung der Osmolalität, beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid, einzubauen. Vorzugsweise ist die zum Injizieren bestimmte Formulierung isotonisch mit Blut. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von die Absorption verzögernden Mitteln, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine, in den Zusammensetzungen erreicht werden. Pharmazeutische Formen, die für eine Injektion geeignet sind, können durch einen beliebigen geeigneten Weg, einschließlich intravenöser, intramuskulärer, intrazerebraler, intrathekaler und epiduraler Injektion bzw. Infusion, verabreicht werden.
Sterile injizierbare Lösungen lassen sich durch den Einbau der aktiven Verbindungen mit dem erforderlichen Anteil in das geeignete Lösungsmittel mit verschiedenen der anderen Bestandteile wie den zuvor aufgezählten, erforderlichenfalls mit anschließender Filtriersterilisation, herstellen. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch den Einbau der verschiedenen sterilisierten Wirkstoffe in einen sterilen Träger, der das Grunddispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile von den weiter oben aufgezählten enthält, hergestellt. Bei sterilen Pulvern für die Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind bevorzugte Herstellungsverfahren die Vakuumtrocknung oder Gefriertrocknung einer zuvor steril filtrierten Lösung des Wirkstoffs plus zusätzlicher gewünschter Bestandteile.
Wenn die Wirkstoffe auf geeignete Weise geschützt sind, können sie oral verabreicht werden, beispielsweise mit einem inerten Verdünnungsmittel oder mit einem verstoffwechselbaren essbaren Träger, sie können in einer harten oder weichen Gelatinekapsel eingeschlossen werden, können zu Tabletten gepresst oder direkt in das Lebensmittel der Ernährungsvorschrift eingebaut werden.
Für eine orale therapeutische Verabreichung kann die wirksame Verbindung in eine Arzneimittelgrundlage eingebaut und in Form von essbaren Tabletten, in der Mundhöhle zergehenden Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Scheibchen und dergleichen verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Präparate enthalten vorzugsweise mindestens 1 Gew.-% wirksame Verbindung. Der prozentuale Anteil der Zusammensetzungen und Präparate kann selbstverständlich variiert werden und kann bequemerweise zwischen etwa 5 bis etwa 80 Gew.-% der Einheit liegen. Der Anteil der wirksamen Verbindung in solchen therapeutisch nützlichen Zusammensetzungen ist derart, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dergleichen können auch die anschließend aufgezählten Komponenten enthalten: Ein Bindemittel wie Gummi, Akaziengummi, Maisstärke oder Gelatine, Arzneimittelgrundlagen wie Dicalciumphosphat, ein Sprengmittel wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und dergleichen, ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat, ein Süßungsmittel wie Sucrose, Laktose oder Saccharin oder ein Geschmacksstoff wie Pfefferminze, Salicylsäuremethylester oder Kirschgeschmack können zugesetzt werden. Wenn die Form der Dosiereinheit eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu den zuvor genannten Materialien einen flüssigen Träger enthalten. Es können verschiedene andere Materialien als Beschichtung oder um die physikalische Form der Dosiereinheit auf andere Weise zu modifizieren, vorhanden sein. So können beispielsweise Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schelllack, Zucker oder beidem beschichtet werden. Ein Sirup oder Elixier kann die wirksame Verbindung, Sucrose als Süßungsmittel, Methyl- und Propylparaben als Konservierungsstoffe, einen Farbstoff und einen Geschmacksstoff wie Kirsch- oder Orangegeschmack enthalten. Selbstverständlich sollte jeder Stoff, der zur Herstellung der Form einer Dosiereinheit verwendet wird, pharmazeutisch rein und in den verwendeten Mengen im Wesentlichen nicht-toxisch sein. Zusätzlich kann (können) die wirksame(n) Verbindung(en) in Präparate und Formulierungen mit allmählicher Freisetzung eingebaut werden.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf beliebige andere Formen, die für eine Verabreichung geeignet sind, beispielsweise topische Applikation wie Cremes, Lotionen und Gele, oder Zusammensetzungen, die für eine Inhalation oder intranasale Abgabe, beispielsweise Lösungen oder trockene Pulver, geeignet sind.
Parenterale Dosierungsformen, einschließlich denjenigen, die für eine intravenöse, intrathekale, intrazerebrale oder epidurale Abgabe geeignet sind, sind bevorzugt.
Pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel umfassen ein es) von und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, Bakterizide und Fungizide, isotonische und die Absorption verzögernde Mittel und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist aus dem Stand der Technik bekannt. Außer dass ein herkömmliches Medium oder Mittel sich mit dem Wirkstoff nicht verträgt, liegt seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzung innerhalb des Erfindungsumfangs. Zusätzlich können auch andere Wirkstoffe in die Zusammensetzung eingebaut werden.
Für eine Erleichterung der Verabreichung und der Einheitlichkeit der Dosierung ist es besonders vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in Dosierungseinheitsform zu formulieren. Dabei bezieht sich die verwendete Dosierungseinheitsform auf physikalisch diskrete Einheiten, die für Einheitsdosierungen für das zu behandelnde Säugetier geeignet sind, wobei jede Einheit eine festgelegte Menge Wirkstoff enthält, die berechnet ist, um den gewünschten therapeutischen Effekt hervorzurufen, zusammen mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger. Die Spezifizierung der erfindungsgemäßen neuen Dosierungseinheitsformen wird (a) von den einzigartigen Charakteristika des Wirkstoffs und dem zu erreichenden bestimmten therapeutischen Effekt und (b) von den Beschränkungen, die der Technologie der Compoundierung eines solchen Wirkstoffs für die Behandlung einer Erkrankung von Lebewesen in einem kranken Zustand, in welchem die körperliche Gesundheit, wie hierin im Einzelnen beschrieben wird, beeinträchtigt ist, eigen sind, bestimmt und ist direkt davon abhängig.
Der hauptsächliche Wirkstoff wird für eine bequeme und wirkungsvolle Verabreichung in wirksamen Mengen mit einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger in Dosierungseinheitsform compoundiert. Eine Dosierungseinheitsform kann beispielsweise die hauptsächliche wirksame Verbindung mit einer Menge von 0,25 μg bis etwa 2000 mg enthalten. Ausgedrückt in Anteilen, liegt die wirksame Verbindung im Allgemeinen von etwa 0,25 μg bis etwa 200 mg/ml Träger vor. Bei Zusammensetzungen, die zusätzliche Wirkstoffe enthalten, wird die Dosierung in Abhängigkeit von der üblichen Dosis und der Art und Weise der Verabreichung dieser Wirkstoffe bestimmt.
Die Erfindung wird anschließend unter Bezugnahme auf die Beispiele und die im Anhang befindlichen Zeichnungen näher erläutert, wobei es jedoch selbstverständlich ist, dass die Besonderheit der folgenden Beschreibung die Allgemeinheit der vorhergehenden Beschreibung der Erfindung nicht aufheben soll.
Bezüglich der Figuren zeigt:
1 ein Diagramm, das die typische Wirkung von χ-MrIA auf den Zeitverlauf der Kontraktionen des in zwei Hälften geschnittenen Vas deferens einer Rattenprostata auf eine Feldstimulation mit einem einzigen supramaximalen Impuls (55 V, 1 ms) darstellt; χ-MrIA (30 nM bis 3 μM) wurde dem Organbad in halblogarithmischen Einheitsschritten kumulativ zugegeben,
2 ein Diagramm der Wirkung von χ-MrIA, -MrIA bei Kontraktionsreaktionen von in zwei Hälften geschnittenen Teilen des Vas deferens eines Rattennebenhodens auf exogene α₁-Adrenozeptor-Agonisten, (a) logarithmische Konzentration-Reaktion-Kurven für Noradrenalin ohne (O) und mit 1 μM (Δ) oder 3 μM (☐) in χ-MrIA, -MrIA; (b) logarithmische Konzentration-Reaktion-Kurven für Methoxamin ohne (O) und mit (☐) 3 μM χ-MrIA; jeder Wertepunkte in (a) und (b) bedeutet den Mittelwert ± SA von Beobachtungen an 4 bis 5 einzelnen Gewebepräparaten; einige Fehlerbalken sind von den Symbolen verdeckt,
3 ein Diagramm, das die Inhibition durch χ-MrIA der Desipramin-empfindlichen Akkumulation von [³H]-Noradrenalin in Eizellen eines chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), die mit dem cDNA-Klon für den humanen neuronalen Noradrenalintransporter transfektiert waren, darstellt; die Akkumulation von [³H]-Noradrenalin ist angegeben als prozentualer Anteil der zellulären Aufnahme ohne χ-MrIA; die Datenpunkte bedeuten den Mittelwert ± SA von Beobachtungen an 4 einzelnen Versuchen, und
4 ein Diagramm, das die Derivatisierung von Kegelschneckengift-Peptidsequenzen darstellt; 5'-RACE-PCR unter Verwendung der Primer AP1 + CHI-1B produzierten die 5'-UTR- und Leader-Peptidsequenz, die anschließend verwendet wurde, um die für χ-Conotoxine spezifischen PCR-Primer zu erzeugen; die 3'-UTR unter Verwendung der Primer CHI-1A + ANCHOR vervollständigte die Derivatisierung der übriggebliebenen reifen Peptidsequenz und der 3'-UTR-Sequenz.
BEISPIELE
Arzneimittel
Die Arzneimittel, die in diesem und den folgenden Beispielen verwendet wurden, umfassen: Desipraminhydrochlorid (Sigma), Indomethacin (Sigma), Methoxaminhydrochlorid (Sigma), (–)-Noradrenalinbitartrat (Sigma), [³H]-I-Noradrenalin (spezifische Aktivität 2200 Ci/mM, New England Nuclear, Boston, MA, USA), Tetrodotoxin (Sigma) und Yohimbinhydrochlorid (Sigma).
Statistische Analyse
Die Daten für die anschließenden Beispiele sind als Mittelwert und Standardabweichung von 4 bis 6 Versuchen angegeben. Die sigmoidale Kurvenanpassung für die Berechnung der EC₅₀-Werte wurde durch nichtlineare Regression unter Verwendung der Software Igor Pro (WaveMetrics) durchgeführt. Differenzen zwischen den Mittelwerten wurden durch den (zweiendigen) Student-t-Test unter Verwendung der Software Prism (GraphPad) bewertet. Werte von P < 0,05 wurden als solche genommen, die statistisch signifikante Differenzen anzeigen.
Beispiel 1
Präparation von Ratten-vas-deferens
Männliche Wistar-Ratten (250 bis 350 g) wurden durch einen Schlag auf den Kopf getötet und die Vasa deferentia entfernt. Jedes Gewebe wurde in hälftig geschnittene Nebenhoden- und Prostatateile geteilt. Die Gewebesegmente wurden in 5-ml-Organbädern unter einer Spannung von 0,5 g befestigt. Die Badlösung hatte folgende Zusammensetzung (mM): NaCl, 119; KCl, 4,7; MgSO₄, 1,17; KH₂PO₄, 1,18; NaHCO₃, 25,0; Glucose, 5,5; CaCl₂, 2,5 und EDTA, 0,026; wurde bei 37 °C gehalten und mit 5 % Vol./Vol. CO₂ in O₂ gespült. Es wurde das Gleichgewicht der Präparate mindestens 45 min lang vor Beginn der Versuche einstellen gelassen. Die Kontraktionen wurden von einem isometrischen Kraftaufnehmer (Narco Bio-System F-60) gemessen und von einem Power Macintosh Computer unter Verwendung der Software Chart version 3.5.4/s und des Datenerfassungssystems MacLab/8s (ADInstruments) bei einer Probenfrequenz von 200 Hz aufgezeichnet.
Die hälftig geschnittenen Prostatasegmente wurden verwendet, um die Wirkung von χ-MrIA auf die von der sympathischen Neurotransmission vermittelten elektrisch hervorgerufene Kontraktion des glatten Muskels zu untersuchen. Die Gewebepräparate wurden mit stimulierenden Platinelektroden gespreizt. Die Elektrische-Feld-Stimulation (EFS) wurde in 3-min-Intervallen unter Anwendung eines einzigen 55-V-Impulses mit einer Dauer von 1 ms, erzeugt von einem Grass-S44-Stimulator, durchgeführt. Die Kontraktionen konnten von Tetrodotoxin (0,1 μM) blockiert werden, was anzeigt, dass sie neural vermittelt waren. Steigende Peptidkonzentrationen wurden dem Organbad kumulativ in halblogarithmischen Einheitsinkrementen zugegeben. Jede Dosis wurde gegeben, wenn die Wirkung der vorhergehenden Dosis auf die Reaktion auf die elektrische Stimulation einen Gleichgewichtszustand erreicht hatte.
Wirkung von χ-MrIA auf die sympathische Neurotransmission
Die hälftig geschnittenen Teile des Rattenprostata-Vasdeferens reagierten auf die Feldstimulation mit einer zweiphasigen Kontraktion. Bei diesem Präparat waren die zwei Komponenten der zweiphasigen Kontraktion zeitlich gut voneinander getrennt. Der erste Teil der Reaktion war der dominante und erreichte eine maximale Stärke von etwa 200 ms nach Abgabe des elektrischen Impulses. Die zweite Phase der Kontraktion erreichte ihre Spitze etwa 500 ms nach Stimulation. Unsere Versuche, die pharmakologische Wirkung von χ-MrIA zu identifizieren, begannen mit der Untersuchung seiner Effekte in dem Feld-stimulierten Ratten-Vas-deferens. Die Wirkung von χ-MrIA auf die Reaktion des Präparates auf die Feldstimulation ist in 1 gezeigt. Das Conotoxin (30 nM bis 3 μM) bewirkte die Verstärkung der zweiten Kontraktionsphase. Es wurde festgestellt, dass dieser Effekt konzentrationsabhängig ist. Indem die Kontrollreaktion von den Spuren subtrahiert wurde, die in Gegenwart von χ-MrIA erhalten worden waren, wurde die spezifische Verstärkung ausschließlich der zweiten Komponente der Kontraktion durch das Peptid offensichtlich. Es kann auch eine Kontraktions-Reaktions-Kurve für χ-MrIA, das wirkt, indem es spezifisch die zweite Komponente potenziert, konstruiert werden.
Die Wirkung von χ-MrIA auf die elektrisch ausgelöste Reaktion war sehr spezifisch und verstärkte ausschließlich die zweite Komponente der zweiphasigen Reaktion. Diese späte Kontraktionsphase wird als eine solche angesehen, die von Noradrenalin vermittelt und selektiv von Prazosin und anderen α₁-Adrenozeptor-Antagonisten inhibiert wird. Die erste Kontraktionsphase, die auf die Aktivierung von postjunktionalen P_2x-Purinozeptoren durch freigesetztes ATP zurückzuführen ist, war nicht auf eine ähnliche Weise verstärkt. Die Größe der noradrenergen Kontraktionskomponente wird von der Noradrenalinmenge, die von der sympathischen Nervenleitung freigesetzt wird, der Dichte der postjunktionalen α₁-Adrenozeptoren und deren Kopplung an die Effektorsysteme und der Geschwindigkeit, mit welcher Noradrenalin von der Synapse entfernt wird, modifiziert.
Der Antagonismus bei präsynaptischen α₂-Adrenozeptoren ist als ein solcher bekannt, der die elektrisch ausgelöste Abgabe von Noradrenalin aus sympathischen Nerven durch Blockierung der Aktivierung eines negativen Feedbacksystems durch freigesetztes Noradrenalin verstärkt. Jedoch kann der α₂-Adrenozeptor-Antagonismus nicht der Wirkungsmechanismus von χ-MrIA sein. Anders als χ-MrIA wirken α₂-Adrenozeptor-Antagonisten wie Yohimbin und Idazoxan so, dass sie gleichermaßen die purinergen und noradrenergen Kontraktionskomponenten des Ratten-Vasdeferens verstärken. Weiterhin ist die Reaktion auf einen einzigen Impuls, im Gegensatz zu einem Stimulizug, nicht der Regulation durch diesen negativen Feedbackmechanismus unterworfen, da kein Agonist an diesen Rezeptorstellen zum Zeitpunkt der Stimulation vorhanden ist. Dementsprechend hat Yohimbin (1 μM) keinen Einfluss auf die in diesem Versuch ausgelösten Reaktionen.
Beispiel 2
Präparat zur Untersuchung der Wirkung von χ-MrIA auf Reaktionen auf α₁-Adrenozeptor-Agonisten
Das Ratten-Vas-deferens wurde wie weiter oben beschrieben verwendet, außer dass die hälftig geschnittenen Nebenhodensegmente nicht elektrisch stimuliert wurden. Diese Präparate wurden stattdessen verwendet, um Konzentrations-Reaktions-Kurven für Noradrenalin und Methoxamin ohne und mit χ-MrIA aufzustellen. In diesem Gewebe verursachten Noradrenalin und Methoxamin eine Kontraktion des glatten Muskels über die Aktivierung postjunktionaler α₁-Adrenozeptoren. χ-MrIA mit einer Konzentration von entweder 1 μM oder 3 μM wurde dem Organbad zugegeben und das Gleichgewicht mit dem Gewebe 20 min lang vor der kumulativen Zugabe von Noradrenalin oder Methoxamin einstellen gelassen. Es wurde eine einzige Konzentrations-Reaktions-Kurve pro Präparat bestimmt mit kontralateralen Gewebesegmenten, denen kein χ-MrIA zugesetzt worden war und welche als Kontrolle dienten.
Wirkung von χ-MrIA auf Reaktionen auf α₁-Adrenozeptor-Agonisten
Es war möglich zu bestimmen, ob die Wirkung von χ-MrIA stromaufwärts oder stromabwärts von der Neurotransmitter-Freisetzung stattfand, durch Untersuchung des Einflusses des Peptids auf die Reaktion auf exogen verabreichtes Noradrenalin. Da χ-MrIA die Potenz von im Bad verabreichtem Noradrenalin verstärkte, kann geschlussfolgert werden, dass das Conotoxin durch Potenzierung der Reaktion auf Noradrenalin wirkt, anstatt dass es durch Verstärkung von dessen Freisetzung aus neuronalen Vorräten wirkt. Diese Potenzierung konnte als Folge eines erhöhten α₁-Adrenozeptor-Reaktionsvermögens oder einer verschlechterten Beendigung der Wirkung des Noradrenalins auftreten. Der α₁-Adrenozeptor-Agonist Methoxamin wurde verwendet, um festzustellen, welches davon der Wirkmechanismus von χ-MrIA war. Dieser α₁-Adrenozeptor-Agonist unterscheidet sich von Noradrenalin insoweit, als er kein Substrat für den neuronalen Noradrenalintransporter ist. Dieser Transporter wirkt, indem er Noradrenalin und andere Catecholamine aus der Synapse durch Aufnahme in die Nervenenden entfernt und stellt den Hauptmechanismus für die Beendigung der Wirkung von Noradrenalin an den Adrenozeptoren von sympathisch innerviertem Gewebe dar. Da Methoxamin nicht der Entfernung durch diesen Mechanismus unterliegt, verstärkt die Inhibition des Transporters die Potenz seiner Wirkungen nicht.
Es wurde die Wirkung von χ-MrIA auf die Reaktionen der hälftig geschnittenen Segmente des Vas deferens von Rattennebenhoden auf zwei α₁-Adrenozeptor-Agonisten untersucht. Logarithmische Konzentrations-Reaktions-Kurven für Noradrenalin ohne und mit χ-MrIA sind in 2a gezeigt. Bei einer Konzentration von 1 μM wirkte χ-MrIA in Richtung Erhöhung der Empfindlichkeit des Gewebes gegenüber Noradrenalin und verschob die Konzentrations-Reaktions-Kurve nach links. Der beobachte Grad der Potenzierung war größer in Versuchen mit 3 μM χ-MrIA. Keine Conotoxinkonzentration veränderte die maximale Reaktion des Gewebes auf Noradrenalin. χ-MrIA mit einer Konzentration von 3 μM hatte keinen Einfluss auf die Konzentrations-Reaktions-Kurve für Methoxamin (2b). Die Beobachtung, dass χ-MrIA die Wirkung von Methoxamin nicht potenziert, im Gegensatz zu seinem Effekt auf das Reaktionsvermögen gegenüber Noradrenalin, stimmt damit überein, dass χ-MrIA ein Inhibitor des neuronalen Noradrenalintransporters ist.
Der fehlende Einfluss von χ-MrIA auf die Konzentrations-Reaktions-Kurve für Methoxamin zeigt auch, dass χ-MrIA keinen Effekt bei α₁-Adrenozeptoren hat, was offensichtlich würde als Parallelverschiebung der Kurve nach rechts. Dies unterscheidet χ-MrIA von einigen anderen Inhibitoren des Noradrenalintransports, insbesondere solchen, die als Antidepressiva verwendet werden. Das therapeutische Ziel vieler Antidepressiva ist der neuronale Noradrenalintransporter. Jedoch werden viele dieser Verbindungen, insbesondere die tricyclischen Antidepressiva, und in geringerem Ausmaß einige neuere Arzneimittel, die strukturell nicht mit den herkömmlichen Tricyclica verwandt sind, als solche angesehen, die an anderen Stellen, wie α₁-Adrenozeptoren und ACh-Muscarin-Rezeptoren, wirken.
Beispiel 3
Meerschweinchenileum
Männliche Meerschweinchen (285 bis 425 g), die über Nacht hungern gelassen worden waren, wurden durch einen Schlag auf den Kopf getötet und ausbluten gelassen. Ileumsegmente mit einer Länge von etwa 1,5 cm wurden entfernt und der lichte Inhalt durch vorsichtiges Waschen unter Verwendung einer mit der Badlösung gefüllten Spritze entfernt. Die Präparate wurden in 5-ml-Organbädern angeordnet, die eine Badlösung mit folgender Zusammensetzung enthielten (mM): NaCl, 136,9; KCl, 2,68; CaCl₂, 1,84; MgCl₂, 1,03; Glucose, 5,55; NaHCO₃, 11,9 und KH₂PO₄, 0,45; erwärmt auf 37 °C und mit 5 % Vol./Vol. CO₂ in O₂ gespült. Zur Erzeugung einer stabilen Grundlinie wurde Indomethacin (10 μM) der Badlösung zugegeben. Die Gewebe wurden einer Spannung von 1,0 g ausgesetzt und 40 min lang vor Versuchsbeginn das Gleichgewicht einstellen gelassen. Es wurden Nikotindosen (4 μM) anschließend in Abständen von 15 min zugegeben, bis die Reaktionen als konsistent festgestellt wurden. Danach wurde χ-MrIA (3 μM) zugegeben, wonach 25 min später eine weitere Nikotindosis zugegeben wurde. Die Reaktionen auf Nikotin wurden isometrisch gemessen und mit einer Probengeschwindigkeit von 10 Hz digitalisiert.
Wirkung von χ-MrIA auf Reaktionen auf Nikotin im Meerschweinchenileum
χ-MrIA (3 μM) hatte keine signifikante Wirkung auf die Reaktionen der Ileumsegmente auf Nikotin. Ohne Conotoxin betrug die mittlere Reaktion 3,83 ± 0,76 g, verglichen mit 4,07 ± 0,80 g, wenn χ-MrIA vorhanden war (p > 0,1, paarweiser t-Test, n = 4). Die α-Conotoxine blockieren ACh-Nikotin-Rezeptoren entweder des neuronalen oder des Muskelsubtyps. Unter Verwendung von isolierten Segmenten des Meerschweinchenileums wurde gezeigt, dass χ-MrIA nicht auf neuronale ACh-Nikotin-Rezeptoren abzielt. Aufgrund der Abhängigkeit der Kontraktionsreaktion auf die Aktivierung des Muscarinrezeptors wäre zu erwarten gewesen, dass die Reaktion des Meerschweinchenileums auf Nikotin in Gegenwart von χ-MrIA abgeschwächt würde, wenn das Conotoxin auch als ein Muscarin-ACh-Rezeptor-Antagonist wirkte. Bei diesem Präparat war die von Nikotin ausgelöste Freisetzung von ACh und verschiedenen anderen Neurotransmittern, welche postjunktionale Rezeptoren aktivieren, von χ-MrIA unbeeinflusst. Somit, und im Gegensatz zu vielen anderen Transportinhibitoren, fehlt χ-MrIA die Anti-Muscarin-Wirkung.
Beispiel 4
Mausphrenikusnerv-Hemidiaphragma-Präparate
Männliche Quackenbush-Mäuse (20 bis 30 g) wurden durch Genickbruch getötet. Es wurden das linke und das rechte Hemidiapraghma mit dem daran befestigten Phrenikusnerv entfernt. Der Boden eines jeden Hemidiaphragmas wurde zwischen zwei parallelen stimulierenden Platinelektroden und der Phrenikusnerv durch zwei kleine Platinschleifen für die Feldstimulation angeordnet. Das Präparat wurde bei 37 °C in einem 5-ml-Organbad, das mit 5 % Vol./Vol. CO₂ in O₂ gespült wurde, inkubiert. Die Zusammensetzung der Badlösung war (mM): NaCl, 135,0; KCl, 5,0; CaCl₂, 2,0; MgCl₂, 1,0; Glucose, 11,0; NaHCO₃, 15,0 und KH₂PO₄, 1,0. Die Gewebe wurden unter einer ruhenden Spannung von 1,0 g angeordnet. Nach einer mindestens 30 min langen Einstellung des Gleichgewichtes wurde eine abwechselnd direkte und indirekte Stimulierung in 10-s-Intervallen unter Anwendung eines 30-V-Impulses mit einer Dauer von 2 ms an dem Muskel bzw. ein 3-V-Impuls mit einer Dauer von 0,2 ms am Nerv durchgeführt. Der Einfluss einer Einzeldosis χ-MrIA mit einer Konzentration von 3 μM auf die direkt und indirekt ausgelöste Kontraktion wurde untersucht. Die Reaktionen wurden wie bei den Vasdeferens-Präparaten beschrieben digitalisiert und aufgezeichnet.
Wirkung von χ-MrIA auf die Reaktionen auf elektrische Stimulation des Mausphrenikusnerv-Hemidiaphragmas
Kontraktionen, die durch Feldstimulation des Phrenikusnervs oder durch direkte Muskelstimulation ausgelöst worden waren, waren nicht beeinflusst von 3 μM χ-MrIA (n = 4). χ-MrIA blockierte die Muskel-Nikotin-ACh-Rezeptoren in dem Mausphrenikusnerv-Hemidiaphragma-Präparat nicht. Die fehlende Wirkung von χ-MrIA auf die Skelettmuskulatur oder die motorischen Nerven unterscheidet es von der Mehrheit der Conotoxinpeptide, die bisher charakterisiert und welche lähmende Toxine sind und somit eine deutliche Rolle beim Beutefang spielen.
Beispiel 5
Zelluläre Aufnahme von (³H)-Noradrenalin
Chinesische Hamstereizellen (CHO-Zellen) wurden in 24-Loch-Platten (Falcon) in 10 % Vol./Vol. Rinderfötusserum gezüchtet. Nach Erreichen von 60 bis 70 % Konfluenz wurden die Zellen vorübergehend transfektiert (Lipofectamin, Gibco) mit einem Expressionsvektor (pcDNA3, Invitrogen), der die cDNA mit voller Länge für den humanen neuronalen Noradrenalintransporter enthielt (Pacholczyk et al., Nature, 350, 350-4 [1991]). Es wurde ein cDNA-Klon des neuronalen Noradrenalintransporters verwendet (Vollum Institute, Portland, OR, USA). Die Zellaufnahmestudien wurden 36 Stunden nach der Transfektion durchgeführt. Die CHO-Zellen wurden anfänglich mit einem Transportpuffer gewaschen, der enthielt (mM): NaCl, 157; KCl, 2,7; NaH₂PO₄, 11,8; MgCl₂, 1,0 und CaCl₂, 0,1 und mit einem pH 7,4. Die Zellen wurden anschließend mit einem Transportpuffer inkubiert, der 50 nM [³H]-Noradrenalin (erforderlichenfalls ergänzt mit nicht markiertem Noradrenalin) und 100 μM Ascorbinsäure enthielt. χ-MrIA (0,1 nM bis 1 μM) oder Desipramin (10 μM) wurde ebenfalls erforderlichenfalls eingebaut. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Zellen schnell mit eiskalter phosphatgepufferter konzentrierter Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in 0,1 % Vol./Vol. Triton-x lysiert. Die Zelllysate wurden für eine Flüssigkeitszintillationszählung aufgenommen, um ihren Grad an Radioaktivität zu bestimmen. Zusätzlich wurde ein Aliquot des Zelllysats verwendet, um die Proteinkonzentration zu messen (BioRad DC Protein-Assay). Die spezifische Aufnahme von [³H]-Noradrenalin durch den Noradrenalintransporter wurde als die gegenüber Desipramin (10 μM) empfindliche Komponente definiert.
Wirkung von χ-MrIA auf die zelluläre Akkumulation von (³H]-Noradrenalin
Die Akkumulation von Noradrenalin in CHO-Zellen, die den humanen neuronalen Noradrenalintransporter exprimieren, wurde auf weniger als 0,5 % des Kontrollanteils durch Desipramin (10 μM) gesenkt, was zeigte, dass die Akkumulation fast vollständig auf die spezifische Aufnahme über den klonierten Transporter zurückzuführen war. Es wurde nachgewiesen, dass der Noradrenalintransporter das Conotoxintarget in Zellaufnahmestudien war. χ-MrIA (0,1 nM bis 1 μM) inhibierte die Akkumulation von radiomarkiertem Noradrenalin auf eine konzentrationsabhängige Weise (3) bei einem logIC₅₀-Wert von –8,17 ± 0,0275 (n = 4). Die χ-MrIA-Konzentration, die erforderlich war, um die Akkumulation um 50 % zu inhibieren, wurde mit etwa 7 nM festgestellt. Diese Konzentration ist etwa um eine Größenordnung niedriger als die für Desipramin erforderliche, um dieselbe Wirkung zu erzielen.
Kokain und χ-MrIA sind beide natürlich vorkommende Verbindungen, jedoch sind sie einander recht unähnlich. Kokain ist ein Alkaloid, das aus den Blätter der Kokapflanze extrahiert wird, während χ-MrIA ein Peptid ist, das direkt von einem tierischen Gen codiert wird. Zusätzlich zu seinem Einfluss auf den Aufnahmetransporter ist Kokain dafür bekannt, dass es potente Lokalanästhesieeigenschaften besitzt. Dies ist auf die Blockade von sowohl dem Natrium- als auch dem Kaliumkanal zurückzuführen. Es wurde kein Hinweis auf die lokalanästhetische Wirkung von χ-MrIA in einem der Versuche gefunden. Es wurde festgestellt, dass χ-MrIA von sich aus weder einen kontrahierenden noch einen entspannenden Effekt auf den Tonus des Vas deferens hat. Ähnliche Studien zeigten, dass χ-Conotoxin den Dopamintransporter nicht inhibiert.
Beispiel 6
Die Bindung von tritiiertem Mazindol an den Noradrenalintransporter wurde in Zellen gemessen, die das Transporterprotein exprimierten (siehe Beispiel 5). Der Einfluss von χ-MrIA mit 10^-6 bis 10^-9 auf die Bindung von tritiiertem Mazindol wurde gemessen. χ-MrIA hatte keinen Einfluss auf die Bindung von tritiiertem Mazindol, was zeigt, dass es an einer Stelle im Unterschied zu herkömmlichen Noradrenalintransportinhibitoren wie Desipramin, Mazindol und Kokain nicht kompetitiv wirkt.
Beispiel 7
Derivatisierung der Gensequenz für die χ-Conotoxinpeptide
Die komplette Gensequenz für das χ-MrIA wurde unter Anwendung einer kombinierten 5'-RACE- (Random Amplification of cDNA Ends) und 3'-RACE-Strategie, zusammen mit Klonieren und DNA-Sequenzieren, isoliert.
5'-RACE
Der Oligonucleotidprimer CHI-1B wurde aus der reifen Peptidsequenz entworfen. Die Beziehung der Oligonucleotide zu dem Peptid ist wie folgt, zusammen mit der Oligonucleotidsequenz:
χ-MrIA NGVCCGYKLCHPC SEQ ID Nr. 3
CHI-1B 5' – CANGGRTGRCANARYTTRTA – 3' SEQ ID Nr. 4
AP1 5' – CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC – 3' SEQ ID Nr. 5
(wobei N = A/C/G/T, R = A/G, Y = C/T).
Unter Verwendung des Oligonucleotids CHI-1B zusammen mit dem AP1-Oligonucleotid auf cDNA-Templaten, die von der aus Kegelschneckengiftleitungen isolierten mRNA abgeleitet worden waren, wurde eine Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. Die PCR-Produkte, die die 5'-Region des MrIA-Gens repräsentieren, wurden isoliert, auf gereinigt, in bakteriellen Vektoren kloniert und sequenziert. Die Gensequenz für MrIA wurde aus C. marmoreus (4) erhalten.
3'-RACE
Die DNA-Sequenz für die 5'-Regionen des Gens wurde verwendet, um Oligonucleotide zu entwerfen, die in der Lage waren, die MrIA-Sequenz und Sequenzen von anderen eng verwandten Peptiden zu detektieren. Die Positionierung der Oligonucleotide in Bezug auf die Gensequenz ist in 4 gezeigt. Das Oligonucleotid CHI-1A wurde in PCR zusammen mit dem ANCHOR-Oligonucleotid verwendet, um DNA-Fragmente zu produzieren, die der Leader-Peptid-, reifen Peptid- und 3'-untranslatierten (3'-UTR) Region des Gens entsprachen. Eine PCR der Giftleitungs-cDNA-Template aus C. marmoreus produzierte DNA-Fragmente, die dem MrIA-Peptid entsprachen.
Die DNA-Sequenzen für die Oligonucleotide sind:
CHI-1A 5' – ACAGGCAGAATGCGCTGTCTCCC – 3' SEQ ID Nr. 6
ANCHOR5' – AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAAT – 3' SEQ ID Nr. 7
Komplette Sequenz für χ-MrIA
Die Gensequenz für χ-MrIA, die unter Anwendung von 5'-RACE und 3'-RACE produziert worden war, repräsentiert überlappende Fragmente des Gens. Diese Fragmente wurden kombiniert, um eine Konsensus-Sequenz für das Gen herzustellen. Die Konsensus-Sequenz ist die vollständige cDNA für das Gen und umfasst 5'-UTR, das Leader-Peptid, das reife Peptid und die 3'-UTR. Die χ-MrIA-Leader- und reife Peptid-Oligonucleotid-Sequenz ist in SEQ ID Nr. 8 gezeigt, während die Leader- und die reife Peptid-Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 9 gezeigt ist.
In dieser Beschreibung und den anschließenden Patentansprüchen bedeuten, sofern der Kontext nichts anderes erfordert, das Verb "umfassen" und Flexionen wie "umfasst" und "umfassend" den Einschluss einer festgestellten ganzen Zahl, eines Schritts oder einer Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten, aber nicht den Ausschluss einer beliebigen anderen ganzen Zahl oder eines Schritts oder einer Gruppe aus ganzen Zahlen oder Schritten.
SEQUENZLISTE

Claims

Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes χ-Conotoxinpeptid oder ein Derivat davon mit dem Vermögen, einen neuronalen Amintransporter zu inhibieren.
χ-Conotoxinpeptid nach Anspruch 1 mit dem Vermögen, einen neuronalen Noradrenalintransporter zu inhibieren.
Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes χ-Conotoxinpeptid mit dem Vermögen, einen neuronalen Amintransporter zu inhibieren, und welches eine Sequenz, die aus NGVCCGYKLCHOC SEQ ID Nr. 1 und VGVCCGYKLCHOC SEQ ID Nr. 2 ausgewählt ist, oder eine solche Sequenz, die eine oder mehrere Aminosäuredeletionen, -additionen, -substitutionen oder -seitenkettenmodifizierungen erfahren hat, besitzt.
χ-Conotoxinpeptid nach Anspruch 3, das χ-MrIA oder χ-MrIB ist.
χ-Conotoxinpeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 4, das ein selektiver Inhibitor eines neuronalen Noradrenalintransporters ist.
χ-Conotoxinpeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 5 mit einer zu vernachlässigenden oder keiner anticholinergen Wirkung.
χ-Conotoxinpeptid nach Anspruch 2 mit einer zu vernachlässigenden oder keiner Wirkung als Natriumkanalblocker.
χ-Conotoxinpeptid nach Anspruch 2 mit einer zu vernachlässigenden oder keiner Wirkung als Inhibitor eines Dopamintransporters.
χ-Conotoxinpeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit vier Cysteinresten und zwei Disulfidbindungen.
χ-Conotoxinpeptid nach Anspruch 9, worin die Disulfidbrückenbindung A-D/B-C ist, wobei A, B, C und D den ersten, zweiten, dritten bzw. vierten Cysteinrest bedeuten, die an der Disulfidbrückenbildung beteiligt sind.
Verwendung eines χ-Conotoxinpeptids nach einem der vorhergehenden Ansprüche in einem Rezeptorbindungsversuch, um die Wirksamkeit eines Moleküls als Inhibitor eines neuronalen Amintransporters, vorzugsweise eines neuronalen Noradrenalintransporters, zu untersuchen.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für eine Sequenz codiert oder zu dieser komplementär ist, die für ein χ-Conotoxinpeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 codiert.
Nucleinsäuresonde, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die für eine Sequenz codiert oder zu dieser komplementär ist, die für das gesamte χ-Conotoxinpeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einen Teil davon codiert.
Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper zu einem χ-Conotoxinpeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
Genetisches Konstrukt, das einen Vektorteil und eine Nucleinsäure umfasst, die in der Lage ist, für ein χ-Conotoxinpeptid nach einem Ansprüche 1 bis 10 zu codieren.
Chimäres Peptid, das ein Segment oder eine Sequenz eines natürlich vorkommenden χ-Conotoxinpeptids wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert und ein Segment oder eine Sequenz eines anderen biologisch wirksamen Peptids oder Proteins derart umfasst, dass das resultierende chimäre Peptid eine Aktivität besitzt, die mit dem anderen Peptid oder Protein verbunden ist.
χ-Conotoxinpeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von kardiovaskulären oder Harnwegsstörungen bzw. -erkrankungen, Befindlichkeitsstörungen oder bei der Behandlung oder Bekämpfung von Schmerzen oder Entzündungen.
Verwendung eines χ-Conotoxinpeptids nach einem der Ansprüche 2 bis 10 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten oder Störungen hinsichtlich welcher die Inhibition eines neuronalen Noradrenalintransporters mit einer wirksamen Behandlung oder Prophylaxe verbunden ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Arzneimittel für die Behandlung oder Prophylaxe von kardiovaskulären oder Harnwegsstörungen oder -erkrankungen, Befindlichkeitsstörungen oder für die Behandlung oder Bekämpfung von Schmerzen oder Entzündungen vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Erkrankung oder Störung des Harnwegssystems Harn- oder Stuhlinkontinenz ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die kardiovaskuläre Erkrankung oder Störung eine Arrhythmie oder eine Beeinträchtigung der Herzkranzgefäße ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Befindlichkeitsstörung eine Depression, Angst oder Sucht ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei der Schmerz ein chronischer, neuropathischer oder Entzündungsschmerz ist.
Zusammensetzung, die ein isoliertes, synthetisches oder rekombinantes χ-Conotoxinpeptid mit dem Vermögen, einen neuronalen Noradrenalintransporter zu inhibieren, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsstoff umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 24, die eine pharmazeutische Zusammensetzung ist.
Verwendung eines χ-Conotoxinpeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen oder Störungen in Bezug auf welche die Inhibition eines Noradrenalintransporters mit einer wirksamen Behandlung oder Prophylaxe verbunden ist.