[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

HUT77171A - Lipopoliaminok mint transzfekciós ágensek, és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények - Google Patents

Lipopoliaminok mint transzfekciós ágensek, és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények Download PDF

Info

Publication number
HUT77171A
HUT77171A HU9701862A HU9701862A HUT77171A HU T77171 A HUT77171 A HU T77171A HU 9701862 A HU9701862 A HU 9701862A HU 9701862 A HU9701862 A HU 9701862A HU T77171 A HUT77171 A HU T77171A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
composition
lipopolamine
nucleic acid
formula
compound
Prior art date
Application number
HU9701862A
Other languages
English (en)
Inventor
Gerardo Byk
Catherine Dubertret
Daniel Scherman
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S.A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Publication of HUT77171A publication Critical patent/HUT77171A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/02—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C07C233/04—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C233/05—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C235/06—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

A találmány tárgya a lipopoliaminok családjába tartozó új vegyületek, az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint a vegyületek felhasználása nukleinsavak in vivő és/vagy in vitro transzfektálására.
Sok olyan genetikai betegség van, amely hibás és/vagy abnormális expresszióval, vagyis egy vagy több nukleinsav hiányos vagy túlzott mértékű expresszálásával kapcsolatos. A génterápia fő célja az ilyen genetikai abnormalitások korrigálása klónozott gének in vivő vagy in vitro sejtexpressziója útján.
Sokféle módszert ajánlanak az ilyen genetikai információ intracelluláris kifejezésére. Közülük az egyik kémiai és biokémiai vektorokat alkalmaz. A szintetikus vektorok két fő funkciója a transzfektálandó DNS komplementációja valamint a sejtben való rögzítésének, és ezáltal a sejtmembránon és adott esetben a két maghártyán való átjutásának elősegítése.
Ebben a transzfektálási módszerben lényeges előrelépést jelentett egy kationos lipid alkalmazásán alapuló tecnológia kidolgozása. Ennek révén bebizonyosodott, hogy egy pozitív töltésű lipid kation, az N-[ 2,3-di(oleil-oxi)-propil] -N,N,N-trimetil-ammónium-klorid (DOTMA) liposzómák, vagyis apró hólyagocskák alakjában spontán reakcióba lép a negatív töltésű DNS-sel, ily módon lipid-DNS komplex képződik, amely a sejtmembránokkal fuzionálni képes, és így lehetővé teszi a DNS sejten belüli expresszióját. Ez a molekula transzfekció szempontjából hatásos, azonban hátránya, hogy biológiai úton nem bontható le, és a sejtekre mérgező.
A DOTMA után ezen szerkezeti modell alapján - amelyben a lipofil csoport egy térkitöltő (spacer) szakasz révén kap3 csolódik egy aminocsoporthoz - más lipid kationokat is kidolgoztak. Ezek között vannak olyanok, amelyek lipofil csoportként két zsírsavat vagy egy koleszterin-származékot, és ezen kívül adott esetben aminocsoportként egy kvaterner ammónium-csoportot tartalmaznak. Az ilyen lipid kationok reprezentatív példáiként említhetjük a DOTAP-ot, a BOBT-t vagy a ChOBT-t. Más vegyületek, például a DOSC és a ChOSC azzal jellemezhetők, hogy a kvaterner ammóniumcsoport helyett egy kolincsoportot tartalmaznak. Általában azonban ezeknek a vegyületeknek elég gyenge a transzfekciós aktivitása.
Ugyancsak leírták már a kationos lipidek egy másik fajtáját, a lipopoliaminokat. Az ilyen vegyületekben a kationos csoportot az L-5-karboxi-spermin képezi, amely négy aminocsoportot tartalmaz, közülük kettő primer, kettő szekunder. Ilyen például a DOGS és a DPPES. Ezek a lipopoliaminok különösen hatásosak a primer endokrin sejtek transzfektálásában.
Egy ideális szintetikus transzfekciós ágens magas szintű transzfekciót nyújt, az alkalmazott dózisokban a sejtek széles körére nézve egyáltalán nem vagy csak nagyon kevéssé mérgező, és biológiai úton lebontható, hogy a kezelt sejtekre semmiféle másodlagos hatást ne fejtsen ki.
A találmány tárgyát közelebbről olyan új vegyületek képezik, amelyek sejtek in vivő és in vitro transzfektálására, nevezetesen a nukleinsavak vektorizálására alkalmazhatók.
A találmány elsődleges tárgyát (I) általános képletű, D, L vagy LD formájú lipopoliaminok képezik, amely képletben m értéke egy 2 és 6 közötti egész szám;
• · n értéke egy 1 és 9 közötti, előnyösen 1 és 5 közötti egész szám - az általános képletben csak egy olyan R csoport van, amelynek jelentése hidrogénatomtól eltérő, és m értéke a különböző -(CH)m- és -(CH2)m- csoportokban I
R azonos vagy különböző;
R jelentése hidrogénatom vagy egy (II) általános képletű csoport, amelyben
X és X' jelentése egymástól függetlenül oxigénatom, -(CH2)qáltalános képletű csoport - amelyben q értéke 0, 1, 2 vagy 3 -, vagy -NH- képletű vagy -NR'- általános képletű aminocsoport, amelyben R' jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport;
Y és Y’ jelentése egymástól függetlenül metilén-, karbonilvagy tiokarbonil-csoport;
R3, R4 és R5 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos, szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkilcsoport, és p értéke 0 és 5 között változhat;
Rg jelentése egy koleszterin-származék vagy egy -NR1R2 általános képletű alkil-aminocsoport, amelyben R^ és R2 jelentése egymástól függetlenül egy 12-22 szénatomos, telített vagy telítetlen, egyenes vagy elágazó láncú alifás csoport.
Különösen előnyösek azok a vegyületek, amelyek képletében R jelentése (II') általános képletű csoport, amelyben R3, R4, R5, Rg,és p jelentése a fenti, és X jelentése oxigénatom vagy egy • · • · ····· · ·««. ««··· ·· ··«· ··· · · ·
-(CH2)q- általános képletű csoport, amelyben q értéke 0.
A vegyületeknek ezt a családját egy belső észterkötés jelenléte jellemzi, ami a biológiai lebonthatóság szempontjából fontos.
A találmány szerinti előnyös lipopoliaminok közé tartozik a (III), (IV), (V) és (VI) képletű vegyület D, L vagy DL alakban, valamint ezek sói.
A találmány további tárgyát képezi a találmány szerinti lipopoliaminok bármiféle terápiás felhasználása, akár közvetlenül, akár gyógyszerkészítményekben.
Mint mondottuk, az (I) általános képletű vegyületek különösen jól használhatók nukleinsavak in vivő és in vitro transzfektálására. Hatásosan komplementálják a DNS-t, és a kezelt sejtekkel szemben toxicitásuk nagyon csekély vagy nulla. Ezenkívül észterkötésük hidrolízise útján biológiailag lebonthatók.
A találmány szerinti vegyületek maximális hatásának eléréséhez az (I) általános képletű vegyület és a nukleinsav arányát előnyösen úgy határozzuk meg, hogy az R arány, vagyis a szóbanforgó lipopoliamin pozitív töltéseinek a nukleinsav negatív töltéseihez viszonyított aránya optimális legyen. Ez az arány erősen függ a felhasználási módtól - tehát hogy in vivő vagy in vitro alkalmazzuk - és a transzfektálandó sejttípustól, ezért minden esetben külön kell optimalizálni. Az optimalizálás az átlagosan művelt szakember ismereteinek körébe tartozik.
A találmány szerinti vegyületekben a polinukleotid lehet dezoxiribonukleinsav vagy ribonukleinsav. Szekvenciája lehet eredeti természetes vagy mesterséges, éspedig DNS genom, cDNS, mRNS, tRNS, rRNS, hibrid szekvencia, szintetikus vagy félszintetikus szekvencia. Ezek a nukleinsavak lehetnek emberi, állati, növényi, bakteriális, virális vagy hasonló eredetűek. Bármilyen, az átlagosan művelt szakember előtt ismert úton megkaphatok, éspedig beszerezhetők bankokból, előállíthatok kémiai szintézissel vagy vegyes módszerekkel, tehát a bankból beszerzett szekvenciák kémiai vagy enzimatikus módosításával. Továbbá be lehetnek építve vektorokba, például plazmid vektorokba.
A dezoxiribonukleinsavak lehetnek egy- vagy kétszálasak. Ezek a dezoxiribonukleinsavak hordozhatnak terápiás géneket, a transzkripciót vagy replikációt szabályozó szekvenciákat, adott esetben modifikált antiszensz szekvenciákat, az egyéb sejtkomponensekhez kötő régiókat és hasonló elemeket.
A találmány szempontjából terápiás génnek tekintünk minden olyan gént, amely valamilyen terápiás hatású fehérje-típusú anyagot kódol. Az így kódolt fehérje-típusú anyagok lehetnek fehérjék, peptidek és hasonló vegyületek. Ezek a fehérje-típusú anyagok lehetnek a cél-sejttel homológok, vagyis olyan vegyületek, amelyeket a célsejt normális, betegségtől mentes állapotában expresszál. Ebben az esetben a fehérje expresszálása lehetővé teheti például a sejt valamilyen nem kielégítő expreszsziójának enyhítését, egy inaktív vagy kevéssé aktív fehérje expresszálását valamilyen modifikáció céljából, vagy a szóban forgó fehérje expressziójának fokozását. Továbbá a terápiás gén kódolhatja egy sejtfehérjének valamilyen megnövelt stabilitású vagy megváltozott aktivitású mutánsát. A fehérje-típusú anyag a célsejttel szemben heterológ is lehet. Ez esetben az expresszált • · • · · · ·· fehérje kiegészíthet vagy létrehozhat egy meghatározott aktivitást a sejtben, amely lehetővé teszi a sejt számára, hogy valamilyen betegséggel szemben fellépjen, vagy egy immunválaszt stimuláljon .
A találmány szerinti terápiás anyagok közé tartoznak például az enzimek, vérből származó anyagok, hormonok, limfokinok mint az interleukinok, interferonok, TNF és hasonló anyagok, amelyeknek ismertetése megtalálható például az FR 9203120 számú francia szabadalmi leírásban -, felismerési faktorok, neurotranszmitterek vagy prekurzoraik vagy a szintézisükhöz szükséges enzimek, trofikus (táplálkozási) faktorok - mint a BDNF, CNTF,
NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofin és hasonlók -, a disztrofin vagy egy minidisztrofin, amit az FR 9111947 számú francia szabadalmi leírás ismertet, a mukoviszcidózzal összekapcsolt CFTR fehérje, a daganatszuppresszor gének - mint p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev és hasonlók, amelyeknek ismertetése megtalálható például az FR 9304745 számú francia szabadalmi leírásban a koagulációban szerepet játszó VII, VIII és IX faktorokat kódoló gének, a DNS javításában résztvevő gének, az öngyilkos gének (timidin-kináz, citozin-dezamináz), a hemoglobin -gének vagy más néven fehérjetranszportáló gének, az apolipoprotein típusú (lipoproteinből származó) A-I, A-II, A-IV, B,
C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J és apó(a) lipidek metabolizálásában résztvevő fehérjéknek megfelelő gének, az anyagcsere enzimei, például a lipoprotein lipáz, a lipáz májenzim, a lecitin-koleszterin-aciltranszferáz, a 7-a-koleszterin-hidroxiláz, a savas foszfatidil foszfatáz, továbbá lipidtranszfer-fehérjék 8 például a koleszterin-észtereket transzferáló és a foszfo-lipideket transzferáló fehérje egy HDL-kötő fehérje, egy receptor, például LDL-receptorok, chylomicron-maradék receptorok, scavenger (gyökfogó) receptorok és hasonlók.
A terápiás nukleinsav lehet továbbá egy gén vagy egy antiszensz szekvencia, amelynek a célsejten belüli expressziója lehetővé teszi a génexpresszió szabályozását vagy a celluláris mRNS transzkripcióját. Például az ilyen szekvenciák a célsejtben az EP 140308 számú európai szabadalmi leírásban ismertett módon átírhatók a celluláris mRNS-sel komplementer RNS-sé, és így a fehérjévé történő lefordításuk blokkolható. Terápiás gének továbbá a riboszómákat kódoló szekvenciák, amelyek az EP 321201 számú európai szabadalmi leírás szerint szelektíve képesek roncsolni a megcélzott RNS-eket.
Mint mondottuk, a nukleinsav hordozhat egy vagy több gént, amelyek egy - embernél vagy állatnál immunválaszt generáló antigén peptidet kódolnak. Tehát ebben a megvalósítási módban a találmány lehetővé teszi vakcinák készítését, vagy azt, hogy embernél vagy állatoknál mikroorganizmusokkal, vírusokkal vagy rákkal szembeni immunterápiás kezeléseket hajtsunk végre. E célból szóba jöhetnek az Epstein Barr vírusra, a HÍV vírusra, a hepatitis B vírusra (EP 185573), az álveszettség vírusára, a Syncitia forming vírus-ra továbbá más vírusokra vagy tumorokra (EP 259212) nézve specifikus antigén peptidek.
A nukleinsav előnyösen olyan szekvenciákat is tartalmaz, amelyek a kívánt sejtben vagy szervezetben terápiás gének és/vagy antigén peptideket kódoló gének expresszióját teszik le9 hetővé. Ezek lehetnek olyan szekvenciák, amelyek a természetben az adott gén kódolásáért felelősek, ha feltételezhető, hogy ezek a szekvenciák a fertőzött sejtben működőképesek lesznek. De másféle eredetű (más fehérjék kódolásáért felelős vagy akár szintetikus) szekvenciák is szóba jöhetnek. Lehetnek ezek eukarióta vagy virális gének promoter szekvenciái, például a megfertőzendő sejt genomjából származó promoter szekvenciák. Ugyanakkor lehetnek egy vírus genomjából származó promoter szekvenciák is. E tekintetben megemlíthetjük az E1A, MLP, CMV, RSV gének promotereit. Ezen kívül ezek az expressziós szekvenciák aktiváló, szabályozó és hasonló szekvenciák hozzáadásával módosíthatók is. Végül a szóban forgó szekvenciák lehetnek indukálható vagy represszálható promoterek.
A nukleinsavak a terápiás gén előtti szakaszon egy szignál szekvenciát is hordozhatnak, amely a szintetizált terápiás anyagot a célsejt kiválasztási útvonalaira irányítja. Ez lehet a terápiás anyag természetes szignál szekvenciája, de lehet egészen más funkcionális szignál szekvencia vagy akár egy mesterséges szignál szekvencia is. A nukleinsav egy olyan szignál szekvenciát is hordozhat, amely a szintetizált terápiás anyagot a sejtnek egy meghatározott részébe vezérli.
A találmány további tárgyát képezik olyan készítmények, amelyek egy nukleinsavat, valamilyen - például a találmány szerinti - lipopoliamint és egy olyan adalékanyagot tartalmaznak, amely a sejtmag lipopoliamin/nukleinsav-komplexéhez kötődik, és ezáltal a transzfektáló képességet fokozza. Ténylegesen kimutattuk, hogy a lipopoliaminok transzfektáló képessége váratlan mér···· tékben megnövekszik bizonyos adalékanyagok - például lipidek vagy fehérjék - jelenlétében, amelyek a sejtmag lipopoliamin/nukleinsav-komplexéhez kötődni képesek.
A találmány szerinti készítmények adalékanyagként előnyösen egy vagy több neutrális lipidet tartalmaznak. Ezek a készítmények különösen előnyösek akkor, ha az R arány kicsi. Ténylegesen kimutattuk, hogy egy neutrális lipid hozzáadása fokozza a nukleolipid részecskék képződését, és meglepő módon a sejtmembrán destabilizálása révén elősegíti a részecskék behatolását a sejtbe .
A találmány szerinti eljárásban még előnyösebben 2 zsírsavláncot tartalmazó lipideket alkalmazunk.
Különösen előnyös, ha természetes vagy szintetikus ikererionos vagy iontöltés nélküli lipideket alkalmazunk fiziológiás körülmények között. Ezeket még előnyösebben a dioleoil-foszfatidil-etanol-amin (DOPE), az oleoil-palmitoil-foszfatidil-etanol-amin (POPÉ), a disztearoil-, -palmitoil- vagy -mirisztoil-foszfatidil-etanol-amin vagy ezek egy-háromszorosan N-metilezett származékai; a foszfatidil-glicerinek, a diacil-glicerinek, a glükozil-diacil-glicerinek, a cerebrozidok (például galakto-cerebrozidok), a szfingolipidek (például a szfingomielinek) vagy az asialogan-glikozidok (például az asialoGMl és GM2) közül választjuk.
Ezen különböző lipideket hagyományos, az átlagosan művelt szakember számára ismert módszerekkel előállíthatjuk szintetikus úton, vagy extrakcióval kinyerhetjük szervekből (például az agyból) vagy tojásokból. A természetes lipidek extrahálását végez44
444444 · 44 ·· ···· · · • · · 444 4 4 • 4 4 · · · 4 4 · ·· 4444 444 · ·· hetjük szerves oldószerekkel, amint azt például Lehninger [ Biochemistry] leírja.
A találmány szerinti készítmények egy ekvivalensnyi (I) általános képletű vegyületre számítva előnyösen 0,1 - 20, még előnyösebben 1-5 ekvivalens adalékanyagot tartalmaznak.
A beadás szempontjából formulálhatunk lokális, bőrbe beadandó, orális, rektális, vaginális, parenterális, intravénás, intramuszkuláris, szubkután, intraokuláris vagy transzdermális találmány szerinti készítményeket. A találmány szerinti injektálható, nevezetesen a közvetlenül a kívánt szervbe beadható és a helyileg (a bőrön és/vagy nyálkahártyán) alkalmazható gyógyszerkészítmények előnyösen tartalmaznak egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot. Ezek a készítmények lehetnek steril, izotóniás oldatok vagy száraz, liofilizált készítmények, amelyekből az esettől függően steril víz vagy fiziológiás szérum hozzáadásával injektálható oldatokat készíthetünk. Az injekció céljára használandó nukleinsav-dózist valamint a beadások számát különböző tényezők - mint az alkalmazott beadási mód, a szóban forgó betegség, az expresszálandó gén, illetve a kezelés alkalmazásának időtartama - függvényében kell meghatározni. Ami a beadást illeti, az történhet közvetlenül a szövetekbe, vagy oly módon, hogy a sejteket tenyészetben kezeljük, majd injekció vagy beültetés révén visszajuttatjuk az élő szervezetbe.
A találmány további tárgya egy különösen előnyös módszer betegségek kezelésére. Ez abból áll, hogy a fenti körülmények között in vivő vagy in vitro beadunk egy, a betegség gyógyítására alkalmas nukleinsavat egy találmány szerinti (I) általános • · ·· «« « 4 * ·· ······ ·· « · · ··· · · ··· · · · · · • · ···· · « · « «· képletű vegyülettel együtt. Ez a módszer közelebbről fehérjevagy nukleinsav-típusú anyag hiányából eredő betegségeknél alkalmazható, és a beadott nukleinsav ezt a fehérje-típusú anyagot kódolja vagy a szóban forgó nukleinsavat tartalmazza.
A találmány oltalmi köre a találmány szerinti lipopoliaminoknak minden olyan alkalmazására kiterjed, amelynek célja sejtek in vivő vagy in vitro transzfektálása.
Az alábbi példák a találmány részletes ismertetésére szolgálnak, annak oltalmi körét nem korlátozzák.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
A. A felhasznált anyagok
A diaoktadecil-amint (DODA), a trietil-amint, az L-ornitint, a tetrametil-ammónium-hidroxidot, a Raney-nikkelt és a diglikolanhidridet a Fluka; a benzotriazol-l-oxi-trisz(dimetil-amino)-foszfónium-hexafluoro-foszfátot (BOP) a Propeptid Francé: a 4-(dimetil-amino)-piridint (DMAP), az izobutil-klór-formiátot és az N-metil-morfolint az Aldrich cégtől szereztük be. A tetrahidrofurán a Merck, minden más felhasznált oldószer az RP Prolabo terméke. Nátrium-kloridból és vizes nátrium-hidrogén-karbonátból telített, kálium-hidrogén-szulfátból pedig
0,5 M oldatot használtunk.
B. Fizikai mérések
A protonmágneses rezonancia-spektrumot (iHNMR) Bruker spektrométerrel vettük fel.
C. Szilikagél-kromatográfia
A vékonyréteg-kromatográfiát 0,2 mm vastagságú Merck szili• · • · kagél lemezeken hajtottuk végre.
Előhívási módok:
- ultraibolya (UV) fénnyel (254 nm)
- ninhidrinnel oly módon, hogy 100 ml etanolban 40 mg ninhidrint tartalmazó oldattal a lemezt enyhén bepermetezzük, így 150°C-ra felmelegítve az aminok illetve amidok előhívódnak;
- fluoreszkaminos módszer: a primer aminok előhívására a lemezt 100 ml acetaonban 40 mg anyagot tartalmazó oldattal bepermetezzük;
- jódos módszer: a lemezt por alakú jód gőzeibe helyezzük.
A szilikagél-oszlopkromatográfiát Merck szilikagél 60-on hajtottuk végre, amelynek részecskemérete 0,063 és 0,200 mm közé esik.
1. Példa
2,5-bisz[(3-Amino-propil)-amino]-pentil-(dioktadecil-karbamoil-metoxi)-acetát [(III) képletű vegyület] előállítása
l.a) (Tetrametil-ammónium)-2,5-bisz[(2-ciano-etil)-amino]-pentanoát (l.a vegyület) előállítása ξ>,Ί$ g (80 mmol) 2,5-diamino-pentánsavat (L-ornitin) és 14,48 g (80 mmol) (tetrametil-ammónium)-hidroxid-penthidrátot 20 ml metanolban oldunk. A képződött vizet és a metanolt olaj szivattyúval létesített csökkentett nyomáson száraz maradékig elpárologtatjuk .
Az így kapott sóhoz 30 ml dimetil-formamidot adunk. A reakcióelegyet nitrogénnel gáztalanítjuk, azután 10 percig erőteljesen keverjük, ezáltal a 2,5-diamino-pentanoát feloldódik (a ·*·»· « + , »· » · «·«· · · • · «··«· · • · · ·«·«· ·· ·«<· ·t · » ·» tetrametil-ammónium-klorid szuszpenzióban marad a dimetil-formamidban) .
A reakcióelegyhez cseppenként hozzáadunk 6 ml (85,6 mól) acetonitrilt, 1 órán át szobahőmérsékleten, nitrogén atmoszférában állni hagyjuk, majd a tetrametil-ammónium-klorid eltávolítására leszűrjük, és a dimetil-formamidot csökkentett nyomáson elpárologtatjuk. Az így kapott olajszerű folyadék a rotációs bepárlóból kiöntve megszilárdul. 100 ml acetonitrilt adunk hozzá, és az oldat kitisztulásáig enyhén melegítjük, majd addig adunk hozzá tetrahidrofuránt, míg zavarossá nem válik. A lombikot 2 napig fagyasztószekrényben tároljuk, majd szűréssel kinyerjük a 2,5-bisz[ (2-ciano-etil)-amino]-pentanoát (tetrametil-ammónium)-sóját fehér szilárd anyag alakjában. Ezt zsugorított üvegszűrőn tetrahidrofuránnal leöblítjük, majd foszfor-pentoxid felett szárítjuk. Ily módon 6,06 g anyagot kapunk, ami 49 %-os (nyers) kihozatalnak felel meg.
1. b) (Tetrametil-ammónium) -2,5-bisz [ (3-amino-propil) -amino] -pentanoát (l.b vegyület) előállítása
Az l.a vegyületet 18 ml etanol, 2 ml víz és 5 ml 2M kálium-hidroxid elegyében oldjuk. Az oldatot argon átbuborékoltatásával tisztítjuk, és hozzáadunk 2 ml Fluka Raney-nikkel-szuszpenziót. A hidrogénezést nitrogénnel átfúvatott autoklávban, 26°C-on végezzük. A nyomás 3 óra alatt 50,6 bar-ról 44,7 bar-ra csökken, majd több mint egy órán át stabil marad. Az autokláv 250 ml-es, a reakcióelegy 30 ml. A kapott szuszpenziót leszűrjük, vízzel leöblítjük, és rotációs bepárlóban bepároljuk, így egy sárga olajat kapunk. A fluoreszkaminos vizsgálat eredménye pozitív.
» J * w • · · »» · · 4·
l.c) 2,5-bisz{(terc-Butoxi-karbonil)-3-[(terc-butoxi-karbonil)-amino]-propil-amino}-pentánsav (1.c vegyület) előállítása
Az l.b vegyületet 30 ml dioxánban oldjuk, cseppenként hozzáadunk 17,46 g (80 mmol) di (terc-butil)-dikarbonátot, és a reakcióelegyet egy éjszakán át keverjük. Ezután kálium-hidrogén-szulfátot adunk hozzá, és háromszor 100 ml kloroformmal extraháljuk. A szerves fázist 7,5 pH-jú nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, és csökkentett nyomáson bepároljuk. Ily módon 10 g anyagot kapunk; az ornitinre számított kihozatal 39 %.
Nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC): acetonitril/víz: 0-3 perc 50 % acetonitril; 3-20 perc 50-100 % acetonitril; 20-40 perc 100 % acetonitril; K’= 7,96 (Rp-18 oszlop, sebesség = 1 ml/perc).
Vékonyréteg-kromatográfia (TLC): Rf (kloroform és etil-acetát 95:5 térfogatarányú elegyében) = 0,28.
NMR (ppm) : 1,3 (m, 8H, N+CH2-CH2-CH2-CHN+COO / 2x N+CH2CH2CH2-CHN+) ; 2,7-3,0 (m, 10H 5x N+CH2); 3,8 (t, 1H, N+CHCOO).
MS: MH+ = 647, (M = 646).
l.d) 2,5-bisz[(terc-Butoxi-karbonil)-{3-[(terc-butoxi-karbonil)-amino]-propil}-amino]-pentanol (l.d vegyület) előállítása
1,94 g (3 mmol) L-5-karboxi-tetra-(terc-butoxi-karbonil)-spermint 30 ml tetrahidrofuránban oldunk, és mikropipettából hozzáadunk 370 μΐ (3,1 mmol) N-metil-morfolint. A reakcióelegyet nitrogén atmoszférában, szénsavhó és etilénglikol keverékéből (,·«· • V w 4· * *
b. * * ·β» « » • · · ··«<>« ·· ···· ]»| tv álló fürdőben -15°C-ra hűtjük, és hozzáadunk 390 μΐ (3,1 mmol) izobutil-klór-formiátot. 3 perc elteltével a reakcióelegyet főzőpohárba öntjük, amely 2 g nátrium-[ tetrahidro-borát] -ot tartalmaz 20 ml 4°C-os vízben oldva. Ezután pH = 7 eléréséig kálium-hidrogén-szulfátot adunk hozzá. A terméket etil-acetáttal extraháljuk, nátrium-hidrogén-karbonát-, majd nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, leszűrjük, és bepároljuk. Ily módon 1,15 g anyagot kapunk, ami 61 %-os kihozatalnak felel meg.
A vékonyréteg-kromatográfiát (TLC) két lépésben hajtjuk végre: ugyanazon eluenssel szilikagél oszlopon is végzünk elválasztást, így 0,97 g vegyületet kapunk sárga olaj alakjában. Az elválasztás kihozatala 84 %.
A redukció kihozatala 51 %.
TLC: Rf (petroléter és etil-acetát 1:1 térfogatarányú elegyében) =0,24.
NMR (ppm): 1,42 (s, 4xBoc); 1,5-1,7 (m, 8H, N+CH2-CH2-CH2-CHN /
2x N+CH2CH2CH2CH2N) ; 2,85-3,2 (m, 10H 5x NCH2); 3,4 (m, 1H,
NCH-CH2OH); 3,7 (d, 2H, CH2OH); 6,8 (m, 2H: NH) .
MS: MH+ = 633, M = 632.
l.e) 2,5-bisz{3-[(terc-Butoxi-karbonil)-amino]-propil}-[(terc-butoxi-karbonil)-amino] -pentil-oxi-karbonil-metoxi-ecetsav (l.e vegyület) előállítása
0,51 g (0,806 mmol) l.d vegyületet metilén-dikloridban oldunk, és hozzáadunk 2 ekvivalens (0,178 g, 1,535 mmol) diglikolanhidridet, 2,2 ekvivalens (235 μ1,687 mmol) trietil-amint és 5 mg 4-(dimetil-amino)-piridint. Egy óra múlva a TLC azt mutat• · ja, hogy az alkohol a reakcióban elfogyott; ekkor a reakcielegyhez metilén-dikloridot adunk, háromszor 50 ml kálium-hídrogén-szulfát-oldattal, majd háromszor 50 ml nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, leszűrjük, azután bepároljuk. Ily módon 0,26 g szilárd anyagot kapunk, ami 43 %-os kihozatalnak felel meg.
TLC: Rf (kloroform, metanol és ecetsav 90:8:2 térfogatarányú elegyében) = 0,75.
MS: MH+ = 749, M = 748.
1.f) 2,5-bisz[(terc-Butoxi-karbonil)-{3-[(terc-butoxi-karbonil) -amino] -propil}-amino] -pentil-(dioktadecil-karbamoil-metoxi)-acetát (l.f vegyület) előállítása
A fenti vegyületből 0,123 g-ot (0,164 mmol), továbbá 1 ekvivalens (0,0856 g) dioktadecil-amint, 3 ekvivalens (68,4 ml) trietil-amint és 1,1 ekvivalens (0,0798 g) benztriazol-l-oxi-trisz(dimetil-amino)-foszfónium-hexafluoro-foszfátot (BOP) kloroformban oldunk, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük. Két óra múlva hozzáadunk 100 ml metilén-dikloridot, azután háromszor 100 ml kálium-hidrogén-szulfát-oldattal, nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és pH = 7-es nátrium-klorid-oldattal mossuk, szárítjuk, leszűrjük, majd bepároljuk. Ily módon 0,13 g szilárd anyagot kapunk, ami 63 %-os kihozatalnak felel meg.
TLC: Rf (petroléter és etil-acetát 1:1 térfogatarányú elegyében) = 0,62; előhívás: jóddal, ninhidrinnel és fluoreszkaminnal.
NMR (ppm): 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 6H; CH3) ; 1,20-1,75 (m, 108H:
CH2/C(CH3)3); 3,05-3,35 (m, 14H: CH2N); 4,15-4,35 (m, 3H:
NCHCH2OCO); 4,23-4,27 (2s, 2x 2H: OCH2CO); 4,5-5,5 (elnyúlt m, • · • · ·
2Η, NH).
MS: MH+ = 1252, M = 1251.
Az elemanalízis eredményei a C7XH137N5O12 összegképletre:
C % H % N %
számított 68,06 11,02 5,59
mért 67,14 11, 93 5,86
1. g) 2,5-bisz[ (3-Amino-propil) -amino] -pentil- (dioktadecil-karbamoil-metoxi)-acetát [(III) képletű vegyület] előállítása
1.5 ml-es Eppendorf® kémcsőben 0,025 g (0,02 mmol) l.f vegyülethez 1 ml trifluor-ecetsavat adunk, és 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a trifluor-ecetsavat elpárologtatjuk.
500 μΐ etanol hozzáadásával megkapjuk a biológiai vizsgálatokhoz szükséges 40 mM oldatot.
MS: MH+ = 852, M = 851.
2. Példa
1,3-bisz[(3-Amino-propil)-amino]-2-propil-(dioktadecil-karbamoil-metoxi)-acetát [(IV) képletű vegyület] előállítása
2.a) 1,3-bisz[ (2-Ciano-etil)-amino]-2-propanol (2.a vegyület) előállítása
3.6 g (40 mmol) 1,3-diamino-2-propanolt 75 ml metanolban oldunk, és 15 perc alatt hozzáadunk 5,76 ml (80 mmol) acetonitrilt. A fluoreszkaminos vizsgálat eredménye pozitív.
2.b) 1,3-bisz[ (3-Amino-propil) -amino]-2-propanol (2.b vegyület) előállítása • · • · · · · · • · ···· · · • · «·«·« · ··· ····· ··' ···· «·· · ·· 19
A hidrogénezést nitrogénnel átfúvatott autoklávban, 27°C-on végezzük.
A 2.a vegyületet 15 ml metanol, 10 ml etanol és 5 ml 2M kálium-hidroxid-oldat elegyében oldjuk. Az oldatot argonnal tisztítjuk, és az autoklávban hozzáadunk 4 ml-t a Raney-nikkel-szuszpenzióból.
A nyomás 3,5 óra alatt 51,6 bar-ról 37,6 bar-ra csökken, majd több mint egy órán át stabil marad. Az autokláv 250 ml-es, a reakcióelegy 30 ml. A kapott szuszpenziót leszűrjük, vízzel leöblítjük, és rotációs bepárlóba töltjük át. Ily módon egy sárga olajat kapunk. A fluoreszkaminos vizsgálat eredménye pozitív.
2. c) 1,3-bisz[3-[(terc-Butoxi-karbonil)-amino]-2-{[ (terc-butoxi-karbonil) -amino] -propil} ]2-propanol (2. c vegyület) előállítása
A 2.b vegyületet az l.c vegyületnél leírt módon védőcsoporttal látjuk el. 100 ml metilén-dikloridot adunk hozzá, majd cseppenként hozzáadunk 100 ml dioxánban oldott 39,2 g (179 mmol) di(terc-butil)-dikarbonátot, és az így kapott oldatot 72 órán át keverjük. Ezután az oldószert elpárologtatjuk, és kálium-hidrogén-szulfátot adunk hozzá. A terméket háromszor 100 ml etil-acetáttal extraháljuk, a szerves fázisokat egyesítjük, kálium-hidrogén-szulfát-, nátrium-hidrogén-karbonát-, majd nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, és bepároljuk. Ily módon 20 g anyagot kapunk; a kiindulási vegyületre számított kihozatal 83 %.
A vegyületet petroléterből átkristályosítjuk.
TLC: Rf (petroléter és etil-acetát 1:1 térfogatarányú elegyében) •··· ·· · ·· · · ·· ···· · · • · «·«·· · ··· «···· • · ···· ··· · ·· = 0,23.
Rf (petroléter és etil-acetát 1:2 térfogatarányú elegyében) = 0,63.
NMR (ppm): 1,4 (m, 36H, 4x (CH3)3); 1,65 (qt, 4H: 2x NCH2CH2CH2NH); 2,95 (q, 4H: 2x NHCH2CH2); 3,1 (2d, 4H: NCH2CHCH2N); 3,2 (t, 4H: NCH2CH2); 3,85 (m, 1H: OH); 5,9 (s, 2H: NH) .
MS: MH+ = 605, M = 604.
2.d) 1,3-bisz[3-[ (terc-Butoxi-karbonil)-amino]-2-{[(terc-butoxi-karbonil) -amino] -propil]] -2-propil- (etoxi-karbonil)-metoxi-ecetsav (2.d vegyület) előállítása
604 mg (1 mmol) 2.c vegyületet 20 ml metilén-dikloridban oldunk, és 2 ekvivalens (0,232 g, 2 mmol) anhidridet, 2,2 ekvivalens (307 μΐ, majd 100 μΐ) trietil-amint és 6,5 g 4-(dimetil-amino-piridint adunk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át keverjük, azután metilén-dikloridot adunk hozzá, kálium-hidrogén-szulfát-, majd nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, leszűrjük, és bepároljuk. Ily módon 0,156 g anyagot kapunk; kihozatal: 22 %.
TLC: Rf (kloroform, metanol és ecetsav 90:8:2 térfogatarányú elegyében) = 0,71.
NMR (ppm): 1,2-1,4 (m, 36H, 4x (CH3)3); 1,5 (m, 4H: 2x NHCH2CH2-CH2N); 2,85 (q, 4H: 2x NHCH2CH2); 3,1 (m, 8H: 4x NCH2) ; 3,9-4,2 (2s,
4H: 2x OCH2COO); 5,25 (m, 1H: CH2CHCH2); 6,7 (2H: NH).
MS: MH+ = 721, M = 720.
2.e) l,3-bisz{3-[(terc-Butoxi-karbonil)-amino]-2-[ (terc-butoxi-karbonil)-amino]-propil] -propil}- (dioktadecil-karbamoil-metoxi)-acetát (2.e vegyület) előállítása
A 2.d savból 0,216 mmol-t 3 ml kloroformban oldunk, és 1 ekvivalens (0,113 g) dioktadecil-amint, 3 ekvivalens (100 μΐ) trietil-amint és 1,1 ekvivalens (0,11 g) BOP-t adunk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át keverjük, majd a kloroformot elpárologtatjuk, és 100 ml etil-acetátot adunk hozzá. A szerves fázist 0,5M sósav-oldattal, nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd pH = 7 eléréséig nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, és bepároljuk. Ily módon 0,185 g anyagot kapunk; kihozatal: 70 %. Szilikagél-oszlopon végzett tisztítással 110 mg terméket kapunk (kihozatal: 42 %) .
TLC: Rf (kloroform, metanol és ecetsav 90:8:2 térfogatarányú elegyében) = 0,81;
Rf (petroléter és etil-acetát 1:1 térfogatarányú elegyében) = 0,67.
NMR (ppm) : 0,85 (t, 6H: 2x (CH3) ; 1,20-1,55 (m, 100H, CH2/C(CH3)3); 1,6 (m, 4H: 2x NH-CH2CH2CH2N); 3,05-3,4 (m, 16H:
2x NH-CH2CH2CH2N / N-CH2CH2CH2N / 2x -CH2N); 4,1 (s, 2H:
NCOCH2O); 4,15 (s, 2H: OCH2COO) ; 5,25 (m, 1H: CH2CHCH2) ; 6,15 (2H: NH).
MS: MH+ = 1224, M = 1223.
2.f) l,3-bisz[ (3-Amino-propil) -amino]-2-propil- (dioktadecil-karbamoil-metoxi)-acetát [(IV) képletű vegyület] előállítása
1,5 ml-es Eppendorf® kémcsőben 0,0247 g (0,021 mmol) 2.e vegyülethez 1 ml trifluor-ecetsavat adunk, és 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a trifluor-ecetsavat elpárologtatjuk.
• ··
505 μΐ etanol hozzáadásával megkapjuk a biológiai vizsgálatokhoz szükséges 40 mM oldatot.
MS: MH+ = 824, M = 823.
3. Példa
2-[3- (Amino-propil) -amino] -1-[3- (amino-propil) -metil] -etil- (Ν,Ν-diokatadecil)-szukcinamát [ (V) képletű vegyület] előállítása
Ezt a vegyületet a 2. példában leírtak szerint állítjuk élőn oly módon, hogy a diglikolsavat borostyánkősavval helyettesítjük .
Az így kapott vegyület tömegspektrometriás elemzése egy MH+ = 808-as fragmentumot mutat, ami a számított molekulatömegnek megfelel.
Az alábbiakban ismertetjük a találmány szerinti lipopoliaminok felhasználását genetikai anyagok in vitro transzfektálására.
A. A gének in vitro transzfektálására használt plazmidok
Erre a célra pCMV-LUC plazmidot használjuk. Ez olyan szerkezet, amely luciferázt expresszál, és a pGL2-Basic Vector-ból (Promega) vagy a pGL2-Control Vector-ból (Promega) kapható egy, a pcDNA3 (Invitrogen) plazmidból kinyert humán Cytomegalovirus (CMV) promoterét tartalmazó Mlul-Hind III fragmentum inszertálása révén.
B. A transzfektáláshoz használt oldatok készítése
A példák alapján előállított találmány szerinti lipopolia• · ·· minőkből 40 mM etanolos oldatot készítünk, majd ezt etanol és víz elegyével úgy hígítjuk, hogy az etanol koncentrációja 10 %nál kisebb legyen.
A transzferálandó nukleinsav oldatát fiziológiás szérummal (0,15M nátrium-klorid-oldat) hígítjuk, majd 1:1 térfogatarányban hozzáadjuk a lipopoliamin oldatát. Az így kapott elegyet mágneses keverővei homogenizáljuk, 15 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk majd a DNS/lipopoliamin-oldatot 99 % végkoncentrációban elosztjuk a lyukakba, amelyekbe a sejteket a fehérjementes tápközeggel (szérum) belemostuk.
4. Példa
A terhelési arány (aminok/foszfátok) hatása a transzfekció hatékonyságára
10$ - exponenciális szaporodási fázisban lévő - NIH 3T3 sejtből álló mintákat egy 2 cm^-es felületen 37°C-on, 5 % szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában 4 órán át kezelünk változó terhelési arányokat képviselő lipopoliamin/pCMV-LUC-oldatokkal; mindegyik mintához 1 pg nukleinsavat adunk. A riportergén expressziójának vizsgálatát 8 % végkoncentrációjú borjú-magzati szérum hozzáadása és szén-dioxidos szárítókamrában 40 órán át végzett inkubálás után hajtjuk végre.
A luciferáz-aktivitást a luciferin, koenzim A és ATP (adenozin-5'-trifoszfát) jelenlétében 20 másodperc alatt [ RLU ] -bán (relatív fényegység) mért fénykibocsátás alapján határozzuk meg, és a sejtbontás után kapott felülúszóban jelenlévő fehérje egységnyi tömegére (pg) vonatkoztatva adjuk meg. Az eredmények az alábbi 1. táblázatban láthatók.
1. táblázat
Az 1. példa szerinti lipopoliamin A 2. példa szerinti lipopoliamin
terhelési arány fénykibo- csátás var. koeff. (%) fénykibo- csátás var. koeff. (%)
1 69 5 23 34
2 5091 3 252 6
4 3636 30 7890 3
6 21334 3 61401 5
8 40846 3 73224 2
10 55321 1 77633 2
12 53239 5 48634 5
14 36 10 52417 2
DNS önmagában 52 5
Mindegyik adat három, egymástól független mérés átlagértékét jelenti.
Ez a kísérlet világosan mutatja, hogy a találmány szerinti lipopoliaminok az expresszióhoz szükséges körülmények között lehetővé teszik a gének transzfektálását.
5. Példa
A DNS/lipopoliamin-keverékek nukleinsav-koncentrációjának hatása
Az NIH 3T3 sejteket az előbbi példa szerinti módon DNS/lipopoliamin-keverékekkel kezeljük, úgy, hogy azonos terhelési arányok mellett különböző DNS-koncentrációkat alkalmazunk.
A luciferáz-aktivitást itt 20 másodpercen át mérjük, és
2500 kezelt sejtre vonatkoztatva adjuk meg. Az eredmények az alábbi 2. és 3. táblázaton láthatók.
2. táblázat
Az 1. példa szerinti lipopoliamin:
Terhelési arány
DNS pg 4x 6x 8x lOx
0,25 27 (19) 25 (20) 32 (31) 36 (15)
0,5 23 (5) 37 (54) 4476 (4) 4811 (19)
1,0 4945 (12) 19194 (14) 30933 (21) 39357 (3)
2,0 93937 (2) 105533 (1) 111167 (14) 8315 (15)
3,0 106293 (11) 100093 (8) 53475 (12)
4,0 98533 (10) 68963 (8)
3. táblázat
A 2. példa szerinti lipopoliamin:
Terhelési arány
DNS pg 4x 6x 8x lOx
0,25 40 (17) 52 (64) 122 (14) 51 (5)
0,5 28 (10) 204 (25) 36533 (7) 44473 (7)
1,0 3427 (12) 48167 (13) 49363 (13) 50083 (9)
2,0 33377 (13) 44697 (18) 30670 (17) 9544 (4)
3,0 9686 (3) 31557 (2) 9157 (8)
4,0 4321 (9) 40105 (10)
Mindegyik adat három, egymástól független mérés átlagértékét jelenti.
A zárójelben meagadott számok a variációs koefficiens százalékos értékét jelentik.

Claims (22)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. D, L vagy DL formájú lipopoliamin vagy valamely sója, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képlettel írható le, amelyben m értéke egy 2 és 6 közötti egész szám;
    n értéke egy 1 és 9 közötti, előnyösen 1 és 5 közötti egész szám, azzal a feltétellel, hogy ha n értéke 2 és 9 közé esik, akkor az általános képletben csak egy olyan
    R csoport van, amelynek jelentése hidrogénatomtól eltérő, és m értéke a különböző -(CH)m- és -(CH2)m - csoI
    R portokban azonos vagy különböző;
    R jelentése hidrogénatom vagy egy (II) általános képletű csoport, amelyben
    X és X' jelentése egymástól függetlenül oxigénatom, -(CH2)qáltalános képletű csoport - amelyben q értéke 0, 1, 2 vagy 3 -, vagy -NH- képletű vagy -NR'- általános képletű aminocsoport, amelyben R' jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport;
    Y és Y' jelentése egymástól függetlenül metilén-, karbonilvagy tiokarbonil-csoport;
    R3, R4 és R5 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos, szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkilcsoport, és p értéke 0 és 5 között változ hat;
    Rg jelentése egy koleszterin-származék vagy egy -NR]_R2 álta• · lános képletű alkil-aminocsoport, amelyben és R2 jelentése egymástól függetlenül egy 12-22 szénatomos, telített vagy telítetlen, egyenes vagy elágazó láncú alifás csoport.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti lipopoliamin, amelynek képletében R jelentése egy (II') általános képletű csoport, amelyben R3, R4,R5,Rg és p jelentése az 1. igénypontban megadott, és X jelentése oxigénatom vagy egy -(CH2>q- általános képletű csoport, amelyben q értéke nulla.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti lipopoliamin, amely az (I) általános képletű vegyületek körébe tartozó (III) képletű vegyület D, L vagy DL formában vagy valamely sója alakjában.
  4. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti lipopoliamin, amely az (I) általános képletű vegyületek körébe tartozó (IV) képletű vegyület D, L vagy DL formában vagy valamely sója alakjában.
  5. 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti lipopoliamin, amely az (I) általános képletű vegyületek körébe tartozó (V) képletű vegyület D, L vagy DL formában vagy valamely sója alakjában.
  6. 6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti lipopoliamin, amely az (I) általános képletű vegyületek körébe tartozó (VI) képletű vegyület D, L vagy DL formában vagy valamely sója alakjában.
  7. 7. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy, az 1-6. igénypontok valamelyike szerinti lipopoüamint és legalább egy nukleinsavat tartalmaz.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy nukleinsavként egy dezoxiribonukleinsavat tartalmaz.
  9. 9. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy nukleinsavként egy ribonukleinsavat tartalmaz.
    • »·
  10. 10. A 7., 8. vagy 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy egy kémiai úton módosított nukleinsavat tartalmaz .
  11. 11. A 7-10. igénypontok valamelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy egy antiszensz nukleinsavat tartalmaz.
  12. 12. A 7-10. igénypontok valamelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy egy terápiás gént hordozó nukleinsavat tartalmaz.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy olyan terápiás gént tartalmaz, amely egy, a lipidek - például az A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J vagy apó(a) apolipoproteinek - metabolizmusában résztvevő fehérjét, egy enzimet - például lipoprotein lipázt, a máj lipáz enzimét vagy egyéb lipázokat, a lecitin-koleszterin-aciltranszferázt, a 7-a-koleszterin-hidroxilázt, a savas foszfatidil foszfatázt -, egy lipidtranszfer-fehérjét - például a koleszterin-észtereket vagy a foszfolipideket transzferáló fehérjét -, egy HDL-kötő fehérjét vagy egy, az LDL-receptorok, a chylomicron-maradék receptorok vagy a scavenger (gyökfogó) receptorok közé tartozó receptort kódol.
  14. 14. Gyógyszerkészítmény, amely egy nukleinsavat, egy, az 1-6. igénypontok valamelyike szerinti lipopoliamint és egy olyan adalékanyagot tartalmaz, amely a lipopoliamin/nukleinsav-komplexhez kötődni képes, és annak transzfektáló képességét javítja.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy adalékanyagként egy vagy több semleges lipidet tartalmaz.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy semleges lipidként szintetikus vagy természetes, ikerionos vagy iontöltés nélküli lipid(ek)et tartalmaz fiziológiás körülmények között.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 2 zsírsavláncból álló semleges lipide(ke)t tartalmaz.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy semleges lipidként egyet vagy többet tartalmaz az alábbi lipidek közül: dioleoil-foszfatidil-etanol-amin (DOPE), oleoil-palmitoil-foszfatidil-etanol-amin (POPÉ), disztearoil-, -palmitoil- vagy -mirisztoil-foszfatidil-etanol-amin vagy ezek egy-háromszorosan N-metilezett származékai, foszfatidil-glicerinek, diacil-glicerinek, glükozil-diacil-glicerinek, cerebrozidok (például galakto-cerebrozidok), szfingolipidek (például szfingomielinek) és asialogan-glikozidok (például asialoGMl vagy GM2).
  19. 19. A 14-18. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 1 ekvivalens lipopoliaminra vonatkoztatva 0,1 - 20 ekvivalens, előnyösen 1-5 ekvivalens adalékanyagot tartalmaz.
  20. 20. A 7-19. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy egy injektálható készítmény céljára gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.
  21. 21. A 7-19. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a bőrön vagy nyálkahártyán való alkalmazás céljára gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.
  22. 22. Egy 1-6. igénypont szerinti lipopoliamin felhasználása sejtek in vivő vagy in vitro transzfektálására.
HU9701862A 1994-12-05 1995-12-04 Lipopoliaminok mint transzfekciós ágensek, és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények HUT77171A (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9414596A FR2727679B1 (fr) 1994-12-05 1994-12-05 Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT77171A true HUT77171A (hu) 1998-03-02

Family

ID=9469480

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9701862A HUT77171A (hu) 1994-12-05 1995-12-04 Lipopoliaminok mint transzfekciós ágensek, és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6107286A (hu)
EP (1) EP0796240B1 (hu)
JP (1) JPH10509958A (hu)
KR (1) KR100447517B1 (hu)
AT (1) ATE200662T1 (hu)
AU (1) AU713662B2 (hu)
BR (1) BR9510080A (hu)
CA (1) CA2208184A1 (hu)
CZ (1) CZ289513B6 (hu)
DE (1) DE69520748T2 (hu)
DK (1) DK0796240T3 (hu)
ES (1) ES2157351T3 (hu)
FI (1) FI972366A (hu)
FR (1) FR2727679B1 (hu)
GR (1) GR3035759T3 (hu)
HU (1) HUT77171A (hu)
IL (1) IL116251A (hu)
NO (1) NO972566L (hu)
PT (1) PT796240E (hu)
SK (1) SK282601B6 (hu)
WO (1) WO1996017823A1 (hu)
ZA (1) ZA9510326B (hu)

Families Citing this family (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5948767A (en) * 1994-12-09 1999-09-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphile/DNA complexes
US5939401A (en) * 1994-12-09 1999-08-17 Genzyme Corporation Cationic amphiphile compositions for intracellular delivery of therapeutic molecules
US6331524B1 (en) 1994-12-09 2001-12-18 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile / DNA complexes for gene therapy
US6383814B1 (en) 1994-12-09 2002-05-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
AUPN741696A0 (en) * 1996-01-05 1996-01-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of nucleic acids ii
FR2756491B1 (fr) * 1996-11-29 1999-01-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition transfectante utile en therapie genique associan t a un virus recombinant incorporant un acide nucleique exog ene, un agent de transfection non viral et non plasmidique
US7097854B2 (en) 1996-09-12 2006-08-29 Medigene Oncology Gmbh Amino alcohol derivatives, process for their production and pharmaceutical preparations and reagents containing these compounds
DE19637043A1 (de) * 1996-09-12 1998-03-19 Boehringer Mannheim Gmbh Neue Aminoalkoholderivate, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und Reagenzien
FR2754272B1 (fr) * 1996-10-08 1998-11-13 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de preparation de compositions pour le transfert d'acides nucleiques
US7008776B1 (en) 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
US6884430B1 (en) * 1997-02-10 2005-04-26 Aventis Pharma S.A. Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles
CA2288306A1 (en) 1997-04-28 1998-11-05 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Adenovirus-mediated intratumoral delivery of an angiogenesis antagonist for the treatment of tumors
FR2763943B1 (fr) * 1997-05-28 1999-07-09 Rhone Poulenc Rorer Sa Composes, leur preparation et leur utilisation pour le transfert d'acides nucleiques dans les cellules
US6875606B1 (en) 1997-10-23 2005-04-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Human α-7 nicotinic receptor promoter
CA2318512C (fr) 1998-01-30 2009-10-13 Aventis Pharma S.A. Composes transfectants sensibles aux conditions reductrices, compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs applications
FR2777017B1 (fr) * 1998-04-02 2002-08-23 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications
KR20010042318A (ko) * 1998-04-02 2001-05-25 아방티 파르마 소시에테 아노님 신규 핵산 전달제, 이를 함유하는 조성물 및 용도
AU768542C (en) 1998-04-08 2004-06-17 Celltech R & D Limited Lipids
US6225456B1 (en) 1998-05-07 2001-05-01 University Technololy Corporation Ras suppressor SUR-5
US6506889B1 (en) 1998-05-19 2003-01-14 University Technology Corporation Ras suppressor SUR-8 and related compositions and methods
US6441156B1 (en) 1998-12-30 2002-08-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Calcium channel compositions and methods of use thereof
ES2288472T3 (es) * 1999-04-26 2008-01-16 Ucb Pharma, S.A. Lipidos bipolares y su uso para la liberacion de sustancias bioactivas.
GB9918670D0 (en) 1999-08-06 1999-10-13 Celltech Therapeutics Ltd Biological product
AU1556701A (en) * 1999-12-02 2001-06-12 Tomohiko Ohwada Reagents for gene transfer
EP1276500B1 (en) 2000-03-13 2011-06-08 Cornell Research Foundation, Inc. Blocking leukocyte emigration and inflammation by interfering with cd99/hec2
US20040033600A1 (en) 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
GB0018307D0 (en) 2000-07-26 2000-09-13 Aventis Pharm Prod Inc Polypeptides
EP1272526A4 (en) 2000-04-13 2004-10-13 Univ Rockefeller REINFORCING ANTIBODY-IMMUNE RESPONSE
KR100373844B1 (ko) * 2000-09-21 2003-02-26 굿젠 주식회사 유전자 및 생물학적 활성 약물 전달용 양이온성 지질과이의 제조방법
KR100373845B1 (ko) * 2000-09-21 2003-02-26 굿젠 주식회사 유전자 및 생물학적 활성 약물 전달용 양이온성 지질과이의 제조방법
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
US20020091242A1 (en) 2000-10-11 2002-07-11 Michel Bessodes Acid-sensitive compounds, their preparation and uses
JP4445200B2 (ja) 2000-12-28 2010-04-07 ワイス エルエルシー ＄ｉ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の組換え保護タンパク質
MXPA03007492A (es) 2001-02-20 2004-10-15 Rheogene Holdings Inc Receptores de retinoide x quimerico y su uso en un sistema de expresion de gen inducible basado en receptor de ecdisona novedoso.
CA2438133C (en) 2001-02-20 2015-01-27 Rheogene, Inc. Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
US9493540B2 (en) 2001-02-20 2016-11-15 Intrexon Corporation Ecdysone receptor/invertebrate retinoid X receptor-based inducible gene expression system
ES2422303T3 (es) 2001-02-20 2013-09-10 Intrexon Corp Receptores mutantes por sustitución novedosos y su uso en un sistema de expresión génica inducible basado en receptores nucleares
ATE448793T1 (de) 2001-03-02 2009-12-15 Univ Rockefeller Rekombinante hybrid-allergenkonstrukte mit verringerter allergenität unter beibehaltung der immunogenität des natürlichen allergens
CA2820170C (en) 2001-09-26 2016-07-05 Intrexon Corporation Whitefly ecdysone receptor nucleic acids, polypeptides, and uses thereof
CA2820144C (en) 2001-09-26 2017-06-20 Intrexon Corporation Leafhopper ecdysone receptor nucleic acids, polypeptides, and uses thereof
US20040023910A1 (en) * 2001-09-28 2004-02-05 Zhiming Zhang Use of cyr61 in the treatment and diagnosis of human uterine leiomyomas
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
ES2282602T3 (es) 2002-01-17 2007-10-16 Johnson Controls Denmark Aps Evaporador sumergido con intercambiador de calor integrado.
JP4563171B2 (ja) 2002-05-24 2010-10-13 シェーリング コーポレイション 中和ヒト抗ｉｇｆｒ抗体
US7375093B2 (en) 2002-07-05 2008-05-20 Intrexon Corporation Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7785608B2 (en) 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
US7304161B2 (en) 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7456315B2 (en) 2003-02-28 2008-11-25 Intrexon Corporation Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7432057B2 (en) 2004-01-30 2008-10-07 Michigan State University Genetic test for PSE-susceptible turkeys
JP4890442B2 (ja) 2004-04-20 2012-03-07 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ アミロイドベータタンパク質産生を阻害するための方法、組成物及び化合物アッセイ
MXPA06012162A (es) 2004-04-27 2007-03-30 Galapagos Nv Metodos, agentes y ensayos de seleccion de compuestos para inducir diferenciacion de celulas de mamifero no diferenciadas, en osteoblastos.
US7935510B2 (en) 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
EP1773997B1 (en) 2004-06-14 2011-11-23 Galapagos N.V. Methods for identification, and compounds useful for the treatment of degenerative & inflammatory diseases
EP2386856B1 (en) 2004-06-21 2013-07-24 Galapagos N.V. Methods and means for treatment of osteoarthritis
US7604798B2 (en) 2004-07-15 2009-10-20 Northwestern University Methods and compositions for importing nucleic acids into cell nuclei
EP1784416B1 (en) 2004-07-16 2011-10-05 GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Vaccines against aids comprising cmv/r nucleic acid constructs
US7485468B2 (en) 2004-10-15 2009-02-03 Galapagos Bv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of joint degenerative and inflammatory diseases
US9034650B2 (en) 2005-02-02 2015-05-19 Intrexon Corporation Site-specific serine recombinases and methods of their use
US20060211004A1 (en) 2005-02-15 2006-09-21 Ilsley Diane D Methods and compositions for determining non-specific cytotoxicity of a transfection agent
CN101437539B (zh) 2005-07-05 2013-10-02 康奈尔研究基金会（有限公司） 通过干扰cd99l2阻断白细胞迁出和炎症
WO2007028147A2 (en) 2005-09-01 2007-03-08 Philadelphia Health & Education Corporation D.B.A. Drexel University College Of Medicin Identification of a prostatic intraepithelial neoplasia (pin)-specific gene and protein (pin-1) useful as a diagnostic treatment for prostate cancer
CA2659353C (en) 2006-07-28 2014-07-15 Sanofi-Aventis Composition and method for treatment of tumors
JP2010507365A (ja) 2006-10-19 2010-03-11 メルク アンド カンパニー インコーポレイテッド 抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体およびその使用
ES2501947T3 (es) 2006-10-19 2014-10-02 Csl Limited Antagonistas de anticuerpos de alta afinidad del receptor alfa 1 de interleucina
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
AU2007337897A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Imuthes Limited Lipids and their use as non-viral delivery vehicle
CN101848887A (zh) 2007-05-29 2010-09-29 英特拉克森公司 通过蜕皮素受体复合物调节外源性基因表达的手性二酰基肼配体
US8637257B2 (en) 2007-06-20 2014-01-28 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of bone and joint degenerative diseases
US20090069266A1 (en) 2007-06-27 2009-03-12 Northwestern University Methods and compositions for nucleic acid transfer into cells
KR20100049084A (ko) 2007-08-23 2010-05-11 인트렉손 코포레이션 질병 진단을 위한 방법 및 조성물
BRPI0817009A2 (pt) * 2007-09-17 2014-10-07 Rohm & Haas Sistema de expressão de gene para a expressão controlável de resposta ao etileno em uma célula de planta, composição, e, métodos para produzir uma planta transgênica, e para modular sensibilidade ao etileno em uma planta.
EP2205249B1 (en) 2007-09-28 2018-11-07 Intrexon Corporation Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof
ES2531522T3 (es) 2007-10-08 2015-03-16 Intrexon Corporation Células dendríticas modificadas por ingeniería y usos para el tratamiento del cáncer
US8790664B2 (en) 2008-09-05 2014-07-29 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Multimodular assembly useful for intracellular delivery
CA2736425A1 (en) 2008-09-11 2010-03-18 Galapagos Nv Method for identifying compounds useful for increasing the functional activity and cell surface expression of cf-associated mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
JP2012508174A (ja) 2008-11-05 2012-04-05 ワイス・エルエルシー β溶血性連鎖球菌（ＢＨＳ）疾患を予防するための多成分免疫原性組成物
WO2010096561A1 (en) 2009-02-18 2010-08-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Synthetic hiv/siv gag proteins and uses thereof
WO2010094732A1 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Biofocus Dpi B.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
US20110306655A1 (en) 2009-02-19 2011-12-15 Richard Antonius Jozef Janssen Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
EP2398479A2 (en) 2009-02-19 2011-12-28 Galapagos N.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
EP2414830A2 (en) 2009-03-31 2012-02-08 Robert Zimmermann Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor
WO2010112569A1 (en) 2009-03-31 2010-10-07 Robert Zimmermann Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor
EP3043179B1 (en) 2009-04-01 2020-05-06 Galapagos N.V. Methods and means for treatment of osteoarthritis
CN102724993B (zh) 2009-04-17 2016-04-27 纽约大学 靶向tnf家族受体并拮抗tnf作用的肽、组合物、方法及其用途
WO2011015572A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
WO2011015573A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
WO2011116351A2 (en) 2010-03-19 2011-09-22 University Of South Alabama Methods and compositions for the treatment of cancer
MX362513B (es) 2010-03-23 2019-01-22 Intrexon Corp Vectores que expresan de manera condicional proteinas terapeuticas, celulas hospedadoras que comprenden vectores, y usos de los mismos.
US9556240B2 (en) 2010-08-23 2017-01-31 Wyeth Llc Stable formulations of Neisseria meningitidis rLP2086 antigens
EP3056212B1 (en) 2010-09-10 2019-04-03 Wyeth LLC Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens
CA2819552C (en) 2010-12-09 2023-09-26 Institut Pasteur Mgmt-based method for obtaining high yield of recombinant protein expression
EP2492279A1 (en) 2011-02-25 2012-08-29 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Rapid immunogen selection method using lentiviral display
JP6189754B2 (ja) 2011-03-04 2017-08-30 イントレキソン コーポレーション タンパク質を条件的に発現するベクター
WO2012135696A2 (en) 2011-04-01 2012-10-04 University Of South Alabama Methods and compositions for the diagnosis, classification, and treatment of cancer
EP2546358A1 (en) 2011-07-15 2013-01-16 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Methods and reagents for efficient control of HIV progression
HUE041740T2 (hu) 2011-09-20 2019-05-28 Univ North Carolina Chapel Hill Nátriumcsatornák szabályozása PLUNC-fehérjékkel
WO2013053765A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. A non-human animal model of mucosa-associated lymphoid tissue (malt) lymphoma
US9061063B2 (en) 2011-12-07 2015-06-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
JP6215223B2 (ja) 2011-12-09 2017-10-18 アンスティテュ・パストゥール マルチプレックス免疫スクリーニングアッセイ
WO2013103401A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 University Of South Alabama Methods and compositions for the treatment of cancer
CZ201220A3 (cs) * 2012-01-13 2013-07-17 Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i. Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
JP5925342B2 (ja) 2012-03-09 2016-05-25 ファイザー・インク 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）組成物およびその方法
EP2698377A1 (en) 2012-08-17 2014-02-19 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Enhanced rapid immunogen selection method for HIV gp120 variants
WO2014107739A1 (en) 2013-01-07 2014-07-10 Eleven Biotherapeutics, Inc. Antibodies against pcsk9
WO2014136064A2 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
CA2940513C (en) 2013-03-11 2023-08-15 University Of Florida Research Foundation, Inc. Delivery of card protein as therapy for ocular inflammation
US20160054304A1 (en) 2013-03-14 2016-02-25 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrotic diseases
EP2972380A2 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Galapagos NV Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrosis
WO2014139885A2 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of diseases associated with epithelial mesenchymal transition
US9127024B2 (en) 2013-03-15 2015-09-08 Intrexon Corporation Boron-containing diacylhydrazines
US20160130585A1 (en) 2013-05-28 2016-05-12 The Johns Hopkins University Aptamers for the treatment of sickle cell disease
CA2923129C (en) 2013-09-08 2020-06-09 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US11053291B2 (en) 2014-02-19 2021-07-06 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Delivery of Nrf2 as therapy for protection against reactive oxygen species
KR101605421B1 (ko) 2014-03-05 2016-03-23 국립암센터 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
EP4148083A1 (en) 2014-06-25 2023-03-15 Acuitas Therapeutics Inc. Novel lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
SG11201701944WA (en) 2014-09-17 2017-04-27 Intrexon Corp Boron-containing diacylhydrazine compounds
MX2017010705A (es) 2015-02-19 2017-12-04 Pfizer Composiciones de neisseria meningitidis y metodos de la misma.
TW201710503A (zh) 2015-06-12 2017-03-16 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院 新穎多核苷酸、載體、醫藥組成物以及其用途
EP3313829B1 (en) 2015-06-29 2024-04-10 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
AU2016334401A1 (en) 2015-10-10 2018-04-26 Intrexon Corporation Improved therapeutic control of proteolytically sensitive, destabilized forms of interleukin-12
EP3368507B1 (en) 2015-10-28 2022-12-07 Acuitas Therapeutics Inc. Novel lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
BR112019009446A2 (pt) 2016-11-09 2019-07-30 Intrexon Corp construtos de expressão da frataxina
JP7010961B2 (ja) 2017-01-31 2022-02-10 ファイザー・インク 髄膜炎菌組成物およびその方法
WO2018191657A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
AU2018256877B2 (en) 2017-04-28 2022-06-02 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2019036008A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
WO2019036028A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
US11524932B2 (en) 2017-08-17 2022-12-13 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019036000A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
EP3539975A1 (en) 2018-03-15 2019-09-18 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Micropeptides and uses thereof
KR20210043623A (ko) 2018-08-10 2021-04-21 주식회사 유틸렉스 Hla-dr에 결합하는 키메라 항원 수용체 및 car-t 세포
LT3908568T (lt) 2019-01-11 2024-09-25 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipidai, skirti veikliųjų medžiagų įvedimui, panaudojant lipidų nanodaleles
EP3935077A1 (en) 2019-03-08 2022-01-12 Obsidian Therapeutics, Inc. Cd40l compositions and methods for tunable regulation
EP4084872A1 (en) * 2020-01-03 2022-11-09 Ascendis Pharma A/S Conjugates undergoing intramolecular rearrangements
KR20220139319A (ko) 2020-01-08 2022-10-14 옵시디안 테라퓨틱스, 인크. 조정 가능한 전사의 조절을 위한 조성물 및 방법
EP3885440A1 (en) 2020-03-26 2021-09-29 Splicebio, S.L. Split inteins and their uses
MX2023000614A (es) 2020-07-16 2023-02-13 Acuitas Therapeutics Inc Lipidos cationicos para usarse en nanoparticulas lipidicas.
EP4448485A2 (en) 2021-12-16 2024-10-23 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE757840A (fr) * 1969-10-23 1971-04-22 Basf Ag Procede de preparation d'amines a partir d'alcools
US4014933A (en) * 1969-10-23 1977-03-29 Basf Aktiengesellschaft Production of amines from alcohols
FR2645866B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5858784A (en) * 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
US5334761A (en) * 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5795587A (en) * 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production

Also Published As

Publication number Publication date
IL116251A0 (en) 1996-03-31
ZA9510326B (en) 1996-06-11
FI972366A0 (fi) 1997-06-04
US6107286A (en) 2000-08-22
DE69520748D1 (de) 2001-05-23
FI972366A (fi) 1997-06-04
IL116251A (en) 2000-11-21
EP0796240A1 (fr) 1997-09-24
CZ171197A3 (cs) 1998-03-18
CA2208184A1 (fr) 1996-06-13
DE69520748T2 (de) 2001-09-13
WO1996017823A1 (fr) 1996-06-13
AU713662B2 (en) 1999-12-09
JPH10509958A (ja) 1998-09-29
SK282601B6 (sk) 2002-10-08
ES2157351T3 (es) 2001-08-16
NO972566D0 (no) 1997-06-05
AU4307296A (en) 1996-06-26
FR2727679B1 (fr) 1997-01-03
CZ289513B6 (cs) 2002-02-13
FR2727679A1 (fr) 1996-06-07
DK0796240T3 (da) 2001-05-07
GR3035759T3 (en) 2001-07-31
SK70197A3 (en) 1997-11-05
NO972566L (no) 1997-06-05
KR100447517B1 (ko) 2004-11-20
BR9510080A (pt) 1997-12-30
EP0796240B1 (fr) 2001-04-18
MX9703928A (es) 1998-05-31
PT796240E (pt) 2001-09-28
ATE200662T1 (de) 2001-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT77171A (hu) Lipopoliaminok mint transzfekciós ágensek, és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények
EP0861228B1 (fr) Lipopolymamines comme agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
US5945400A (en) Nucleic acid-containing composition, preparation and use thereof
US6346516B1 (en) Cationic amphiphiles containing N-hydroxyalkyl group for intracellular delivery of biologically active molecules
JP4467084B2 (ja) 核酸を細胞に導入するための化合物、その製法及びその使用
AU731503B2 (en) Cationic amphiphile compositions for intracellular delivery of therapeutic molecules
AU3659097A (en) Cationic amphiphile/ DNA complexes
JPH05508626A (ja) 生物学的活性分子の細胞内配達のための陽イオン脂質
PT901463E (pt) Compostos glicerolipidicos uteis para a transferencia de uma substancia activa para uma celula alvo
US5948925A (en) Cationic amphiphiles containing linkers derived from neutral or positively charged amino acids
US5942634A (en) Cationic amphiphiles for cell transfections
AU759197B2 (en) Transfecting compounds which are sensitive to reducing conditions, pharmaceutical compositions containing them and their applications
EP0888379A1 (fr) Composes apparentes a la famille des amidiniums, compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications
JPH09173067A (ja) 細胞のトランスフェクション
FR2764304A1 (fr) Nouvelle classe d&#39;agents transfectants cationiques des acides nucleiques
JP4629333B2 (ja) アミノグリコシドの脂質誘導体
CA2446951C (fr) Derives lipidiques de polythiouree
MXPA97003928A (en) New transfection agents and their pharmaceutical applications
CA2321200A1 (en) Composition for transporting negatively charged substances
FR2786700A1 (fr) Nouveaux agents de transfert d&#39;acides nucleiques, compositions les contenant et leurs utilisations

Legal Events

Date Code Title Description
FD9A Lapse of provisional protection due to non-payment of fees