DE69530389T2

DE69530389T2 - Dexanabinol-derivate und ihre verwendung als neuroprotektive pharmazeutische zusammensetzungen

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Publication number: DE69530389T2
Application number: DE69530389T
Authority: DE
Inventors: Raphael Mechoulam; Emil Pop; Mordechai Sokolovsky; Yoel Kloog; Anat Biegon
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem; Pharmos Corp
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem; Pharmos Corp
Priority date: 1994-02-07
Filing date: 1995-02-06
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2015-02-07
Also published as: JPH09511493A; IL112572A0; EP0765160A4; US5521215A; AU690221B2; SG49625A1; WO1995020958A1; DE69530389D1; ATE237324T1; EP0765160B1; CA2183466A1; AU1743395A; EP0765160A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verhinderung oder Linderung von Neurotoxizität. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen als Wirkstoff die stereospezifischen (+)-Enantiomere, mit (3S,4S)-Konfiguration, von Δ⁶-Tetrahydrocannabinol (THC)-artigen Verbindungen der allgemeinen Formel (I), wie unten definiert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Chronische degenerative Veränderungen sowie verzögerte oder sekundäre neuronale Schädigung, die auf eine direkte Schädigung des zentralen Nervensystems (ZNS) folgen, können durch pathologische Veränderungen der endogenen neurochemischen Systeme des Gehirns veursacht sein. Obwohl die genauen Mechanismen, die eine sekundäre Schädigung vermitteln, nur schlecht verstanden werden, können posttraumatische neurochemische Veränderungen eine Überaktivierung einer Neutrotransmitter-Freisetzung oder -Wiederaufnahme, Veränderungen einer präsynaptischen oder postsynaptischen Rezeptorbindung oder die pathologische Freisetzung oder Synthese endogener Faktoren einschließen. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Faktoren und des Timings der neurochemischen Kaskade nach einer ZNS-Schädigung stellt ein Möglichkeitsfenster zur Behandlung mit pharmakologischen Mitteln bereit, die die Synthese, Freisetzung, Rezeptorbindung oder physiologische Aktivität mit folgender Abschwächung neuronaler Schädigung und Verbesserung des Folgezustands modifizieren. In einer Vielzahl von Studien wurde vorgeschlagen, dass die Modifikation der Ereignisse nach einer Schädigung durch eine pharmakologische Maßnahme die funktionale Wiederherstellung sowohl in einer Vielfalt von Tiermodellen als auch bei einer klinischen ZNS-Schädigung fördern kann. Von einer pharmakologischen Manipulation der endogenen Systeme durch solche diversen pharmakologischen Mittel wie Anticholinergika, Antagonisten exzitatorischer Aminosäuren, Antagonisten von endogenem Opioid, Katecholamine, Serotoninantagonisten, Modulatoren von Arachidonsäure, Antioxidantien, Radikalfänger, Steroid- und Lipidperoxidationsinhibitoren, Antagonisten des Plättchen-aktivierenden Faktors, Anionenaustauschinhibitoren, Magnesium, Ganglioside und Calciumkanal-Antagonisten wurde vorgeschlagen, dass sie den funktionalen Folgezustand nach einer Gehirnschädigung potenziell verbessert (McIntosh, J. Neurotrauma 10: 215–243, 1993).
Die Pathogenese einer vielfältigen Gruppe neurologischer Störungen wurde mit einer übermäßigen Aktivierung von Rezeptoren exzitatorischer Aminosäuren in Zusammenhang gebracht. Diese Störungen schließen Epilepsie, fokale und globale Ischämie, ZNS-Trauma und verschiedene Formen der Neurodegeneration einschließlich der Chorea Huntington, Parkinsonschen Krankheit und Alzheimer Krankheit ein. Es wurden viele Bemühungen in die Entwicklung von Rezeptorantagonisten exzitatorischer Aminosäuren als therapeutische Mittel investiert (Rogawski, M. A., Trends in Pharmacol Sci. 14: 325–331, 19931.
Da bislang keine bewiesene effektive Therapie für eine neuronale Schädigung oder Degenerierung bekannt ist und zum Beispiel der Schlaganfall alleine eine der führenden Todesursachen in vielen Ländern ist, ist die Wichtigkeit des Auffindens solcher therapeutischen NMDA-Antagonisten selbsterklärend. Es wird wichtig sein, zu bestimmen, ob bestimmte NMDA-Antagonisten in bestimmten Krankheitszuständen wirksamer sind als andere oder weniger Nebenwirkungen aufweisen.
Manche der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind in den U.S.-Patenten 4,179,517 und 4,876,276 offenbart. Wie in diesen U.S.-Patenten offenbart wird, weisen diese im Wesentlichen reinen synthetischen (+)-(3S,4S)-THC-Derivate und -Analoga keine unerwünschten cannabimimetischen psychotropen Nebenwirkungen auf. Von diesen bekannten Verbindungen wurde beschrieben, dass sie analgetische, antiemetische und Antiglaukom-Wirksamkeit besitzen.
Die Erfinder haben nun gefunden, dass diese bekannten Verbindungen sowie manche neue Verbindungen zusätzlich zu der analgetischen, antiemetischen und Antiglaukom-Wirksamkeit auch wirksam gegen die oben erwähnten Krankheiten und Bedingungen sind, möglicherweise als Blocker von Rezeptoren exzitatorischer Aminosäuren, z. B. NMDA- oder Glutamat-Blocker, oder durch Wechselwirkung mit dem Glycinrezeptor, und wirksam sind bei der Linderung und Behandlung vieler abnormer Zustände, einschließlich der Neutrotransmitter-vermittelten Toxizität. Siehe U.S.-Patent Nr. 5,284,867 und die unten angegebene Offenbarung.
FR-A-2,394,541 offenbart Verbindungen der allgemeinen Formel
Diese Verbindungen weisen die entgegengesetzte Stereospezifität im Vergleich zu den Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf, d. h. sie sind die (–)-Enantiomere.
GB-A-1,464,695 offenbart Verbindungen der allgemeinen Formel
in welchen: Ring A ein Benzolring, ein Cyclohexanring oder ein Cyclohexenring ist, bei dem die Doppelbindung an Position 6a-10 ist; R, Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist; R₂ Wasserstoff oder Alkanoyl mit zwei bis fünf Kohlenstoffatomen ist; R₃ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl und R₄ und R₅ Wasserstoff oder Methyl sind, wobei mindestens einer von R₃, R₄ und R₅ nicht Wasserstoff ist; R₆ Alkyl mit vier bis acht Kohlenstoffatomen ist; und R, Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist. Wenn der Ring A Cyclohexan ist, wird ein Racemat von (+)- und (–)-Enantiomeren erhalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind insbesondere wirksam zur Linderung und sogar zum Verhindern von Glutamat-Neurotoxizität aufgrund akuter Schädigungen des zentralen Nervensystems (ZNS), wie Schädigungen aufgrund längerer Anfälle, beeinträchtigter oder verringerter Blutversorgung, von Glucose-Versorgungsmangel und mechanischem Trauma. Die vorliegenden Zusammensetzungen sind auch wirksam zur Linderung anderer Schädigungen des ZNS, wie Gift-induzierte Konvulsionen, von denen angenommen wird, dass sie mit anderen Aminosäurerezeptoren als dem von Glutamat assoziiert sind, z. B. Glycin.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch wirksam sein bei der Behandlung bestimmter chronischer degenerativer Krankheiten, die durch einen allmählichen selektiven neuronalen Verlust gekennzeichnet sind. In diesem Zusammenhang werden die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch als therapeutisch wirksam bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit betrachtet.
Die vorliegenden Zusammensetzungen sind bei Grand-Mal-Anfällen, globalen hypoxischen ischämischen Anfällen, bei Hypoxie, alleine oder in Kombination mit einer Blutflussverringerung (Ischämie) sowie in Fällen von Herzstillstand und in Fällen einer plötzlichen Okklusion von Hirnarterien (Schlaganfall) von speziellem Wert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, um Neurotoxizität exzitatorischer Aminosäuren aufgrund einer akuten Schädigung oder Vergiftung des ZNS zu verringern oder zu verhindern, wie Schädigungen aufgrund längerer Anfälle, beeinträchtigte oder verringerte Blutversorgung, Glucose-Versorgungsmangel und mechanisches Trauma und Vergiftungen durch z. B. Strychnin, Pikrotoxin oder Organophosphorverbindungen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch wirksam sein bei der Behandlung bestimmter chronischer degenerativer Krankheiten, die durch einen allmählichen selektiven neuronalen Verlust gekennzeichnet sind. In diesem Zusammenhang werden die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von Chorea Huntington, Parkinson'scher Krankheit und der Alzheimer-Krankheit als therapeutisch wirksam angesehen.
Wie oben angegeben, sind die vorliegenden Zusammensetzungen bei Anfällen, globalen hypoxischen ischämischen Schädigungen, bei Hypoxie, alleine oder in Kombination mit einer Blutflussverringerung (Ischämie) sowie in Fällen von Herzstillstand und in Fällen einer plötzlichen Okklusion von Hirnarterien (Schlaganfall) von besonderem Wert.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf pharmazeutische Zusammensetzungen für die oben genannten Zwecke, in welchen der Wirkstoff eine Verbindung der allgemeinen Formel:
mit (3S,4S)-Konfiguration und im Wesentlichen ohne das (3R,4R)-Enantiomer, wobei A-----B eine optionale 1(2)- oder 6(1)-Doppelbindung darstellt, R ist: (a) -Q, wobei Q eine heterocyclische Einheit mit einem labilen Wasserstoffatom ist, so dass die Einheit als ein Carbonsäureanalogon fungiert, (b) -R³X, wobei R³ C1-C5-Alkyl ist und X ist: Halogen, -OR', wobei R'' C1-C5-Alkyl ist, oder -OC(O)R''', wobei R''' Wasserstoff oder C1-C5-Alkyl ist, (c) -R³N(R'')₂, wobei R³ wie oben definiert ist und jeder der R'', die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff oder C1-C5-Alkyl ist, das gegebenenfalls eine terminale -OR'''- oder -OC(O)R'''-Einheit enthalten kann, wobei R''' wie oben definiert ist, (d) -R⁵, wobei R⁵ C2-C5-Alkyl ist, oder, wenn keine A-----B vorhanden ist, (e) -R³OR''', wobei R³ und R''' wie oben definiert sind, G ist: (a) ein Halogen, (b) C1-C5-Alkyl, (c) -OR'', wobei R'' wie zuvor definiert ist, oder (d) -OC(O)R''', wobei R''' wie zuvor definiert ist, und R² ist: (a) C1-C12-Alkyl, (b) OR'''', worin R'''' ein geradkettiges oder verzweigtes C2-C9-Alkyl ist, das am terminalen Kohlenstoffatom mit einer Phenylgruppe substituiert sein kann, oder (c) -(CH₂)OR''', wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 7 ist und R''' wie oben definiert ist; mit der Maßgabe, dass G, R und R² nicht OH, CH₂OC(O)C(CH₃)₃ bzw. 1,1-Dimethylheptyl sein dürfen, wenn A-----B eine 6(1)-Doppelbindung ist, und pharmazeutisch annehmbare Salze oder quaternäre Ammoniumderivate davon, ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf pharmazeutische Zusammensetzungen für die oben genannten Zwecke, in welchen der Wirkstoff eine Verbindung der gleichen allgemeinen Formel
mit (3S,4S)-Konfiguration und im Wesentlichen ohne das (3R,4R)-Enantiomer, wobei A-----B eine optionale 1(2)- oder 6(1)-Doppelbindung darstellt. In dieser Ausführungsform ist jedoch: R: -R³X, wobei R³ C1-C5-Alkyl ist und X: (a) -OC(O)-R⁴Y, wobei R⁴ ein linearer oder verzweigter Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Arylalkyl-, Alkylaryl- oder Heterocyclylrest oder ein mono- oder polyhydroxyliertes oder -halogeniertes Derivat der Reste ist und Y ist -H, -ON, -C(O)O^–B⁺, -SO₃ ^–B⁺ oder -OPO₃ ^2–(B⁺)₂, wobei B⁺ ist: ein Kation eines Alkalimetalls oder von Ammoniak oder ein organisches Ammoniumkation, -N(R''')₂·AH, -N(R''')₃ ⁺A^– oder ein cyclischer Stickstoffrest, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
wobei R''' wie oben definiert ist, D CH₂, O oder NR''' ist, (B⁺)₂ zusätzlich ein Erdalkalimetallkation sein kann und A ein pharmazeutisch annehmbares anorganisches oder organisches Anion ist, (b) -OC(O)O-R⁴Y, wobei R⁴ und Y wie oben definiert sind, (c) -OC(O)NH-R⁴Y, wobei R⁴ und Y wie oben definiert sind, (d) -OC(O)-R⁴ZR⁴Y, wobei R⁴ und Y wie oben definiert sind und Z O, S, SO, SO₂ oder NH ist, (e) -C(NH₂ ⁺)-R⁴A^–, wobei R⁴ und A wie oben definiert sind, (f)-OPO3^2–(B⁺)₂, wobei B⁺ wie oben definiert ist, oder (g) -ON, G: (a) ein Halogen, (b) C1-C5-Alkyl oder (c) OR'', wobei R''' wie zuvor definiert ist, (d) -OC(O)R''', wobei R''' wie zuvor definiert ist, oder (e) -OR³X, wobei R³ und X wie oben definiert sind, mit der Maßgabe, dass X in der Definition von G nicht -OH sein darf, wenn X in der Definition von R -OH ist, und R² ist wie oben definiert, und pharmazeutisch annehmbare Salze oder quaternäre Ammoniumderivate davon, ist.
Dem Fachmann wird die breite Vielfalt organischer und anorganischer Säuren und Basen wohlbekannt sein, die verwendet werden kann, um pharmazeutisch annehmbare Salze von pharmakologisch wirksamen Verbindungen herzustellen. Solche Säuren schließen ohne Einschränkung Fuorwasserstoff-, Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Iodwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter-, Phosphor-, Zitronen-, Succin-, Malein- und Palmitinsäuren ein. Die Basen schließen solche Verbindungen wie Natrium- und Ammoniumhydroxide ein. Ebenso sind dem Fachmann Quaternierungsmittel bekannt, die verwendet werden können, um pharmazeutisch annehmbare quaternäre Ammoniumderivate von pharmakologisch wirksamen Verbindungen herzustellen. Diese schließen ohne Einschränkung Methyl- und Ethyliodide und -sulfate ein.
In einer gegenwärtig bevorzugten Gruppe von Verbindungen stellt R² einen 1,1-Dimethylalkylrest oder einen 1,2-Dimethylalkylrest mit insgesamt mindestens 7 Kohlenstoffatomen dar. Auch Vorläufer solcher Verbindungen sind bevorzugt. Insbesondere bevorzugte Verbindungen sind solche, worin R² 1,1-Dimethylheptyl oder 1,2-Dimethylheptyl ist. Diese Ausführungsformen von R² wurden in THC und den Analoga davon gefunden. Jedoch wird in Bezug auf die neuroprotektive Wirksamkeit, die die vorliegende Erfindung kennzeichnet, angenommen, dass jeder niedere oder mittlere Alkylsubstituent an dieser Position geeignet sein wird.
Eine Gruppe bevorzugter spezifischer Verbindungen, die in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen, ist die Gruppe von Verbindungen der Formel (I), worin R² 1,1-Dimethylheptyl ist, G -OH ist und R R³X ist, wobei R³ Methylen ist und X -OC(O)CH₂NH₂·HCl, -OC(O)CH₂N(CH₃)₂·HCl, -OC(O)CH₂N(C₂H₅)₂·HCl, -OC(O)CH₂N(CH₃)₃ ⁺B^–, -OC(O)CH₂N(C₂H₅)₃ ⁺Br^–, Morpholinoacetyloxy (Hydrobromid), mit Methyliodid quatemisiertes Morpholinoacetyloxy, ω-Morpholinobutyroyloxy (Hydrobromid), mit Methyliodid quaternisiertes ω-Morpholinobutyroyloxy, N-Methylpiperazinoacetyloxy (Dihydrobromid), zweifach mit Methyliodid quaternisiertes N-Methylpiperazinoacetyloxy, ω-(N-Methylpiperazino)butyroyloxy (Dihydrobromid), Nicotinoyloxy (Hydrochlorid), mit Methylchlorat quaternisiertes Nicotinoyloxy, Succinoyloxy (Monoammoniumsalz), Maleoyloxy (Monoammoniumsalz), Phthaloyloxy (Monoammoniumsalz), 2-Quinolinoyloxy (Monoammoniumsalz), Acetyloxy, Bromacetyloxy, Trifluoracetyloxy oder Dinatriumphosphoroyloxy ist. Eine weitere Gruppe bevorzugter spezifischer Verbindungen, die in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen, ist die Gruppe von Verbindungen der Formel (I), worin R² 1,1-Dimethylheptyl ist, R -CH₂OH ist und G ω-Morpholinobutyroyloxy (Hydrobromid), N-Methylpiperazinoacetyloxy (Dihydrobromid), zweifach mit Methyliodid quaternisiertes N-Methylpiperazinoacetyloxy oder Dinatriumphosphoryloxy ist. Gegenwärtig die am meisten bevorzugten Verbindungen sind die, die in den Synthesebeispielen hierin beschrieben sind.
Eine archetypische Verbindung, mit welcher viele physiologische Experimente durchgeführt wurden, ist die Verbindung, die als das (+)-(3S,4S1-1,1-Dimethylheptyl-Homolog von 7-Hydroxy-Δ⁶-tetrahydrocannabinol bezeichnet werden kann. Diese Verbindung, die früher als HU-211 bezeichnet wurde, wird hiernach mit dem chemischen Trivialnamen "Dexanabinol" bezeichnet.
Es wird betont, dass alle die Verbindungen, die in der (+)-(3S,4S)-Konfiguration vorliegen, im Wesentlichen frei von dem (–)-(3R,4R)-Enantiomer sind, wobei vom Letzteren bekannt ist, dass es die unerwünschten psychotropen Nebenwirkungen besitzt. So wurden die Enantiomere des 1,1-Dimethyl-Homologs des synthetischen Cannabinoids 7-Hydroxy-Δ⁶-tetrahydrocannabinol beschrieben [Mechoulam, R., et al., Tetrahedron: Asymmetry 1: 315–319, 1990; Mechoulam, R., et al., Experientia 44: 762-764, 1988]. Das (–)-(3R,4R)-Enantiomer, das hierin als HU-210 bezeichnet wird, ist eine hochwirksame cannabimimetische Verbindung (nahezu 100 Mal wirksamer als -1-Tetrahydrocannabinol, die wirksame Komponente von Haschisch). Das (+)-(3S,4S)-Enantiomer, das hierin als Dexanabinol bezeichnet wird, ist, während bekannt ist, dass es analgetisch und antiemetisch wirksam ist, selbst bei Dosen, die mehrere Tausend Mal höher sind als die ED50 von HU-210 nicht wirksam als Cannabimimetikum (Mechoulam, R. et al., Experientia 44: 762–764, 1988).
Wie oben erwähnt, sind die hierin definierten Verbindungen der allgemeinen Formel (I außerdem im Wesentlichen frei von einer cannabimimetischen Wirkung auf das zentrale Nervensystem.
Pharmakologie Die neuen Zusammensetzungen enthalten zusätzlich zu dem wirksamen Bestandteil konventionelle pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel und dgl. Feste Zusammensetzung zur oralen Verabreichung, wie Tabletten, Pillen, Kapseln oder dgl. können hergestellt werden, indem der Wirkstoff mit konventionellen, pharmazeutisch annehmbaren Zusatzstoffen, wie Maisstärke, Lactose, Saccharose, Sorbit, Talk, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Dicalciumphosphat und Gummi mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln gemischt wird. Die Tabletten oder Pillen können beschichtet oder auf andere Weise mit pharmazeutisch annehmbaren Materialien, die im Fachgebiet bekannt sind, gemischt werden, um eine Dosierungsform bereitzustellen, die eine verlängerte Wirkung oder eine anhaltende Freigabe bietet.
Andere feste Zusammensetzungen können als Zäpfchen für eine rektale Verabreichung hergestellt werden. Flüssige Formen können für eine orale Verabreichung oder für eine Injektion hergestellt werden, wobei der Ausdruck subkutan, transdermal, intravenös, intrathekal und andere parenterale Wege der Verabreichung einschließt. Die flüssigen Zusammensetzungen schließen wässrige Lösungen, mit oder ohne organische Colösungsmittel, wässrige oder ölige Suspensionen, mit Geschmack versetzte Emulsionen mit essbaren Ölen, sowie Elixiere und ähnliche pharmazeutische Vehikel ein. Außerdem können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als Aerosole für eine intranasale und ähnliche Verabreichung vorliegen.
Die wirksame Dosis für Menschen ist im Allgemeinen im Bereich von 0,05 mg bis ungefähr 50 mg pro kg Körpergewicht, bei einer Verordnung von 1–4 Mal am Tag. Jedoch ist auch eine Verabreichung alle zwei Tage möglich, da der Wirkstoff eine ziemlich anhaltende Wirkung besitzt. Der bevorzugte Bereich der Dosierung ist von 0,1 mg bis ungefähr 20 mg pro kg Körpergewicht. Jedoch ist es für den Fachmann offensichtlich, dass die Dosierungen von dem behandelnden Arzt abhängig von der zu behandelnden Krankheit, dem Verfahren der Verabreichung, dem Alter, dem Gewicht des Patienten, Kontraindikationen und dgl. bestimmt werden wird.
Alle oben definierten Verbindungen sind wirksame NMDA-Rezeptorblocker und können als Wirkstoffe von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung eines oder gleichzeitig mehrerer Symptome der oben definierten Störungen verwendet werden. Die wirksamen Dosierungen sind im Wesentlichen ähnlich und zusätzlich zu den bekannten charakteristischen Eigenschaften dieser Verbindungen ist die herausgestelltere Wirkung die der NMDA-Rezeptorblockierung. Jedoch ist es wichtig zu bemerken, dass die Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch gegen Konvulsiva, die nicht notwendigerweise NMDA-Rezeptormediatoren sind, eine gute Blockierungswirksamkeit zeigen können. Z. B. können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einer Vergiftung aufgrund von Strychnin, Organophosphorverbindungen und Distickstoffmonoxid vorbeugen oder diese zumindest lindern.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden für die oben definierten Zwecke in herkömmlichen pharmazeutischen Formen mit den erforderlichen Lösungsmitteln, Verdünnungsmitteln, Hilfsstoffen etc. verabreicht, um eine physiologisch annehmbare Formulierung zu erzeugen. Sie können über die konventionellen Wege der Verabreichung verabreicht werden. Die erforderliche Dosis für Menschen reicht von 0,005 mg/kg bis ungefähr 50 mg/kg pro Dosiseinheitsform. Der am meisten bevorzugte Dosisbereich ist von ungefähr 0,1 mg/kg bis ungefähr 20 mg/kg Körpergewicht.
Es wird verstanden werden, dass die meisten geeigneten Verabreichungen der pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung von der Art der zu behandelnden Schädigung oder Krankheit abhängen wird. Somit wird die Behandlung eines akuten Kopftraumas, von Schlaganfall oder einer ischämischen Hirnschädigung aufgrund von Herzstillstand eine systemische Verabreichung des Wirkstoffes so schnell nach der Auslösung der Schädigung wie möglich erfordern. Andererseits wird eine Verringerung oder eine Prophylaxe chronischer degenerativer Schädigungen eine Verordnung mit anhaltender Dosis erfordern.
Dexanabinol fördert eine beträchtliche Neuroprotektion in verschiedenen Modellen von Kopftrauma, globaler Hirnischämie und gequetschtem Sehnerv. Dies weist auf das neuroprotektive Potenzial in einem breiten Spektrum von ZNS-Krankheiten, Vergiftungen oder Schädigungen, wie es oben detailliert ausgeführt ist, einschließlich von Bedingungen, die eine axonale Schädigung, wie die, die bei einer Rückenmarksverletzung davongetragen werden, hin. Dexanabinol ist auch insbesondere nützlich bei der Behandlung eines Neuralödems, das mit einem Trauma, Infektion, Tumoren oder chirurgischen Verfahren einschließlich Kraniotomien und Rückenmarksbehandlungen im Zusammenhang steht.
Darüber hinaus führen die kombinierten neuroprotektiven Eigenschaften von Dexanabinol sowie die bekannten Anti-Glaukom-Eigenschaften dieser Klasse von Verbindungen zu einer besonderen Berücksichtigung von retinalen Augenkrankheiten, insbesondere solchen, die mit einer ischämischen Schädigung oder einer widrigen biochemischen Umgebung im Zusammenhang stehen.
Die folgenden sind einige hauptsächliche Okularkrankheitsgruppen, die als Kandidaten für eine Dexanabinol-Therapie in Betracht gezogen werden sollen:

(1) Diabetische Retinopathie, die hauptsächlich von einer veränderten retinalen Kapillarzirkulation herrührt, welche die Retina ischämisch macht.
(2) Altersbedingte Makuladegeneration, welche mit einer langsamen Verschlechterung des retinalen Pigmentepitheliums im Zusammenhang steht, welche schließlich zu retinalem Zelltod und Gewebeveränderungen führt.
(3) Retinale Gefäßokklusionen, die ziemlich häufig sind und eine beträchtliche ischämische Schädigung verursachen können. Alle retinalen Okklusionen, venös und arteriell, einschließlich des Sehnervs (ischämische Augenneuropathie) sowie Frühgeborenenretinopathie (Sauerstofftoxizität bei frühgeborenen Babys), können in dieser Kategorie enthalten sein.
(4) Jede Wunde, die zu einer sekundären neuralen Schädigung führt, welche einem direkten retinalen Zelltod folgt, z. B. Trauma, einschließlich chirurgischen Traumas, wie Laserverbrennungen, Entzündungen, Infektionen und degenerative Prozesse.
(5) Chronische ischämische Schädigung, einschließlich glaukomatöser Sehnervschädigung.
(6) Toxische Schädigung (z. B. Chloroquin-Toxizität) und chronische Fehlernährung.

Die Erfinder haben gefunden, dass Dexanabinol und die Verbindungen der Formel (I) sowie die neuen Monoester, welche bevorzugte Wirkstoffe der hierin beanspruchten Zusammensetzungen sind, bei Dosen oberhalb von 25 mg/kg Körpergewicht Stereotypie, lokomotorische Hyperaktivität und Tachykardie-Auswirkungen, die typischerweise durch NMDA-Rezeptorantagonisten verursacht werden, induzieren. Bei beträchtlich niedrigeren Dosen von ungefähr 2,5 mg/kg Körpergewicht stellen sie wirksame Blocker von NMDA-induziertem Tremor, Anfall und Lethalität dar (Feigenbaum et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 86: 9584–9587, 1989). Somit wurde eine gute Trennung zwischen den therapeutischen Wirkungen (NMDA-Antagonismus) und möglichen Nebenwirkungen (wie Tachykardie) erreicht. Bindungsstudien zeigen, dass Dexanabinol NMDA-Rezeptoren auf stereospezifische Weise blockiert, und dass die Wechselwirkung an Bindungsstelle(n) auftritt, die unterschiedlich ist/sind von denen mancher anderer nicht-kompetitiver NMDA-Antagonisten oder von Glutamat und Glycin. Diese und die anderen Verbindungen gemäß der Formel (I) können sich daher als nicht-psychotrope Substanzen, die vor einer NMDA-Rezeptor-vermittelten Neurotoxizität schützen, erweisen.
Es wurde kürzlich gezeigt, dass das pharmakologische Profil von Dexanabinol und manchen anderen Verbindungen, die die Wirkstoffe der vorliegenden Zusammensetzungen darstellen, die Induktion von Stereotypie, lokomotorischer Hyperaktivität und Tachykardie in Mäusen einschließt (Feigenbaum et al., 1989 ibid.). Diese Eigenschaften stimmen mit denen von nicht-kompetitiven Antagonisten der NMDA-Unterklasse von Glutamatrezeptoren überein und legen nahe, dass diese Verbindungen wirksame NMDA-Rezeptorantagonisten sind. Diese Möglichkeit wurde erforscht, indem die Wirksamkeit der Verbindungen für einen Schutz gegen Tremor-, konvulsive und lethale Wirkungen von NMDA und NMDA-Agonisten in Mäusen untersucht wurden. Solchen Wirkungen wird praktisch durch alle NMDA-Antagonisten entgegengewirkt und wie erwartet wurde durch Dexanabinol tatsächlich eine NMDA-Neurotoxizität blockiert (Feigenbaum et al., 1989, ibid.).
Testsysteme Die Bewertung der therapeutischen Wirkungen von Dexanabinol und seinen Analoga wurde nun in einer Reihe von experimentellen Systemen mit zunehmender Verfeinerung durchgeführt, um die Nützlichkeit dieser Wirkstoffe als Neuroprotektoren zu stützen. Die neuroprotektiven Wirkungen wurden sowohl in vitro als auch in vivo untersucht. Diese neuroprotektiven Wirkungen wurden in den folgenden Systemen bestätigt:

(a) Bindung an den NMDA-Rezeptor-verbundenen Kanal: Nicht-kompetitive Antagonisten von NMDA, wovon das Hauptbeispiel die Verbindung MK-801 ist, binden an eine Stelle innerhalb des NMDA-Rezeptorkanals, wobei die Aktivierung des Rezeptorkanalkomplexes und die folgende Neurotoxizität verhindert werden. Die Fähigkeit verschiedener Verbindungen, mit der Bindung von Tritium-markiertem MK-801 an Gehirnmembranen zu konkurrieren, wird als Maß ihrer Wirksamkeit als nicht-kompetitive NMDA-Antagonisten angesehen.
(b) Blockierung von NMDA-Toxizität in einer Gewebekultur: Neuronen können in Kultur wachsen und für mehrere Wochen überleben. Die Anwendung von NMDA auf neuronale Kulturen führt zu einer Toxizität gegenüber den Neuronen: Mikroskopisches Betrachten der Kulturen zeigt eine verringerte Zelldichte und Veränderungen in der Form und den Färbeeigenschaften überlebender Neuronen, und die metabolische Aktivität in den Kulturen wird stark verringert, wie es durch eine Verringerung der Bildung eines durch Chemikalien, die gegenüber den mitochondrialen metabolischen Enzymen empfindlich sind, gefärbten Produktes bestimmt wird. Die Fähigkeit verschiedener Verbindungen, die durch NMDA induzierten morphologischen und metabolischen Veränderungen zu verhindern, wird als Maß ihrer neuroprotektiven Wirksamkeit in Kultur angesehen.
(c) Schutz gegen hypobare Anoxie in Mäusen: Das Aussetzen von Mäusen einer hypobarischen (200 mmHg)-Atmosphäre verringert die Menge an Sauerstoff, die den Tieren zur Verfügung steht und führt bei unbehandelten Mäusen innerhalb von 1–2 Minuten zum Tod. Eine Vorbehandlung mit Verbindungen, die den Wirkungen eines Sauerstoffmangels entgegenwirken können, verlängern (verdoppeln oder mehr) die Überlebenszeit der dieser Behandlung unterworfenen Mäuse. Die Erhöhung der Überlebenszeit ist ein Maß für die Wirksamkeit der Verbindungen, der anoxischen Schädigung in vivo entgegenzuwirken.
(d) Verbesserte klinische Ergebnisse nach einer geschlossenen Kopfverletzung in Ratten: Eine ernste Kopfverletzung ist mit einer hohen Sterblichkeit und ernster neurologischer Beeinträchtigung verbunden. Tiere, die auf kontrollierte Weise einem Kopftrauma ausgesetzt werden, dienen als Modelle, in welchen die Wirkstoffe mit therapeutischem Potenzial getestet werden. Testverbindungen können sowohl für ein verbessertes klinisches Ergebnis als auch für eine Verringerung eines durch eine geschlossene Kopfverletzung induzierten Ödems untersucht werden. Die Fähigkeit von Verbindungen, die Schwere neurologischer Symptome zu verringern und Hirnödeme zu verringern, wird als Maß ihrer Wirksamkeit bei der Verringerung einer Hirnschädigung angesehen.
(e) Inhibierung ischämischer neuronaler Schädigung in Wüstenspringmäusen: Eine temporäre Blockierung der Blutversorgung zum Gehirn einer Wüstenspringmaus durch eine operative Ligatur der zwei Hauptarterien (gemeinsame Kopfschlagadern) führt zu einer transienten globalen Vorderhirnischämie. Eine temporäre globale Ischämie erzeugt eine verzögerte selektive Degeneration von Neuronen im Hippokampus, welcher eine für die Gedächtnisbildung wesentliche Gehirnstruktur darstellt. Die Fähigkeit verschiedener Verbindungen, den hippocampalen Zellverlust und die begleitenden Gedächtnisdefizite zu verhindern, wird als Maß ihrer Wirksamkeit als Neuroprotektoren bei ischämischen Bedingungen betrachtet.
(f) Sehnervquetschung: Die Anwendung von mechanischem Druck auf den Sehnerv führt zu einer Druckverletzung der Axone, was durch plötzliche Veränderungen im oxidativen Metabolismus und einen verzögerten axonalen Tod begleitet ist, was sich wiederum in einer Verringerung des Verbindungsaktionspotenzials, welches von dem Nerv messbar ist, und in einem Verlust der Reaktion auf visuelle Stimuli (Blindheit) ausdrückt. Die Fähigkeit verschiedener Verbindungen, den Verlust von metabolischer Aktivität, Verbindungsaktionspotenzial und visuell hervorgerufenem Potenzial zu verhindern, wird als Maß ihrer Wirksamkeit bei der Verhinderung der Folgen einer traumatischen Schädigung der Axone betrachtet.
(g) Okklusion der mittleren Gehirnarterien (MCAO): Die mittlere Gehirnarterie ist das zerebrale Blutgefäß, welches bei Menschen am anfälligsten für einen Schlaganfall ist. In Tieren erzeugt eine Koagulation, permanente Ligation oder permanente Anbringung eines Verschlussfadens in der Arterie einen permanenten fokalen Schlag, welcher das MCA-Gebiet beeinträchtigt. Eine transiente Ligation oder Okklusion führt zu einem transienten fokalen Schlaganfall. Sowohl die transienten als auch permanenten fokalen Schlaganfälle führen zu variierenden Graden an Ödemen und Infarktbildung in den betroffenen Hirnregionen. Die Fähigkeit von Verbindungen, die Volumina von Ödemen und von Infarktbildung zu verringern, wird als Maß ihrer Wirksamkeit als Anti-Schlaganfallbehandlung betrachtet.
(h) Viergefäßokklusion (4VO) in Ratten: Die Blutversorgung zum Rattengehirn kommt über die zwei vertebralen und zwei gemeinsamen Kopfschlagadern an. Eine transiente Okklusion aller vier Gefäße führt zu einer globalen Ischämie, wie sie während eines Herzstillstands in Menschen auftreten würde. Globale Ischämie führt zu neurologischen Defiziten, einschließlich Kurzgedächtnisdefiziten, und zu einem selektiven Verlust von Neuronen in dem CA1-Feld des Hippokampus. Die Fähigkeit von Verbindungen, die neurologischen Defizite in diesem Modell zu verringern und ein neuronales Überleben zu erhöhen, wird als hinweisend auf ihre Wirksamkeit bei der Verhinderung einer mit einem Herzstillstand verbundenen Gehirnschädigung betrachtet.

Jedes dieser Systeme stellt einen Aspekt der Neurotoxizität dar, welcher für eine Wechselwirkung mit pharmazeutischen Mitteln, die an den NMDA-Rezeptor binden, zugänglich ist. Es ist wahrscheinlich, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung ihre gezeigten neuroprotektiven Wirkungen aufgrund ihrer Fähigkeit, an den NMDA-Rezeptor zu binden, ausüben. Nichtsdestotrotz kann nicht ausgeschlossen werden, dass ihre Wirksamkeit durch andere Rezeptoren oder zusätzliche Mechanismen vermittelt wird.
Der Wirkstoff-Prototyp, der für die Untersuchung der NMDA-Blockierungswirksamkeit verwendet wird, ist die Verbindung MK-801, welche ein wirksamer und selektiver NMDA-Antagonist ist, der aufgrund seiner Toxizität nicht als therapeutisches Mittel für den Menschen verwendet werden kann. Wir haben die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den biologischen Wirksamkeiten von MK-801 und Dexanabinol untersucht, wie es in Tabelle 1 zusammengefasst ist. Diese Untersuchung stützt deutlich das Konzept, dass Dexanabinol nicht alleine als NMDA-Antagonist wirkt. Vielmehr können die therapeutischen Wirkungen von Dexanabinol zusätzlichen Mechanismen zugeschrieben werden, Antioxidans- und Radikalfänger-Eigenschaften, anticholinerge Wirkung, Plättchen-aktivierender Faktor-Antagonismus, Modulation von Arachidonsäure oder Inhibierung von Lipidperoxidation, u. a. eingeschlossen. Von allen diesen Arten pharmakologischer Mittel wurde vorgeschlagen, dass sie den funktionalen Folgezustand nach einer Hirnverletzung potenziell verbessern. Alle diese Mechanismen können an einer verzögerten, sekundären oder chronischen neuronalen Schädigung, die auf eine Schädigung des ZNS folgt, beteiligt sein (McIntosh, J. Neurotrauma 20: 215–243, 1993).
TABELLE 1: Eigenschaften von Dexanabinol und MK-801: Ähnlichkeiten und Unterschiede
Verbindungen Experimente haben gezeigt, dass die (+)-(3S,4S)-Verbindung der Formel (I), worin A-----B eine 6(1)-Doppelbindung bedeutet, R Methyl ist, R1 Wasserstoff ist und R² 1,1-Dimethylheptyl ist, und die Verbindung der Formel (I), worin A-----B eine 1(2)-Doppelbindung bedeutet, R Methyl ist, R1 Wasserstoff ist und R2 1,1-Dimethylheptyl ist, wobei beide Verbindungen im Wesentlichen frei von dem (–)-(3R,4R)-Enantiomer sind, praktisch die gleiche Wirksamkeit aufweisen, wie die Verbindung, die Dexanabinol genannt wird. Die erstere Verbindung wird im U.S. Patent Nr. 4,179,517 Verbindung Vb genannt; die letztere Verbindung darin ist XIb.
Zusätzlich wurde gefunden, dass manche neue Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin R CH₂OR' bedeutet und R' eine Acylgruppe bedeutet, auch die gewünschte Anti-Glutamat- oder Glycin-verbundene Wirksamkeit aufweisen. Diese neuen Verbindungen können z. B. durch Veresterung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin R CH₂OH bedeutet und R1 Wasserstoff ist, unter Bedingungen hergestellt werden, die die Bildung des gewünschten Monoesters mit relativ hoher Ausbeute bevorzugen.
Unter den neuen getesteten Verbindungen sind Monoester, einschließlich Nicotinat, Succinat und Maleat, bevorzugt. Am meisten bevorzugte Verbindungen schließen den Glycinatester und N-substituierte Glycinatestersalze wie die Trimethyl- und Triethylammoniumacetatderivate von Dexanabinol ein. Diese neuen Verbindungen weisen den zusätzlichen Vorteil auf, dass sie in manchen wässrigen Lösungen löslich sind, wohingegen die Stammverbindungen extrem hydrophob sind.
Der stark lipophile Charakter von Dexanabinol ermöglicht der Verbindung, in das zentrale Nervensystem einzudringen, da es die Blut-Hirn-Schranke leicht passiert. Jedoch ist die hohe Fettlöslichkeit auch mit einer sehr geringen Löslichkeit in Wasser verbunden. Dies erschwert die Entwicklung von Formulierungen, die für eine intravenöse Verabreichung von Dexanabinol geeignet sind, was die klinische Anwendung behindert. Wasserlösliche Derivate von Dexanabinol, die so gestaltet sind, dass sie den Wirkstoff nach einer i.v.-Verabreichung durch Hydrolyse leicht freisetzen, könnten dieses Problem beseitigen und werden als Prodrugs verwendet werden. Andererseits, wenn die erhaltenen Derivate hydrolytisch stabil sind, aber eine ihnen innewohnende biologische Wirksamkeit aufweisen, können sie als leicht formulierbare Analoga (Artgenossen) verwendet werden, die eine beachtliche NMDA-Antagonisten-Wirksamkeit besitzen.
Die neuen Derivate werden erhalten, indem an die allylischen (C-7)- oder phenolischen (C-3')-Hydroxylfunktionalitäten von Dexanabinol, die zwei Stellen, die für eine reversible strukturelle Modifikation geeignet sind, über eine Carbonsäureester- oder Phosphat-Bindung polare oder permanente Ladung-tragende Gruppen angebracht werden.
Die allylische Hydroxylgruppe an der C-7-Position von Dexanabinol ist reaktiver als die sterisch gehinderte phenolische C-3'-Gruppe. Aufgrund dieses Unterschieds der Reaktivität trat die Acylierung von Dexanabinol bevorzugt an der allylischen Hydroxylgruppe auf, obwohl die Produkte im Allgemeinen durch kleine Mengen an Phenolestern kontaminiert waren. Die Reaktion von Dexanabinol mit N-geschütztem (t-BOC)-Glycin in einer Mischung von Acetonitrildimethylformamid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 4-(Dimethylamino)pyridin (DMAP) ergab den 7'-(N-t-BOC)-Glycylester von Dexanabinol, welcher mittels Säulenchromatographie aufgereinigt wurde. Die t-BOC-Schutzgruppe wurde mit Chlorwasserstoffsäure in Ethylacetatlösung entfernt, was zu dem HCl-Salz des Glycylesters von Dexanabinol in reiner Form führte (Schema I).
Schema I
Mehrere N,N-disubstituierte Derivate von 3 wurden über das 7-Bromacetyldexanabinol synthetisiert, welches durch Acylierung von Dexanabinol mit Bromessigsäureanhydrid in Toluol gefolgt von einer säulenchromatographischen Aufreinigung erhalten wurde (Schema II).
Schema II
Die Reaktion von 7-Bromacetyldexanabinol mit Dimethylamin in Hexan erzeugte das N,N-Dimethylglycinat. Das Hydrochloridsalz davon wurde durch Behandlung der freien Base mit ethanolischer HCl erhalten. Auf ähnliche Weise wurden das N,N-Diethylglycyldexanabinol und sein Hydrochloridsalz hergestellt. Zwei Dexanabinolester mit permanenten Ladungen, das Trimethylammoniumacetylbromid und das Triethylammoniumacetylbromid wurden erhalten, indem das 7-Bromacetylderivat mit Trimethylamin bzw. Triethylamin in Pyridin umgesetzt wurde.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, die vorliegende Erfindung auf nicht beschränkende Weise zu veranschaulichen.
Synthesebeispiel 1
(6aS-trans)-6,6-dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methylhemisuccinat
1a. Dexanabinolhemisuccinattriethylammoniumsalz
1,95 g Dexanabinol (0,005 mol) wurden in 50 ml trockenem Toluol gelöst, und es wurden 0,51 g Succinsäureanhydrid (0,005 mol), gelöst in 50 ml Toluol, zu der Dexanabinollösung zugegeben. Die Mischung wurde in einen Rundkolben eingebracht, der mit einem Rückflusskühler ausgerüstet war, und für 6 Stunden unter Rückfluss gekocht. Es wurden 700 ml (0,5 g, 0,005 mol) Triethylamin zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht unter Rückfluss gehalten. Die Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie (DC) auf Fluoreszenz-markierten Silikagelplatten kontrolliert, mobile Phase-Toluol : Aceton 1 : 3. Nachdem kein Dexanabinol (Rf = 0,86) mehr in der Reaktionsmischung vorhanden war, wurde das organische Lösungsmittel mithilfe eines Rotationsverdampfers vollständig abgedampft (50 mmHg, 60°C). Der Rückstand wurde in 20 ml Diethylether und 20 ml n-Heptan gelöst und wieder zur Trockene eingedampft, wobei diese Stufe zur vollständigen Entfernung von Toluol zwei Mal wiederholt wurde. Das Triethylammoniumsalz von Dexanabinolhemisuccinat wurde als leicht gelbliches viskoses Öl erhalten, die Ausbeute beträgt ungefähr 98%.
1b. Freie Säure von Dexanabinolhemisuccinat
Das Triethylammoniumsalz von Dexanabinolhemisuccinat wurde in 100 ml einer 2%igen wässrigen Lösung von Tris(hydroxymethyl)aminomethan mithilfe von Ultraschall (30 Minuten) oder eines Gelenkschüttlers (2 Stunden) gelöst und unter starkem Rühren in 500 ml kalte Lösung von 2% HCl in Wasser gegossen. Sedimentierte freie Säure von Dexanabinolhemisuccinat wurde gesammelt, 3–5 Mal mit reinem Wasser gewaschen, bis der pH-Wert der Waschlösung auf pH 4–5 gestiegen war. Das viskose Produkt (Wassergehalt ungefähr 60%) wurde gesammelt und in 300 ml Diethylether gelöst. Die Lösung wurde dann für 24 Stunden unter Verwendung von großen Mengen von wasserfreiem Na₂SO₄ oder MgSO₄ lichtgeschützt getrocknet. Nach dem Abdampfen des organischen Lösungsmittels mittels eines Rotationsverdampfers wurde eine gelblich-orangene trockene freie Säure von Dexanabinolhemisuccinat erhalten (Ausbeute ungefähr 65%). Sie ist hygroskopisch und muss in einem gut verschlossenen Gefäß kalt aufbewahrt werden.
Dexanabinolhemisuccinat ist ein orange-gelbes festes Material, welches in Methanol, Acetonitril und teilweise in Wasser löslich ist. Für Dexanabinolhemisuccinat wurde unter Verwendung einer Haake-Buchler-Schmelzpunktvorrichtung (S/N 17681B-77) ein mittlerer (n = 5) Schmelzpunktbereich von 50,3–62,7°C beobachtet.
Auf einem Perkin-Elmer Modell 1600 FTIR (SN 134707) wurde ein Infrarotspektrum von Dexanabinolhemisuccinat (zubereitet als KBr-Pressling) aufgenommen. Das Infrarotspektrum stimmt mit der zugewiesenen Struktur überein. Interpretation des FTIR-Spektrums von Dexanabinolhemisuccinat: IR (KBr,v,cm^–1): 3424 und 3226 (2 × OH), 2961 (vas CH₃), 2826 (vas CH₂), 2894 (vs CH₃), 2868 (vs CH₂), 1736 (vs C = O), 1719 (vs C = O), 1625 (v C = C, Olefin), 1578 (Phenylkern), 1459 (d CH₃), 1415, 1384 und 1371 (gem. Dimethyl), 1267 (vas C-O-C), 1186 (vs C-O-C), 1085 (v C-O Phenol), 968 (g CH, Ar), 839 (g CH, Olefin). Das UV-Spektrum von Dexanabinolhemisuccinat wurde (als eine 2,58 × 10^–4 M Lösung in Methanol) auf einem Shimadzu UV-160 Spektrophotometer (S/N 1235621) aufgenommen. Das UV-Spektrum der Dexanabinolhemisuccinat-Probe, die in Methanol hergestellt wurde, stimmt mit der zugewiesenen Struktur überein (log e276,0 = 3,09 und log e282,0 = 3,10).
Synthesebeispiel 2
7-(N-t-BOC-Glycyl)dexanabinol
Zu einer Lösung von Dexanabinol (1,00 g, 2,59 mmol) in Acetonitril (20 ml) und Dimethylformamid (5 ml) wurden N-t-BOC-Glycin (0,544 g, 3,10 mmol), Dicyclohexylcarbodiimid (0,64 g, 3,10 mmol) und Dimethylaminopyridin (0,025 g, 0,2 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 3 Tage unter wasserfreien Bedingungen bei 22–25°C gerührt. Der präzipitierte Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert, die Lösung wurde im Vakuum abgedampft, und der Rückstand wurde durch Chromatographie gereinigt. Silikagel: Aldrich, 200–425 mesh, 40/3 cm: Elution nacheinander mit Hexan, 2% und 4% Ethylacetat in Hexan (jeweils 200 ml) und 6% Ethylacetat in Hexan (1500 ml), um 0,55 g (40%) der Titelverbindung zu ergeben (Reinheit gemäß HPLC-Peakbereich: 99,3%). Durch Umkristallisation (Nitromethan) einer zweiten Fraktion (91% Reinheit) wurde eine Gesamtausbeute von 70% reiner Verbindung (>99%), Schmelzpunkt 110–112°C erhalten.
Synthesebeispiel 3
7-Glycyldexanabinol-Hydrochlorid
Eine Lösung der Verbindung von Synthesebeispiel 2 (0,35 g, 0,64 mmol) in 2N Chlorwasserstoffsäure in Ethylacetat (3 ml) wurde für 10 Minuten bei 20-25°C gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Ethylether aufgeschlämmt (5 ml) und getrocknet, was zu 0,28 g (90% Ausbeute) der Titelverbindung als schmutzigweißen Feststoff führte; (HPLC-Peakbereich): 97,7%.
Synthesebeispiel 4
7-Bromacetyldexanabinol
Zu einer Lösung von Dexanabinol (0,100 g, 0,26 mmol) in Toluol (6 ml) wurde Bromessigsäureanhydrid (0,118 g, 0,45 mmol) zugegeben, und die resultierende Mischung wurde bei 20-25°C für 48 Stunden gerührt. Die organische Lösung wurde mit Wasser (2 × 2 ml) extrahiert, dann über Na₂SO₄ getrocknet und abgedampft. Der Rückstand wurde mittels Chromatographie aufgereinigt (Silikagel: Aldrich, Merck Qualität 60, 230–400 mesh, 32/2 cm; Elution mit Hexan, dann mit Hexan und stufenweise erhöhten Konzentrationen von Ethylacetat von 0 bis 6%), was eine Ausbeute von 0,123 g (93,4% Ausbeute) der Titelverbindung als Öl ergab. Die Reinheit gemäß HPLC-Peakbereich: 96,8%.
Synthesebeispiel 5
7-Dimethylaminoacetyldexanabinol (5)
Zu einer Lösung von 7-Bromacetyldexanabinol (0,119 g, 0,24 mmol) in Hexan (6 ml) unter Argon wurde Dimethylamin (Gas) zugegeben, und die Mischung wurde für 2 Stunden bei 20-25°C gerührt. Das präzipitierte Dimethylaminbromid wurde abfiltriert, und die Lösung wurde bis zur Trockene eingedampft und der resultierende Rückstand mit Hexan aufgeschlämmt (3 × 2 ml). Nach dem Trocknen wurden 0,01 g (Ausbeute 90%) von 7-Dimethylaminoacetyldexanabinol erhalten, Schmelzpunkt 110–112°C; Reinheit (HPLC-Peakbereich): 99,6%.
Das Hydrochloridsalz von 7-Dimethylaminoacetyldexanabinol wurde hergestellt, indem eine Lösung von HCl in Ether zu einer Lösung dieser Verbindung in Ether gegeben wurde, gefolgt von Abfiltrieren und Spülen des resultierenden Feststoffes mit Ether.
Synthesebeispiel 6
7-Diethylaminoacetyldexanabinol (6)
Zu einer Lösung von 7-Bromacetyldexanabinol (0,178 g, 0,34 mmol) in Hexan (6 ml) unter Argon wurde Diethylamin (2 ml, 1,41 g, 1,9 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde für 4 Stunden bei 20–25°C gerührt. Das präzipitierte Diethylaminohydrobromid wurde abfiltriert, die Lösung wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde mit Hexan aufgeschlämmt (3 × 2 ml). Nach dem Trocknen (Temperatur unterhalb 50°C) erhielt man 0,160 g von 7-Diethylaminoacetyldexanabinol (Ausbeute 94%) als schmutzigweißen Feststoff, Schmelzpunkt 128–130°C; Reinheit (HPLC-Peakbereich); 98,4%.
Das Hydrochloridsalz von 7-Diethylaminoacetyldexanabinol wurde hergestellt, indem eine Lösung von HCl in Ether zu einer Lösung dieser Verbindung in Ether zugegeben wurde, gefolgt von Abfiltrieren und Spülen des resultierenden Feststoffes mit Ether.
Synthesebeispiel 7
Dexanabinol-7-acetyltrimethylammoniumbromid (7)
Zu einer Lösung von 7-Bromacetyldexanabinol (0,81 g, 1,60 mmol) in Hexan (15 ml), eingebracht in ein geschlossenes System unter Argon, wurde bei 20-25°C Trimethylamin (Gas) zugegeben. Die resultierende Mischung wurde für 18 Stunden bei 20–25°C gerührt, dann wurde das Präzipitat abfiltriert und mit Hexan gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum wurden 0,89 g (Ausbeute 89%) des rohen Dexanabinol-7-acetyltrimethylammonium-bromids erhalten. Die Aufreinigung (Aufschlämmung mit 3 × 15 ml kaltem Ether) führte zu 0,49 g (54,3%) der reinen Verbindung. Reinheit (HPLC-Peakbereichl: 98,1%, Schmelzpunkt 178–180°C.
Synthesebeispiel 8
Dexanabinol-7-acetyltriethylammoniumbromid (8)
Zu einer Lösung von 7-Bromacetyldexanabinol (0,081 g, 0,16 mmol) in Toluol (45 ml) wurde Triethylamin (5 ml, 3,6 g, 0,035 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde in Argonatmosphäre für 3 Tage bei 20-25°C gerührt. Das präzipitierte Salz wurde abfiltriert, und die Lösung wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit Toluol (3 × 5 ml) aufgeschlämmt, um 0,92 g (95% Ausbeute) von Dexanabinol-7-acetyltriethylammoniumbromid zu erhalten. Reinheit (HPLC): 94%.
Synthesebeispiel 9
Dexanabinol-7-wasserstoffmaleat
Eine Lösung von Dexanabinol (100,0 mg, 0,26 mmol), Maleinsäureanhydrid (29,4 mg, 0,30 mmol) und Pyridin (24,3 ml, 0,30 mmol) in Toluol (1,0 ml) wurde für 24 Stunden unter Argon bei 25°C gerührt. Die Lösung wurde in Eiswasser (20 g) gegossen, mit Essigsäure auf pH 5 angesäuert und mit Toluol/Ethylacetat (10 + 10 ml) extrahiert. Das Extrakt wurde mit eiskaltem Wasser (10 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ (20 g) getrocknet und unter verringertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde einer Säulenchromatographie (Silikagel) unter Verwendung von Toluol/Ethylacetat/Dioxan/Ethanol (1 : 1 : 1 : 1) als Eluent unterzogen. Es wurde reines Dexanabinol-7-hydrogenmaleat (71,8 mg, 57%) als ölige Substanz erhalten.
Synthesebeispiel 10
Dexanabinolammoniummaleat
Eine Mischung von Dexanabinol (103,7 mg, 0,27 mmol), Maleinsäureanhydrid (132,1 mg, 1,35 mmol), Pyridin (1,62 ml, 2,0 mmol) und Toluol (2,0 ml) wurde unter Argon für 6 Stunden bei 25°C gerührt. 5%ige NaHCO₃ (6,0 ml, 3,57 mmol) wurde zugegeben, und das Rühren bei 25°C wurde für zusätzliche 30 Minuten weitergeführt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether (30 ml) extrahiert. Das Extrakt wurde mit 5%igem NaHCO₃ (5 ml) gefolgt von Wasser (10 ml), dann mit sehr verdünnter N₂SO₄ (pH 3, 5 ml) und wieder mit Wasser (10 ml) gewaschen. Schließlich wurde das Extrakt über MgSO₄ (0,50 g) getrocknet und unter verringertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in Ether (2,0 ml) gelöst, und die Lösung wurde mit gasförmigem NH₃ gesättigt. Das Lösungsmittel und überschüssiger NH₃ wurden abgedampft. Triturieren mit Hexan überführte den klebrigen Rückstand in ein gelbliches Pulver. Der Feststoff wurde durch Dekantieren abgetrennt und bei 50°C unter verringertem Druck (0,5 Torr) getrocknet, um analytisch reines Dexanabinolammoniummaleat (87,6 mg, 65%) zu ergeben. Schmelzpunkt 90-100°C. Analyse: berechnet: C, 69,43; N, 8,64; N, 2,79; gefunden: C, 69,16; H, 8,54; N, 2,54.
Synthesebeispiel 11
Dexanabinolhydrogenphthalat
Eine Mischung von Dexanabinol (196,6 mg, 0,51 mmol), Phthalsäureanhydrid (110,9 mg, 0,75 mmol), Pyridin (81 ml, 1,00 mmol) und Toluol (2,0 ml) wurde für 24 Stunden bei 25°C unter Argon gerührt. 5%iges Natriumbicarbonat (6 ml, 3,57 mmol) wurde zugegeben, und das Rühren bei 25°C wurde für zusätzliche 30 Minuten weitergeführt. Durch tropfenweise Zugabe von Essigsäure wurde der pH-Wert der Mischung von 8,0 auf 7,0 erniedrigt. Die Mischung wurde mit Wasser (20 ml) verdünnt und mit Ether (30 ml) extrahiert. Die ätherische Lösung wurde mit Wasser (20 ml), gefolgt von 10% Essigsäure (20 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach dem Abdampfen des Ethers wurde der Rückstand in Toluol (20 ml) gelöst und wieder unter verringertem Druck (20 Torr, 50°C) abgedampft, um Essigsäure vollständig zu entfernen. Der feste Rückstand wurde im Vakuumofen (0,5 Torr, 50°C) getrocknet, um reines 1 zu ergeben (191,4 mg, 70%), weißes Pulver, Schmelzpunkt 88–89°C C₃₃H₄₂O₆ Analyse: berechnet: C, 74,13; H 7,92; gefunden: C, 73,91, H 8,08.
Synthesebeispiel 12
Dexanabinol-3-carboxy-2-pyridincarboxylat
Pyridin (81 ml, 1,00 mmol) wurde einer Suspension von Dexanabinol (208,8 mg, 0,54 mmol) und 2,3-Pyridindicarbonsäureanhydrid (198,1 mg, 1,33 mmol) in Toluol (2 ml) zugegeben, und die erhaltene Mischung wurde unter Argon für 25 Stunden bei 25°C gerührt. DC-Kontrolle zeigte kein Vorhandensein von Dexanabinol an. Die Reaktionsmischung wurde in Eiswasser (25 g) gegossen und mit Ether (30 ml) extrahiert. Die ätherische Schicht wurde mit Wasser (20 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von Silikagel und AcOEt/EtOH/Et₃N (7 : 2 : 1) als Eluent unterzogen. Der nach dem Abdampfen der ersten Fraktion erhaltene Rückstand wurde in Ether (30 ml) gelöst, und die ätherische Lösung wurde mit eiskalter verdünnter Schwefelsäure mit pH 3,0 (2 × 20 ml) gefolgt von Wasser (20 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Abdampfen des Ethers und Trocknen des Rückstands im Vakuumofen (0,5 Torr, 50°C) führte zu einem reinen Produkt als weißen Feststoff (176,3 mg, 61%), Schmelzpunkt 150–153°C (Zersetzung).
C₃₂H₄₁NO₆ berechnet: C, 71,75, H 7,71, N 2,61; gefunden: C, 71,56, H 7,86, N 2,66.
Synthesebeispiel 13
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
1-(Dimethylphosphat)
Zu einer Lösung von 0,231 g (0,48 mmol) Dexanabinol-7-trifluoracetat in 1 ml trockenem Pyridin bei Eiskühlung wurden 0,075 ml (0,80 mmol) frisch destilliertes Phosphoroxychlorid zugegeben und für 20 Stunden bei +3°C aufbewahrt. Zu der Mischung wurden 0,20 ml (5,0 mmol) trockenes Methanol zugegeben und für 5 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Es wurde bei Raumtemperatur im Vakuum (1 Hgmm) abgedampft, es wurden 3 ml trockenes Toluol zugegeben und abdestilliert. Der Rückstand wurde mit 3 ml trockenem Toluol behandelt, filtriert, mit 3 × 1 ml trockenem Toluol gewaschen und die vereinigten Lösungen wurden im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft. Der Rückstand (0,326 g) wurde auf 25 g Silikagel mit Acetonitril-Dichlormethan (7-3 v/v) chromatographiert, was zu 0,098 g (41%) der reinen Titelverbindung als leicht braunes, dickes Öl führte. Rf = 0,61 (Acetonitril-Dichlormethan, 7-3 v/v).
Synthesebeispiel 14
(6aS-trans)12tyl)-1-Hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
1-(Dihydrogenphosphat)
Zu einer Lösung von 0,405 g (0,84 mmol) Dexanabinol-7-trifluoracetat in 2 ml trockenem Pyridin bei –20°C wurden 0,14 ml (1,5 mmol) frisch destilliertes Phosphoroxychlorid zugegeben und für 20 Stunden bei +3°C aufbewahrt. Es wurde bei Raumtemperatur im Vakuum (1 Hgmm) abgedampft, der Rückstand wurde mit 3 × 3 ml trockenem Benzol extrahiert, und die vereinigten Benzollösungen wurden im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft. Der Rückstand wurde mit 2 × 10 ml trockenem Ether extrahiert, und die vereinigten Lösungen wurden im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft. Der Rückstand (0,485 g) wurde in 50 ml trockenem Ether gelöst, es wurden unter Eiskühlung 30 ml entionisiertes Wasser zugegeben, und es wurde bei Eiskühlung für 18 Stunden gerührt. Zu der Mischung wurden 10 ml 20%ige Natriumchlorid-Lösung zugegeben, getrennt, die ätherische Lösung wurde mit 3 × 10 ml 20%igen Natriumchlorid-Lösungen gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft. Der Rückstand wurde in 20 ml Ether gelöst, es wurden 10 ml 5%ige Natriumhydrogencarbonat-Lösung zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde aufgetrennt, die organische Lösung wurde mit 3 × 5 ml 20%iger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft. Der Rückstand (0,309 g) wurde mit Methylacetat-Essigsäure-Wasser (85-10-5 v/v) an 25 g Silikagel chromatographiert. Die vereinigten Fraktionen wurden abgedampft, der Rückstand wurde in 10 ml Ether gelöst, mit 3 × 5 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonat- und 3 × 5 ml 20%igen Natriumchloridlösungen gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft, was zu 0,141 g (36%) reiner Titelverbindung als dickes Öl führte. Rf = 0,43 (Methylacetat-Essigsäure-Wasser, 85-10-5 v/v).
Synthesebeispiel 15
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydyro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
1-(Dihydrogenphosphat)-Dinatriumsalz
Zu einer Lösung von 0,047 g (0,10 mmol) Dexanabinol-3'-phosphat in 5 ml trockenem Ethanol unter Argonatmosphäre wurden 1,07 ml (0,20 mmol) 0,187 M Natriumhydroxidlösung in trockenem Ethanol zugegeben (pH^–8), und dann wurde die Lösung im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft. Der Rückstand wurde mit 20 ml entionisiertem Wasser unter Argonatmosphäre für 2 Stunden gerührt. Es wurde abfiltriert, mit 2 × 10 ml, Wasser gewaschen und die klare Lösung wurde über Nacht gefriertgetrocknet, was zu 0,32 g (63%) reiner Titelverbindung als hygroskopisches weißes Material führte.
Synthesebeispiel 16
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydyroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
α-(Di-t-butylphosphat)
Zu einer gerührten Lösung von 3,22 g (8,33 mmol) Dexanabinol in einer Mischung aus 16 ml trockenem Ppyridin und 3,49 ml (25,0 mmol) trockenem Triethylamin wurde eine Lösung von 5,72 g (25,0 mmol) Di-t-butylphosphorchloridat in 80 ml trockenem Dichlormethan bei –40°C zugegeben und bei –15°C für 3 Tage aufbewahrt. Es wurde bei Raumtemperatur im Vakuum (1 Hgmm) abgedampft, der Rückstand wurde in 75 ml Dichlormethan gelöst und mit 1 × 40 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 1 × 40 ml 20%iger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft. Der Rückstand (8,75 g) wurde mit Dichlormethan-Methanol (95-5 v/v) an Silikagel (500 g) chromatographiert, um 3,41 g (71%) der reinen Titelverbindung als blassgelbes dickes Öl zu ergeben. Rf = 0,54 (Dichlormethan-Methanol, 95-5 v/v); Analyse: berechnet für C₃₃HP₅₅O₆ (578,77): C: 68,48, H. 9,58%; gefunden: C: 68,28, H: 9,53%.
Synthesebeispiel 17
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
α-(Dihydrogenphosphat)
Zu einer Lösung von 1,45 g (2,5 mmol) Dexanabinol-7-(di-t-butyl-phosphat) in 40 ml trockenem Chloroform bei Raumtemperatur wurden 1,93 ml (25 mmol) Trifluoressigsäure zugegeben und für 40 Minuten gerührt. Es wurde mit 20 ml Chloroform verdünnt, mit 1 × 50 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, gesättigt mit Natriumchlorid, und 2 × 25 ml 20%igen Natriumchlorid-Lösungen gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft. Der Rückstand (1,045 g) wurde 2 × mit Methylacetat-Essigsäure-Wasser (85-10-5 v/v) an 100 g Silikagel chromatographiert. Die vereinigten Fraktionen wurden im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft, in 25 ml Chloroform gelöst, mit 2 × 25 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, gesättigt mit Natriumchlorid, und 1 × 25 ml 20%iger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft, um 0,171 g (15%) reine Titelverbindung als glasartiges Material zu erhalten.
Synthesebeispiel 18
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
α-(Dihydrogenphosphat)biscyclohexylaminsalz
Zu einer Lösung von 0,971 g (2,1 mmol) Dexanabinol-7-phosphat in 15 ml trockenem Methanol wurden 0,48 ml (4,2 mmol) Cyclohexylamin zugegeben und auf 5 ml abgedampft. Diese Lösung ließ man bei 0°C für 10 Tage kristallisieren. Die abgetrennten Kristalle wurden filtriert, mit 4 × 2 ml trockenem Methanol gewaschen und im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur getrocknet, um 0,467 g Salz zu ergeben. Es wurde aus 6 ml trockenem 1-Propanol umkristallisiert, was zu 0,394 g (28%) reiner Verbindung als weiße Nadeln führte; Schmelzpunkt: 176–180°C; Analyse: berechnet für C₃₇H₆₅N₂O₆P (664,91): C; 66,84, H: 9,85, N: 4,21 %; gefunden: C: 66,62, H: 9,84, N: 4,17%.
Synthesebeispiel 19
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
α-(Dihydrogenphosphat)-Dinatriumsalz
Zu einer Lösung von 0,052 g (0,11 mmol) Dexanabinol-7-phosphat in 2 ml trockenem Ethanol wurden 0,83 ml (0,22 mmol) einer 0,268 M Natriumhydyroxid-Lösung in trockenem Ethanol bei Raumtemperatur zugegeben (pH^–7–8). Die Lösung wurde im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft. Der Rückstand (0,055 g) wurde mit 40 ml entionisiertem Wasser gerührt, filtriert und mit 2 × 20 ml Wasser gewaschen. Die vereinigten wässrigen Lösungen wurden über Nacht gefriergetrocknet, was zu 0,044 g (78%) der Titelverbindung als sehr hygroskopisches weißes Material führte; Schmelzpunkt: über 200°C beginnt es, zu verkohlen.
Synthesebeispiel 20
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
α-(4-Morpholinyl)acetat
Zu einer Mischung von 0,194 g (0,50 mmol) Dexanabinol, 1,2 mg Dimethylaminopyridin-Katalysator, 0,091 g (0,50 mmol) (4-Morpholinyl)essigsäure-Hydrochlorid und 8 ml trockenem Dichlormethan wurden 0,103 g (0,50 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und für 113 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das gebildete Dicyclohexylcarbamid wurde abfiltriert, drei Mal mit Dichlormethan gewaschen, die vereinigten Lösungen wurden mit 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 × 25 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum (1 Hgmm) bei 40°C abgedampft. Der Rückstand (0,319 g) wurde mit Cyclohexan-Diethylamin (8-2 v/v) an Silikagel (30 g) chromatographiert, um 0,154 g (60%) reine Titelverbindung als leicht braunes klebriges Material zu erhalten. Rf = 0,44 (Cyclohexan- Diethylamin, 8-2 v/v); Analyse: berechnet für C₃₁H₄₇NO₅ (513,721: C: 72,48, H: 9,22, N: 2,73%; gefunden: C: 72,51, H: 9,25, N: 2,92%.
Synthesebeispiel 21
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
α-[4-(4-Morpholinyl)butyrat]
Zu einer Mischung von 0,194 g (0,50 mmol) Dexanabinol, 1,2 mg Dimethylaminopyridin-Katalysator, 0,105 g (0,50 mmol) 4-Morpholinobuttersäure-Hydrochlorid und 8 ml trockenem Dichlormethan wurden 0,103 g (0,50 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das gebildete Dicyclohexylcarbamid wurde abfiltriert, drei Mal mit Dichlormethan gewaschen, die vereinigten Lösungen wurden mit 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 × 5 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum (1 Hgmm) bei 40°C abgedampft. Der Rückstand (0,281 g) wurde mit Cyclohexan-Diethylamin (8-2, v/v) an Silikagel (25 g) chromatographiert, um 0,221 g (82%) reine Titelverbindung als blassgelbes sehr dickes Öl zu erhalten. Rf = 0,42 (Cyclohexan-Diethylamin, 8-2 v/v), IR (Film, v, cm^–1): 3358 (n OH), 2927 (n_as CH_2, ₃), 2852 (n_s CH_2, ₃), 1736 (n C = O, aliphatischer Ester), 1621 (n C = C, Olefin), 1576 (Phenylkern), 1450 (d CH₃), 1266 (n_as C-O-C), 1185 (n_s C-O-C), 1118 (n C-O), 967 (g C-H, Aromaten), 859 (g C-H, Olefin); Analyse: berechnet für C₃₁H₅₁NO₅ (541,77): C: 73,16, H: 9,49, N: 2,59%; gefunden: C: 72,92, H: 9,53, N: 2,62%.
Synthesebeispiel 22
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
α-[4-(4-Methylmorpholinium-4-yl)butyrat]iodid
Zu einer Lösung von 0,092 g (0,17 mmol) Dexanabinol-7-morpholinobutyrat in 1 ml trockenem Aceton wurden 0,053 ml (0,85 mmol) Methyliodid zugegeben und bei Raumtemperatur für 2 Tage aufbewahrt. Nach dem Abdampfen wurde der Rückstand in trockenem Ether (4 ml) gelöst, filtriert und für 5 Tage im Dunkeln aufbewahrt. Das abgetrennte klebrige Material wurde filtriert, drei Mal mit trockenem Ether gewaschen und im Vakuum (1 Hgmm) bei 35°C getrocknet, was zu 0,043 g (37%) reiner Titelverbindung als fast weißes klebriges Material führte. Ihre Reinheit betrug 98,5%, bestimmt durch HPLC.
Synthesebeispiel 23
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
α-(4-Methyl-1-piperazinyl)acetat
Zu einer Mischung von 0,194 g (0,50 mmol) Dexanabinol, 1,2 mg Dimethylaminopyridin-Katalysator, 0,079 g (0,50 mmol) (4-Methyl-1-piperazinyl)essigsäure und 8 ml trockenem Dichlormethan wurden 0,103 g (0,50 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und für 113 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das gebildete Dicyclohexylcarbamid wurde abfiltriert, drei Mal mit Dichlormethan gewaschen, die vereinigten Lösungen wurden mit 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 × 25 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum (1 Hgmm) bei 40°C abgedampft. Der Rückstand (0,345 g) wurde mit Cyclohexan-Diethylamin (8-2 v/v) an Silikagel (30 g) chromatographiert, um 0,137 g (52%) reine Titelverbindung als blassgelbes, sehr dickes Öl zu erhalten. Rf = 0,37 (Cyclohexan-Diethylamin, 8-2 v/v).
Synthesebeispiel 24
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
α-[(4-Methyl-1-piperazinyl)acetat]-Bishydrobromid
Zu einer Lösung von 0,052 g (0,10 mmol) Dexanabinol-7-(N-methylpiperazinoacetat) in 1 ml trockenem Dichlormethan wurden 0,56 ml (0,23 mmol) einer 0,40 M Bromwasserstoff-Lösung in trockenem Dichlormethan unter Eiskühlung zugegeben, und die Lösung wurde im Vakuum (20 Hgmm) bei Raumtemperatur auf einmal abgedampft. Zu dem Rückstand (0,067 g) wurden 25 ml entionisiertes Wasser zugegeben, es wurde für 2 Minuten gerührt, filtriert, mit 5 ml entionisiertem Wasser gewaschen, und die vereinigten wässrigen Lösungen wurden über Nacht gefriergetrocknet, um 0,060 g (87%) reine Titelverbindung als hygroskopisches weißes Material zu erhalten.
Synthesebeispiel 25
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
α-[4-(4-Methyl-1-piperazinyl)butyrat]
Zu einer Mischung von 0,194 g (0,50 mmol) Dexanabinol, 1,2 mg Dimethylaminopyridin-Katalysator, 0,144 g (0,50 mmol) 4-(4-Methyl-1-piperazinyl)buttersäure-Bishydrochlorid und 15 ml trockenem Dichlormethan wurden 0,103 g (0,50 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben, und es wurde für 65 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das gebildete Dicyclohexylcarbamid wurde abfiltriert, drei Mal mit Dichlormethan gewaschen, die vereinigten Lösungen wurden mit 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 × 25 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum (1 Hgmm) bei 40°C abgedampft. Der Rückstand (0,329 g) wurde mit Cyclohexan-Diethylamin (8-2 v/v) an Silikagel (50 g) chromatographiert, um 0,142 g (51%) reine Titelverbindung als blassgelbes, sehr klebriges Material zu erhalten. Rf = 0,43 (Cyclohexan-Diethylamin, 8-2 v/v), IR (Film, v, cm^–1): 3000 (sehr breit, n OH), 2930 (n CH_2, ₃), 1734 (n C = O, aliphatischer Ester), 1620 (n C = C, Olefin), 1575 (Phenylkern), 1461 (d CH₃), 1371 (geminales Dimethyl), 1283 und 1186 (n C-O-C), 1087 (n C-O, Phenol), 968 (g C-H, Aromaten), 816 (9 C-H, Olefin); Analyse: berechnet für C₃₄H₅₄N₂O₄ (554,82 + 1% Dichlormethan + 3% Diethylamin): C: 72,78, H: 9,90, N: 5,42%; gefunden: C: 72,78, H: 9,96, N: 5,36%.
Synthesebeispiel 26
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
α-[4-(4-Methyl-1-piperazinyl)butyrat]-Bishydrobromid
Zu einer Lösung von 0,060 g (0,11 mmol) Dexanabinol-7-(N-methylpiperazinobutyrat) in 1 ml trockenem Dichlormethan wurden 2,45 ml (0,27 mmol) 0,11 M Bromwasserstofflösung in trockenem Dichlormethan bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 10 Minuten wurde im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft, und zu dem Rückstand wurden 30 ml entionisiertes Wasser zugegeben und für 5 Minuten gerührt. Es wurde filtriert, und die wässrige Lösung wurde über Nacht gefriergetrocknet, um 0,071 g (90%) der reinen Titelverbindung als hygroskopisches weißes Material zu erhalten.
Synthesebeispiel 27
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
α-(Trifluoracetat)
Zu einer Lösung von 1,160 g (3,0 mmol) Dexanabinol in 60 ml trockenem Chloroform wurden 2,3 ml (30 mmol) Trifluoressigsäure und 9 g Molekularsiebe (3 ü, 4–8 mesh) zugegeben und für 22 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Es wurde filtriert, mit trockenem Chloroform (3 × 10 ml) gewaschen, und die vereinigten Lösungen wurden im Vakuum bei Raumtemperatur abgedampft. Der Rückstand wurde mit 12 ml trockenem n-Pentan behandelt, die kleine Menge an unlöslichem Material wurde abfiltriert und mit trockenem n-Pentan (3 × 1 ml) gewaschen, und die vereinigten Pentanlösungen wurden im Vakuum (1 Hgmm) bei Raumtemperatur abgedampft, um 1,424 g (98%) der reinen Titelverbindung als farbloses, klebriges Material zu erhalten. Rf = 0,71 (Benzol-Isopropanol 9-1 ); IR (Film, v, cm^–1): 3392 (n OH), 2960 (n_as CH₃), 2930 (n_as CH₂) 2858 (n_s CH₂), 1785 (n C = O, -Halogenester), 1623 (n C = C, Olefin), 1575 (Phenylkern), 1459 (d CH₃), 1168 (n C-O-C), 1082 (n C-O Phenol), 966 (g C-H, Aromaten), 837 (g C-H, Olefin); Analyse: berechnet für C₂₇H₃₇F₃O₄ (482,58): C: 67,20, H: 7,73%; gefunden: C: 67,17, H: 7,77%.
Synthesebeispiel 28
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
1-[4-(4-Morpholinyl)butyrat]
Zu einer Mischung von 0,241 g (0,50 mmol) Dexanabinol-7-trifluoracetat, 1,2 mg Dimethylaminopyridin-Katalysator, 0,105 g (0,50 mmol) 4-Morpholinobuttersäure-Hydrochlorid und 8 ml trockenem Dichlormethan wurden 0,103 g (0,50 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das gebildete Dicyclohexylcarbamid wurde abfiltriert, drei Mal mit Dichlormethan gewaschen, die vereinigten Lösungen wurden mit 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 × 5 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum (1 Hgmm) bei 40°C abgedampft. Der Rückstand (0,330 g) wurde mit Toluol-Diethylamin (9-1 v/v) an Silikagel (25 g) chromatographiert, um 0,134 g (71%) der reinen Titelverbindung als blassgelbes, sehr dickes Öl zu erhalten. Rf = 0,45 (Toluol-Diethylamin, 9-1 v/v), IR (Film, v, cm^–1): 3408 (n OH), 2929 (n_as CH_2, ₃); 2856 (n_s CH_2, ₃), 1757 (n C = O, Phenolester), 1624 (n C = C, Olefin), 1563 (Phenylkern), 1459 (d CH₃), 1370 (geminales Dimethyl), 1119 (n C-O), 864 (g C-H, Olefin); Analyse: berechnet für C₃₁H₅₁NO₅ (541,77): C: 73,16, H: 9,49, N: 2,59%; gefunden: C: 72,93, H: 9,50, N: 2,60%.
Synthesebeispiel 29
(6aS-trans)-6,6-Dimethyl-3-(1,1-dimethylheptyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
1-[4-(4-Methylmorpholinium-4-yl)butyrat]iodid
Zu einer Lösung von 0,059 g (0,11 mmol) Dexanabinol-4-morpholinobutyrat in 1 ml trockenem Aceton wurden 0,034 ml (0,55 mmol) Methyliodid zugegeben und für 2 Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt. Nach dem Abdampfen wurde der Rückstand für 2 Stunden mit kochendem n-Hexan kontinuierlich extrahiert. Der unlösliche Teil wurde im Vakuum (1 Hgmm) bei 40°C getrocknet, um 0,031 (41%) der reinen Titelverbindung als blassgelbes glasartiges Material zu erhalten. Seine Reinheit betrug 96,0%, bestimmt durch HPLC.
Synthesebeispiel 30
(6aS-trans)11tyl)-1-hydroxy-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol
1-[4-(4-Methyl-1-piperazinyl)butyrat]
Zu einer Mischung von 0,407 g (0,843 mmol) Dexanabinol-7-trifluoracetat, 2,5 mg Dimethylaminopyridin-Katalysator, 0,172 g (0,93 mmol) 4-(4-Methyl-1-piperazinyl)buttersäure und 25 ml trockenem Dichlormethan wurden 0,209 g (1,01 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und für 305 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das gebildete Dicyclohexylcarbamid wurde abfiltriert, mit 3 × 1,5 ml Dichlormethan gewaschen, die vereinigten Lösungen wurden mit 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 × 50 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum (1 Hgmm) bei 40°C abgedampft. Der Rückstand (0,495 g) wurde an Silikagel (50 g) zuerst mit Benzol-Triethylamin (8-2 v/v) und wieder an Silikagel (25 g) mit Benzol- Isopropanol-Triethylamin (8-1-1 v/v) chromatographiert, um 0,213 g (46%) Titelverbindung als leicht gelbes klebriges Material zu erhalten. Die analytische Probe wurde weiter durch Säulenchromatographie an Silikagel mit Cyclohexan-Diethylamin (8-2 v/v) aufgereinigt, die vereinigten Fraktionen wurden in Dichlorethan gelöst, abfiltriert und im Vakuum (1 Hgmm) bei 40°C abgedampft. Rf = 0,26 (Cyclohexan-Diethylamin, 8-2 v/v), Rf = 0,17 (Benzol-Triethylamin, 8-2 v/v), Rf = 0,31 (Benzol-Isopropanol-Triethylamin, 8-1-1 v/v), IR (Film, v, cm^–1): 3193 (n OH), 2930 (n CH_2, ₃), 1757 (n C = O, Phenolester), 1624 (n C = C, Olefin), 1566 (Phenylkern), 1462 (d CH₃), 1371 (geminales Dimethyl), 1283 (n C-O-C), 867 (g C-H, Olefin); Analyse: berechnet für C₃₄H₅₄N₂O₄ (554,82 + 1% Dichlormethan + 2% Diethylamin): C: 72,86, H: 9,84, N: 5,28%; gefunden: C: 72,74, H: 9,87, N: 5,20%.
Synthesebeispiel 31
Dexanabinol-7-acetat
Essigsäureanhydrid (0,48 ml, 5,0 mmol) wurde zu einer Suspension von Dexanabinol (2,00 g, 5,2 mmol) in wasserfreiem Chloroform (6,0 ml) zugegeben, und die erhaltene Mischung wurde unter Argon bei 24°C für 22 Stunden gerührt. Die erhaltene Lösung wurde einer Säulenchromatographie (Silikagel) unter Verwendung von Toluol/Ethylacetat (19 : 1) als Eluent unterzogen. Fraktionen, die Dexanabinol-7-acetat enthielten, wurden vereinigt und abgedampft, um analytisch reines Produkt (0,73 g, 34%) als klebriges Öl zu erhalten. Analyse: berechnet: C, 75,66; H 9,41; gefunden: C, 75,56, H 9,46.
Aus der zweiten Fraktion der Säulenchromatographie wurde das unumgesetzte Dexanabinol zurückgewonnen (1,30 g, 65%).
Physiologisches Beispiel 1
Neuroprotektive Wirksamkeit gegen Toxizität in kortikalen Kulturen, die über Glutamat-Rezeptoren vermittelt wird.
Die neuroprotektiven Wirksamkeiten der Verbindungen der Erfindung wurden an Neuronen getestet, die verschiedenen Exzitotoxinen in Kultur ausgesetzt waren. Die getesteten Verbindungen schlossen Dexanabinol und Dexanabinolacetat ein, von welchen kürzlich gezeigt wurde, dass sie NMDA-Antagonisteneigenschaften in Mäusen besitzen (U.S.-Patent Nr. 5,284,867 und Dexanabinolsuccinat).
Quantitative Neurotoxizitätstudien. Die Testwirkstoffe wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, Neuronen in Kultur vor toxischen Wirkungen von Agonisten der verschiedenen Gluatamatrezeptor-Subtypen (Agonisten von ionotropen und/oder metabotropen Glutamatrezeptoren), z. B. NMDA, AMPA, Kainat und Quisqualat, zu schützen. Die Kulturbedingungen und Assaybedingungen wurden alle so durchgeführt, wie es in Eshar et al., NeuroReport 5, 237–240 (1993) beschrieben ist. Kurz beschrieben, wurden primäre Hirnrindenzellkulturen aus 18–20 Tage alten Rattenföten durch enzymatische Dissoziation hergestellt. Die resultierenden Zellsuspensionen wurden auf einer konfluenten Feederschicht mit kortikalen Glialzellen (hergestellt 2 Wochen vorher durch ein ähnliches Verfahren) plattiert. Die Neuronen wurden in MEM-Medium enthaltend 0,6% Glucose, FUDR/Uridin-Mischung und N2-Zusatz (Insulin, Progesteron, Putrescin, Selen und Transferrin) kultiviert. Nach 10 Tagen in Kultur wurden die Zellen den verschiedenen Toxinen entweder alleine oder in Gegenwart der getesteten Verbindungen ausgesetzt. Alle Behandlungen wurden bei 37°C für 20–24 Stunden durchgeführt, bevor die Schädigung neuronaler Zellen und die neuroprotektive Wirksamkeit bestimmt wurden. Die Zelllebensfähigkeit wurde nach einer Neuron-spezifischen Enolaseimmunoanfärbung der Zellen unter Verwendung des ABC-Biotin-Avidin-Komplexverfahrens morphologisch und durch Messen des Ausmaßes an mitochondrialer Wirksamkeit in lebenden Zellen unter Verwendung des XTT-basierenden Assays quantitativ bestimmt. XTT (2,3-Bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilid-Salz) wird durch mitochondriale Dehydrogenase zu einem löslichen gefärbten Formazan reduziert. Die Dichte der Farbbildung (O.D.), welche proportional ist zur mitochondrialen Aktivität, wurde durch ein Platten-ELISA-Lesegerät gemessen. Das Ausmaß an neuroprotektiver Wirksamkeit wird als % an Zellen, die durch die getesteten Wirkstoffe gerettet werden, ausgedrückt.
Vorderhirnmembran-Präparation: Die Gehirne wurden von Sprague-Dawley-Ratten nicht länger als 5 Minuten nach der Dekapitation entfernt. Die Membran-Präparationen wurden gemäß einer kürzlich beschriebenen Vorgehensweise isoliert (Eshhar et al., Brain Res. 476: 57, 1989). Vor den Radioligandenbindungs-Messungen wurde in den Membranen vorhandenes endogenes Glutamat von der Präparation entfernt, indem die Membranen 3–4 aufeinanderfolgenden Waschungen in 10 mM Tris HHI pH 7,2, durchgeführt bei 4°C, unterzogen wurden.
Radioligandenbindungsstudien. Die Bindung von [3H]MK-801 an Membranen wurde in Gegenwart von 30 mM Glycin und 10 mM L-Glutamat durchgeführt. Die Membranen (250 mg Protein) wurden in 50 mM Tris-Acetat pH 7,4-Puffer, resuspendiert und mit 10 nM (3H]MK-801, entweder alleine oder in Gegenwart von Dexanabinol bei Konzentrationen von 0,195–100 mM für drei Stunden bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die in den verschiedenen Radioligandenbindungsstudien verwendeten Reaktionspuffer enthielten 10% einer Mischung aus Ethanol/Emulphor620/entionisiertem Wasser. Das Verhältnis (Volumen) der betreffenden Komponenten in der Mischung war 20/3/57. Diese Mischung ist erforderlich, um Dexanabinol bei Konzentrationen oberhalb von 30 mM zu solubilisieren. Das Reaktionsvolumen betrug 1 ml. Die nicht-spezifische [3H]MK-801-Bindung wurde in Gegenwart von 100 mM unmarkiertem MK-801 bestimmt. Die Bindung von [3H]AMPA und [3H]Vinylidenkainsäure an Membranen wurde wie in Eshhar et al., 1993 (ibid.) durchgeführt.
Neutroprotektive Wirksamkeit von Dexanabinol: Die Coanwendung von 1000 mM NMDA und 10 mM Dexanabinol bei Zellkulturen führte zu einer vollständigen Bewahrung der Neuronen vor NMDA-induzierter Toxizität. Die morphologischen Merkmale von Dexanabinol-behandelten Zellen ähnelten denen von unbehandelten Schwesterkulturen. Dexanabinol verhinderte sowohl das Schwellen von neuronalen Zellkörpern als auch den durch das Toxin verursachten dendritischen und axonalen Degenerationsprozess. Die neuroprotektive Wirkung von 10 mM Dexanabinol gegen NMDA-induzierte Toxizität war vergleichbar mit der, die von 30 mM MK-801 hervorgerufen wird. Ein Enzym-verbundenes Immunoanfärben mit Antikörpern zu Enolase führte zu einem dichten Färben in Nervenzellkörpern und Prozessen von MK-801- und Dexanabinol-behandelten Zellen. Die Färbeintensität war ähnlich der, die durch Kontrollzellen von Schwesterkulturen erzeugt wurde. Diese morphologischen Beobachtungen wurden bestätigt, indem die mitochondriale Aktivität in Zellen aufgrund einer Schädigung und/oder der Schutz unter Verwendung des XTT-basierenden Assays gemessen wurden. Die Dosis-Reaktion-Beziehung von Dexanabinol, die erforderlich ist, um vor einer NMDA- und Quisqualat-Neurotoxizität zu schützen, wurde untersucht. NMDA-hervorgerufene neurotoxische Wirkungen wurden durch Dexanabinol auf konzentrationsabhängige Weise abgeschwächt. Bei 3,8 ± 0,9mM Dexanabinol (Mittel ± s.d.; n = 3) wurde eine halbmaximale Neuroprotektion gegen NMDA-vermittelte Toxizität (EC50) beobachtet. Die Neurotoxizität, die hervorgerufen wird, wenn die Zellen 1000 Quisqualat ausgesetzt werden, wurde durch Dexanabinol abgeschwächt, obwohl dies zu einem geringeren Ausmaß der Fall war. Der Prozentanteil von Zellen, die durch 10 mM Dexanabinol gerettet wurden, wurde auf 28,2 ± 8% bestimmt. Im Gegensatz dazu schützte Dexanabinol Neuronen nicht vor der Schädigung durch die Nicht-NMDA-Agonisten – Kainat oder AMPA.
Wirkungsmechanismus von Dexanabinol, analysiert durch Radioligandenbindungsstudien: Die Identifikation von möglichen Erkennungsstellen für Dexanabinol bei verschiedenen Glutamatrezeptor- Subtypen wurde durchgeführt, indem die Fähigkeit von Dexanabinol, die Bindung von entweder MK-801, Kainsäure oder AMPA an Rattenvorderhirnmembranen zu inhibieren. Radioligandenbindungsstudien zeigten, dass Dexanabinol mit der Bindung von MK-801 an Membranen konkurriert, während es eine AMPA- oder Kainsäure-Bindung nicht inhibieren kann. Es wurde der Inhibierungskonstantenä(KI)-Wert, der von Dexanabinol gezeigt wird, gemessen, und es wurde festgestellt, dass er 11,0 ± 1,3 mM betrug. Wie aus Scatchard-Analysen gefolgert wurde, beeinträchtigte Dexanabinol stark die Affinität von (3H]MK-801 für Rattenvorderhirnmembranen. Es wurden bemerkenswerte Erhöhungen der Affinität (erhöhte KD-Werte) beobachtet. Der KD für die [3H]MK-801-Bindung betrug 40,5 ± 2,5 nM und 74,7 ± 2,2 nM, wenn dem System Dexanabinol zugegeben wurde. Die offensichtlichen berechneten BMAX-Werte für [3H]MK-801 waren 0,290 ± 0,012 bzw. 0,273 ± 0,007 pmol/mg Protein. Die betreffenden nN-Werte wurden auf 1,011 ± 0,027 und 1,008 ± 0,009 bestimmt. Diese Daten weisen darauf hin, dass Dexanabinol die MK-801-Bindung auf kompetitive Weise verdrängt.
Physiologisches Beispiel 2
Neurotoxische Wirkungen von Natriumnitroprussid in kortikalen Kulturen von Ratten werden durch Dexanabinol abgeschwächt
Die Fähigkeit von Dexanabinol, einen neuronalen Zelltod, der durch den Stickstoffoxid-(NO)-Donor Natriumnitroprussid (SNP) induziert wird, zu verhindern, wurde in kortikalen Zellkulturen von Ratten untersucht. Die neurotoxischen Wirkungen von SNP können NO, welches spontan durch die Verbindung freigesetzt wird, oder möglicherweise freigesetztem Cyanid zugeschrieben werden. NO ist ein aktives Mittel bei Neurotoxizität und stellt einen wichtigen Neurotransmitter im zentralen und peripheren Nervensystem dar (Garthwaite, TINS 14: 60–67, 1991). Es wurde auch vermutet, dass NO ein Mediator neuronaler Schädigung während Ischämie ist (Nowicki et al, J. Pharmacol., 204: 339, 1991) und es wurde als chemischer Mediator vorgeschlagen, der exzitatorische Neurotransmission mit exzitotoxischem Zelltod koppelt (Dawson et al., PNAS 88: 6368, 1991). Es wurden mehrere Beweisketten dafür vorgeschlagen, dass die toxischen Wirkungen von SNP nicht nur aus der Freisetzung von NO resultiert. Wie von Izumi et al. (Exp. Neurol. 121: 14, 1993) gezeigt, wurde eine in hippokampalen Schnitten von Ratten erzeugte SNP-Neurotoxizität nicht durch MK-801 abgeschwächt. Darüber hinaus hat diese Studie vorgeschlagen, dass SNP eine Zellschädigung induziert, die sich von der unterscheidet, die von NMDA oder Cyanid verursacht wird.
METHODEN
Präparation von kortikalen Zellkulturen: Die Kulturen wurden gemäß der oben in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise präpariert.
Behandeln der Zellen mit SNP und Toxizitätsbestimmungen: Die Zellen, die 10–14 Tage in Kultur waren, wurden 0,5–10 mM SNP, entweder alleine oder zusammen mit 10 mM Dexanabinol (HPCD-Präparation) oder 30 mM MK-801 ausgesetzt. Alle Behandlungen wurden für 20–24 Stunden bei 37°C durchgeführt, bevor der neuronale Zelltod bestimmt wurde. Zellen von Schwesterkulturen wurden parallel nur dem Vehikel ausgesetzt und wurden als Kontrollen bezeichnet. Der Zelltod wurde nach einer immunozytochemischen Lokalisierung von neuronenspezifischer Enolase morphologisch analysiert und quantitativ bestimmt, indem der XTT-basierende Assay, wie es in Physiologischem Beispiel 1 beschrieben ist, verwendet wurde.
ERGEBNISSE
Die Inkubation von Zellen mit SNP führte zu einer massiven Neuronal- und Glialzellenschädigung. Eine dramatische Abschwächung des Zelltods wurde beobachtet, wenn die Zellen mit Dexanabinol und SNP, Konzentrationen bis zu 5 mM, coinkubiert wurden. Dexanabinol war nicht wirksam, wenn es zusammen mit SNP bei einer Konzentration von 10 mM verabreicht wurde. Quantitative Bestimmungen der mitochondrialen Aktivität in Zellen haben gezeigt, dass Dexanabinol in der Lage war, 75% der Zellen vor einer Schädigung aufgrund von 500 mM SNP zu retten. Es wurde keine Zellrettung beobachtet und gemessen, wenn die Zellen mit MK-801 coinkubiert wurden. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± S.E.M. von 3 Experimenten, die sechsfach durchgeführt wurden. Wie oben diskutiert und in Beispiel 1 gezeigt, zeigen die Ergebnisse, dass Dexanabinol neuroprotektive Wirksamkeiten hervorruft, die nicht für MK-801 gezeigt werden konnten, obwohl beide Wirkstoffe nichtkompetitive NMDA-Antagonisten sind und Neuronen über eine Bindung an gleiche Stellen, die in dem NMDA-verbundenen Ionenkanal lokalisiert sind, vor einer Exzitotoxizität schützen können. Es ist offensichtlich, dass Dexanabinol Neuronen vermutlich über mehr als einen Wirkungsmechanismus vor einer Schädigung, die durch eine Vielzahl von Wirkstoffen induziert wird, schützen kann. Das breitere Spektrum der von Dexanabinol gezeigten neuroprotektiven Wirksamkeit ist offensichtlich von großem Vorteil.
Physiologisches Beispiel 3
Die neuroprotektive Wirkung von Dexanabinol auf permanente fokale Ischämie (Ratten MCAo)
Die neuroprotektive Wirkung von Dexanabinol wurde in einem Modell für permanente fokale Ischämie bestimmt, wobei Ratten verwendet wurden, in welchen die mittlere Hirnarterie elektrisch koaguliert wurde. In diesem Modell ist die verursachte primäre Schädigung nicht durch eine pharmakologische Maßnahme behandelbar. Die Verbesserung des Ergebnisses wird aufgrund der Verringerung bei der Penumbra sekundärer Schädigung, die in der unmittelbaren Nachbarschaft von MCA vorhanden sein kann, erwartet. Somit wird eine erfolgreiche Maßnahme das gesamte Volumen des Infarkts verringern.
VORGEHENSWEISEN
Man ließ die Tiere (Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 300–400 g) über Nacht fasten, ließ ihnen aber freien Zugang zu Wasser. Es wurde mit 4% Halothan, 70% Stickstoffoxid und einem Rest von Sauerstoff eine Anästhie induziert und während der chirurgischen Verfahren mit 2% Halothan und 70% Stickstoffoxid aufrechterhalten. Es wurde Atropinsulfat (0,04 mg, i.p.) injiziert. Die rechte Oberschenkelarterie und -vene wurden mit PE-50 Polyethylenkathetern kanüliert, um den arteriellen Blutdruck und Blutgase zu kontrollieren und um Wirkstoffe zu verabreichen. Die Ratten wurden dann intratracheal intubiert, mit Pancuroniumbromid immobilisiert (Anfangsdosis 0,6 mg/kg; zusätzliche Dosis 0,2 mg/kg, i.v.) und mechanisch beatmet. Die Tiere wurden in einem Stereotaxisgerüst (Stoelting, Illinois) fixiert. Die Blutgase (ABL 30 System, Radiometer, Kopenhagen), Plasmaglucose und Lactat (Glucose/Lactat Analyzer Modell 2300 STAT, YSI, Ohio) wurden 30 Minuten vor der Verabreichung von Dexanabinol oder eines Vehikels während der Ischämie (30 Minuten nach MCAo, d. h. 60 Minuten nach der Wirkstoffverabreichung) kontrolliert. Die physiologischen Variablen wurden innerhalb normaler Grenzen gehalten.
MCA-Behandlung, Gehirntemperatur-Kontrolle und CBF-Kontrolle.
Die rechte MCA wurde dem Verfahren von Tamura et al. ausgesetzt (Tamura et al., J. Cereb. Blood Flow Metab., 1: 53–60, 1981). Kurz gesagt, wurden das Schädeldach und die rechte seitliche Fläche des Schädels mittels eines longitudinalen Hautschnitts zwischen dem Auge und dem Ohr freigelegt. Der Jochbogen wurde entfernt. Ein Bohrerloch (Durchmesser 1,5 mm) für die Gehirntemperatursonde wurde oberhalb des rechten Parietalkortex mittels eines Hochgeschwindigkeit-Minibohrers (Nihon-Seimitsu Kikai Kogyo K. K., Japan) unter einem Operationsmikroskop (Carl Zeiss, Deutschland) erzeugt; der Bereich wurde häufig mit kalter Saline gespült, um eine thermische Schädigung zu vermeiden. Die Gehirntemperatur wurde mit einer Thermoelementsonde (CN 9000, Omega) kontrolliert, welche in den Kortex insertiert wurde (ungefähre Koordinaten, 4 mm lateral zum Bregma, 2 mm Tiefe von der Gehirnfläche). Die Gehirntemperatur wurde mittels einer kleinen Heizlampe, die 20 cm oberhalb des Kopfes platziert war, zwischen 35–36°C gehalten. Ein anderes Bohrerloch (2 mm lateral zum Bohrerloch für die Temperatursonde, 2 mm Durchmesser) wurde in die laterale Fläche des Schläfenbeins gebohrt, um eine kontinuierliche CBF-Messung mittels Laser-Dopplerflussmetrie (P433-3, Vasamedics) zu erlauben. Diese Sonde wurde mit einem Perfusionsmonitor (LaserFlo BPM 403A, Vasamedics) verbunden. Diese Position der Sonde wurde basierend auf vorherigen Studien bestimmt (Duverger und MacKenzie, J. Cereb. Blood Flow Metab. 8: 449–461, 1988; Shiraishi, Sharp & Simon, J. Cereb. Blood Flow Metab. 9: 675–773, 1989; Tyson et al., Ann. Neurol. 15: 559–567, 1984), wobei das gleiche proximate MCA-Okklusionsmodell in Sprague-Dawley-Ratten verwendet wurde. Dann wurde ein Schläfenbeinbohrerloch in die retroorbitale Region gebohrt, um ein Klemmen der MCA zu erlauben, und die Dura Mater, die die MCA bedeckt, wurde geöffnet.
Steady State-Kontrolle, Wirkstoffverabreichung und MCAo.
Nach diesen chirurgischen Vorgehensweisen wurde das eingeatmete Halothan unterbrochen, um die Wirkung von Halothan auf den systemischen Blutdruck und CBF zu vermeiden. Die Anästhesie wurde mit 70% Stickstoffoxid und 30% Sauerstoff aufrechterhalten. 30 Minuten nach der Unterbrechung von Halothan wurde mit der Messung präischämischer physiologischer Variablen, CBF, MAP und Pulsfrequenz begonnen. Die Steady State-Basisniveau-Werte wurden vor der Verabreichung von Dexanabinol oder dem Vehikel aufgenommen, und CBF wurde als Prozentanteil des Mittelwertes von 6 Basisniveau-Messungen, die alle 5 Minuten vor der Verabreichung genommen wurden, ausgedrückt. Da Umgebungslicht das Auslesen des Flusses stört, wurde die Heizlampe während jeder CBF-Aufnahme für 30 Sekunden ausgestellt. Die Gehirntemperatur erniedrigte sich während dieser Zeit nicht unter 35°C. Um die Wirkung von Dexanabinol auf CBF und MAP zu detektieren, wurden diese Variablen alle 15 Minuten nach der Verarbeichung von Dexanabinol oder dem Vehikel gemessen.
Nach 30 Minuten der präischämischen Datenaufnahme wurden Dexanabinol (11 mg/ml, 20 mg/kg i.p.) oder die gleiche Menge an Vehikel verabreicht. 30 Minuten nach der Wirkstoff-Verabreichung wurde der proximale Teil der rechten MCA elektrokoaguliert und durchtrennt.
Hirnperfusion, pathologische Studie: Die Gehirne wurden 3 Tage nach dem ischämischen Trauma für eine pathologische Untersuchung Perfusion-fixiert. Die Ratten wurden mit Pentobarbital stark anästhesiert und transkardial mit physiologischer Saline (5 Minuten) und dann mit FAM (einer Mischung aus 40% Formaldehyd : Eisessig : Methanol, 1 : 1 : 8 in Volumen, 20 Minuten) bei einem Druck von 120 mmHg perfundiert. Der Kopf wurde für mindestens 24 Stunden in FAM getaucht; das Hirn wurde dann entfernt und für 7 Tage in dem gleichen Fixativ gehalten. Die Gehirne wurden koronal geschnitten und in Paraffin eingebettet. In 200 mm Intervallen wurden 10 mm dicke Gehirnscheiben präpariert und mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Für eine morphometrische Studie wurden 10 koronale Schnitte bei definierten anatomischen Levels selektiert (Osborne et al., 1987). Jeder Schnitt wurde bei geringer Leistung (10 ×) angesehen und der kortikale Infarkt wurde auf Papier aufgezeichnet, indem eine Camera Lucida-Mikroskopeinrichtung verwendet wurde. Jede Zeichnung wurde dann auf einem Digitalisiertablett nachgezogen, welches mit einem Computer verbunden war, der Infarktbereiche bei jedem koronalen Level berechnete. Das Infarkt-Volumen wurde durch rechnerische Integration sequenzieller Infarktbereiche berechnet.
Stereotaxiskoordinaten (mm) der Level 1–10 sind: 1 = 12,13; 2 = 10,05; 3 = 8, 92; 4 = 7,19; 5 = 6,06; 6 = 5,15 7 = 3, 75; 8 = 2,18; 9 = 1,02; 10 = –0,48 hinter der Interaurallinie.
ERGEBNISSE
Die Tiere, deren physiologische Variablen nicht innerhalb normaler Grenzen gehalten werden konnten, oder welche unkontrollierbare Blutungen aufwiesen, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Es wurde eine Gesamtzahl von neunundzwanzig Ratten verwendet. Es wurden zwanzig Ratten ohne unkontrollierbare Blutung, und die die physiologischen Kriterien erfüllten, behandelt. Eine Ratte von zwanzig wurde entsorgt, da die pathologische Untersuchung keinen Hirninfarkt zeigte. Die Abwesenheit eines Infarkts bedeutet das Versagen von MCAo.
Die neurologischen Werte bei 1d, 2d und 3d nach der MCAo waren verglichen mit dem neurologischen Wert bei 2h in der Dexanabinol-behandelten Gruppe deutlich verbessert. Die Verbesserung der Dexanabinol-behandelten Gruppe war verglichen mit Vehikel-behandelten Kontrollen wesentlich verbessert. Aufschlussreicher ist die Analyse des Infarktbereichs. Bei Levels zwischen 4 und 8 war das Infarktvolumen von Dexanabinol-behandelten Tieren signifikant verringert. Dies zeigt, dass Dexanabinol bei der wesentlichen Verringerung von penumbraler Schädigung, welche außerhalb der Region auftritt, die regelmäßig an einer direkten Schädigung aufgrund der MCA-Okklusion beteiligt ist, wirksam ist.
Physiologisches Beispiel 4
Die Wirkung von Dexanabinol auf zerebrales Ödem in einem Rattenmodell für Kopftrauma
Die zerebroprotektive Wirkung von Dexanabinol wurde in einem Modell für Kopftrauma (HT) in Ratten bestimmt. In anästhesierten Ratten wurde eine Verletzung durch eine Gewichtfallvorrichtung, gefolgt von einer Erholungsphase von bis zu 48 Stunden eine Verletzung induziert. Eine solche Art von Trauma führt zu einem Gehirnödem (d. h. Erhöhung des Wassergehalts, Abnahme des spezifischen Gewichts des Gehirns), Zusammenbruch der Blut-Gehirn-Schranke (BBB) und einer klinischen Dysfunktion. Der klinische Status der Ratten wurde 1, 24 und 48 Stunden nach der Verletzung zusammen mit der Messung des Ausmaßes an zerebralem Ödem bewertet. Das neurologische Defizit, bestimmt durch ein Set von Kriterien, die Neurological Severity Score (NSS, Skala neurologischer Heftigkeit) genannt wird, ist 1 Stunde nach der Initiierung des Kopftraumas maximal. Die NSS nimmt ausgehend von der Initiierung von HT mit der Zeit ab, wobei sich die Ratten allmählich spontan erholen.
Dexanabinol verringert die Ödembildung und die BBB-Zerstörung wesentlich, wenn es davor (30 Minuten), direkt nach dem HT (0 Minuten) oder selbst 1 und 2 Stunden nach dem HT verabreicht wird. Diese Wirkung war ähnlich, gleichgültig, ob der Wirkstoff in das Gehirn (i.c.v.) oder parenteral (i.p. oder i.v.) verabreicht wurde. Die erforderliche Dosis für eine wesentliche Neuroprotektion hängt von der Art der Verabreichung ab und reicht von 0,5-20 mg/kg. Es ist auch wichtig anzumerken, dass die NSS, hauptsächlich die spezifische motorische Funktion (z. B. Laufen auf einem Balken und Balance) bei der Verabreichung von Dexanabinol wesentlich verbessert wurde. In der Tat verringerte selbst eine Dosis von Dexanabinol, die 1 Stunde nach dem Schlag verabreicht wurde, das Ödem effektiv und verbesserte das klinische Ergebnis, das 48 Stunden nach dem HT gemessen wurde (Shohami et al., J. Neurotrauma 10: 109, 1993).
EXPERIMENTELLE VORGEHENSWEISE
Das Modell wurde detailliert bei Shapira et al., Crit. Care Med. 16: 258–265, 1988 beschrieben. Die Ratten wurden mittels einer Gewichtfallvorrichtung einem Kopftrauma (HT) unterzogen, und überlebende Ratten wurden nach einer Woche nachbehandelt. Während dieser Zeitdauer hatten sie freien Zugang zu Nahrung und Wasser, und es wurden 2–3 Ratten pro Käfig gehalten. Zu vorbestimmter Zeit (15 Minuten, 1, 4, 24, 48 Stunden, 4, 7 Tage) wurden die Ratten getötet. Ihre Gehirne wurden dann schnell entfernt, und es wurde kortikales Gewebe entnommen, um den Wassergehalt, Ionen und die Metaboliten von Interesse bei jeder speziellen untersuchten metabolischen Kaskade zu bestimmen. Während der Erholungszeit wurde der klinische Status durch ein Set von Kriterien (NSS) bewertet.
Das Trauma induzierte eine beträchtliche Abnahme des spezifischen Gewichts (SG) von Gehirngewebe und eine Erhöhung des Wassergehalts aufgrund der Kopfverletzung. Es entwickelten sich Ödeme, da sich entweder in den extrazellulären (vasogenen) oder intrazellulären (cytotoxischen) Bereichen mehr Wasser ansammelte. Die zur Bestimmung von Ödemen verwendeten Verfahren basieren auf linearen Gradientensäulen von Brombenzol und Kerosin (für SG) und für den Wassergehalt auf dem Trocknen des Gewebes in einem Trockenofen. Gewebeteile (jeweils 20 mg) wurden am oberen Teil der Säule platziert, und das SG wurde ausgehend von der Gleichgewichtsposition in der Säule unter Verwendung einer Standardkurve berechnet.
Den Tieren wurde Chloralhydrat (350 mg/kg i.p.) verabreicht und sie wurden 30 Minuten nach dem Trauma für einen 10-minütigen T2-gewichteten Scan (TR = 2,5 Sekunden), TE = 55 mSekunden, Scheibendicke = 1 mm, Zentrum zu Zentrum-Scheibenseparation = 1,2 mm, 128 × 256 Matrix, FOV = 5 cm) in einen 4,7 Tesla = Magnet platziert. Eine Stunde nach dem Trauma erhielten die Ratten eine i.v.-Injektion von Dexanabinol 5 mg/kg in Emulsion (N = 9) oder das entsprechende Vehikel (N = 11). Der Scan wurde 24 Stunden nach dem Trauma wiederholt. Das Ausmaß (Volumen) der anfänglichen Schädigung des Gehirns wurde aus der Volumendifferenz zwischen den rechten und linken Hemisphären berechnet. Das Volumen des Ödems 24 Stunden später wurde aus der Fläche hyperintensiver Regionen (außer Ventrikeln) an allen den Scheiben berechnet, bei welchen solche Regionen vom Schwellwert ab beobachtet wurden, multipliziert mit 1,2 mm. Für jedes einzelne Tier wurde das Verhältnis zwischen dem Volumen der anfänglichen Schädigung und dem Ödem-Volumen berechnet, um Variationen der anfänglichen Schädigung zu berücksichtigen.
ERGEBNISSE
In Tabelle 2 werden die Ergebnisse in zwei Sets von Experimenten zusammengefasst. In dem ersten wurde Dexanabinol in niedriger Dosis (1,6 mg/kg) direkt in die zerebralen Ventrikel verabreicht. In dem zweiten wurde es i.p. Mit 20–30 mg/kg injiziert. In beiden Sets von Experimenten wurde der Wirkstoff eine halbe Stunde vor und genau nach der Induktion des Traumas verabreicht, und seine Wirkung auf das Ödem und das klinische Resultat wurden 24 und 48 Stunden später bewertet. Das Ergebnis zeigt eine beträchtliche (p < 0,5) Erniedrigung des Ausmaßes des nach einem Kopftrauma (HT) entwickelten Ödems. Als Ergebnis der Dexanabinol-Behandlung von traumatisierten Ratten sammelten sich ungefähr 50% weniger Wasser im Gehirn an.
TABELLE 2: Die Wirkung von Dexanabinol bei der Verbesserung von zerebralem Ödem nach einem Kopftrauma
Die Wirkung von Dexanabinol wurde durch den Prozentanteil der Ödembildung berechnet, wobei 100% als das Ödem bei nichtbehandelten Kontroll-Ratten genommen wurde. Somit wurde das SG wie folgt berechnet:
SG (Schein(sham))-SG (Wirkstoff)/SG (Schein)-SG/Kontrolle × 100.
Die Erhöhung des Wassergehalts wurde wie folgt berechnet:
% H₂O (Wirkstoff-% H₂O (Schein)/% H₂O (Kontrolle)-H₂O (Schein) × 100.
Alle in der Tabelle dargestellten Ergebnisse sind statistisch unterschiedlich (p < 0,05) von den Kontroll-traumatisierten Vehikel-behandelten Ratten.
Nachdem wir die Wirkung auf das Ödem bestimmt haben, wenn es 30 Minuten vor oder gleich nach dem HT verabreicht wurde, untersuchten wird das "therapeutische Fenster", wobei Dexanabinol 25 mg/kg i.p. eine, zwei oder drei Stunden nach dem HT verabreicht wurde. Es wurde seine Wirkung auf NSS (und auf eine spezifische motorische Funktion) sowie die Wirkung auf ein Ödem und die BBB-Integrität bestimmt. Dexanabinol war voll wirksam, auch wenn es bis zu 2 Stunden nach der Verletzung verabreicht wurde; bei 3 Stunden nach dem Trauma war die Wirkung weniger stark.
MRI-Analyse von Ödemen. MRI (magnetische Resonanzabbildungs)-Analyse der Ergebnisse des Kopftraumas ermöglichten uns, die Wirkung von Dexanabinol auf die Verteilung des Ödems relativ zu der Stelle und der Größe der anfänglichen Schädigung zu untersuchen: Die Tiere wurden 30 Minuten nach dem Trauma gescannt, ihnen wurde 30 Minuten später Dexanabinol oder ein Vehikel injiziert, und sie wurden 24 Stunden nach dem Trauma wieder gescannt. Das Volumen der anfänglichen Schädigung wurde aus der Differenz zwischen der rechten (ungequetscht) und linken Hemisphäre berechnet und das Volumen des Ödems wurde durch Messen der hyperintensiven Regionen an den Gehirnscheiben gemessen. Dexanabinol verringerte das Verhältnis von dem Ödem-Volumen zu dem Volumen der anfänglichen Schädigung beträchtlich, was widerspiegelt, dass sich die Verteilung des Ödems auf die Schwere der anfänglichen Verletzung normalisierte.
Das Volumen der Gehirngewebeschädigung in den Versuchstieren variierte von 15 bis 60 ml. Das mittlere Volumen der anfänglichen Schädigung war in den Dexanabinol-behandelten Tieren höher (39 ml vs. 24 ml), da die Vehikel-behandelten Ratten mit großen (>45 ml) Wunden nicht überlebten. In Vehikel-behandelten Tieren war das Ödem-Volumen jedoch höher (p = 0,05), und das Verhältnis des Ödems zur anfänglichen Schädigung in einzelnen Ratten war in der Dexanabinol-behandelten Gruppe beträchtlich niedriger: Mittel ± sem Vehikel, 5,95 ± 1,6; Dexanabinol 1,6 ± 0,55; p < 0,03, Student-t-Test, zweiteilig.
FOLGERUNG
Eine ernste Kopfverletzung oder eine zerebrale Ischämie ist mit einer hohen Sterblichkeitsrate (oberhalb 50%) und einem schlechten funktionellen Resultat verbunden. Trotz extensiver klinischer und experimenteller Forschung gibt es für diese Bedingungen keine wohldefinierten Therapien. Es gibt heutzutage sehr wenig erhältliche Behandlungen für eine Hirnverletzung, und die allmählichen zunehmenden biochemischen Veränderungen, die nach einem Kopftrauma auftreten, können zur Entwicklung einer permanenten neuronalen Schädigung führen. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, d. h. Dexanabinol, zerebroprotektive Eigenschaften in einem Modell für geschlossene Kopfverletzung in Ratten besitzen.
Physiologisches Beispiel 5
Vorteilhafte Wirkung von Dexanabinol bei verletzten Sehnerven in Ratten
Eine Schädigung der Nerven des zentralen Nervensystems (ZNS) des Säugers führt zu einer axonalen Degeneration gefolgt von einem Verlust von Zellkörpern. Eine anfängliche Degeneraton des verletzten Nervs resultiert vermutlich aus der direkten Schädigung. Die physiologischen und biochemischen Ereignisse, die direkt nach der Schädigung in dem Nerv auftreten, sind wahrscheinlich nicht nur für die Degeneration der direkt verletzten Axone, sondern auch für die verantwortlich, die der primären Läsion entkommen sind. Somit besitzen die primären biochemischen und physiologischen Ereignisse, die die verschonten Axone zerstören, einen kritischen Einfluss auf das funktionelle Langzeitresultat.
Die vorliegende Studie wurde darauf ausgerichtet, die mögliche Fähigkeit der Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung, insbesondere Dexanabinol, Defizite, die durch eine frühe Schädigung induziert sind, und darauffolgende physiologische Manifestationen abzuschwächen, zu bestimmen. Defizite, die durch eine frühe Schädigung induziert sind, wurden nicht-invasiv unter metabolischen Bedingungen und Langzeitmanifestation wurde unter physiologischen Bedingungen kontrolliert.
Die Kontrolle der sofort durch eine Schädigung induzierten Veränderungen bietet optimale Mittel für die Bestimmung der Fähigkeit des hierin beanspruchten Wirkstoffes (Dexanabinol) wie für jeden anderen potenziellen Wirkstoff, die Ursachen einer sekundären Degeneration eher als ihre Folgen zu verhindern. Dies versetzt einen in die Lage, herauszufinden, ob der hierin beanspruchte Wirkstoff (Dexanabinol) oder beliebige andere getestete Wirkstoffe die Rettung von Axonen, die von der primären Schädigung verschont wurden, erleichtern wird. In all diesen Studien wurde der Sehnerv von Ratten als Modell für das ZNS verwendet. Die Ergebnisse sind somit auf das ZNS-Trauma im Allgemeinen und den Sehnerv im Besonderen anwendbar. Darüber hinaus ist es insbesondere hinweisend für einen Schutz gegen axonale Schädigung und ist daher auch relevant für Rückenmarksverletzungen.
METHODEN
Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 300 bis 400 g wurden mit Natriumpentobarbiton (35 mg/kg intraperitoneall anästhesiert. Wenn erforderlich, wurde für eine künstliche Beatmung eine Kanüle in die Trachea eingeführt. Es wurde eine laterale Kanthotomie unter einem binokularen Operationsmikroskop durchgeführt, wobei der Kopf des Tieres durch einen Kopfhalter in Position gehalten wurde, und die Konjunktiva wurde lateral zur Hornhaut aufgeschnitten. Nach der Abtrennung der Retraktionsbulbimuskeln wurde der Sehnerv identifiziert, und es wurde ein 3-3,5 mm langes Stück nahe des Augapfels durch stumpfe Präparation freigelegt. Die Dura wurde intakt gelassen, und es wurde aufgepasst, dass der Nerv nicht verletzt wurde. Der erste Teil eines Lichtwellenleiterhalters wurde an der Oberfläche des Sehnervs 1 mm von der Stelle der Verletzung lokalisiert. Dann wurde der zweite Teil so fixiert, dass der Lichtwellenleiter auf der Fläche des Sehnervs, 1 mm von der Stelle der Verletzung lokalisiert war.
Oberflächenfluorometrie-Reflektometrie: Die Kontrolle des intramitochondrialen Nicotinaminadenindinukleotid-(NADH)-Redoxzustandes basiert auf der Tatsache, dass NADH, im Gegensatz zu der oxidierten Form NAD+, fluoresziert, wenn es mit Licht bei 366 nm bestrahlt wird, was zur Emission von blauem Licht mit einer Peakemission von 450 nm führt. Die Quelle des 366 nm-Anregungslichts war eine 100 W luftgekühlte Quecksilberlampe, ausgerüstet mit einem starken 366 nm-Filter [Corning 5860 (7–37) plus 9782 (4–96)]. Es wurde ein flexibles Y-förmiges Bündel optischer Fasern (Lichtwellenleiter) verwendet, um das Licht zu dem und von dem Sehnerv zu leiten, wodurch in vivo-Messungen technisch durchführbar werden. Anregungslicht (366 nm) wurde durch das Bündel der Anregungsfasern zu dem Nerv übertragen. Das von dem Nerv emittierte Licht wurde, nachdem es durch ein zweites Bündel von Fasern geleitet wurde, durch zwei Photovervielfacher, die mit einem Einkanal-Gleichstrom-Fluorometer-Reflektometer verbunden waren, in ein Verhältnis von 90 : 10 für eine Messung des Fluoeszenzlichts (90%) bei 450 nm und des reflektierten Lichts (10%) bei 366 nm, aufgespalten. Um die Variationen zwischen den Tieren zu minimieren, wurde bei Beginn der Aufnahmen ein Standardsignalkalibrierungsverfahren angewandt, wie es zuvor detailliert beschrieben wurde (Yoles et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 30: 3586–3591, 1992). Veränderungen der Fluoreszenz- und Reflektionssignale während des Experiments wurden relativ zu den kalibrierten Signalen berechnet.
Veränderungen des reflektierten Lichts wurden mit Veränderungen der Gewebeabsorption aufgrund von hämodynamischen Effekten und Bewegungen des Sehnervs nach Veränderungen des arteriellen Blutdrucks und des Nervenvolumens korreliert. Es wurde gefunden, dass die Fluoreszenzmessungen hinsichtlich der NADH-Redoxzustands-Messungen durch Subtraktion des reflektierten Lichts (366 nm) von dem Fluoreszenzlicht (1 : 1-Verhältnis) angemessen korrigiert waren, um das korrigierte Fluoeszenzsignal zu erhalten.
Metabolische Messungen: Man ließ Tiere, die noch anästhesiert waren, sich für 30 Minuten von den chirurgischen Verfahren erholen, und dann wurden sie anoxischen und hyperoxischen Bedingungen ausgesetzt. Ein anoxischer Zustand wurde erreicht, indem man die Ratte in einer Atmosphäre atmen ließ, die durch einen Fluss von 100% Stickstoff für 2 Minuten begast wurde, wonach sie zurück an die Luft gesetzt wurde. Wenn die Tiere nicht spontan zu normalem Atmen zurückfanden, wurden sie zwei Mal über die Trachea beatmet. Ein hyperoxischer Zustand wurde induziert, indem man das Tier für 6–10 Minuten 100% O₂ atmen ließ. Um die metabolische Wirksamkeit des Sehnervs zu bewerten, wurden vor und nach der Quetschungsverletzung die relativen Veränderungen der Reflektions- und Fluoreszenzlicht-Intensitäten als Reaktion auf Anoxia und Hyperoxia gemessen.
Experimentelles Protokoll für metabolische Messungen: Unter Verwendung kalibrierter Überkreuzpinzetten (Duvdevani et al., Res. Neurol. Neurosci. 2: 31-38, 1991) wurde dem Nerv zwischen dem Auge und dem Lichtwellenleiterhalter eine mittlere Quetschverletzung bei einem Druck entsprechend 120 g für 30 Sekunden, wie es zuvor beschrieben wurde (Duvdevani et al., 1991) zugefügt. In Kontrollgruppen (13 Tiere) wurde direkt nach der Verletzung Phosphat-gepufferte Saline (PBS) injiziert; in den experimentellen Gruppen (6 Tiere) wurde Dexanabinol (20 mg/kg) injiziert. In allen Nerven wurde die metabolische Aktivität vor der Verletzung gemessen.
ERGEBNISSE
Eine einzelne Dexanabinol-Injektion (interaperitoneal, 20 mg/kg) zur Zeit der Verletzung der metabolischen Aktivität der verletzten Nerven verminderte teilweise die Verletzungs-induzierte Verringerung der metabolischen Aktivität. Die Wirkung war bereits nach 30 Minuten nach der Verletzung bemerkbar. Diese Verringerung des Verletzungs-induzierten Defizits dauerte mindestens für die 4 Stunden des Experiments an. Die Wirkung wurde gemäß dem gepaarten t-Test statistisch signifikant.
Um die Nach-Verletzungszeitdauer zu bestimmen, innerhalb welcher die Behandlung noch nützlich ist, wurde das Experiment wiederholt, wobei Dexanabinol jedoch 2 Stunden nach der Verletzung injiziert wurde. In 3 der 6 untersuchten Tiere konnte noch eine positive Wirkung beobachtet werden.
Die Dexanabinol-induzierte Verbesserung der metabolischen Aktivität könnte ein Ergebnis der Umgehung jeglicher Ereignisse sein, die in den verletzten Nerven auftreten und schließlich zum Ca²⁺-Eintritt und der axonalen Degeneration führen können. Die Gesamtwirkung könnte eine Verlangsamung der Degeneration oder die Rettung von Axonen sein, die nicht direkt durch lokale Ereignisse in ihrer Umgebung geschädigt sind.
Die Bestimmung der möglichen Langzeitwirkung von Dexanabinol wird durch physiologische Mittel erreicht.
Physiologische Messungen: Der experimentelle Aufbau war wie von Assia et al. (1990). Vor der Entfernung der Sehnerven für eine elektrophysiologische Messung wurden die Ratten mit 70 mg/kg Pentobarbiton tief anästhesiert. Von dem Schädel wurde die Haut entfernt, und die Sehnerven wurden von den Augäpfeln abgetrennt. Eine nicht vollständige Dekapitation wurde durchgeführt, und der Schädel wurde mit einer Knochenzange geöffnet. Das Zerebrum wurde lateral verschoben, wobei der intrakraniale Teil des Sehnervs freigelegt wurde. Das Zerlegen auf Höhe des Chiasmas ermöglichte die Entfernung der gesamten Länge des Nervs, welcher in Gefäße transferriert wurde, die frische, kalte Krebs-Lösung bestehend aus (in ml): NaCl 125, KCl 5, KHP₂O₄ 1,2, NaHCO₃ 26, MgSO₄ 0,6, CaCl₂ 24, D-Glucose 11, mit 95% O₂ und 5% CO₂ begast, enthielten. Die Nerven wurden in dieser Lösung gehalten, in welcher die elektrische Aktivität für mindestens 3–4 Stunden stabil blieb. Nach 1 Stunde der Erholung wurden die Nerven bei 27°C in die Krebs-Lösung getaucht. Es wurden elektrophysiologische Aufzeichnungen von dem Nerv erhalten, der von der Quetschung entfernt ist, da die Nerven zu klein waren, um Messungen an beiden Seiten der Quetschung zu erlauben. Die Nervenenden wurden dann mit zwei Ag-AgCl-Saugelektroden, eingetaucht in die Badlösung, verbunden. Der stimulierende Puls wurde durch die Elektrode an dem nächstgelegenen Ende angewandt und das Aktionspotenzial wurde an der entfernten Elektrode aufgenommen. Für die elektrische Stimulierung (2 V, 50 ms) wurde ein Grass SD9-Stimulator verwendet. Das Signal wurde zu einem Medelec PA63-Vorverstärker und dann zu einem Medelec MS7 Elektromyographen und einem AA7T-Verstärker geleitet. Die Lösung, der Stimulator und der Verstärker wiesen eine gemeinsame Erdung auf. Die maximale Amplitude von 8 gemittelten Verbindungsaktionspotenzialen (CAPS = compound action potential) wurde aufgezeichnet und mit einer Polaroidkamera aufgenommen. Die linken Nerven (nicht verletzt) wurden verwendet, um die Referenzwerte normaler Nerven zu messen, und um die Quetschpinzetten zu kalibrieren.
Langzeitwirkung von Dexanabinol. Direkt nach der Verletzung wurde Dexanabinol intraperitoneal in verschiedenen Dosierungen injiziert. Die elektrophysiologische Aktivität wurde in vitro 2 Wochen nach der Verletzung und der Wirkstoffverabreichung unter Verwendung von Saugelektroden aufgezeichnet.
Kontrollen. Verletzte Nerven wurden von den Tieren entfernt, denen zur Zeit der Verletzung ein Vehikel injiziert wurde. Bereits bei 3 mg/kg war das Aktionspotenzial höher als in Kontrollnerven. Eine maximale physiologische Aktivität wurde bei 7 mg/kg beobachtet. Bei 20 mg/kg gab es keinen Effekt.
In allen Tieren wurden die kontralateralen Nerven, die nicht verletzt waren, als Kontrollen für die physiologischen Messungen und für die Behandlung verwendet. Dexanabinol wies keine Wirkung auf nicht verletzte Nerven auf. Die Untersuchung der Form der Aktionspotenzialkurve (Mono- oder Multikomponenten) ergab, dass Dexanabinol selektiv schnell-leitende Fasern zu retten scheint.
Nützliche Wirkung von Dexanabinol als eine Funktion der Schwere der Verletzung. In allen obigen Experimenten war die zugefügte Quetschverletzung von mittlerer Schwere. Wir haben die Möglichkeit betrachtet, dass die vorteilhafte Wirkung von Dexanabinol verstärkt sein könnte, wenn die Anzahl an verletzten Fasern am Anfang niedriger ist, wobei mehr Fasern verbleiben, die einer primären Verletzung entkommen, und für eine sekundäre Degeneration anfällig wären. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde das Langzeit-Experiment wiederholt, jedoch mit einer schwächeren zugefügten Verletzung. Es wurde gefunden, dass eine einzelne Injektion von 7 mg/kg zu einer beträchtlichen Verbesserung der Nervenleistung führt.
Langzeitwirkung von Dexanabinol, bestimmt durch Aufzeichnung der VEP-Reaktionen. VEP-Reaktionen wurden in einem Versuch aufgezeichnet, um zu bestimmen, ob Dexanabinol irgend eine Wirkung auf die Rettung von Fasern und somit auf die Erhaltung der Funktion besitzt. Alle diese Tiere wiesen Elektroden auf, die in den Kortex implantiert waren, und dann wurde die funktionelle Erholung bestimmt, indem auf das Auge mit dem verletzten Nerv Licht gestrahlt wurde. In zwei der sieben Kontrolltiere wurde eine positive VEP-Reaktion aufgezeichnet, verglichen mit fünf der acht Dexanabinol-behandelten verletzten Nerven (Tabelle 3).
Von diesen experimentellen Ergebnissen ist es offensichtlich, dass der Wirkstoff der vorliegenden Erfindung wirksam ist bei der Behandlung von Verletzungen des zentralen Nervensystems und folglich bei der Verbesserung des neurologischen Resultats solcher Verletzungen.
TABELLE 3 VEP-Reaktionen in verletzten Nerven, behandelt mit Dexanabinol, verglichen mit verletzten Kontrollnerven
Physiologisches Beispiel 6
Neuroprotektion durch Dexanabinol bei Okklusion mittlerer Hirnarterien
In dieser Studie wurden Sprague-Dawley-Ratten durch Insertion einer intraluminalen Nylonnaht rückläufig durch die externe Halsschalgader in die interne Halsschalgader und MCA 60 Minuten einer temporären Okklusion mittlerer Hirnarterien (MCA = middle cerebral artery) ausgesetzt. Der Wirkstoff (Dexanabinol in Öl, 20 mg/kg i.p.) oder das Vehikel wurden 30 Minuten vor der MCA-Okklusion auf Blindstudien-Weise verabreicht. Die Tiere erhielten die folgende physiologische Kontrolle: intermittierende Messung von arteriellem PCO₂, PO₂ und pH; kontinuierliche Messung von arteriellem Blutdruck; intermittierende Messung von Blutglucose und Kontrolle der Schläfenmuskeltemperatur. Man ließ die Tiere für drei Tage überleben. Die Gehirne wurden mit FAM Perfusions-fixiert. Paraffin-eingebettete koronale Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Die Infarktbereiche wurden bei 11 koronalen Levels gemessen. Bei jedem dieser Level wurden auch die ipsilateralen und kontralateralen hemisphärischen Volumina gemessen, und von den letzteren Messungen wurde ein Index des hemisphärischen Ödems [(ipsi-kontra) (kontra)] berechnet.
Experimentelle Gestaltung
Die anfängliche Ausgestaltung war eine randomisierte, in welcher der Experimentator nicht wusste, ob der Wirkstoff oder das Vehikel verabreicht wurde, und es wurde versucht, ungefähr eine gleiche Anzahl an Wirkstoff- und Vehikel-behandelten Tieren zu bilden. Es wurde offensichtlich, dass viele Tiere nicht überlebten, und dass sie zum größten Teil Vehikel-behandelte Ratten waren. Somit wurden zusätzliche Tiere zu den Serien hinzugefügt, und diese wurden hauptsächlich mit Wirkstoff behandelt, sodass schließlich für eine statistische Analyse eine gleiche Anzahl erhalten wurde. Die Endanzahl an untersuchten Tieren in dieser Serie ist wie folgt:
TABELLE 4
ERGEBNISSE
Überleben: Dies ist in Tabelle 4 oben angegeben. Diese Daten wurden mit dem exakten Wahrscheinlichkeitstest von Fisher analysiert, was einen p < 0,1 ergab, was darauf hinweist, dass es einen wesentlichen Trend in Richtung eines verbesserten Überlebens in HU-behandelten Tieren gibt.
Physiologische Daten: Es gab im Wesentlichen keine wichtigen Unterschiede in dem Hauptarterienblutdruck oder den Blutgasen bei den überlebenden Tieren, die mit Dexanabinol oder dem Vehikel behandelt worden waren, oder in den nicht-überlebenden Tieren. Ebenso gab es auch keinen Unterschied bei der Kopftemperatur. Es sollte bemerkt werden, dass in diesen spontan atmenden Tieren arterielles PCO₂ dazu neigte, in allen Gruppen etwas erhöht zu sein.
Infarkt- und Ödem-Volumina: Einzelne und gemittelte Daten sind in Tabelle 5 dargestellt. Es ist offensichtlich, dass es bei einer 60-Minuten-MCA-Okklusion einen extrem breiten Infarktbereich gibt. Trotzdem gibt es einen Trend in Richtung einer 18%-Verringerung im gemittelten Infarkt-Volumen mit Dexanabinol, sowie einer 31%-Verringerung des Ödem-Volumens.
Die dargestellten Daten zeigen einen wesentlichen Trend in Richtung eines verbesserten Tierüberlebens mit einer Dexanabinol-Behandlung und in Richtung einer moderaten Verringerung des Infarkt-Volumens bei überlebenden Tieren. Wie oben angemerkt, könnten, wenn alle Tiere überlebt hätten, und wenn man annehmen würde, dass die Infarkte in den sterbenden Tieren größer wären als in den überlebenden, die Daten eine stärkere Tendenz dafür zeigen, dass Dexanabinol das Infarkt-Volumen verringert. D. h., dass Dexanabinol sowohl das Überleben von Tieren mit sehr starken Infarkten erhöht als auch gleichzeitig das Infarkt-Volumen verringert. Diese Ergebnisse zeigen das therapeutische Potenzial von Dexanabinol bei transienter fokaler Ischämie, welche als Modell für den Schlaganfall in Menschen angesehen wird.
TABELLE 5 Infarkt- und Ödem-Volumina
Physiologisches Beispiel 7
Neuroprotektion gegen zerebrale Ischämie in Wüstenspringmäusen
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurden auf ihre Fähigkeit hin getestet, eine neurologische Schädigung in Wüstenspringmäusen, die einer bilateralen Okklusion der gemeinsamen Kopfschlagader ausgesetzt wurden, zu verhindern.
Mongolische Wüstenspringmäuse (männlich), 65–70 g (Tumblebrook Farm) unterliefen die ischämische Prozedur, während sie mit Equitisin anästhesiert waren.
Gemeinsame Kopfschlagadern (CCA = common carotid arteries) wurden isoliert, und es wurde ein 3-O Seidennähmaterial locker um sie herumgelegt. Die Spitzen jeder Schlaufe wurden verbunden, und das Nähmaterial wurde neben die Trachea gesteckt. Dann wurde der ventrale Halsschnitt genäht. Am folgenden Tag wurden sie leicht mit Ether anästhesiert, die Halshautwunden wurden geöffnet, und beide CCA wurden unter Verwendung kleiner Arterienclips für 10 Minuten abgeklemmt. Während der Ischämie und bis sich die Tiere erholten (Wiedererlangen der Stellreflexel, wurden sie in warmem Zustand gehalten (36,5–37,5°C Rektaltemperatur). Dreißig Minuten nach dem Beginn der Ischämie wurden die Tiere reanästhesiert (Ether), und es wurde der entsprechende Wirkstoff i.v. über die Oberschenkelvene verabreicht.
Klinische Bewertung. Drei bis 5 Stunden später wurden die Tiere unter Verwendung der Rudolphi-Methode auf ihre klinische Erscheinung hin beobachtet (Rudolphi et al., Cereb. Blood Flow Metab. 7: 74, 1987). Dies wurde alle 24 Stunden für die gesamte 96-Stunden-Zeitdauer durchgeführt. Am Ende dieser Zeitdauer wurden die Tiere anästhesiert (Equithisin) und transkardial mit 10% Formaldehydlösung perfundiert.
TABELLE 6 Neuroverhaltensbewertungen im Schlaganfallmodell bei Wüstenspringmäusen (normale Bewertung 0)
Modifikation der klinischen Bewertungsmethode nach Rudolphi.
Hisopathologische Bewertung. Die Gehirne wuren entfernt und für eine Woche aufbewahrt. Dann wurden von dem Bereich des dorsalen Hippokampus 5 mm-Schnitte abgeschnitten, mit H&E und Kresylviolett angefärbt, und gemäß dem folgenden System bewertet. Die Anzahl an lebensfähigen Pyramidenzellen im medialen, mittleren und lateralen CA 1-Subbereich des Hippokampus wurden bei × 400 Vergrößerung entlang 0,4 mm nach beiden Seiten gezählt.
Das Studienparadigma war (n = 10): unbehandelte Tiere, Vehikel-behandelte Tiere (SME, 4 ml/kg i.v.) und Tiere, die mit dem Testwirkstoff behandelt waren (8 mg/kg i.v.).
Statistik. Die neuroklinische Erscheinung wurde unter Verwendung des Rangsummentests nach Wilcoxon analysiert. Die histopathologische Bewertung wurde unter Verwendung der Einweg-ANOVA gefolgt von dem Test nach Duncan analysiert.
ERGEBNISSE
Verhaltensstudie: Wie es aus Tabelle 7 ersichtlich ist, zeigte der klinische Status der Dexanabinol-behandelten Gruppe ein beträchtlich besseres Ergebnis (niedrige Bewertung, Mittel 2,1), verglichen mit der Vehikel-behandelten Gruppe (Mittel 4,0) und der unbehandelten Gruppe (Mittel 8,6). Die Dexanabinol-Gruppe zeigte weit weniger ernste Anzeichen (nur ein Tier hatte ernste Symptome, d. h. Symptome der Bewertung 5–8) verglichen mit den Kontrollgruppen. Fünf Tiere der Dexanabinol-behandelten Gruppe zeigten überhaupt keine Symptome (verglichen zu keinem der unbehandelten Gruppe und einem von der Vehikel-behandelten Gruppe).
Auch zeigte die niedrigere Sterblichkeitsrate (Tabelle 8) eine starke Tendenz zur Ischämie (Schlaganfalll)-Protektion in den Dexanabinol-behandelten Tieren verglichen mit den Kontrollgruppen.
Histopathologische Bewertung: Die Ergebnisse zeigen (Tabelle 9) wesentliche Unterschiede in der CA1-Hippokampus-Degeneration zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen aufgrund des ischämischen Traumas. Die unbehandelten und die Vehikel-behandelten Gruppen waren weit ernsthafter geschädigt als die Dexanabinol-Behandlungsgruppe.
Alle Tiere zeigten eine Schädigung verglichen zu einfachen Kontrollen. Jedoch wurden beträchtlich mehr lebende Zellen in den Dexanabinol-behandelten Tieren erhalten.
TABELLE 7 Wüstenpringmaus-Ischämiemodell, verbessertes klinisches Resultat nach einer Verabreichung von Dexanabinol (8 mg/kg i.v., 0,5 Stunden nach dem Trauma)
TABELLE 8 Sterblichkeitsrate in verschiedenen Behandlungsgruppen nach 10 Minuten bilateraler CCA-Okklusion in mongolischen Wüstenspringmäusen
TABELLE 9 Wüstenspringmaus-Ischämiemodell Verbessertes histopathologisches Resultat nach der Verabreichung von Dexanabinol (8 mg/kg i.v., 0,5 Stunden nach dem Trauma)
Wie es aus den obigen Tabellen ersichtlich ist, wird nach der Behandlung mit dem Wirkstoff der vorliegenden Erfindung verglichen mit Vehikel- und unbehandelten Kontrollen ein wesentlich besseres klinisches Ergebnis beobachtet.
Der Wirkstoff der vorliegenden Erfindung verbesserte sowohl die neurologischen als auch histopathologischen Resultate globaler Ischämie in dem Modell von mongolischen Wüstenspringmäusen. Die zwei Kontrollbehandlungen zeigten ein ähnliches Ergebnis: ein ernstes neurologisches Defizit und eine ähnliche CA1-Hippokampus-Degeneration.
Physiologisches Beispiel 8
Neuroprotektion durch Dexanabinol im 4VO-Modell in Ratten
Das 4-Gefäßokklusions-(4VO)-Rattenmodell wird häufig als Tiermodell für eine Gehirnischämie verwendet, da es relativ leicht durchzuführen ist und eine gute Reproduzierbarkeit zeigt. Transiente, aber ernste globale oder Vorderhirnischämie, welche klinisch in Patienten auftritt, welche nach einem Herzstillstand erfolgreich reanimiert wurden, und die experimentell in manchen Tiermodellen auftritt, führt zu einer irreversiblen Schädigung einiger spezifischer Populationen von hochanfälligen Neuronen.
In unserer Studie schützt Dexanabinol in Hydroxypropyl-b-cytodextrin (HPCD) vor einer durch eine transiente ernste Vorderhirnischämie verursachten neuronalen Schädigung in Ratten. Das 4VO-Modell ist verglichen mit dem Wüstenspringmaus-Modell ein Modell der ernsteren Ischämie und spricht gewöhnlich nicht auf eine Behandlung an. Die Wirkung von Dexanabinol und Verbindungen der vorliegenden Erfindung in diesem Modell zeigen die Nützlichkeit dieser Verbindungen als neuroprotektive Mittel.
MATERIALIEN UND METHODEN
In dieser Studie wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten (180–400 g), bereitgestellt von Anilab (Hulda, Israel) verwendet. Sie wurden zur Induktion unter Verwendung von Pentothal (Abbott, Italien) anästhesiert und mit Halothan (ICI Pharmaceuticals, England) in einer Mischung von 70% N₂ und 30% O₂ zur Aufrechterhaltung anästhesiert.
Es wurden zwei Testmaterialien verwendet: 45% HPCD, in Wasser, für eine Vehikel-Behandlung (4 ml/kg) und Dexanabinol (8 mg/kg) in 45% HPCD, in Wasser, hergestellt bei Pharmos Ltd. (Rehovot, Israel). Die Tiere unterliefen das 4-Gefäßokklusions-Modell (4VO) gemäß Pulsinelli et al. (ref) 1982):
Es wurde eine Zweistufenoperation durchgeführt:

(1) Am ersten Tag wurden die vertebralen Arterien verschlossen. Oberhalb des Rückenmarks hinter dem Schädelhinterhauptbein wurde ein Medianhautschnitt durchgeführt. Die Muskeln wurden separiert und geschnitten, bis der C1-Wirbel isoliert war. Die Ala foramina wird lokalisiert und die vertebralen Arterien werden über die Ala foramina koaguliert. Am selben Tag werden die gemeinsamen Kopfschlagadern (CCA) über einen zentralen Halsmedianschnitt isoliert. Um sie herum wird ein loses Nähmaterial gelegt und die Haut wird geschlossen.
(2) Am zweiten Tag werden die CCA verschlossen. Das Tier wird leicht (Ether) anästhesiert, die Haut wird geöffnet, und die CCA werden für 20 Minuten mit Arterienclips verschlossen.

Zwischen den zwei Stufen der Studie ließ man die Tiere über Nacht fasten (Wasser war erlaubt).
Der Verlust des Stellreflexes ist das Hauptkriterium, um eine ernste Vorderhirnischämie in dem 4VO-Modell in der Ratte zu gewährleisten. Deshalb wurden Tiere, die dieses Symptom nicht zeigten, nicht in die Studie aufgenommen. Die Tiere wurden am Tag der CCA-Okklusion zufällig einer Behandlungsgruppe zugewiesen.
Das Testmaterial wurde i.v. 15 Minuten vor dem Beginn der CCA-Okklusion verabreicht. Es wurde Dexanabinol mit einer Dosis von 8 mg/kg oder das gleiche Volumen an Vehikel (HPCD) verabreicht (4 ml/kg).
Es wurden vier "Behandlungs"-Gruppen verwendet:

(a) Schein(sham)tiere wurden einer Okklusion beider vertebralen Arterien ohne eine Okklusion der gemeinsamen Kopfschlagadern unterzogen.
(b) Unbehandelte Kontrolltiere – Okklusion von sowohl vertebralen als auch gemeinsamen Kopfschlagadern.
(c) HPCD (Vehikel)-behandelte Kontrollen – Okklusion von sowohl vertebralen als auch gemeinsamen Kopfschlagadern, Tiere wurden 15 Minuten vor der CCA-Okklusion mit HPCD behandelt.
(d) Dexanabinol (in HPCD) – Okklusion von sowohl vertebralen als auch gemeinsamen Kopfschlagadern, die Tiere wurden 15 Minuten vor der CCA-Okklusion mit HU-211 behandelt.

Die Körper (rektal)-Temperatur wurde zwischen 37–38°C gehalten. Die Tiere wurden zu den folgenden Zeiten auf ihre klinische Erscheinung hin kontrolliert:

(i) vor der vertebralen Okklusion
(ii) vor der CCA-Okklusion
(iii) 5 Stunden nach der CCA-Okklusion
(iv) 24 Stunden nach der CCA-Okklusion
(v) 48 Stunden nach der CCA-Okklusion
(vi) 72 Stunden nach der CCA-Okklusion

TABELLE 10 Neurologische Untersuchung – Bewertungsskala für Ratten (Modell globaler Ischämie der Viergefäßokklusion)
ERGEBNISSE
Es wurde gefunden, dass das Vehikel alleine von der Kontroll-(ischämisch unbehandelt)-Gruppe nicht unterscheidbar ist. Die Dexanabinol-behandelte Gruppe ist beträchtlich besser als die ischämisch unbehandelten oder nur Vehikel-Kontrollgruppen und ist bemerkenswert ununterscheidbar von Schein- operierten Tieren 72 Stunden nach dem anfänglichen Operationstrauma. 48 Stunden nach dem Trauma war die Dexanabinol-behandelte Gruppe bereits statistisch nicht verschieden von der Schein-operierten Gruppe. Diese Tests wurden mit 17 Tieren pro Gruppe durchgeführt. Die gezeigten Daten stellen gesamte neurologische Bewertungsverbesserungsraten dar (d. h. der Unterschied zwischen der normalen Bewertung, welche 16 ist, und der Bewertung zur Zeit der Untersuchung). Es ist zu beachten, dass in dem Mehrfachbereichtest (Multiple Range Test) nach Duncan für jeden Zeitabschnitt, bei welchem eine Messung aufgenommen wird, der Unterschied zwischen der Scheingruppe und der HU-Gruppe abnahm, und schließlich nach 72 Stunden null erreichte. Daher können Dexanabinol und Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung post-ischämischer Ereignisse in Patienten, die unter einem neurologischen Trauma leiden, nützlich sein. Dieses Modell ist insbesondere relevant für globale Ischämie sowie die, die mit Herzstillstand im Zusammenhang steht.
Physiologisches Beispiel 9
Anti-hypoxische Wirkungen von Dexanabinol-Analoga
Das Aussetzen von Mäusen einer hypobarischen Atmosphäre (200 mmHg) führt bei normalen, unbehandelten Tieren innerhalb von wenigen Minuten zum Tod. Nicht nur MK-801, sondern auch Diazepam und Pentobarbital sind dafür bekannt, dass sie das Überleben von Tieren in diesem allgemeineren Modell verlängern. Dexanabinol erhöht die Überlebenszeit bei so niedrigen Dosen wie 2 und 5 mg/kg i.p. (in MCT-Öl) beträchtlich. Das reduzierte stereospezifische Analogon von Dexanabinol, HU-521 bezeichnet (Devane et al., J. Exp. Med. 2065–2069, 1992), war in diesem System so wirksam wie 211.
Hypobarische Anoxie wurde als Testsystem zum Screenen der neuroprotektiven Wirkungen aller neuen Verbindungen einschließlich Dexanabinolphosphat und Dexanabinolsuccinat verwendet. Das experimentelle Paradigma wurde von dem von Gotti beschriebenen abgeleitet (Gotti & Depoortere, Congres Circ. Zerebrale, Toulouse, 105–107, 1979). Kurz gesagt, wurden Mäuse in Gruppen von jeweils 5 in eine Kammer eingebracht, die bei einem atmosphärischen Druck von 200 mmHg äquilibriert war (durch Evakuierung mit einer Vakuumpumpe). Die Mäuse wurden beobachtet, bis sie aufhörten, zu atmen, und für jede Maus wurde die Zeit aufgezeichnet. Die Testverbindungen wurden 45 Minuten vor dem Einführen der Tiere in die Kammer verabreicht. In allen Fällen wurde das Experiment in einer kontrollierten Studie mit maskiertem Vehikel durchgeführt, um eine Voreingenommenheit von Seiten des Beobachters zu vermeiden. Jede Maus erhielt die Testverbindung, gelöst in MCT-Öl, oder eine geeignete gepufferte wässrige Lösung intraperitoneal in einer Dosis von 5 mg/kg, oder das Vehikel alleine. Die Ergebnisse zeigen deutlich eine statistisch signifikante Erhöhung der Überlebenszeit in mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung vorbehandelten Tieren (Tabelle 11).
TABELLE 11 Antihypoxische Wirksamkeit von Dexanabinol-Analoga 5 mg/kg i.p.
Die Gruppen schlossen mindestens fünf Tiere pro Testverbindung ein. Keines der Vehikel wies eine signifikante Wirkung auf das Überleben auf.
Physiologisches Beispiel 10
Stabilität von Dexanabinolestern
Für die Stabilitätsstudien wurden Wasser (pH 5,6–5,7) und Plasma (Ratte, Hund, Mensch) als Medium verwendet.
Probenpräparation und Inkubationsbedingungen. Die Verbindungen wurden in Wasser oder 10% (vol/vol) Ethanol : Wasser in Konzentrationen von 2,0–7,3 mg/ml gelöst und 20 ml der resultierenden Lösungen wurden zu 180 ml Wasser oder frisch gesammeltem Plasma hinzugegeben, um Endkonzentrationen von 200–730 mg/ml zu erhalten. Die Mischungen wurden bei 37°C für 1 Stunden und 24 Stunden inkubiert. Die Proben wurden dann durch Zugabe von Acetonitril (3 vol) extrahiert, gefolgt von Vortexbehandlung und sofortiger Zentrifugation (Eppendorf-Zentrifuge). Aliquoten der organischen (oberen) Phase wurden durch HPLC analysiert. Die Nullzeit-Bestimmungen wurden durchgeführt, indem die Lösung direkt nach dem Lösen der Proben mit Acetonitril extrahiert wurde. Die Mengen an Dexanabinol, die durch Hydrolyse der untersuchten Ester (als mg und %) entstanden sind, wurden unter Verwendung einer Kalibrierungskurve bestimmt. Es wurden die Mittelwerte für 3 Experimente angezeigt.
Analytische Methodik. Für eine quantitative Analyse von Dexanabinol wurde Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) verwendet. Die HPLC bestand aus einem Kontron-410-Lösungsmitteltransportsystem, einem Kontron-430 UV-Detektor (variable Wellenlänge: Kanal 1 bei 232 nm; Kanal 2 bei 283 nm), einem Kontron-450-Datensystem. Die Säule war Econosphere C18 (100 mm × 4,6 mm 3 mm Alltech), ausgerüstet mit einem Säulenschutz (Alltech). Die mobile Phase war: Acetonitril : wässriger Phosphatpuffer pH 3 (KHP₂O₄ HP₃O₄, 0,01 M): 60 : 40. Flussrate 0,7–1,5 mm/min. Die Detektion und Quantifizierung wurden parallel bei zwei Wellenlängen (230 und 280 nm) durchgeführt. Die Retentionszeit von Dexanabinol war im Bereich von 3,5–4,5 Minuten.
Assayvalidierung. Der Hauptaspekt der Assayvalidierung war, zu bestimmen, dass die Linearität durch die Extraktion aus biologischem Fluid nicht beeinträchtigt wurde, und dass die Wiederfindung hoch und reproduzierbar ist. Es wurden Spikingexperimente durchgeführt, in welchen eine bekannte Menge an Dexanabinol (1) (10 ml der Acetonitrillösung) in dem gesamten Bereich des Kalibrierungsverlaufs zu Plasma injiziert wurde. Das Plasma wurde dann wie beschrieben extrahiert. Die Kalibrierungskurven wurden in Wasser und verschiedenem Plasma durchgeführt. Es wurde eine 100% Wiederfindung von dem Plasma erhalten.
Stabilität: Es wurde die Stabilität der Ester in Wasser und Plasma (Ratte, Hund, Mensch) bestimmt. Dexanabinol, das durch die Hydrolyse entstand, wurde bei der Nullzeit und nach 1 Stunde und nach 24 Stunden der Inkubation bei 37°C in der geeigneten Matrix durch HPLC quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefasst. Die Verbindungen der Synthesebeispiele 3, 7 und 8 sind in Wasser löslich (mindestens 2–7 mg/ml), während die Verbindung des Synthesebeispiels 5 und sein Hydrochloridsalz in 10% (vol/vol) wässrigem Ethanol löslich ist. Die Ergebnisse zeigen an, dass das Glycinatsalz (Synthesebeispiel 31 in allen untersuchten Medien relativ stabil ist. In humanem Plasma wurde weniger als 1% Dexanabinol nach 1 Stunde und ungefähr 22% in 24 Stunden freigesetzt. Die Dialkylglycinat(N,N-Dimethyl, Synthesebeispiel 5 und N,N-Diethyl, Synthesebeispiel 6)-Salze sind in allen Medien sogar noch stabiler als das Glycinatsalz, wobei das stabilste Produkt das N,N-Diethylglycinat ist, das in Wasser überhaupt nicht und in humanem Plasma nur wenig hydrolysiert wurde. Ein unterschiedliches Profil wurde mit den quaternären Stickstoff-enthaltenden Verbindungen der Synthesebeispiele 7 und 8 beobachtet (Trimethylammonium- bzw. Triethylammoniumacetylbromide). Während sie ziemlich stabil in Wasser sind (6–7% Hydrolyse in 24 Stunden), hydrolysierten diese beiden Verbindungen leicht in Plasma verschiedener Quellen, humanes Plasma eingeschlossen. Von besonderem Interesse ist die Verbindung des Synthesebeispiels 7, die in humanem Plasma leicht hydrolysiert (92% und 100% bei 1 Stunde bzw. 24 Stunden). Das Triethylammonium-Homolog scheint nach 1 Stunde auch vollständig hydrolysiert zu sein, da sowohl nach 1 Stunde als auch nach 24 Stunden Inkubation die gleiche Menge an Dexanabinol (^–68%) gewonnen wurde.
TABELLE 12 Stabilität von Aminosäure-Typ Estern von Dexanabinol (HU-211)
Physiologisches Beispiel 11
Wirksamkeit von Dexanabinolestern
Prodrugs sind per Definition unwirksame Kombinationen, die aktiviert werden, um nach einer in vivo Hydrolyse den Stammwirkstoff freizusetzen. Jedoch war es basierend auf den zuvor erwähnten Überlegungen von Interesse, zu bestimmen, ob die wasserlöslichen Ester der Synthesebeispiele 3–8 eine ihnen innewohnende Wirksamkeit besitzen.
Es wurden drei verschiedene Assays verwendet, um die Wirksamkeit und Toxizität dieser Kombinationen zu bestimmen: a) NMDA-Rezeptorbindung, wie es durch Agonistenverdrängung gemessen wird, b) in vitro-Protektion von Neuronen gegenüber NMDA-induzierter Toxizität und c) Toxizitätspotenzial für neuronale Zellen. Wie es im physiologischen Beispiel 1 gezeigt ist, inhibiert Dexanabinol die Bindung von [3H]-TCP und [3H]-MK-801, welche zwei nicht kompetitive NMDA-Antagonisten sind, an den aktivierten Zustand des NMDA-Rezeptorkanals und die Bindung von Tritium-MK-801 an Rattenvorderhirnmembranen. Auch die Inkubierung mit NMDA (100–1000 mM) in Kulturen von Kortexneuronen aus fötalen Rattenhirnen, die über eine Gliazell-Feederschicht gewachsen waren, führte innerhalb von 24 Stunden zum Tod von 50–60% der Zellen. Wenn Dexanabinol mit einer Konzentration von 1–10 mM mit NMDA-ausgesetzten Neutronen coinkubiert wurde, wurde der Zelltod auf Dosis-abhängige Weise verringert oder vollständig verhindert. Diese Wirkung war ähnlich der Wirkung und dem Ausmaß der Wirkung des klassischen nicht-kompetitven NMDA-Antagonisten MK-801. Gleichzeitig erwies sich Dexanabinol in diesen Assays als nicht toxisch gegenüber den Wirtszellen. Die wasserlöslichen Dexanabinolester der Synthesebeispiele 3–8 wurden diesen Tests unterzogen. Es wurde nicht erwartet, dass während der Rezeptorbindungsbestimmungen bei den gegebenen Systemanordnungen eine Hydrolyse auftreten würde. Da die Assays b und c eine längere Inkubationszeit erforderten, war eine Hydrolyse der Ester während der Experimente möglich.
Jedoch konnte in den Kulturen kein Dexanabinol detektiert werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 zusammengefasst.
TABELLE 13. Wirksamkeit von wasserlöslichen Derivaten von Dexanabinol
Die Daten zeigen, dass alle Verbindungen mit Ausnahme von 7-Diethylaminoacetyldexanabinol relativ gute NMDA-Rezeptorbindungseigenschaften besitzen, wobei die IC50-Werte zwischen 6,8 und 20 mM verglichen mit 5 mM für Dexanabinol variieren. Die Inhibierung der [3H]MK-801-Bindung an den NMDA-Rezeptor betrug 80–90% bei einer Konzentration von 1–100 mM. Die Derivate des quaternären Ammoniumtyps der Synthesebeispiele 7 und 8 sind die wirksamsten bei der Protektion gegen NMDA-vermittelten Zelltod, bei gleichzeitigem Nichtvorhandensein von Zelltoxizität (EC50, 2–5 mM 100% Protektion bei einer Konzentration von 10 mM). Die Verbindungen der Synthesebeispiele 5 und 6 erwiesen sich als nicht schützend gegenüber einer NMDA-Toxizität; darüber hinaus war die Letztere in zwei von drei Experimenten toxisch gegenüber Neuronen. Es ist interessant, dass die Verbindung von Synthesebeispiel 5 die erste unter den untersuchten Derivaten ist, die ein potenter [3H]MK-801-Bindungsinhibitor (IC50 15–20 mM) ist, aber die nicht schützend gegenüber einer NMDA-Toxiztität ist (18% Protektion bei einer Konzentration von 10 mM), obwohl sie selbst nicht toxisch ist (0% Mortalität von neuronalen Zellen, verursacht durch 10 mM).
7-Bromacetyldexanabinol wurde getestet, und es wurde gefunden, dass es gegen NMDA-Toxizität schützt (100% Protektion) und eine MK-801-Bindung inhibiert (IC50 13–15 mM; % Inhibierung 83%), dass es aber in manchen Experimenten eine beträchtliche Zellmortalität verursachte.
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass die zwei Derivate des quaternären Ammoniumtyps, die Trimethyl- und Triethylammoniumacetate, die vielversprechendsten unter den untersuchten Glycinatestern sind. Beide Derivate hydrolysieren leicht in humanem Plasma und sind reltativ löslich und stabil in Wasser. Die zwei Verbindungen haben auch gute Rezeptorbindungseigenschaften, zeigen einen Schutz gegen NMDA-induzierte Toxizität und weisen keine neuronale Toxizität auf. Es ist wesentlich, dass die Wirkungs- und Toxizitätseigenschaften für Derivate wie solche der Synthesebeispiele 7 oder 8 nicht relevant sein könnte, da sie dafür gedacht sind, als Prodrugs verwendet zu werden, die schnell die Stammverbindung freisetzen. Jedoch sind die Daten aus Sicht von QSAR von Interesse. Während es scheint, dass die Verbindungen der Synthesebeispiele 3, 5 und 6 in humanem Plasma zu stabil sind, um als Prodrugs verwendet zu werden, und ihr Wirkungs-Toxizitäts-Profil keine Verbesserung verglichen mit Dexanabinol aufweist, scheinen die Ester der Synthesebeispiele 7 und 8 vielversprechende Prodrug-Kandidaten zu sein.

Claims

Verbindung der allgemeinen Formel
mit (3S,4S)-Konfiguration und im Wesentlichen ohne das (3R,4R)-Enantiomer, wobei A----B eine optionale 1(2)- oder 6(1)-Doppelbindung darstellt, R ist: (a) -Q, wobei Q eine heterocyclische Einheit mit einem labilen Wasserstoffatom ist, so dass die Einheit als ein Carbonsäureanalogon fungiert, (b) -R³X, wobei R³ C1-C5-Alkyl ist und X ist: (a') Halogen, (a'') -OR', wobei R' C1-C5-Alkyl ist, (a''') -OC(O)R''', wobei R''' Wasserstoff oder C1-C5-Alkyl ist, (a'''') -OC(O)-R⁴Y, wobei R⁴ ein linearer oder verzweigter Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Arylalkyl-, Alkylaryl- oder Heterocyclylrest oder ein mono- oder polyhydroxyliertes oder -halogeniertes Derivat der Reste ist und Y ist H, -ON, -C(O)O^–B⁺, -SO₃ ^–B⁺ oder -OPO₃ ^2–(B⁺)₂, wobei B⁺ ist: ein Kation eines Alkalimetalls oder von Ammoniak oder ein organisches Ammoniumkation, -N(R''')₂·AH, -N(R''')₃ ⁺A^– oder ein cyclischer Stickstoffrest, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
wobei R''' wie oben definiert ist, D CH₂, O oder NR''' ist, (B⁺)₂ zusätzlich ein Erdalkalimetallkation sein kann und A ein pharmazeutisch annehmbares anorganisches oder organisches Anion ist, (b') -OC(O)O-R⁴Y, wobei R⁴ und Y wie oben definiert sind, (c') -OC(O)NH-R⁴Y, wobei R⁴ und Y wie oben definiert sind, (d') -OC(O)-R⁴ZR⁴Y, wobei R⁴ und Y wie oben definiert sind und Z O, S, SO, SO₂ oder NH ist, (e') -C(NH₂ ⁺)-R⁴A^–, wobei R⁴ und A wie oben definiert sind, (f') -OPO3^2–(B⁺)₂, wobei B⁺ wie oben definiert ist, oder (g') -ON, (c) -R³N(R'')₂, wobei R³ wie oben definiert ist und jeder der R'', die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff oder C1-C5-Alkyl ist, das gegebenenfalls eine terminale -OR'''- oder -OC(O)R'''-Einheit enthalten kann, wobei R''' wie oben definiert ist, (d) -R⁵, wobei R⁵ C2-C5-Alkyl ist, oder, wenn keine A-----B vorhanden ist, (e) -R³OR''', wobei R³ und R''' wie oben definiert sind, G ist: (a) ein Halogen, (b) C1-C5-Alkyl, (c) OR'', wobei R'' wie zuvor definiert ist, (d) -OC(O)R''', wobei R''' wie zuvor definiert ist, oder (e) -OR³X, wobei R³ und X wie oben definiert sind, mit der Maßgabe, dass X in der Definition von G nicht -OH sein darf, wenn X in der Definition von R -OH ist, und R² ist: (a) C1-C12-Alkyl, (b) -OR'''', worin R'''' ein geradkettiges oder verzweigtes C2-C9-Alkyl ist, das am terminalen Kohlenstoffatom mit einer Phenylgruppe substituiert sein kann, oder (c) -(CH₂)_nOR''', wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 7 ist und R''' wie oben definiert ist; mit der Maßgabe, dass G nicht -OH ist, wenn R CH₂OH ist, und mit der Maßgabe, das G, R und R² nicht OH, CH₂OC(O)C(CH₃)₃ bzw. 1,1-Dimethylheptyl sein dürfen, wenn A-----B eine 6(1)-Doppelbindung ist, und pharmazeutisch annehmbare Salze oder quaternäre Ammoniumderivate davon.
Verbindung nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel
mit (3S,4S)-Konfiguration und im Wesentlichen ohne das (3R,4R)-Enantiomer, wobei A-----B eine optionale 1(2)- oder 6(1)-Doppelbindung darstellt, R ist: (a) -Q, wobei Q eine heterocyclische Einheit mit einem labilen Wasserstoffatom ist, so dass die Einheit als ein Carbonsäureanalogon fungiert, (b) -R₃X, wobei R³ C1-C5-Alkyl ist und X Halogen, -OR', wobei R' C1-C5-Alkyl ist, oder -OC(O)R''' ist, wobei R''' Wasserstoff oder C1-C5-Alkyl ist, (c) R³N(R'')₂, wobei R³ wie oben definiert ist und jeder der R'', die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff oder C1-C5-Alkyl ist, das gegebenenfalls eine terminale -OR'''- oder -OC(O)R''''-Einheit enthalten kann, wobei R''' wie oben definiert ist, (d) -R⁵, wobei R⁵ C2-C5-Alkyl ist, oder, wenn keine A-----B vorhanden ist, (e) -R³OR''', wobei R³ und R''' wie oben definiert sind, G ist: (a) ein Halogen, (b) C1-C5-Alkyl, (c) -OR'', wobei R'' wie zuvor definiert ist, mit der Maßgabe, dass R'' in der Definition von G nicht -OH sein darf, wenn X in der Definition von R -OH ist, oder (d) -OC(O)R''', wobei R''' wie zuvor definiert ist, und R² ist: (a) C1-C12-Alkyl, (b) -OR'''', worin R'''' ein geradkettiges oder verzweigtes C2-C9-Alkyl ist, das am terminalen Kohlenstoffatom mit einer Phenylgruppe substituiert sein kann, oder (c) -(CH₂)_nOR''', wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 7 ist und R''' wie zuvor definiert ist, und pharmazeutisch annehmbare Salze oder quaternäre Ammoniumderivate davon.
Verbindung nach Anspruch 2, worin G Hydroxy und R² 1,1-Dimethylheptyl oder 1,2-Dimethylheptyl ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei Q ein gesättigter oder ungesättigter Ring mit 4 bis 8 Ringgliedern aus C, N, S oder O ist, gegebenenfalls substituiert mit einer -COR'''- oder -C(O)OR'''-Einheit, wobei R''' wie zuvor definiert ist.
Verbindung nach Anspruch 4, wobei Q Tetrazol-5-yl ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R²-OR'''' oder -(CH₂)_nOR''' ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei A-----B eine 6(1)-Doppelbindung, R R³OR' und G -OH ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R R⁵ und G -OH ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R -R³X oder -R³N(R'')₂ oder R⁵ ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei G -OR'' ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei keine A----B vorhanden ist, G -OH und R² 1,1-Dimethylheptyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel
mit (3S,4S)-Konfiguration und im Wesentlichen ohne das (3R,4R)-Enantiomer, wobei A-----B eine optionale 1(2)- oder 6(1)-Doppelbindung darstellt, R ist -R³X, wobei R³ C1-C5-Alkyl ist und X ist: (a) -OC(O)-R⁴Y, wobei R⁴ ein linearer oder verzweigter Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Arylalkyl-, Alkylaryl- oder Heterocyclylrest oder ein mono- oder polyhydroxyliertes oder -halogeniertes Derivat der Reste ist und Y ist -H, -ON, -C(O)O^–B⁺, -SO₃ ^–B⁺ oder -OPO₃2^–(B⁺)₂, wobei B⁺ ist: ein Kation eines Alkalimetalls oder von Ammoniak oder ein organisches Ammoniumkation, -N(R''')₂·AH, -N(R''')₃ ⁺A^– oder ein cyclischer Stickstoffrest, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
wobei R''' Wasserstoff oder C1-C5-Alkyl ist, D CH₂, O oder NR''' ist, (B⁺)₂ zusätzlich ein Erdalkalimetallkation sein kann und A ein pharmazeutisch annehmbares anorganisches oder organisches Anion ist, (b) -OC(O)O-R⁴Y, wobei R⁴ und Y wie oben definiert sind, (c) -OC(O)NH-R⁴Y, wobei R⁴ und Y wie oben definiert sind, (d) -OC(O)-R⁴ZR⁴Y, wobei R⁴ und Y wie oben definiert sind und Z O, S, SO, SO₂ oder NH ist, (e) -C(NH₂ ⁺)-R⁴A^–, wobei R⁴ und A wie oben definiert sind, (f) -OPO₃ ^2–(B⁺)₂, wobei B⁺ wie oben definiert ist, oder (g) -OH, G ist: (a) ein Halogen, (b) C1-C5-Alkyl, (c) -OR'', wobei R'' wie zuvor definiert ist, (d) -OC(O)R''', wobei R''' wie zuvor definiert ist, (e) -OR³X, wobei R³ und X wie oben definiert sind, mit der Maßgabe, dass X in der Definition von G nicht -OH sein darf, wenn X in der Definition von R -OH ist, und R² ist: (a) C1-C12-Alkyl, (b) -OR'''', worin R'''' ein geradkettiges oder verzweigtes C2-C9-Alkyl ist, das am terminalen Kohlenstoffatom mit einer Phenylgruppe substituiert sein kann, oder (c) -(CH₂)_nOR''', wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 7 ist und R''' wie oben definiert ist; mit der Maßgabe, dass G nicht -OH ist, wenn R CH₂OH ist, und pharmazeutisch annehmbare Salze oder quaternäre Ammoniumderivate davon.
Verbindung nach Anspruch 12, worin G Hydroxy und R² 1,1-Dimethylheptyl oder 1,2-Dimethylheptyl ist.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei X oder G -OC(O)CH₂NH₂·HCl, -OC(O)CH₂N(CH₃)₂·HCl, -OC(O)CH₂N(C₂H₅)₂·HCl, -OC(O)CH₂N(CH₃)₃ ⁺Br^–, -OC(O)CH₂N(C₂H₅)₃ ⁺Br^– , Morpholinoacetyloxy (Hydrobromid), mit Methyliodid quaternisiertes Morpholinoacetyloxy, ω-Morpholinobutyroyloxy (Hydrobromid), mit Methyliodid quaternisiertes ω-Morpholinobutyroyloxy, N-Methylpiperazinoacetyloxy (Dihydrobromid), zweifach mit Methyliodid quaternisiertes N-Methylpiperazinoacetyloxy, ω-(N-Methylpiperazino)butyroyloxy (Dihydrobromid), Nicotinoyloxy (Hydrochlorid), mit Methylchlorat quaternisiertes Nicotinoyloxy, Succinoyloxy (Monoammoniumsalz), Maleoyloxy (Monoammoniumsalz), Phthaloyloxy (Monoammoniumsalz), 2-Quinolinoyloxy (Monoammoniumsalz), Acetyloxy, Bromacetyloxy, Trifluoracetyloxy oder Dinatriumphosphoroyloxy ist.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei R² 1,1-Dimethylheptyl, G -OH und R -CH₂OC(O)CH₂NH₂·HCl, -CH₂OC(O)CH₂N(CH₃)₂·HCl, -CH₂OC(O)CH₂N(C₂H₅)₂·HCl, -CH₂OC(O)CH₂N(CH₃)₃ ⁺Br^–, -CH₂OC(O)CH₂N(C₂H₅)₃ ⁺Br^–, Morpholinoacetyloxymethylen (Hydrobromid), mit Methyliodid quaternisiertes Morpholinoacetyloxymethylen, ω-Morpholinobutyroyloxymethylen (Hydrobromid), mit Methyliodid quaternisiertes ω-Morpholinobutyroyloxymethylen, N-Methylpiperazinoacetyloxymethylen (Dihydrobromid), zweifach mit Methyliodid quaternisiertes N-Methylpiperazinoacetyloxymethylen, ω-(N-Methylpiperazino)butyroyloxymethylen (Dihydrobromid), Nicotinoyloxymethylen (Hydrochlorid), mit Methylchlorat quaternisiertes Nicotinoyloxymethylen, Succinoyloxymethylen (Monoammoniumsalz), Maleoyloxymethylen (Monoammoniumsalz), Phthaloyloxymethylen (Monoammoniumsalz), 2-Quinolinoyloxymethylen (Monoammoniumsalz), Acetyloxymethylen, Bromacetyloxymethylen, Trifluoracetyloxymethylen oder Dinatriumphosphoroyloxymethylen ist.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei R² 1,1-Dimethylheptyl, R-CH₂OH und G ω-Morpholinobutyroyloxy (Hydrobromid), N-Methylpiperazinoacetyloxy (Dihydrobromid), zweifach mit Methyliodid quaternisiertes N-Methylpiperazinoacetyloxy oder Dinatriumphosphoryloxy ist.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei A-----B eine 6(1)-Doppelbindung, R R³X, wobei R³ wie oben definiert ist und X wie unter (a) definiert ist und G -OH ist.
Verbindung nach Anspruch 17, wobei X Acetyloxy, Trifluoracetyloxy, Glycyloxy, 4-(4-Morpholinyl)butyroyloxy, 4-(4-Methyl-1-piperazinyl)butyroyloxy, Succinoyloxy, Maleoyloxy, Phthaloyloxy oder 3-Carboxy-2-pyridincarbonyloxy ist, und die pharmazeutisch annehmbaren Salze und quaternären Ammoniumderivate davon.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Verletzungen des zentralen Nervensystems.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Verletzungen durch eine exzitatorische Aminosäure vermittelte Neurotoxizität, neurale Nekrose aufgrund eines Ödems, zerebrale Ischämie oder Schädeltrauma; Vergiftung des Zentralnervensystems, Herzstillstand, Schlaganfall, optische Neuropathie, Rückenmarksverletzung, Epilepsie, Huntingdon'sche Krankheit, Parkinson'sche Krankheit oder Alzheimerkrankheit umfassen.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 bei der Herstellung eines Medikaments zur Blockierung von N-Methyl-D-aspartat-(NMDA) Rezeptoren in einem Patienten, um N-Methyl-D-aspartat- (NMDA) Rezeptor-vermittelte Neurotoxizität zu behandeln oder alternativ zur Behandlung von neuraler Nekrose aufgrund eines Ödems, zerebraler Ischämie oder Schädeltrauma; Vergiftung des Zentralnervensystems, Herzstillstand, Schlaganfall oder Epilepsie, Huntingdon'scher Krankheit, Parkinson'scher Krankheit oder Alzheimerkrankheit.
Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die Zusammensetzung in einer täglichen Dosis zwischen 0,1 und 25 mg/kg vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 zusammen mit einem annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel dafür.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Träger oder das Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel dafür eine wässrige Co-Lösungsmittel-Lösung mit entweder einem pharmazeutisch annehmbaren Co-Lösungsmittel, einer mit natürlichen oder synthetischen ionischen oder nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln hergestellten micellaren Lösung oder einer Kombination aus einem solchen Co-Lösungsmittel und micellaren Lösungen umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 23 oder 24, wobei der Träger eine Lösung aus Ethanol, einem oberflächenaktiven Mittel und Wasser oder eine Emulsion umfassend ein Triglycerid, Lecithin, Glycerin, einen Emulgator, ein Antioxidationsmittel und Wasser umfasst.