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DE69520748T2 - Lipopolyamine als transfektionsmittel und ihre pharmaceutische verwendung - Google Patents

Lipopolyamine als transfektionsmittel und ihre pharmaceutische verwendung

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DE69520748T2
DE69520748T2 DE69520748T DE69520748T DE69520748T2 DE 69520748 T2 DE69520748 T2 DE 69520748T2 DE 69520748 T DE69520748 T DE 69520748T DE 69520748 T DE69520748 T DE 69520748T DE 69520748 T2 DE69520748 T2 DE 69520748T2
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DE
Germany
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lipopolyamine
composition according
group
nucleic acid
lipids
Prior art date
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DE69520748T
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DE69520748D1 (de
Inventor
Gerardo Byk
Catherine Dubertret
Daniel Scherman
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
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Publication date
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen aus der Familie der Lipopolyamine, die sie enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen und ihre Anwendung für die Transfektion von Nucleinsäuren in vivo und/oder in vitro.
  • Zahlreiche genetische Krankheiten sind mit einem Expressionsfehler und/oder einer anormalen Expression verbunden, das heißt, mit einer schwachen oder übermäßigen Expression von einer oder von mehreren Nucleinsäuren. Die Gentherapie hat hauptsächlich zum Ziel, diesen Typ von genetischen Anomalien über den Umweg der zellulären Expression von klonierten Genen in vivo oder in vitro zu korrigieren.
  • Heutzutage werden mehrere Methoden für die intrazelluläre Freisetzung dieses Typs von genetischer Information vorgeschlagen. Eine von ihnen beruht insbesondere auf der Anwendung von chemischen oder biochemischen Vektoren. Die synthetischen Vektoren besitzen zwei Hauptfunktionen, nämlich die zu transfektierende DNA zu verdichten und ihre zelluläre Fixierung sowie ihre Passage durch die Plasmamembran und gegebenenfalls durch die zwei nuklearen Membranen zu fördern.
  • Ein wesentlicher Fortschritt wurde bei dieser Art der Transfektion mit der Entwicklung einer Technologie erreicht, die auf der Verwendung eines kationischen Lipides basiert. Es wurde auf diese Weise festgestellt, daß ein positiv geladenes kationisches Lipid, das N-[1-(2,3-Dioleyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) in der Form von Liposomen oder kleinen Vesikeln spontan mit der DNA, die negativ geladen ist, interferieren würde, um Komplexe Lipid-DNA zu bilden, die fähig sind, mit den zellulären Membranen zu fusionieren und auf diese Weise die intrazelluläre Freisetzung der DNA ermöglichen würden. Obwohl dieses Molekül im Bereich der Transfektion wirksam ist, weist es jedoch den Nachteil auf, nicht biologisch abbaubar zu sein und im Hinblick auf die Zellen einen toxischen Charakter zu besitzen.
  • Seit dem DOTMA wurden bei diesem Strukturmodell auch andere kationische Lipide entwickelt: die lipophile Gruppe, assoziiert an eine Aminogruppe über einen Arm, den sogenannten "spacer". Unter diesen kann man ganz besonders diejenigen nennen, die als lipophile Gruppe zwei Fettsäuren oder ein Derivat von Cholesterol umfassen, und die außerdem gegebenenfalls als Aminogruppe eine quaternäre Ammoniumgruppe aufweisen. Die DOTAB, DOBT oder ChOTB können insbesondere in dieser Kategorie von kationischen Lipiden als repräsentativ genannt werden. Andere Verbindungen, wie die DOSC und ChOSC sind durch die Anwesenheit einer Cholin-Gruppe anstelle der quaternären Ammoniumgruppe gekennzeichnet. Im allgemeinen bleibt jedoch die transfektierende Aktivität dieser Verbindungen hinlänglich gering.
  • Eine weitere Kategorie von kationischen Lipiden, die Lipopolyamine, wurde ebenfalls in dem Patent EP 0 394 111 beschrieben. Bei diesem Typ von Verbindungen wird die kationische Gruppe durch den Rest L-5-Carboxyspermin dargestellt, der vier Ammoniumgruppen enthält, zwei primäre und zwei sekundäre. Die DOGS und DPPES bilden insbesondere dabei einen Teil. Diese Lipopolyamine sind bei der Transfektion von primären endokrinen Zellen ganz besonders wirksam.
  • Ein ideales synthetisches Mittel zur Transfektion wird nämlich ein hohes Niveau der Transfektion aufweisen, und dies bei einem breiten Spektrum von Zellen, und es wird keine oder notfalls eine sehr herabgesetzte Toxizität bei den verwendeten Dosierungen besitzen sowie schließlich biologisch abbaubar sein, um jede Nebenwirkung im Bereich der behandelten Zellen zu vermeiden.
  • Die vorliegende Erfindung hat genauer gesagt zum Gegenstand, neue Verbindungen vorzuschlagen, die geeignet sind, in wirksamer Weise bei der Transfektion von Zellen in vitro oder in vivo und insbesondere bei der Vektorisation von Nucleinsäuren verwendet zu werden.
  • Sie hat als erstes Lipopolyamine in der Form D, L oder LD und ihre Salze zum Gegenstand, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (I)
  • in der
  • - m eine ganze Zahl zwischen 2 und einschließlich 6 ist,
  • - n eine ganze Zahl zwischen 1 und einschließlich 9 und insbesondere zwischen 1 und 5 ist, mit einer einzigen Gruppe R, die von Wasserstoff verschieden und in der allgemeinen Formel anwesend ist, und variablen oder identischen Werten von m, das in den Gruppen
  • und
  • vorliegt,
  • - R ein Wasserstoffatom oder einen Rest der allgemeinen Formel (II) darstellt:
  • in der
  • - X und X' unabhängig voneinander ein Sauerstoffatom, eine Gruppe Methylen -(CH&sub2;)q- mit q gleich 0, 1, 2 oder 3 bedeuten oder eine Gruppe Amino -NH- oder -NR'- darstellen, worin R' eine Gruppe Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist,
  • - Y und Y' unabhängig voneinander eine Gruppe Methylen, eine Gruppe Carbonyl oder eine Gruppe C = S bedeuten,
  • - R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen substituierten oder nicht substituierten Rest Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen, wobei p zwischen 0 und 5 variieren kann,
  • - R&sub6; ein Derivat von Cholesterol oder eine Gruppe Alkylamino -NR&sub1;R&sub2; bedeutet, worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander einen gesättigten oder ungesättigten, geraden oder verzweigten Rest Alkyl mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen darstellen.
  • Von ganz besonderem Interesse sind die Verbindungen, worin R durch die allgemeine Formel (II')
  • dargestellt wird, worin R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und p den in Anspruch 1 gegebenen Definitionen entsprechen und X ein Sauerstoffatom oder eine Gruppe - (CH&sub2;) q- mit q gleich null ist.
  • Diese Familie von Verbindungen ist insbesondere durch die Anwesenheit einer internen Esterbindung gekennzeichnet, die im Hinblick auf die Biodegradabilität interessant ist.
  • Als gemäß der Erfindung bevorzugte Lipopolyamine kann man ganz besonders die folgenden Verbindungen erwähnen:
  • handelt, in der Form D, L, DL oder eines seiner Salze.
  • Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls jede therapeutische Anwendung der Lipopolyamine gemäß der Erfindung zum Gegenstand, entweder direkt oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen.
  • Wie vorstehend ausgeführt, erweisen sich die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) als ganz besonders interessant bei der Transfektion von Nucleinsäuren in vitro und in vivo. Sie verdichten in wirksamer Weise die DNA und weisen vorteilhafterweise im Hinblick auf die behandelten Zellen eine sehr reduzierte, sogar keine Toxizität auf. Außerdem sind sie biodegradabel, insbesondere durch Hydrolyse ihrer Esterbindung.
  • Um eine maximale Wirkung der Zusammensetzungen gemäß der Erfindung zu erhalten, werden die jeweiligen Anteile der Verbindung der allgemeinen Formel (I) und der Nucleinsäure in der Weise bestimmt, daß das Verhältnis R, positive Ladungen des betrachteten Lipopolyamins pro negative Ladungen der genannten Nucleinsäure, optimal ist. Dieses optimale Verhältnis variiert insbesondere je nach Anwendungsart, nämlich in vivo oder in vitro und je nach zu transfektierendem Zelltyp, und es wird von Fall zu Fall optimiert. Diese Optimierung liegt in der Kompetenz des Fachmannes.
  • In den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann das Polynucleotid sowohl eine Desoxyribonucleinsäure als auch eine Ribonucleinsäure sein. Es kann sich dabei um Sequenzen natürlichen oder künstlichen Ursprungs handeln, und insbesondere um genomische DNA, DNAc, RNAm, RNAt, RNAr, Hybridsequenzen oder synthetische oder halbsynthetische Sequenzen. Diese Nucleinsäuren können beispielsweise menschlichen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen oder viralen Ursprungs sein. Sie können durch jede dem Fachmann bekannte Technik erhalten werden und insbesondere durch Screening von Banken, durch chemische Synthese oder auch durch gemischte Methoden, die eine chemische oder enzymatische Modifizierung der durch Aussieben von Banken erhaltenen Sequenzen einschließen. Sie können außerdem in Vektoren, wie die plasmidischen Vektoren, inkorporiert werden.
  • Was ganz besonders die Desoxyribonucleinsäuren betrifft, so können sie aus einem einfachen oder doppelten Strang bestehen. Diese Desoxyribonucleinsäuren können beispielsweise therapeutische Gene, die Transcription oder die Replikation regulierende Sequenzen, modifizierte oder nicht modifizierte Gegensinn- Sequenzen oder Bereiche der Bindung an andere zelluläre Bestandteile tragen.
  • Im Sinne der Erfindung versteht man unter therapeutischem Gen insbesondere jedes Gen, das für ein proteinisches Produkt mit therapeutischer Wirkung kodiert. Das auf diese Weise kodierte proteinische Produkt kann ein Protein, ein Peptid usw. sein. Dieses proteinische Produkt kann gegenüber der Zielzelle (d. h. einem Produkt, das normalerweise in der Zielzelle exprimiert ist, wenn sie keinen pathologischen Zustand aufweist) homologiert werden. In diesem Fall ermöglicht die Expression eines Proteins beispielsweise, eine unzureichende Expression in der Zelle oder die Expression eines inaktiven oder gering aktiven Proteins im Hinblick auf eine Modifizierung zu beseitigen oder auch das genannte Protein überzuexprimieren. Das therapeutische Gen kann auch für einen Mutanten eines zellulären Proteins mit beispielsweise einer gesteigerten Stabilität oder einer modifizierten Aktivität kodieren. Das proteinische Produkt kann ebenfalls gegenüber der Zielzelle heterolog sein. In diesem Fall kann beispielsweise ein exprimiertes Protein vervollständigt werden oder eine schwache Aktivität in die Zelle einbringen, die ihr ermöglicht, gegen eine Pathologie vorzugehen oder eine immunitäre Antwortreaktion zu. stimulieren.
  • Unter den im Sinne der vorliegenden Erfindung therapeutischen Produkten kann man ganz besonders nennen: die Enzyme, die Blutderivate, die Hormone, die Lymphokine: beispielsweise die Interleukine, die Interferone oder das TNF (FR 9203120), die Wachstumsfaktoren, die Neurotransmitter oder ihre Vorläufer oder Syntheseenzyme, die trophischen Faktoren: beispielsweise BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 oder HARP/Pleiotrophin, das Dystrophin oder ein Minidystrophin (FR 9111947), das Protein CFTR, assoziiert an Mukoviszidose, die Suppressor-Gene von Tumoren: beispielsweise p53, Rb, RaplA, DCC oder k-rev (FR 93 04745), die Gene, die für die bei der Koagulation eingebundenen Faktoren kodieren: Faktoren VII, VIII, IX, die Gene, die bei der Reparatur von DNA eingreifen, die Suizidgene (Thymidin-kinase, Cytosindeaminase), die Gene des Hämoglobins oder anderer proteinischer Transporteure, die Gene, die den beim Metabolismus von Lipiden einbezogenen Proteinen entsprechen, vom Typ der Apolipoproteine, · ausgewählt unter den Apolipoproteinen A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J und (apo)a, die Metabolismus-Enzyme wie beispielsweise die Lipoprotein-Lipase, die hepatische Lipase, die Lecithin-cholesterol-acyltransferase, die 7-alpha-Cholesterol-hydroxylase, die phosphatidische Säure-phosphatase, oder auch Transfer-Proteine von Lipiden wie das Transfer-Protein der Cholesterol-Ester und das Transfer-Protein der Phospholipide, ein Bindungsprotein der HDL oder auch ein Rezeptor, beispielsweise ausgewählt unter den Rezeptoren LDL, den Rezeptoren von Chylomicrons-remnanten und den Rezeptoren Scavenger.
  • Die therapeutische Nucleinsäure kann ebenfalls ein Gen oder eine Gegensinn-Sequenz sein, deren Expression in die Zielzelle ermöglicht, die Expression des Gens oder die Transcription von zellulärer m-RNA zu kontrollieren. Derartige Sequenzen können beispielsweise in die Zielzelle in zusätzliche RNA von zellulärer RNAm transkribiert werden und auf diese Weise ihre Übertragung in Protein blockieren, gemäß der in dem Patent EP 140 308 beschriebenen Technik. Die therapeutischen Gene umfassen ebenfalls Sequenzen, die für Ribozyme kodieren, die ihrerseits fähig sind, Ziel-RNA selektiv zu zerstören (EP 321 210).
  • Wie weiter oben angegeben, kann die Nucleinsäure ebenfalls ein oder mehrere Gene umfassen, die für ein antigenisches Peptid kodieren, das fähig ist, beim Menschen oder beim Tier eine Immunantwort zu erzeugen. In diesem besonderen Fall der Anwendung ermöglicht die Erfindung daher entweder die Realisierung von Vakzinen oder beim Menschen oder Tier angewendete immunotherapeutische Behandlungen, insbesondere gegen Mikroorganismen, Viren oder Krebs. Es kann sich insbesondere um spezifische antigenische Peptide des Virus von Epstein Barr, des Virus HIV, des Virus von Hepatitis B (EP 185 573), des Virus der Pseudotollwut, des "syncitia forming virus" und um andere oder noch spezifischere Viren von Tumoren handeln (EP 259 212).
  • In bevorzugter Weise umfaßt die Nucleinsäure ebenfalls Sequenzen, die eine Expression des therapeutischen Gens und/oder des Gens ermöglichen, das für das antigenische Peptid in der gewünschten Zelle oder in dem gewünschten Organ kodiert. Es kann sich um Sequenzen handeln, die natürlicherweise für die Expression des betrachteten Gens verantwortlich sind, wenn diese Sequenzen fähig sind, in der infizierten Zelle zu arbeiten. Es kann sich ebenfalls um Sequenzen verschiedener Herkunft (verantwortlich für die Expression von anderen Proteinen, oder sogar synthetischen) handeln. Insbesondere kann es sich um Promotorsequenzen von eucaryotischen oder viralen Genen handeln. Beispielsweise kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die vom Genom der Zelle stammen, die man zu infizieren wünscht. In gleicher Weise kann es sich um promotorische Sequenzen handeln, die vom Genom eines Virus stammen. In dieser Hinsicht kann man beispielsweise die Promotoren der Gene EIA, MLP, CMV, RSV nennen. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Addition beispielsweise von Sequenzen zur Aktivierung oder zur Regulierung modifiziert werden. Es kann sich auch um Promotoren handeln, die inductibel oder repressibel sind.
  • Außerdem kann die Nucleinsäure ebenfalls insbesondere einen Vorläufer des therapeutischen Gens umfassen, eine Signalsequenz, die das synthetisierte therapeutische Produkt in die Sekretionswege der Zielzelle dirigiert. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des therapeutischen Produktes sein, aber es ist ebenfalls möglich, daß es sich um jede andere funktionelle Signalsequenz handelt oder auch um eine künstliche Signalsequenz.
  • Die Nucleinsäure kann ebenfalls eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte therapeutische Produkt in einen besonderen Raum der Zelle dirigiert.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die eine Nucleinsäure, ein wie beanspruchtes Lipopolyamin und einen Zusatzstoff umfassen, der fähig ist, sich an den Komplex Lipopolyamin/Nucleinsäure zu assoziieren und dessen Transfektionsvermögen zu verbessern. Die Anmelderin hat nämlich gezeigt, daß das Transfektionsvermögen der Lipopolyamine in unerwarteter Weise in Anwesenheit von gewissen Zusatzstoffen (beispielsweise Lipide oder Proteine) erhöht werden kann, die fähig sind, sich an den Komplex Lipopolyamin/ Nucleinsäure zu assoziieren.
  • Vorzugsweise umfassen die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung als Zusatzstoff ein oder mehrere neutrale Lipide. Derartige Zusammensetzungen sind besonders vorteilhaft, insbesondere wenn das Verhältnis R niedrig ist. Die Anmelderin hat nämlich gezeigt, daß die Zugabe eines neutralen Lipides ermöglicht, die Bildung von nucleolipidischen Teilchen zu verbessern und in überraschender Weise das Eindringen des Teilchens in die Zelle unter Destabilisierung ihrer Membran zu begünstigen.
  • In besonderer Weise sind die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten neutralen Lipide solche mit 2 Fettketten. In besonders vorteilhafter Weise verwendet man natürliche oder synthetische, zwitterionische oder solche Lipide, die von ionischer Ladung unter physiologischen Bedingungen befreit wurden. Sie können ganz besonders unter Dioleoylphosphatidyl-ethanolamin (DOPE), Oleoylpalmitoyl-phosphatidyl-ethanolamin (POPE), Distearoyl, -palmitoyl, -miristoyl phosphatidyl-ethanolaminen sowie ihren ein- bis dreimal N-methylierten Derivaten; den Phosphatidyl-glycerinen, den Diacyl-glycerinen, den Glycosyldiacylglycerinen, den Cerebrosiden (wie insbesondere den Galactocerebrosiden), den Sphingolipiden (wie insbesondere den Sphingomyelinen) oder den Asialogangliosiden (wie insbesondere den asialoGMl und GM2) ausgewählt werden.
  • Diese verschiedenen Lipide können entweder durch Synthese oder durch Extraktion ausgehend von Organen (beispielsweise Gehirn) oder Eiern nach dem Fachmann gut bekannten Techniken erhalten werden. Insbesondere kann die Extraktion von natürlichen Lipiden mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln (siehe ebenfalls Lehninger, Biochemistry) realisiert werden.
  • In bevorzugter Weise umfassen die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung 0,1 bis 20 Äquivalente Zusatzstoff pro 1 Äquivalent Verbindung der allgemeinen Formel (I), und noch bevorzugter 1 bis 5 Äquivalente.
  • Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können im Hinblick auf ihre Verabreichung auf topischem, kutanem, oralem, rektalem, vaginalem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokularem oder transdermalem Wege formuliert werden. Vorzugsweise enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung einen für eine injizierbare Formulierung, insbesondere für eine direkte Injektion in den Bereich des gewünschte Organs oder für eine Verabreichung auf topischem Wege (auf die Haut und/oder die Schleimhaut) pharmazeutisch akzeptablen Füllstoff. Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Lösungen oder getrocknete, insbesondere lyophilisierte Zusammensetzungen handeln, die je nach Fall durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum die Bildung von injizierbaren Lösungen gestatten. Die Dosierungen der pro Injektion verwendeten Nucleinsäure sowie die Anzahl der Verabreichungen können in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern angepaßt werden, insbesondere in Abhängigkeit von der angewendeten Art der Verabreichung, der betreffenden Erkrankung, des zu exprimierenden Gens oder auch der Dauer der gewünschten Behandlung. Was ganz besonders die Art der Verabreichung betrifft, so kann es sich entweder um eine direkte Injektion in die Gewebe handeln oder um eine Behandlung von Zellen in Kultur, gefolgt von ihrer Reimplantation in vivo durch Injektion oder Pfropfen.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auf diese Weise eine besonders vorteilhafte Methode zur Behandlung von Erkrankungen, umfassend die Verabreichung einer Nucleinsäure in vivo oder in vitro, die, assoziiert an eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) unter den vorstehend definierten Bedingungen fähig ist, bei der genannten Erkrankung eine Besserung zu gewährleisten. Diese Methode ist ganz besonders bei solchen Erkrankungen anwendbar, die auf einer Defizienz eines proteinischen oder nucleinischen Produktes beruhen und die verabreichte Nucleinsäure kodiert für das genannte proteinische Produkt oder enthält das genannte nucleinische Produkt.
  • Sie erstreckt sich auf jede Anwendung eines Lipopolyamins gemäß der Erfindung bei der Transfektion von Zellen in vivo oder in vitro.
  • Die vorliegende Erfindung wird noch vollständiger mit Hilfe der folgenden Beispiele und Figuren beschrieben, die nur als veranschaulichend und nicht als einschränkend betrachtet werden sollen.
    • ABKÜRZUNGEN UND SYMBOLE
  • AcOEt: Ethylacetat
  • BOP: Benzotriazol-1-yloxytris-(dimethylamino) phosphonium-hexafluorphosphat
  • DCC: Dicyclohexylcarbodiimid
  • DCU: Dicyclohexylharnstoff
  • DMAP: 4-Dimethylaminopyridin
  • DMF: Dimethylformamid
  • DMSO: Dimethylsulfoxid
  • DODA: Dioctadecylamin
  • EP: Petrolether
  • EtOH: Ethanol
  • NEt&sub3;: Triethylamin
  • Rf: Koeffizient der frontalen Retention
  • TFA: Trifluoressigsäure
  • THF: Tetrahydrofuran
  • TMS: Tetramethylsilan
  • UV: Ultraviolett
    • MATERIAL UND METHODEN A. Verwendete Produkte
  • Das DODA, NEt&sub3;, TFA, L-Ornithin, Tetramethyl-ammoniumhydroxid, Raney-Nickel, Diglycol-anhydrid stammen von Fluka; das BOP von Propeptide France; das DMAP, der Isobutyl-chlorameisensäureester und das N-Methylmorpholin von Aldrich. Das THF stammt von Merck, alle anderen verwendeten Lösungsmittel sind Produkte von RP Prolabo. Die Lösungen von NaCl und von NaHCO&sub3; sind gesättigt, die Lösung von KHSO&sub4; ist 0,5 M.
    • B. Physikalische Messungen
  • Die Spektren der magnetischen Kernresonanz des Protons (NMR ¹H) wurden auf einem Spektrometer Bruker aufgezeichnet.
  • Die chemischen Verschiebungen sind in ppm, bezogen auf TMS ausgedrückt.
    • C. Chromatographien auf Kieselerde
  • Die Dünnschichtchromatographien (CCM) wurden auf Platten von Kieselgel Merck von 0,2 mm Dicke durchgeführt.
  • Auswertung:
  • - mit UV (254 nm),
  • - mit Ninhydrin, unter Versprühen (spray leger) einer ethanolischen Lösung von Ninhydrin (40 mg/100 ml EtOH) für die Entwicklung der Amine oder der Amide und unter Erhitzen auf 150ºC,
  • - mit Fluorescamin, unter Versprühen einer Lösung (40 mg/100 ml Aceton) für die Entwicklung der primären Amine,
  • - mit Iod, unter Bedecken der Platte mit Iod-Pulver.
  • Die Chromatographien auf der Kolonne wurden auf Kieselgel 60 Merck mit einer Granulometrie von 0,063-0,200 mm durchgeführt.
    • BEISPIEL 1 Synthese des (Dioctadecyl-carbamoylmethoxy)-acetates von 2,5-Bis-(3-Amino-propylamino)-pentyl
  • 1. a Herstellung des 2,5-Bis-(2-Cyano-ethylamino)-pentanoates von Tetramethylammonium (1.a)
  • Das Monohydrochlorid von 2, 5-Diamino-pentansäure(n) (L-Ornithin) (6,74 g; 40 mMol) und das Tetramethylammonium-hydroxyd-Pentahydrat (14,48 g; 80 mMol) werden in Methanol (20 ml) in Lösung gebracht. Anschließend werden das gebildete Wasser und das Methanol unter reduziertem Druck (mit Hilfe einer Ölpumpe) verdampft, so daß man einen trockenen Rückstand erhält.
  • Dann wird N,N-Dimethylformamid (30 ml) zu den vorstehend erhaltenen Salzen gegeben. Die Mischung wird mit Hilfe von Stickstoff entgast und anschließend 10 Minuten lang kräftig gerührt, was dem 2,5-Diamino-pentanoat von Tetramethylammonium ermöglicht, sich aufzulösen (das Tetramethylammonium-chlorid bleibt in DMF in Suspension).
  • Danach wird Acrylnitril (6 ml; 85,6 Mol) tropfenweise zugesetzt, wobei sich der Kolben wieder leicht erwärmt. Die Reaktionsmischung wird eine Stunde lang unter Stickstoff bei Umgebungstemperatur belassen und anschließend filtriert, um das Tetramethylammonium-chlorid zu entfernen. Dann wird das DMF unter reduziertem Druck verdampft. Der erhaltene Rückstand ist eine ölige Flüssigkeit, die sich am Rotationsverdampfer verfestigt. Es wird Acetonitril (100 ml) zugesetzt und der Kolben leicht bis zum Erhalten einer durchsichtigen Lösung erwärmt. Dann wird THF bis zum Erhalten einer trüben Lösung zugegeben. Der Kolben wird zwei Tage lang im Gefrierschrank gelagert und das Tetramethylammonium-Salz der L-2,5-Bis-(2-Cyano-ethylamino)-pentansäure durch Filtration in Form eines weißen Feststoffes gewonnen. Er wird mit THF auf der Glasfritte gespült und anschließend über P&sub2;O&sub5; getrocknet. Es werden 6,06 g erhalten, das entspricht einer Ausbeute von 49% (roh).
    • 1. b Herstellung des Tetramethylammonium-Salzes der 2,5-Bis-(3- Amino-propylamino)-pentansäure (1.b)
  • Das Produkt l.a wird in einer Mischung von Ethanol (18 ml), Wasser (2 ml) und 2 M Kaliumhydroxid (5 ml) gelöst und die Lösung mit Argon entlüftet. Dann wird Raney-Nickel (2 ml der Suspension von Fluka) zugesetzt. Die Hydrierung wird bei 26ºC in einem mit Argon entlüfteten Autoklaven ausgeführt. Innerhalb von 3 Stunden durchläuft der Druck den Bereich von 50,6 Bar bis 44,7 Bar, anschließend bleibt er mehr als eine Stunde lang stabil. Der Autoklav macht 250 ml aus und die Reaktionsmischung 30 ml. Die erhaltene Suspension wird filtriert, mit Wasser gespült und über den Rotationsverdampfer gegeben. Man erhält ein gelbes Öl. Der Test mit Fluorescamin ist positiv.
    • 1. c Herstellung der 2,5-Bis-{tert.-Butoxycarbonyl-[3-(tert.- butoxycarbonylamino)-propyl]-amino}-pentansäure (1. c)
  • Das Produkt 1.b wird in Dioxan (30 ml) gelöst und danach Ditert.-Butyldicarbonat (17,46 g; 80 mMol) tropfenweise zugegeben. Die Mischung wird über Nacht gerührt und das Dioxan anschließend verdampft. Dann setzt man KHSO&sub4; hinzu und extrahiert das Produkt mit CHCl&sub3; (3 · 100 ml). Die organische Phase wird dann nacheinander mit NaHCO&sub3; (pH = 7,5) und NaCl gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und unter reduziertem Druck eingedampft. Man erhält 10 g Produkt (15,4 mMol, das entspricht einer Ausbeute von 39%, bezogen auf Ornithin).
  • HPLC: MeCN/H&sub2;O: 0-3 min 50% MeCN; 3-20 min 50-100% MeCN, 20- 40 min 100% MeCN, K' = 7.96 (Kolonne RP-18, Durchsatz 1 ml/min) CCM. Rf [CHCl&sub3;: AcOEt; 95. 5 (v. v)] = 0,28
  • NMR (ppm): 1,3 (m, SH, N+CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-CHN+COO/2x N+CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;N+); 2,7-3,0 (m, 10H 5x N+CH&sub2;); 3,8 (t, 1H, N+CHCOO).
  • MS: MH' = 647, (PM = 646).
    • 1. d Herstellung von 2,5-Bis-{tert.-Butoxycarbonyl-[3-(tert.- butoxycarbonylamino)-propyl]-amino}-pentan-1-ol (1.d)
  • Das L-5-Carboxytetra-tert.-butoxycarbonyl-spermin (1,94 g; 3 mMol) wird in 30 ml THF gelöst, und danach trägt man 370 ml (3,1 mMol) N-Methylmorpholin mit der Mikropipette ein. Die Reaktionsmischung wird unter Stickstoff gesetzt, auf -15ºC abgekühlt (in einem Bad von Trockeneis und Ethylenglycol), und anschließend werden 390 ml (3,1 mMol) Chlorameisensäure-isobutylester zugegeben. Nach Ablauf von 3 Minuten wird die Reaktionsmischung in ein Becherglas gegossen, das NaBH&sub4; (2 g), gelöst in 20 ml Wasser von 4ºC enthält. Danach wird das THF verdampft und KHSO&sub4; bis zu einem pH-Wert von 7 zugesetzt. Das Produkt wird mit AcOEt extrahiert, mit NaHCO&sub3; und NaCl gespült, über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und anschließend eingedampft. Man erhält 1,5 g, das entspricht einer Ausbeute von 61%.
  • Die CCM führt zu zwei Flecken. Es wird daher eine Trennung über eine Kolonne mit Kieselerde und dem gleichen Eluent realisiert, die zu 0,97 g Produkt (gelbes Öl) führt. Die Ausbeute der Trennung beträgt 84%.
  • Die Ausbeute der Reduktion beträgt 51%.
  • CCM: Rf [EP. AcOEt; 1 : 1 (v. v)] = 0,24
  • NMR (ppm): 1,42 (s, 4xBoc); 1,5-1,7 (m, 8H N+CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-CHN /2x N+CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2; N); 2,85-3,2 (m, 10H 5x NCH&sub2;); 3,4 (m, 1H, NCHCH&sub2;OH); 3,7 (d, 2H, CH&sub2;OH); 6,8 (m, 2H NH).
  • MS: MH+ = 633, PM = 632.
    • 1. e Herstellung von 2,5-Bis-[3-(tert.-Butoxycarbonylamino) - propyl]-(tert.-butoxycarbonylamino } -pentyloxycarbonyl-methoxyessigsäure (1.e)
  • Das Produkt 1.d (0.,51 g; 0,806 mMol) wird in 10 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst, und danach werden 2 Äquivalente Diglycol-anhydrid (0,178 g; 1,535 mMol), 2, 2 Äquivalente Triethylamin (235 11; 1,687 mMol) sowie 5 mg DMAP zugesetzt. Nach Ablauf von einer Stunde, wo die CCM zeigt, daß der Alkohol reagiert hat, wird der Reaktionsmischung CH&sub2;Cl&sub2; zugefügt, und anschließend wird sie mit 3 · 50 ml KHSOQ und mit 3 · 50 ml NaCl gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und danach eingedampft. Man erhält 0,26 g Feststoff, das entspricht einer Ausbeute von 43%.
  • CCM: Rf [CHCl&sub3;: MeOH. AcOH; 90 : 8 : 2 (v : v " v)] = 0,75 MS. MH&spplus; = 749, PM = 748.
    • 1. f Herstellung von (Dioctadecyl-carbamoylmethoxy)-acetat von 2,5-Bis-{tert.-Butoxycarbonyl]-[3-(tert.-butoxycarbonylamino)- propyl]-amino}-pentyl (1.f)
  • Eine Menge von 0,123 g des vorstehenden Produktes (0,164 mMol), 1 Äquivalent (0,0856 g) Dioctadecylamin, 3 Äquivalenten Triethylamin (68,4 ml) und 1, 1 Äquivalenten (0,0798 g) BOP wird in CHCl&sub3; gelöst. Anschließend wird die Reaktionsmischung bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach Ablauf von 2 Stunden werden der Mischung 100 ml CH&sub2;Cl&sub2; zugesetzt, diese mit 3 · 100 ml KHSO&sub4;, NaHCO&sub3; und NaCl (bis pH = 7) gewaschen, getrocknet und danach eingedampft. Man erhält 0,13 g Produkt, das entspricht einer Ausbeute von 63%.
  • CCM: Rf [EP. AcOEt; 1 : 1 (v : v)] = 0,62; Entwicklung mit Iod, mit Ninhydrin und mit Fluorescamin.
  • NMR (ppm): 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 6H: CH&sub3;); 1,20-1,75 [m, 108H: CH&sub2;/ C(CH&sub3;)&sub3;]; 3,05-3,35 (m, 14H: CH&sub2;N); 4,15-4,35 (m, 3H: NCHCH&sub2;CCO); 4,23-4,27 (25, 2x 2H: OCH&sub2;CO); 4,5-5,5 (m, breit, 2H: NH).
  • MS: MH&spplus; = 1252, P. M. 1251
  • Elementaranalyse: Formel roh. C&sub7;&sub1;H&sub1;&sub3;&sub7;N&sub5;O&sub1;&sub2;
  • % theoretisch: C 68,06 H 11,02 N 5,59
  • % erhalten: C 67,14 H 11,93 N 5,86
    • 1. g Herstellung von (Dioctadecyl-carbamoylmethoxy)-acetat von 2,5-Bis-(3-Amino-propylamino)-pentyl (1.g)
  • Eine Menge von 1 ml TFA wird zu 0,025 g des Produktes 1.f (0,02 mMol) in einem Rohr "Eppendorf"® von 1,5 ml gegeben und eine Stunde lang bei Umgebungstemperatur belassen. Anschließend wird die TFA verdampft.
  • Eine Menge von 500 ul Ethanol wird in der Weise zugesetzt, daß man eine Lösung zu 40 mM erhält, die für die biologischen Tests notwendig ist.
  • MS: MH&spplus; = 852, P. M. = 851
    • BEISPIEL 2 Herstellung von (Dioctadecyl-carbamoylmethoxy)-acetat von 1,3-Bis-(3-Amino-propylamino)-2-propyl (2.f): 2. a Herstellung von 1,3-Bis-(2-Cyano-ethylamino)-propan-2-ol (2. a)
  • Eine Menge von 3,6 g (40 mMol) 1,3-Diaminopropan-2-ol wird in 75 ml Methanol gelöst. Dann werden innerhalb von 15 Minuten 5,76 g (80 mMol) Acrylnitril zugesetzt. Der Test auf Fluorescamin ist positiv. Die Reaktionsmischung bleibt farblos. Sie wird über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Der Test auf Fluorescamin ist danach negativ. Anschließend wird das Methanol verdampft. Es werden 7,9 g Produkt gewonnen (Ausbeute 100% für das rohe Produkt).
    • 2. b Herstellung von 1,3-Bis-(3-Amino-propylamino)- ropan-2-ol (2.b)
  • Die Hydrierung wird in einem mit Stickstoff entlüfteter bei 27ºC realisiert.
  • Das Produkt 2.a wird in einer Mischung von 15 ml Methanol, 10 ml Ethanol und 5 ml KOH (2 M) gelöst. Dann wird die Lösung mit Argon entlüftet und 4 ml der Suspension von Raney-Nickel in den Autoklaven gegeben.
  • Innerhalb von 3 Stunden und 30 Minuten durchläuft der Druck einen Bereich von 51,6 Bar bis 37,6 Bar, danach stabilisiert er sich mehr als eine Stunde lang. Der Autoklav macht 250 ml aus und die Reaktionsmischung 30 ml. Die erhaltene Suspension wird filtriert, mit Wasser gespült und über einen Rotationsverdampfer gegeben. Man erhält ein gelbes Öl. Der Test auf Fluorescamin ist positiv.
    • 2. c Herstellung von 1,3-Bis-[3-tert.-Butoxycarbonylamino-(tert.- butoxycarbonylamino-propyl]-2-propan-2-ol (2.c)
  • Das Produkt 2.b wird in der gleichen Weise wie in 1.c geschützt. Es werden 100 ml CH&sub2;Cl&sub2; zugesetzt. Anschließend werden tropfenweise 39,2 g (179 mMol) Ditert.-Butyldicarbonat, gelöst in 100 ml Dioxan, hinzugegeben. Die Lösung wird 72 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wird verdampft, und dann setzt man KHSO&sub4; hinzu. Das Produkt wird mit AcOEt extrahiert (3 · 100 ml), die Phasen vereinigt und mit KHSO&sub4;, mit NaHCO&sub3; und mit NaCl gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft. Man erhält 20 g Produkt (Ausbeute 83%, bezogen auf das Ausgangsprodukt).
  • Das Produkt wird in EP kristallisiert.
  • CCM: Rf [EP. AcOEt; 1 : 1 (v. v)] = 0,23
  • Rf [EP. AcOEt; 1 : 2 (v : v)] = 0,63
  • NMR (ppm): 1,4 [25, 36H: 4 · (CH&sub3;) 3]; 1,65 (qt, 4H: 2 · NCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;NH); 2,95 (q, 4H: 2 · NHCH&sub2;CH&sub2;); 3,1 (2d, 4H: NCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;NH); 3,2 (t, 4H: NCH&sub2;CH&sub2;); 3,85 (m, 1H: OH); 5,9 (s, 2H: NH).
  • MS: MH&spplus; = 605, PM = 604.
    • 2. d Herstellung von 1,3-Bis-[3-tert.-Butoxycarbonylaminp- (tert.- butoxycarbonylamino-propyl]-2-propyl-2-ethoxycarbonylmethoxyessigsäure (2. d)
  • Eine Menge von 604 mg (1 mMol) des Produktes 2.c wird in 20 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. Dann weiden 2 Äquivalente Anhydrid (0,232 g; 2 mMol), 2, 2 Äquivalente NEt&sub3; (307 ul, danach 100 ul) und 6,5 g DMAP eingetragen. Nach 24 Stunden Rühren bei Umgebungstemperatur wird der Mischung CH&sub2;Cl&sub2; zugesetzt, sie wird mit KHSO&sub4; und mit NaCl gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und anschließend eingedampft. Man erhält 0,156 g Produkt (Ausbeute 22%).
  • CCM: Rf [CHCl&sub3;: MeOH. AcOH; 90 : 8 : 2 (v : v : v)] = 0,71 NMR (ppm): 1,2-1,4 [25, 36H: 4 · (CH&sub3;) 3]; 1,5 (m, 4H: 2 · NCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;NH); 2,85 (q, 4H: 2 · NHCH&sub2;CH&sub2;); 3,1 (m, 8H: 4 · NCH&sub2;); 3,9-4,2 (25, 4H: 2 · OCH&sub2;COO); 5,25 (m, 1H: CH&sub2;CHCH&sub2;); 6,7 (2H: NH).
  • MS: MH&spplus; = 721, PM = 720.
    • 2. e Herstellung von (Dioctadecyl-carbamoylmethoxy)-acetat von 1,3-Bis-[3-tert.-Butoxycarbonylamino-(tert.-butoxycarbonylamino)- propyl]-2-propyl (2. e)
  • Eine Menge von 0,216 mMol der Säure 2.d wird in 3 ml CHCl3 gelöst. Dann werden 1 Äquivalent DODA (0,113 g), 3 Äquivalente NEt3 (100 ul) und 1, 1 Äquivalente BOP (0,11 g) zugesetzt. Anschließend wird die Reaktionsmischung 24 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Danach wird das CHCl&sub3; verdampft und man gibt 100 ml AcOEt hinzu. Die organische Phase wird mit HCl (0,5 M), mit NaHCO&sub3; und mit NaCl bis pR = 7 gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und anschließend eingedampft. Man erhält 0,185 g Produkt (Ausbeute 70%). Eine Kolonne über Kieselerde wird realisiert und es werden 110 mg Produkt gewonnen (Ausbeute 42%).
  • CCM: Rf [CHCl&sub3; : MeOH : AcOH; 90 : 8 : 2 (v : v : v)] = 0,81
  • Rf [EP: AcOEt; 1 : 1 (v : v)] = 0,67
  • NMR (ppm): 0,85 (t, 6H: 2 · CH&sub3;); 1,20-1,55 [m, 100H: CH&sub2;/ (CH&sub3;)];
  • 1,6 (m, 4H: 2 · NCR&sub2;CH&sub2;CH&sub2;N); 3,05-3,4 (m, 16H: 2 · NHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2; N/- NCH&sub2;CHCH&sub2;N) / 2 · CH&sub2;N); 4,1 (s, 2H: NCOCH&sub2;O); 4,15 (s, 2H: OCH&sub2;COO); 5,25 (m, 1H: CK2CHCH&sub2;); 6, 15 (m, 2H: NH).
  • MS: MH&spplus; = 1224, PM = 1223.
    • 2. f Herstellung von (Dioctadecyl-carbamoylmethoxy)-acetat von 1,3-Bis-(3-Amino-propylamino)-2-propyl (2.f)
  • Eine Menge von 1 ml TFA wird zu 0,0247 g des Produktes 2.e (0,021 mMol) in einem Rohr "Eppendorf"® von 1,5 ml gegeben und eine Stunde lang bei Umgebungstemperatur belassen. Anschließend wird die TFA verdampft.
  • Eine Menge von 505 ul Ethanol wird in der Weise zugesetzt, daß man eine Lösung zu 40 mM erhält, die für die biologischen Tests notwendig ist.
  • MS: MH&spplus; = 824, P. M. = 823
    • BEISPIEL 3 Herstellung von (N,N-Dioctadecyl)-succinamat von 2-(3-Arnino-propylamino)-1-(3-amino-propylamino-methyl)-ethyl
  • Diese Verbindung wird nach der vorstehend in Beispiel 2 beschriebenen Vorschrift hergestellt, unter Austausch der Diglycolsäure durch Bernsteinsäure.
  • Die Analyse mittels Massenspektrometrie des auf diese Weise erhaltenen Produktes zeigt ein Fragment MH' von 808, was mit der erwarteten Masse in Übereinstimmung steht.
    • VERWENDUNG DER LIPOPOLYAMINE GEMÄSS DER ERFINDUNG FÜR DIE TRANSFEKTION VON GENETISCHEM MATERIAL IN VITRO
  • A Verwendete Plasmide für den Transfer von Genen in vitro Man verwendet das Plasmid pCMV-LUC. Es handelt sich um eine Konstruktion, die das Rapport-Gen "Luciferase" umfaßt, entweder abgeleitet von dem Plasmid pGL2-Basic Vector® (Promega) oder von dem Plasmid pGL2-Control Vector® (Promega) durch Insertion eines Fragmentes Mlu I-Hind III, das den Promotor von humanem Cytomegalovirus (CMV) enthält, extrahiert vom Vektorplasmid pcDNA3® (Invitrogen).
    • B Vorschrift zur Herstellung der für die Transfektion verwendeten Lösungen
  • Gemäß den vorstehenden Beispielen hergestellte Lipopolyamine werden zu 40 mM in Ethanol in Lösung gebracht und anschließend in einer Mischung Ethanol/Wasser verdünnt, wobei eine ethanolische Konzentration von unter 10% eingehalten wird.
  • Die Lösungen von zu transfektierender Nucleinsäure werden in physiologischem Serum (NaCl 0,15 M) verdünnt und anschließend in einem Verhältnis 1/l (v/v) zu den Lösungen von Lipopolyamin gegeben. Nach der Homogenisierung mittels Vortex und Inkubation 15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur werden die Lösungen DNA/Lipopolyamin mit 9% (v/v) Endkonzentration in Vertiefungen aufgeteilt, wo die Zellen mit einem Kulturmedium gewaschen wurden, das frei von Proteinen (Serum) ist.
    • BEISPIEL 4 Einfluß des Chargenverhältnisses (Amine/Phosphate) auf die Effektivität der Transfektion
  • Es werden Proben von 1.105 Zellen NIH 3T3 in exponentieller Wachstumsphase auf 2 cm³ während 4 Stunden bei 37ºC unter 5% CO&sub2; mit Lösungen Lipopolyamine/pCMV-LUC behandelt, die variable Chargenverhältnisse aufweisen. Jede Probe erhält 1 ug Nucleinsäure. Die Untersuchung der Expression des Reporter-Gens wird nach Zugabe von Kälberfötus-Serum mit 8% Endkonzentration, gefolgt von einer Inkubation 40 Stunden lang im Trockenschrank unter CO&sub2;durchgeführt.
  • Die Luciferase-Aktivität wird durch Lichtemission [RLU = relative light unit] in Anwesenheit von Luciferin, Coenzym A und ATP während 20 Sekunden bestimmt und bezogen auf ug Protein in dem nach der Lyse der Zellen erhaltenen aufschwimmenden Anteil. Die erhaltenen Resultate sind in der unten stehenden Tabelle I aufgeführt. TABELLE I
  • Jeder Wert entspricht dem Mittel von drei unabhängigen Versuchen. Diese Untersuchung zeigt deutlich, daß die Lipopolyamine gemäß der Erfindung den Transfer von Genen unter den für ihre Expression erforderlichen Bedingungen ermöglichen.
    • BEISPIEL 5 Einfluß der Konzentration an Nucleinsäure in den Mischungen DNA/Lipopolyamin
  • Gemäß der gleichen Vorschrift wie in dem vorstehenden Beispiel beschrieben werden Zellen NIH 3T3 mit Mischungen DNA/Lipopolyaminen behandelt, wo unterschiedliche Konzentration von DNA für ein gleiches Chargenverhältnis angewendet werden.
  • In diesem Fall wird die Luciferase-Aktivität während 20 Sekunden gemessen und auf 2,5.103 behandelte Zellen bezogen. Die Resultate sind in den unten stehenden Tabellen II und III aufgeführt. Lipopolyamin von Beispiel 1 TABELLE II Lipopolyamin von Beispiel 2 TABELLE III
  • Jeder Wert entspricht dem Mittel von drei unabhängigen Versuchen. Die zwischen den Klammern dargestellten Werte entsprechen dem Koeffizienten der Variierung, ausgedrückt in %.

Claims (23)

1. Lipopolyamin in der Form D, L oder DL oder eines seiner Salze, dadurch gekennzeichnet, daß es durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt wird:
in der
- m eine ganze Zahl zwischen 2 und einschließlich 6 ist,
- n eine ganze Zahl zwischen 1 und einschließlich 9 ist, mit der Notwendigkeit einer einzigen Gruppe R, die von Wasserstoff verschieden und in der allgemeinen Formel anwesend ist, und variablen oder identischen Werten von m, das in den Gruppen -(CH&sub2;)m- oder
vorliegt,
- R ein Wasserstoffatom oder einen Rest der allgemeinen Formel (II) darstellt:
in der
- X und X' unabhängig voneinander ein Sauerstoffatom, eine Gruppe Methylen -(CH&sub2;)q- mit q gleich 0, 1, 2 oder 3 bedeuten oder eine Gruppe Amino -NH- oder -NR'- darstellen, worin R' eine Gruppe Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist,
- Y und Y' unabhängig voneinander eine Gruppe Methylen, eine Gruppe Carbonyl oder eine Gruppe C=S bedeuten,
- R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen substituierten oder nicht substituierten Rest Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen, wobei p zwischen 0 und 5 variieren kann,
- R&sub6; eine Gruppe Cholesterol oder eine Gruppe Alkylamino -NR&sub1;R&sub2; bedeutet, worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander einen gesättigten oder ungesättigten, geraden oder verzweigten Rest Alkyl mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen darstellen.
2. Lipopolyamin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß n noch bevorzugter zwischen 1 und 5 ausgewählt wird.
3. Lipopolyamin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß darin R vorzugsweise durch die allgemeine Formel (II')
dargestellt wird, worin R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und p den in Anspruch 1 gegebenen Definitionen entsprechen und X ein Sauerstoffatom oder eine Gruppe -(CH&sub2;)q- mit q gleich null ist.
4. Lipopolyamin nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um
handelt, in der Form D, L, DL oder eines seiner Salze.
5. Lipopolyamin nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um
handelt, in der Form D, L, DL oder eines seiner Salze.
6. Lipopolyamin nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um
handelt, in der Form D, L, DL oder eines seiner Salze.
7. Lipopolyamin nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um
handelt, in der Form D, L, DL oder eines seiner Salze.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein Lipopolyamin nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und mindestens eine Nucleinsäure enthält.
9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure eine Desoxyribonucleinsäure ist.
10. Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure eine Ribonucleinsäure ist.
11. Zusammensetzung nach Anspruch 8, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure chemisch modifiziert ist.
12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure einen Gegensinn aufweist.
13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure ein therapeutisches Gen umfaßt.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das therapeutische Gen für ein Protein kodiert, das in den Metabolismus der Lipide einbezogen ist, wie durch ein Apolipoprotein, ausgewählt unter den Apolipoproteinen A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J und apo(a), ein Enzym wie Lipoprotein-Lipase, hepatische Lipase oder andere Lipasen, Lecithin-Cholesterol-Acyltransferase, 7-alpha-Cholesterol-Hydroxylase, phosphatidische saure Phosphatase, ein Transferprotein von Lipiden wie das Transferprotein der Cholesterol-Ester und das Transferprotein der Phospholipide, ein Bindungsprotein von HDL oder auch einen Rezeptor, beispielsweise ausgewählt unter den Rezeptoren LDL, den Rezeptoren von Chylomicron-Remnanten und den Rezeptoren Scavenger.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Nucleinsäure, ein Lipopolyamin nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und einen Zusatzstoff, der fähig ist, sich an den Komplex Lipopolyamin/- Nucleinsäure zu assoziieren und seine Fähigkeit zur Transfektion zu verbessern.
16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatzstoff ein oder mehrere neutrale Lipide darstellt.
17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die neutralen Lipide unter den natürlichen oder synthetischen, zwitterionischen oder solchen Lipiden ausgewählt werden, die von ionischer Ladung unter physiologischen Bedingungen befreit wurden.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die neutralen Lipide solche mit zwei Fettketten sind.
19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die neutralen Lipide unter Dioleoylphosphatidyl-ethanolamin (DOPE), Oleoylpalmitoyl-phosphatidyl-ethanolamin (POPE), Distearoyl, -palmitoyl, -miristoyl phosphatidyl-ethanolamin sowie ihren ein- bis dreimal N-methylierten Derivaten; den Phosphatidyl-glycerinen, den Diacyl-glycerinen, den Glycosyldiacyl-glycerinen, den Cerebrosiden (wie insbesondere den Galactocerebrosiden), den Sphingolipiden (wie insbesondere den Sphingomyelinen) und den Asialogangliosiden (wie insbesondere den asialoGMl und GM2) ausgewählt werden.
20. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,1 bis 20 Äquivalente Zusatzstoff pro 1 Äquivalent Lipopolyamin, und noch bevorzugter 1 bis 5 umfaßt.
21. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff für eine injizierbare Formulierung umfaßt.
22. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff für eine Anwendung auf der Haut und/oder den Schleimhäuten umfaßt.
23. Verwendung eines Lipopolyamins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Transfektion von Zellen in vivo oder in vitro.
DE69520748T 1994-12-05 1995-12-04 Lipopolyamine als transfektionsmittel und ihre pharmaceutische verwendung Expired - Fee Related DE69520748T2 (de)

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