DE69527206T2

DE69527206T2 - Mittel zum einbringen polyanionischer materialien in zellen

Info

Publication number: DE69527206T2
Application number: DE69527206T
Authority: DE
Inventors: Michial Ansell; Michael Hope; Barbara Mui
Original assignee: Inex Pharmaceuticals Corp
Current assignee: Arbutus Biopharma Corp
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 2003-02-27
Anticipated expiration: 2015-09-30
Also published as: EP1179340A3; ATE219660T1; CA2200952C; CA2200952A1; US5785992A; DE69527206D1; EP1179340A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Gentherapie ist ein Gebiet von aktuellem Interesse, das das Einbringen eines genetischen Materials in eine Zelle beinhaltet, um die Expression eines fehlenden Proteins zu vereinfachen. Es gibt gegenwärtig fünf Hauptverfahren, durch die dieses erreicht wird, nämlich: (i) Calciumphosphat-Präzipitation, (ii) DEAE-Dextrankomplexe, (iii) Elektroporation, (iv) kationische Lipidkomplexe und (v) wieder zusammengesetzte Viren oder Virosomen (siehe Chang, et al., Focus 10: 88 (1988)). Kationische Lipidkomplexe sind gegenwärtig die effektivsten allgemein verwendeten Mittel, um eine Transfection zu bewirken.
Eine Anzahl verschiedener Formulierungen, die kationische Lipide einschließen, sind kommerziell erhältlich, nämlich (i) LIPOFECTIN® (welches 1,2-Dioleyloxy-3-(N,N,N-trimethylamin)propanchlorid, oder DOTMA, siehe Eppstein, et al., U.S. Patent Nr. 4,897,355 verwendet); LIPOFECTAMINE® (verwendet DOSPA, siehe Hawley-Nelson, et al., Focus 15(3): 73 (1993)); und LIPOFECTACE® (verwendet N,N-Distearyl-N,N- dimethylammoniumbromid oder DDAB, siehe Rose, U.S. Patent Nr. 5,279,833). Andere Forscher berichteten von alternativen kationischen Lipiden, die in der im Wesentlichen selben Weise aber mit verschiedenen Wirksamkeiten arbeiten, zum Beispiel 1,2-Dioleoyloxy-3,-(N,N,N-trimethylamin)propanchlorid, oder DOTAP (siehe Stomatatos, et al., Biochemistry 27: 3917-3925 (1988)); auf Glycerin basierende Lipide (siehe Leventis, et al., Biochem. Biophys. Acta 1023: 124 (1990); Lipopolyamine (siehe Behr, et al., U.S. Patent Nr. 5,171,678) und auf Cholesterin basierende Lipide (siehe Epand, et al., WO 93/05162).
Andere haben bemerkt, dass DOTMA und verwandte Verbindungen signifikant aktiver in Transfections-Assays sind, als ihre gesättigten Analoga (siehe Felgner, et al., WO 91/16024). Jedoch sind sowohl auf DOTMA als auch auf DOSPA basierende Formulierungen unerschwinglich teuer, obwohl sie beim Bewirken einer Transfection die effizientesten der kationischen Lipide sind. DDAB ist andererseits billig und bei Chemie- Lieferanten leicht erhältlich, ist aber bei den meisten Zell-Linien weniger effektiv als DOTMA.
Was in der Technik gebraucht wird sind neue Zusammensetzungen und Verfahren, die bei einer Transfection sowohl effektiver, als auch erschwinglicher sind. Überraschenderweise stellt die vorliegende Erfindung derartige Zusammensetzungen und Verfahren bereit.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren bereit, welche zum Einbringen von Polyanionenmaterialien in Zellen nützlich sind. Die Zusammensetzungen sind Mischungen kationischer Verbindungen und neutraler Lipide, welche typischerweise als Liposomen formuliert sind. Die kationischen Verbindungen sind quaternäre Ammoniumverbindungen, in denen der Stickstoff zwei gebundene langkettigen Alkylgruppen besitzt, von denen mindestens eine ungesättigt ist. Die Verfahren zum Transfizieren von Zellen beinhalten (a) in Kontakt Bringen der Polyanionenmaterialien mit einer Liposom-Formulierung der oben genannten Zusammensetzungen, um einen Komplex zu erzeugen, und (b) in Kontakt Bringen des Komplexes mit den zu transfizierenden Zellen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 stellt die Fusion von DOTMA : DOPE- und DODAC : DOPE-Vesikeln dar, die durch Plasmid-DNS induziert wird.
Fig. 2 stellt die Fusion von Lipid/DNS-Komplexen mit RBC- Ghosts dar.
Fig. 3 stellt einen vorbereitenden Überblick über die Transfections-Fähigkeiten kationischer Lipid-Vesikel dar, die mit 50 mol-% DOPE formuliert sind.
Fig. 4 stellt die Ladungsverhältnis-Titration von DOTMA : DOPE- und DODAC : DOPE-Transfections- Wirksamkeiten in BHK-Zellen dar.
Fig. 5 stellt die Transfections-Wirksamkeiten von DODAC : DOPE-Komplexen mit 50% konfluenten H9C2- Myoblasten in Abwesenheit (Fig. 5A) und Anwesenheit (Fig. 5B) eines Serums dar.
Fig. 6 stellt die Transfections-Wirksamkeiten von DODAC : DOPE-Komplexen mit 100% konfluenten H9C2-Myoblasten in Abwesenheit (Fig. 6A) und Anwesenheit (Fig. 6B) eines Serums dar.
Fig. 7 stellt die Transfections-Wirksamkeiten von DODAC : DOPE-Komplexen mit H9C2-Myotuben in Abwesenheit (Fig. 7A) und Anwesenheit (Fig. 7B) eines Serums dar.
Fig. 8 stellt die Transfections-Wirksamkeiten von DODAC : DOPE-Komplexen mit ICR-Mäusen dar.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Abkürzungen und Definitionen

Die folgenden Abkürzungen werden hier verwendet: BHK, Babyhamster- Niere; RBC, rote Blutzellen; DDAB, N,N-Distearyl-N,N-dimethylammoniumbromid; DODAC, N,N-Dioleyl-N,N-dimethylammoniumchlorid; DOPE, 1,2-sn-Dioleoylphosphatidylethanolamin; DOSPA, 2,3-Dioleyloxy-N-(2- spermincarboxamid)ethyl)-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoracetat; DOTAP, 1,2-Dioleoyloxy-3-(N,N,N-trimethylamin)propanchlorid; DOTMA, 1,2-Dioleyloxy-3-(N,N,N-trimethylamin)propanchlorid; OSDAC, N-Oleyl-N- stearyl-N,N-dimethylammoniumchlorid; RT, Raumtemperatur; HEPES, 4- (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure; FBS, fötales Rinderserum; DMEM, Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium; PEG-Cer-C&sub1;&sub4;, 1-O-(2'-(ω- Methoxypolyethylenglycol)succinoyl)-2-N-myristoyl-sphingosin; PEG-Cer- C&sub2;&sub0;, 1-O-(2'-(ω-Methoxypolyethylenglycol)succinoyl)-2-N-arachidoylsphingosin; PBS, phosphatgepufferte Salzlösung; THF, Tetrahydrofuran;
EGTA, Ethylenbis(oxyethylennitril)-tetraessigsäure; SF-DMEM, serumfreies DMEM; und NP40, Nonylphenoxypolyethoxyethanol.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Alkyl" auf einen gesättigten Kohlenwasserstoffrest, welcher geradkettig oder verzweigtkettig sein kann (z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl). Bevorzugte Alkylgruppen für einige Substituenten sind niedrigere Alkylgruppen, die 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthalten. Für andere Alkylgruppensubstituenten sind langkettige Alkylgruppen bevorzugt, die 16 bis 20 Kohlenstoffatome enthalten. Alle numerischen Bereiche in dieser Beschreibung und in den Ansprüche sollen ihre oberen und unteren Grenzen beinhalten.
Der Begriff "Acyl" bezieht sich auf einen Rest, der aus einer organischen Säure durch Entfernen der Hydroxylgruppe hergestellt wird. Beispiele von Acyl-Resten umfassen Acetyl, Pentanoyl, Palmitoyl, Stearoyl, Myristoyl, Caproyl und Oleoyl.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "pharmazeutisch annehmbares Anion" auf Anionen von organischen und anorganischen Säuren, die nicht-toxische Salze in pharmazeutischen Präparaten liefern. Beispiele derartiger Anionen umfassen Chlorid, Bromid, Sulfat, Phosphat, Acetat, Benzoat, Citrat, Glutamat und Lactat. Die Herstellung von pharmazeutisch annehmbaren Salzen ist in Berge, et al., J. Pharm. Sci. 66: 1-19 (1977) beschrieben.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Polyanion" auf Materialien, die mehr als eine Anionengruppe besitzen. Zum Beispiel wird Polyanion verwendet, um auf Nukleinsäuren, sowohl DNS, als auch RNS, Bezug zu nehmen, die in ihrer Polyanionen-Form vorhanden sind, die mehr als eine anionische Phosphodiester-Gruppe entlang des Nukleinsäurerückgrades besitzt. Der Begriff "Polyanion" bezieht sich auch auf jene pharmazeutische Mittel, welche mehr als eine anionische Gruppe bei neutralem pH besitzen. Derartige pharmazeutische Mittel umfassen Peptide mit vorhandenen multiplen Carbonsäurefunktionalitäten (i. e. Glu, Asp).
Der Begriff "neutrales Lipid" bezieht sich auf eine beliebige einer Anzahl von Lipid-Spezien, die in einer ungeladenen oder neutralen Zwitterionen- Form bei physiologischem pH existiert. Derartige Lipide umfassen z. B. Diacylphospatidylcholin, Diacylphosphatidylethanolamin, Ceramid, Spingomyelin, Cephalin, Cardiolipin und Cerebroside.
Die Begriffe "Transfection" und "Transformation" werden hier austauschbar verwendet und beziehen sich auf das Einbringen von Polyanionenmaterialien, insbesondere Nukleinsäuren, in Zellen. Der Begriff "Lipofection" bezieht sich auf das Einbringen derartiger Materialien unter Verwendung von Liposom-Komplexen. Die Polyanionenmaterialien können in der Form einer DNS oder einer RNS vorliegen, welche, mit Expressions-Vektoren verknüpft sind, um die Genexpression nach dem Eintritt in die Zelle zu vereinfachen. Daher soll das Polyanionenmaterial, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, DNS umfassen, die Codierungs-Sequenzen für strukturelle Proteine, Rezeptoren und Hormone, wie auch transkriptionale und translationale Regulations-Elemente (i. e. Promotoren, Enhancer, Terminatoren und Signal-Sequenzen) und Vektoren besitzt. Verfahren zum Einbauen besonderer Nukleinsäuren in Expressionsvektoren sind dem Fachmann gut bekannt, sind aber im Detail beispielsweise in Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe), Band 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) oder Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Herausgeber Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York (1987) beschrieben.
"Expressionsvektoren", "Klonierungsvektoren" oder "Vektoren" sind oft Plasmide oder andere Nukleinsäure-Moleküle, die fähig sind, in einer ausgewählten Wirtszelle zu replizieren. Expressionsvektoren können autonom replizieren, oder sie können dadurch repliziert werden, dass sie in das Genom der Wirtszelle durch in der Technik gut bekannte Verfahren eingefügt werden. Vektoren, die autonom replizieren, werden einen Ursprung der Replikation oder eine autonome Replizier-Sequenz (ARS) besitzen, die in der (den) gewählten Wirtszelle(n) funktional ist. Oft ist es erwünscht, dass ein Vektor in mehr als einer Wirtszelle verwendbar ist, z. B. in E. coli zum Klonen und Konstruieren, und in einer Säugetierzelle zur Expression.

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren für das Einbringen von Polyanionenmaterialien in Zellen bereit. Die Zusammensetzungen umfassen eine kationische Verbindung der Formel I und mindestens ein neutrales Lipid.
In Formel I sind R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander C&sub1;- bis C&sub3;- Alkyl. Y und Z sind Alkyl- oder Alkenyl-Ketten und sind jeweils unabhängig voneinander -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-, -CH=CHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH=CHCH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH&sub2;CH=CHCH&sub2;-, -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH=CH-, -CH=CHCH=CHCH&sub2;-, -CH=CHCH&sub2;CH=CH- oder -CH&sub2;CH=CHCH=CH-, unter der Bedingung, dass Y und Z nicht beide -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;- sind. Die Buchstaben n und q bezeichnen ganze Zahlen von 3 bis 7 sind, während die Buchstaben m und p ganze Zahlen von 4 bis 9 bezeichnen, unter der Bedingung, dass die Summen n + m und q + p jeweils ganze Zahlen von 10 bis 14 sind. Das Symbol X&supmin; repräsentiert ein pharmazeutisch annehmbares Anion. In der oben angegebenen Formel kann die Orientierung der Doppelbindung entweder cis oder trans sein, jedoch sind die cis-Isomere allgemein bevorzugt.
In einer Gruppe bevorzugter Ausführungsformen besitzen die kationischen Verbindungen die Formel I, wobei R¹ und R² Methyl und Y und Z jeweils unabhängig voneinander -CH=CHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH=CHCH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH&sub2;CH=CHCH&sub2;- oder -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH=CH- sind. In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind R¹ und R² Methyl; Y und Z sind jeweils -CH=CHCH&sub2;CH&sub2;CH-; n und q sind beide 7; und m und p sind beide 5. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die kationische Verbindung DODAC (N,N-Dioleyl-N,N-dimethylammoniumchlorid). DODAC ist eine bekannte Verbindung, die weit verbreitet als ein Additiv in Detergenzien und Shampoos benutzt wurde. Es gibt auch einen Bericht seiner Verwendung als Colipid in liposomischen Zusammensetzungen mit anderen Detergenzien (siehe Takahashi, et al., GB 2 147 263).
Die neutralen Lipide, die Teil der vorliegenden Zusammensetzungen sind, können beliebige einer Vielfalt neutraler Lipide sein, welche typischerweise in Detergenzien oder für die Bildung von Micellen oder Liposomen verwendet werden. Beispiele neutraler Lipide, welche in den vorliegenden Zusammensetzungen nützlich sind, sind Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylethanolamin, Ceramid, Spingomyelin, Cephalin, Cardiolipin und Cerebroside. In bevorzugten Ausführungsformen werden die vorliegenden Zusammensetzungen ein oder mehrere neutrale Lipide umfassen, welche Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylethanolamin, Ceramid oder Spingomyelin sind. Die Acyl-Gruppen in diesen neutralen Lipiden sind vorzugsweise Acyl-Gruppen, die aus Fettsäuren mit C&sub1;&sub0;- bis C&sub2;&sub4;-Kohlenstoffketten erhalten sind. Bevorzugter sind die Acyl-Gruppen Lauroyl, Myristoyl, Palmitoyl, Stearoyl oder Oleoyl. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird das neutrale Lipide 1,2-sn- Dioleoylphosphatidylethanolamin sein.
Das Anion, X&supmin; kann auf ähnliche Weise ein beliebiges einer Vielfalt pharmazeutisch annehmbarer Anionen sein. Diese Anionen können organisch oder anorganisch sein und zum Beispiel Br&supmin;, Cl&supmin;, F&supmin;, I&supmin;, Sulfat, Phosphat, Acetat, Nitrat, Benzoat, Citrat, Glutamat und Lactat umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen ist X&supmin; Cl&supmin; oder AcO&supmin;.
Zusätzlich zu den oben genannten Komponenten werden die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Pharmazeutisch akzeptable Träger, die dem Fachmann gut bekannt sind. Die Auswahl des Trägers wird zum Teil durch die besondere Zusammensetzung, die verabreicht werden soll, wie auch durch das besondere Verfahren, das zum Verabreichen der Zusammensetzung verwendet wird, bestimmt werden. Vorzugsweise ist der pharmazeutische Träger Wasser oder eine Salzlösung.
In den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wird das Verhältnis der kationischen Verbindung zum neutralen Lipid innerhalb eines Bereichs von ungefähr 25 : 75 (kationische Verbindung : neutrales Lipid) bis 75 : 25 (kationische Verbindung : neutrales Lipid), vorzugsweise ungefähr bei 50 : 50 liegen.
Die kationischen Verbindungen, die in den oben genannten Zusammensetzungen verwendet werden, können durch Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, unter Verwendung von synthetischen Standardreaktionen (siehe March, Avdanced Organic Chemistry, 4. Ausgabe, Wiley-Interscience, NY, NY (1992). Zum Beispiel kann die Synthese von OSDAC dadurch ausgeführt werden, dass zuerst Oleylamin mit Formaldehyd und Natriumcyanborhydrid unter Bedingungen behandelt wird, die zu der reduzierenden Alkylierung des Amins führen. Dies liefert Dimethyloleylamin, welches dann mit Stearylbromid alkyliert werden kann, um das entsprechende Ammoniumsalz zu bilden. Ein Anionen-Austausch führt zu der Bildung von OSDAC. Dimethyloleylamin kann auch durch Behandeln von Oleylbromid mit einem großen Überschuss von Dimethylamin synthetisiert werden, und weiter wie oben beschrieben derivatisiert werden. Für kationische Verbindungen, in denen beide Fettsäureketten ungesättigt sind (i. e. DODAC) kann die folgende allgemeine Prozedur verwendet werden. Eine ungesättigte Säure (i. e. Ölsäure) kann in ihr entsprechendes Acyl-Chlorid mit solchen Reagenzien wie Oxalylchlorid, Thionylchlorid, PCl&sub3; oder PCl&sub5; umgewandelt werden. Das Acylchlorid kann mit einem ungesättigten Amin (i. e. Oleylamin) behandelt werden, um das entsprechende Amid zu liefern. Die Reduktion des Amids mit beispielsweise Lithium-Aluminium-Hydrid liefert ein sekundäres Amin, in dem beide Alkylgruppen ungesättigte langkettige Alkylgruppen sind. Das sekundäre Amin kann dann mit Alkylhalogeniden, wie beispielsweise Methyliodid, behandelt werden, um eine quaternäre Ammoniumverbindung zu liefern. Ein Anionenaustausch kann dann ausgeführt werden, um kationische Verbindungen zu liefern, die das erwünschte pharmazeutisch annehmbare Anion besitzen. Der Alkylamin-Precursor kann in einer ähnlichen Weise synthetisiert werden. Zum Beispiel wird die Behandlung eines Alkylhalogenids mit einer methanolischen Ammoniak-Lösung in großen Überschuss das erforderliche Amin nach der Reinigung erzeugen. Alternativ kann ein Acylchlorid, das durch die Behandlung der geeigneten Carbonsäure mit Oxalylchlorid hergestellt wurde, mit Ammoniak zur Reaktion gebracht werden, um ein Amid zu erzeugen. Die Reduktion des Amids mit LiAlH&sub4; wird das erforderliche Alkylamin liefern.
In einer Gruppe von Ausführungsformen werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als Micellen oder Liposomen formuliert werden.
Micellen, die die kationischen Verbindungen und neutralen Lipide der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch Verfahren erzeugt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Zusätzlich zu den Micellen- Formulierungen der vorliegenden Zusammensetzungen liefert die vorliegende Erfindung auch Micellen-Formulierungen, die andere Spezien, wie beispielsweise Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylserin, Lysophosphatidylglycerin, Phosphatidylethanolamin-Polyoxyethylen-Konjugat, Ceramid-Polyoxyethylen-Konjugat oder Phosophatidsäure-Polyoxyethylen-Konjugat umfassen. Die Polyoxyethylen- Konjugate, welche in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können durch Kombinieren der konjugierenden Gruppe (i. e. Phosphatidsäure oder Phosphatidylethanolamin) mit einem geeigneten funktionalisierten Polyoxyethylen-Derivat erzeugt werden. Zum Beispiel kann Phosphatidylethanolamin mit ω-Methoxypolyethylenglycol- Succinat kombiniert werden, um ein Phosphatidylethanolamin-Polyoxyethylen-Konjugat zu liefern. Siehe Parr, et al., Biochim. Biophys. Acta 1195: 21-30 (1994).
Liposomen können auch aus den kationischen Verbindungen und neutralen Lipiden der vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzungen gebildet werden. Die Auswahl neutraler Lipide wird allgemein durch Berücksichtigung beispielsweise der Liposomgröße und der Stabilität der Liposomen im Blutstrom geleitet.
Wie oben bemerkt, ist die neutrale Lipid-Komponente in den Liposomen ein Lipid mit zwei Acylgruppen (i. e. Diacylphosphatidylcholin und Diacylphosphatidylethanolamin). Lipide mit einer Vielfalt von Acyl-Ketten- Gruppen variierender Kettenlänge und variierenden Sättungsgrades sind erhältlich oder können isoliert oder durch gut bekannte Techniken synthetisiert werden. Im allgemeinen werden gering gesättigte Lipide einfacher auf eine Größe gebracht, insbesondere, wenn die Liposomen auf eine Größe unter ungefähr 0,3 Mikrometer zum Zwecke der Filtersterilisation gebracht werden müssen. In einer Gruppe von Ausführungsformen sind Lipide, die gesättigte Fettsäuren mit Kohlenstoffketten-Längen im Bereich von C&sub1;&sub4; bis C&sub2;&sub2; bevorzugt. In einer anderen Gruppe von Ausführungsformen werden Lipide mit mono- und di-ungesättigten Fettsäuren mit Kohlenstoffketten-Längen im Bereich von C&sub1;&sub4; bis C&sub2;&sub2; verwendet. Zusätzlich können Lipide mit Mischungen gesättigter und ungesättigter Fettsäure- Ketten verwendet werden. Liposomen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können auch aus Sphingomyelin oder Phospholipiden mit anderen Kopf-Gruppen, wie beispielsweise Serin und Inositol, zusammengesetzt sein. Noch andere Liposomen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, werden Cholesterin, Diglyceride, Ceramide, Phosphatidylethanolamin-Polyoxyethylen-Konjugate, Phosphatidsäure-Polyoxyethylen- Konjugate oder Polyethylenglycol-Ceramid-Konjugate (z. B. PEG-Cer-C&sub1;&sub4; oder PEG-Cer-C&sub2;&sub0;) umfassen. Verfahren, die beim in Größe Bringen und beim Filter-Sterilisieren von Liposomen verwendet werden, werden unten diskutiert.
Eine Vielfalt von Verfahren ist verfügbar, um Liposomen zu erzeugen, wie in z. B. Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980); U.S. Pat. Nr. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, in dem Text Liposomen, Marc J. Ostro, Herausgeber, Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Kapitel 1, und in Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40: 89 (1986) beschrieben ist. Ein Verfahren stellt multilamellare Vesikel heterogener Größen her. In diesem Verfahren werden die Vesikel bildenden Lipide in einem geeigneten organischen Lösemittel oder Lösemittel-System aufgelöst und unter Vakuum oder einem inerten Gas getrocknet, um einen dünnen Lipid-Film zu bilden. Falls erwünscht, kann der Film in einem geeigneten Lösemittel wieder aufgelöst werden, wie beispielsweise in tertiärem Butanol, und dann lyophilisiert werden, um eine homogenere Lipidmischung zu bilden, welche in einer einfacheren hydratisierten Pulverähnlichen Form vorliegt. Dieser Film wird mit einer wässrigen gepufferten Lösung bedeckt und man lässt ihn hydratisieren, typischerweise 15 bis 60 Minuten lang unter Rühren. Die Größenverteilung der resultierenden multilamellaren Vesikel kann zu kleineren Größen verschoben werden, durch Hydratisieren der Lipide unter kräftigen Bewegungsbedingungen oder durch Hinzufügen von lösenden Detergenzien, wie beispielsweise Desoxycholat.
Nach der Liposom-Erzeugung können die Liposomen auf eine Größe gebracht werden, um einen erwünschten Größenbereich und eine relativ enge Verteilung von Liposomgrößen zu erreichen. Ein Größenbereich von ungefähr 0,2 bis 0,4 Mikrometer ermöglicht, dass die Liposom-Suspension durch Filtration durch einen konventionellen Filter, typischerweise einen 0,22 Mikrometer-Filter, sterilisiert werden kann. Das Filtersterilisationsverfahren kann auf Basis eines hohen Durchsatzes ausgeführt werden, falls die Liposomen auf eine kleine Größe von ungefähr 0,2 bis 0,4 Mikrometer gebracht wurden.
Mehrere Techniken sind verfügbar, um Liposomen auf eine erwünschte Größe zu bringen. Ein Verfahren, um auf eine Größe zu bringen, ist in U.S. Pat. Nr. 4,737,323 beschrieben. Beschallen einer Liposom- Suspension entweder durch eine Bad- oder Sondenbeschallung erzeugt eine fortschreitende Größenverringerung bis auf kleine unilamellare Vesikel, deren Größe kleiner ist als ungefähr 0,05 Mikrometer. Eine Homogenisierung ist ein anderes Verfahren, welches auf der Scher-Energie basiert, um große Liposomen in kleinere zu fragmentieren. In einer typischen Homogenisierungs-Prozedur werden multilamellare Vesikel durch einen Standard-Emulsionshomogenisator rezirkuliert, bis ausgewählte Liposomgrößen, typischerweise zwischen ungefähr 0,1 bis 0,5 Mikrometer, beobachtet werden. In beiden Verfahren kann die Teilchengrößen- Verteilung durch konventionelle Laserstrahl-Partikelgrößen- Diskriminierung überwacht werden.
Das Extrudieren des Liposoms durch eine kleinporige Polycarbonat-Membran oder eine asymmetrische keramische Membran ist auch ein effektives Verfahren zum Verringern der Liposomgrößen auf eine relativ gut definierte Größenverteilung. Typischerweise wird die Suspension durch die Membran ein oder mehrere Male in einem Zyklus geleitet, bis die erwünschte Liposomgrößen-Verteilung erreicht ist. Die Liposomen können durch sukzessiv kleinere Poren-Membranen extrudiert werden, um eine allmähliche Verringerung der Liposomgröße zu erreichen. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Liposome mit einer Größe von ungefähr 0,05 Mikrometer bis ungefähr 0,15 Mikrometer bevorzugt.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind für das Einbringen von Polyanionenmaterialien in Zellen nützlich. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren zum Einbringen eines Polyanionenmaterials in eine Zelle bereit. Diese Verfahren werden in vitro ausgeführt, zunächst durch in Kontakt Bringen des Polyanionenmaterials mit einer Zusammensetzung mindestens eines neutralen Lipids und einer kationischen Verbindung der Formel I, um einen Polyanionenmaterial- Liposom-Komplex zu bilden. Nach dem in Kontakt Bringen des Polyanionenmaterials mit den Liposom-Formulierungen, um einen Komplex zu bilden, wird der Komplex dann mit den Zellen für einen Zeitraum, der ausreichend ist, dass eine Transfection auftritt, in Kontakt gebracht.
In Formel I bedeuten die Symbole R¹, R², Y, Z, n, m, p, q und X&supmin; dasselbe wie oben für die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung beschrieben. In einer Gruppe von bevorzugten Ausführungsformen besitzen die kationischen Verbindungen, die in den vorliegenden Verfahren verwendet werden, die Formel I, wobei R¹ und R² Methyl und Y und Z unabhängig voneinander -CH=CHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH=CHCH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH&sub2;CH=CHCH&sub2;- oder -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH=CH- sind. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind R¹ und R² Methyl; Y und Z sind jeweils -CH=CHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-, n und q sind beide 7; und m und p sind beide 5. Bevorzugter ist die kationische Verbindung DODAC (N,N-Dioleyl- N,N-dimethylammoniumchlorid). Andere bevorzugte Ausführungsformen für das Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die oben diskutierten bevorzugten Zusammensetzungen umfassen.
Wie oben bemerkt, wird das Polyanionenmaterial zuerst mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die neutrale Lipide und kationische Verbindungen umfasst, um einen Polyanionenmaterial-Liposom-Komplex zu liefern. Der Kontakt kann entweder vor der Liposom-Bildung (aus den neutralen Lipiden und kationischen Verbindungen) oder anschließend an eine anfängliche Liposom-Bildung erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Liposomen aus neutralen Lipiden und den kationischen Verbindungen zuerst gebildet und dann in Kontakt mit den Polyanionenmaterialien gebracht. Die Polyanionenmaterialien werden typischerweise an die Oberfläche des Liposoms als Folge der ionischen Anziehung zwischen dem negativ geladenen Polyanionenmaterial und der positiv geladenen Oberfläche des Liposoms binden. Typischerweise wird der Kontakt zwischen dem Polyanionenmaterial und dem Liposom, welcher zur Bildung eines Komplexes führt, bei Temperaturen von ungefähr 15ºC bis ungefähr 45ºC, bevorzugt bei ungefähr 25ºC ausgeführt werden. Der Zeitraum, der zum Vervollständigen der Bildung eines Komplexes erforderlich ist, wird von der Temperatur, wie auch von der Natur des Polyanionenmaterials und des Liposoms selbst abhängen. Wenn Kontakttemperaturen von ungefähr 25ºC verwendet werden, wird der Zeitraum zum Bilden eines Komplexes zwischen einem Liposom und einer Nukleinsäure ungefähr 15 Minuten bis ungefähr 2 Stunden lang dauern, jedoch in manchen Beispielen können längere Zeiten erforderlich sein. Alternativ können die Polyanionenmaterialien in das Innere der Liposomen durch Verfahren eingebaut werden, die zum Eintragen herkömmlicher Arzneimittel verwendet werden und dem Fachmann bekannt sind. Ein Verfahren zum Eintragen von Arzneimitteln in Liposomen beinhaltet eine Einkapselung und kann durch eine Vielfalt von Techniken ausgeführt werden.
In einer Einkapselungs-Technik werden die Arzneimittel- und Liposomenkomponenten in einem organischen Lösemittel aufgelöst, in dem alle Spezien mischbar sind, und zu einem trockenen Film konzentriert. Ein Puffer wird dann zu dem getrockneten Film hinzugefügt und Liposomen werden gebildet, bei denen das Polyanionenmaterial in die Vesikel-Wände eingebaut ist. Alternativ kann das Polyanionenmaterial in einen Puffer gegeben werden und zu einem getrockneten Film aus ausschließlich Lipid- Komponenten hinzugefügt werden. Auf diese Weise wird das Polyanionenmaterial in dem wässrigen Inneren des Liposoms eingekapselt. Der Puffer, welcher bei der Bildung der Liposomen verwendet wird, kann jede biologisch kompatible Pufferlösung aus beispielsweise isotonischer Salzlösung, phosphatgepufferter Salzlösung oder anderen Puffern mit niedriger Ionenstärke sein. Allgemein wird das Polyanionenmaterial in einer Menge von ungefähr 0,01 ng/ml bis ungefähr 50 mg/ml vorhanden sein. Die resultierenden Liposomen, bei denen das Polyanionenmaterial in dem wässrigen Inneren oder in der Membran eingebaut ist, werden dann ggf. wie oben beschrieben auf eine Größe gebracht.
In einer Gruppe von bevorzugten Ausführungsformen werden die Polyanionenmaterial : Liposom-Komplexe Ladungsverhältnisse (+/-) von ungefähr 0,5 bis ungefähr 4,0 besitzen. Um diese Ladungsverhältnisse zu erreichen, werden die Komplexe durch Erzeugen einer wässrigen Liposom- Formulierung des kationischen Lipids und mindestens eines neutralen Lipids gebildet, in der das kationische Lipid zu ungefähr 25% bis ungefähr 75% der gesamten Lipid-Konzentration vorhanden ist. Nach dem in Größe Bringen der Liposomen, wie oben diskutiert, wird eine wässrige Lösung des Polyanionenmaterials mit der Liposom-Suspension behandelt. Das resultierende Präparat wird dann, bevorzugt ungefähr fünffach, mit einem biologisch kompatiblen Puffer verdünnt, um eine Endkonzentration von 0,05 bis 1,0 ug/ml des Polyanionenmaterial : Liposom-Komplexes mit einem Ladungsverhältnis von ungefähr 0,5 bis ungefähr 4,0 zu liefern.
Nach der Bildung eines Polyanionenmaterial : Liposom-Komplexes folgend wird der Komplex mit den zu transfizierenden Zellen in Kontakt gebracht. Liposomen können an fast jeden Zelltyp adsorbiert werden. Sind sie einmal adsorbiert, können die Liposomen (einschließlich der zuvor beschriebenen Komplexe) entweder von einem Teil der Zellen durch Endocytose aufgenommen werden, Lipide mit Zellmembranen austauschen oder mit den Zellen fusionieren. Ein Transfer oder ein Einbau des Polyanionenteils des Komplexes kann über einen dieser Wege stattfinden. Insbesondere wird, wenn eine Fusion stattfindet, die liposomische Membran in die Zellmembran integriert und die Inhalte des Liposoms mit der intrazellularen Flüssigkeit kombiniert. Der Kontakt zwischen den Zellen und dem Polyanionenmaterial-Liposom-Komplex wird, wenn er in vitro ausgeführt wird, in einem biologisch kompatiblen Medium stattfinden. Die Konzentration des Lipids kann stark variieren, abhängig von der besonderen Anwendung, beträgt aber allgemein zwischen ungefähr 1 umol und ungefähr 10 mmol. Die Behandlung der Zellen mit dem Polyanionenmaterial: Liposom-Komplex wird allgemein bei physiologischen Temperaturen (ungefähr 37ºC) für Zeitdauern von ungefähr 1 bis 6 Stunden, vorzugsweise von ungefähr 2 bis 4 Stunden ausgeführt. Für in-vitro-Anwendungen kann die Zuführung von Polyanionenmaterialien an jede in Kultur gezogene Zelle erfolgen, ob sie pflanzlichen oder tierischen Ursprungs ist, von Wirbeltieren oder wirbellosen Tieren ist und von einem beliebigen Gewebe oder Typ ist. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Zellen tierische Zellen sein, bevorzugter Säugetierzellen und am meisten bevorzugt menschliche Zellen.
In einer Gruppe bevorzugter Ausführungsformen wird der Polyanionenmaterial : Liposom-Komplex zu 60 bis 80% konfluent angesetzten Zellen mit einer Zelldichte von ungefähr 10³ bis ungefähr 10&sup5; Zellen/ ml, bevorzugter ungefähr 2 · 10&sup4; Zellen/ml, hinzugefügt. Die Konzentration des zu den Zellen hinzugefügten Komplexes beträgt bevorzugt ungefähr 0,01 bis 0,2 ug/ml, bevorzugter ungefähr 0,1 ug/ml.
Typische Anwendungen umfassen gut bekannte Transfections-Prozeduren, um eine intrazellulare Zuführung von DNS- oder mRNS-Sequenzen bereitzustellen, die für therapeutisch nützliche Polypeptide codieren. Jedoch können die Zusammensetzungen auch für die Zuführung des exprimierten Genprodukts oder des Proteins selbst verwendet werden. Auf diese Weise ist eine Therapie für genetische Krankheiten durch Zuführen nicht ausreichender oder nicht vorhandener Genprodukte bereitgestellt (i. e. für Duchenne's Dystrophie, siehe Kunkel et al., Brit. Med. Bull. 45 (3): 630-643 (1989) und für zystische Fibrose, siehe Goodfellow, Nature 341: 102-103 (1989)). Andere Verwendungen der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen das Einbringen von Gegensinn-Oligonukleotiden in Zellen (siehe Bennett, et al., Mol. Pharm. 41: 1023-1033 (1992)).
Alternativ können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch für die Transfection von Zellen in vivo verwendet werden, unter Verwenden von Verfahren, welche dem Fachmann bekannt sind. Insbesondere beschreibt Zhu, et al., Science 261: 209-211(1993) die intravenöse Zuführung des Zytomegalovirus(CMV)-Chloramphenicolacetyltransferase(CAT)-Expressionsplasmids unter Verwenden von DOTMA-DOPE- Komplexen. Hyde et al., Nature 362: 250-256 (1993) beschreibt die Zuführung des cystic fibrose transmembran conductance regulator(CFTR)-Gens an Epithelzellen der Luftwege und an Alveolen in der Lunge von Mäusen, unter Verwenden von Liposomen. Brigham, et al., Am. J. Med. Sci. 298: 278-281 (1989) beschreibt die in-vivo-Transfection von Mäuselungen mit einem funktionierenden prokaryotischen Gen, das das intrazellulare Enzym Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) codiert.
Wenn die in dem vorliegenden Verfahren verwendeten Polyanionenmaterialien Nukleinsäuren sind, können sie aus natürlichen Quellen isoliert werden, erhalten aus derartigen Quellen wie ATCC oder GenBank-Bibliotheken oder erzeugt durch synthetische Verfahren. Synthetische Nukleinsäuren können durch eine Vielfalt von Lösungs- oder Festphasen-Verfahren erzeugt werden. Allgemein ist die Festphasen-Synthese bevorzugt. Detaillierte Beschreibungen der Prozeduren für eine Festphasen-Synthese von Nukleinsäuren durch chemische Prozesse mit Phosphit-Triester, Phosphotriester und H-Phosphonat sind weit verbreitet erhältlich. Siehe z. B. Itakura, U.S. Pat. Nr. 4,401,796; Caruthers, et al., U.S. Pat. Nr. 4,458,066 und 4,500,707; Beaucage, et al., Tetrahedron Lett., 22: 1859- 1862 (1981); Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103: 3185-3191 (1981); Caruthers, et al., Genetic Engineering, 4: 1-17 (1982); Jones, Kapitel 2, Atkinson, et al., Kapitel 3 und Sproat, et al., Kapitel 4 in Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gait (Herausgeber), IRL Press, Washington D.C. (1984); Froehler, et al., Tetrahedron Lett., 27: 469-472 (1986); Froehler, et al., Nucleic Acids Res., 14: 5399-5407 (1986); Sinha, et al., Tetrahedron Lett., 24: 5843-5846 (1983); und Sinha, et al., Nucl. Acids Res., 12: 4539-4557 (1984).
Die vorliegende Erfindung ist auch zum Einbringen anderer Polyanionenmaterialien in Zellen nützlich, insbesondere von Proteinen. Das Einbringen von exogenen oder endogenen Proteinen in eine Zelle kann eine geeignete Therapie für ein Individuum liefern, das Zellen hat, welche unfähig sind, eine Translation der mRNS auszuführen.
Die folgenden Beispiele werden nur zum Zwecke der Veranschaulichung gegeben und dienen weder zur Beschränkung noch zur Definition der Erfindung.

BEISPIELE

Materialien

Oleylamin wurde von Fluka Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA erhalten und wurde auch durch das unten beschriebene Verfahren synthetisiert. 40%-ige Formaldehyd-Lösung wurde von Fischer Scientific, Ottawa, Kanada erhalten. Natriumcyanborhydrid, Stearylbromid, Ölsäure, Oxalylchlorid, Lithium-Aluminium-Hydrid, Methyliodid und N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA erhalten. N-(7-Nitrobenz-2-oxa- 1,3-diazol-4-yl)dioleoylphosphatidyl-ethanolamin (NBD-PE), N-(Lissaminerhodamin-8-sulfonyl)dioleoylphosphatidyl-ethanolamin (Rho-PE) und 1,2- sn-Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) wurden von Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA erhalten. Der Lipex-Extruder wurde von Lipex Biomembranes, Vancouver, Kanada erhalten. Der pCMVβ-Expressionsvektor (β-gal) wurde von Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, Kalifornien, USA erhalten. Silicagel wurde von BDH, Kanada erhalten. PEG-Cer-C&sub1;&sub4;, PEG-Cer-C&sub2;&sub0; und andere PEG-modifizierte Lipide können durch die Verfahren erzeugt werden, die in Parr et al., Biochim. Biophys. Acta 1195: 21-30 (1994) bereitgestellt sind.

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel veranschaulicht die Erzeugung von Oleylamin. Diese Synthese wurde entwickelt, da kommerzielles Oleylamin oft mit Elaidylamin kontaminiert ist.
Eine Lösung von Ölsäure (5 g) in Benzol wurde mit Oxalylchlorid (1 ml) unter Rühren bei Raumtemperatur eine Stunde lang behandelt. Das Lösemittel wurde dann durch Destillation entfernt. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid aufgelöst und konzentrierter wässriger Ammoniak wurde hinzugefügt. Die resultierende Emulsion wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Entfernen von Ammoniak unter Vakuum wurde die Lösung mit Salzsäure angesäuert und mit Methylenchlorid extrahiert. Der organische Extrakt wurde getrocknet, gefiltert und unter reduziertem Druck konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde in Diethylether aufgelöst und ein Überschuss an Lithium-Aluminium- Hydrid wurde als Pulver unter kräftigem Rühren langsam hinzugefügt. Eine gelatinartige Lösung bildete sich und wurde zusätzliche 4 Stunden lang gerührt. Methanol wurde dann langsam hinzugefügt, bis die Wasserstoff-Entwicklung aufhörte. Ein Überschuss an verdünnter Salzsäure wurde hinzufügt, bis alle Feststoffe aufgelöst waren und keine weitere Wasserstoff-Entwicklung beobachtet wurde. Die Mischung wurde dann mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigter Salzlösung gewaschen, und das Lösemittel wurde in einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde durch eine Silicagel-Säule (Merck Art. 9385, 20 g Gel pro g des Reaktionsprodukts) unter Verwenden von 2% Methanol in Methylenchlorid (Volumen-%) geschickt, bis alle Verunreinigungen (Oleylalkohol und nicht reduziertes Oleoylamid) eluiert waren. Die Methanolkonzentration wurde dann in 2% Schritten pro 250 ml des Eluenten erhöht, bis eine Konzentration von 24% erreicht war. Die Säule wurde dann mit Methanol gespült. Die Entfernung von Lösemittel aus jenen Fraktionen, die ein Produkt enthielten, lieferte 3 g Oleylamin ohne einen Nachweis von Elaidylamin in dem ¹H-NMR-Spektrum.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel veranschaulicht die Synthese von N-Stearyl-N-oleyl-N,N- dimethylammoniumchlorid (OSDAC).

2.1 Synthese von N,N-Dimethyloleylamin

Einer Lösung von Oleylamin (6,7 g) in Acetonitril (100 ml) und Ethanol (50 ml) wurde mit 40%-igem wässrigem Formaldehyd (10 ml) und Natriumcyanborhydrid (2,7 g) bei Raumtemperatur zwei Stunden lang behandelt. Essigsäure (5 ml) wurde langsam hinzugefügt, und die Lösung wurde eine zusätzliche Stunde lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Wasser verdünnt, mit wässrigem Natriumhydroxid basisch gemacht und mit Methylenchlorid extrahiert, die organische Fraktion wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch eine Silicagel-Säule (150 g) unter Verwenden von 15% Methanol in Methylenchlorid als den Eluenten geschickt, um ein blassgelbes Öl zu liefern (5 g).

2.2. Synthese von OSDAC

Eine Lösung von N,N-Dimethyloleylamin (1 g) und Stearylbromid (5,4 g) wurde in Methylenchlorid (50 ml) aufgelöst und mit wässriger Natriumhydroxid-Lösung (5 ml einer 5-molaren Lösung) bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren behandelt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser gewaschen und dann mit verdünnter Salzsäure gewaschen. Die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (15X) gewaschen und das Lösemittel wurde entfernt. Der Rückstand wurde in methanolischer Salzsäure aufgelöst und mit Wasser und Methylenchlorid extrahiert. Dies wurde zusätzliche drei Male wiederholt. Das organische Lösemittel wurde dann unter Vakuum entfernt und der Rückstand durch eine Silikagel-Säule (150 g) unter Verwenden von 5% Methanol in Methylenchlorid als den Eluenten geschickt, um 0,6 g OSDAC als ein weißes Pulver nach der Lyophilisierung aus 10% Methanol in Benzol zu liefern.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die Synthese von N,N-Dioleyl-N,N- dimethylammoniumchlorid (DODAC) unter Verwenden einer reduktiven Amidierung.

3.1. Synthese von N-Oleyloleoylamid

Eine Lösung von Ölsäure (5 g) in Benzol (50 ml) wurde mit Oxalylchlorid (2 ml) bei Raumtemperatur eine Stunde lang behandelt. Das Lösemittel und der Überschuss Oxalylchlorid wurden unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in Benzol (20 ml) aufgelöst. Eine Lösung von Oleylamin (7 g) in Benzol (10 ml) wurde langsam hinzugefügt, gefolgt von Triethylamin (3 ml). Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt und dann mit einem Überschuss verdünnter Salzsäure neutralisiert. Die Mischung wurde mit Methylenchlorid extrahiert, und die kombinierten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und das Lösemittel wurde entfernt. Der Rückstand wurde durch eine Silicagel-Säule (150 g) unter Verwenden von 5% Methanol in Methylenchlorid als den Eluenten geschickt, um N- Oleyloleoylamid als einen weißen Feststoff zu liefern.

3.2 Synthese von Dioleylamin

Eine Lösung von N-Oleyloleoylamid (oben erzeugt) in THF (100 ml) wurde auf 40ºC erwärmt. Lithium-Aluminium-Hydrid wurde langsam hinzugefügt, bis die kräftige Entwicklung von Gas aufhörte. Die Reaktionsmischung wurde unter Rückfluss eine Stunde lang erwärmt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Methanol (100 ml) wurde langsam hinzugefügt, gefolgt von Wasser (200 ml). Methylenchlorid wurde hinzugefügt und die resultierende Suspension wurde 15 Minuten lang gerührt. Der Schlamm wurde gefiltert und das Präzipitat wurde mit Ethanol/Methylenchlorid (50 : 50, 50 ml; 2x) gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Fraktion wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch eine Silicagel-Säule (150 g) unter Verwenden von 5% Methanol in Methylenchlorid als den Eluenten geschickt, um Dioleylamin als blasses gelbes Öl zu liefern.

3.3 Synthese von N,N-Dioleyl-N,N-dimethylammoniumchlorid

Eine Lösung von Dioleylamin, das oben erzeugt wurde, in Chloroform (50 ml) wurde mit Methyliodid (10 ml) bei Raumtemperatur eine Stunde lang behandelt. Wässriges Natriumhydroxid (1 ml einer 5-molaren Lösung) und Methyliodid (5 ml) wurden dann hinzugefügt und die Mischung wurde eine zusätzliche Stunde lang gerührt. Das organische Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt und der resultierende Schlamm wurde mit verdünnter Salzsäure neutralisiert. Wasser wurde hinzugefügt und die Reaktionsmischung wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (15X) gewaschen, anschließend wurde das Lösemittel aus der organischen Phase unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in einer Lösung konzentrierter Salzsäure in nassem Ethanol aufgelöst, mit Wasser verdünnt und mit Methylenchlorid extrahiert. Dieser Prozess wurde zusätzliche drei Male wiederholt. Das Produkt wurde nach dem Entfernen des Lösemittels durch eine Silicagel-Säule (150 g) unter Verwendung von Methanol in Methylenchlorid als den Eluenten geschickt (wobei die Menge von Methanol von 5 Vol.-% auf 32 Vol.-% gesteigert wurde). Reine Fraktionen wurden kombiniert und das Lösemittel wurde entfernt, um N,N-Dioleyl-N,N-dimethylammoniumchlorid (5 g) entweder als weißen wachsartigen Feststoff oder als ein farbloses Öl, das sich beim Stehen verfestigte, zu liefern. Das DODAC kann dann durch Lyophilisieren aus 10% Methanol in Benzol als ein weißes klebriges Pulver verfestigt werden.

BEISPIEL 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die Synthese von N,N-Dioleyl-N,N- dimethylammoniumchlorid (DODAC) durch einen Alkylierungs-Weg.
Eine Lösung von Dimethylamin wurde durch 30-minütiges Hindurchperlenlassen von wasserfreiem Dimethylamin-Gas durch trockenen Methanol (200 ml) erzeugt. Oleylbromid (5 g) wurde hinzugefügt und die Lösung wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln 16 Stunden lang gerührt. Das Lösemittel wurde in einem Rotationsverdampfer entfernt und das zurückbleibende Dimethylamin wurde durch zwei Zugaben von wasserfreiem Ethanol (50 ml) entfernt gefolgt von der Entfernung des Lösemittels in einem Rotationsverdampfer. Oleylbromid (10 g) wurde zu dem Rückstand hinzugefügt und die Mischung wurde in Chloroform (40 ml) aufgelöst. Natriumhydroxid-Lösung (10 ml von 1 N) wurde hinzugefügt und die resultierende Lösung wurde 16 Stunden lang im Dunkeln am Rückfluss gekocht.
Das organische Lösemittel wurde in einem Rotovap entfernt und der Rückstand wurde in Ethanol (50 ml) aufgelöst. Konzentrierte HCl (33%-ig, 10 ml) wurde hinzugefügt, gefolgt von destilliertem Wasser (100 ml). Die resultierende Emulsion wurde mit Chloroform extrahiert (3 · 50 ml, gefolgt von 2 · 25 ml). Die Extrakte wurden kombiniert und der Wasch- /Extraktions-Prozedur weitere fünf Zyklen lang wieder unterzogen. Das organische Lösemittel wurde dann in einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand wurde in gesättigter Natriumchlorid-Lösung suspensiert. Die Lösung wurde mit Chloroform extrahiert (3 · 50 ml, gefolgt von 2 · 25 ml). Dieser Prozess wurde wiederholt. Das organische Lösemittel wurde in einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand wurde durch zwei Zugaben von trockenem Ethanol gefolgt von der Entfernung des Lösemittels in einem Rotationsverdampfer getrocknet. Der Rückstand wurde unter Verwenden einer Silicagel-Chromatographie (200 g Silicagel) und einer Gradienten-Elution mit Methanol in Chloroform (von 2% bis 12 % Methanol) gereinigt. Fraktionen, die reines DODAC enthielten, wurden kombiniert und das Lösemittel wurde entfernt, um 7 g eines farblosen, klebrigen Mehls zu liefern. Die Lyophilisierung mit 10% Methanol im Benzol lieferte DODAC als ein farbloses klebriges Pulver.

BEISPIEL 5

Dieses Beispiel veranschaulicht die fusogenen Eigenschaften kationischer Vesikel/DNS-Komplexe mit Biomembranen.

5.1. Vesikel-Vesikel-Fusion.

Die Vesikel, die für diese Experimente verwendet wurden, wurden durch die Extrusions-Prozedur wie zuvor beschrieben erzeugt (siehe Hope et al., Biochim. Biophys. Acta 812: 55 (1985), durch Bezugnahme hier enthalten). Kurz gesagt wurden die kationischen Lipid-Mischungen, die aus gleichen molaren Verhältnissen des kationischen Lipids und DOPE bestanden, aus Chloroform unter einem Strom von Stickstoffgas eingetrocknet. Das zurückbleibende Lösemittel wurde unter Vakuum zwei Stunden lang entfernt. Der trockene Lipidfilm wurde in destilliertem Wasser hydratisiert und die resultierende multilamellare Vesikel(MLV)-Suspension wurde fünfmal unter Verwenden von flüssigen Stickstoff und Warmwasser- Zyklen ausgefroren. Große unilamellare Vesikel wurden dann dadurch geformt, dass die MLV-Suspension durch zwei gestapelte Filter mit Porengrößen von 100 nm unter Verwenden des Lipex-Extruders gebracht wurde.
Die Vesikelfusion wurde unter Verwendung eines Resonanz-Energie- Transfers wie zuvor in Struck, et al., Biochemistry 20: 4093 (1981) beschrieben, durch Bezugnahme hier enthalten, überwacht. Kurz gesagt wurden unmarkierte Vesikel 10 : 1 mit ähnlichen Vesikeln, die jeweils 0,5 mol-% von Rho-PE (N-(Lissaminerhodamin-B-sulfonyl)dioleoylphosphatidylethanolamin) und NBD-PE (N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol- 4-yl)-dioleoylphosphatidylethanolamin) in 20 mmolarem HEPES-pH 7,4- Puffer gemischt. Die letztere Membran-Fluoreszenz-Sonde dient als der Energie-Donor und die erstere als der Energie-Akzeptor. Eine Fusion von markierten Vesikeln mit unmarkierten Vesikeln führt zur Sondenverdünnung. Daher würde ein Anstieg in der NBD-PE-Fluoreszenz aufgrund einer Verringerung der Rho-PE-Vesikel eine Membranfusion anzeigen. Ein 7 kB- β-gal-Plasmid wurde verwendet, um die Fusion der kationischen Vesikel zu induzieren. Fig. 1 zeigt die Ergebnisse, die aus Fusionsexperimenten mit DOTMA : DOPE und DODAC : DOPE mit Plasmid-DNS erhalten wurden. Die Ladungsverhältnisse wurden basierend auf dem durchschnittlichen Nukleotid-Molekulargewicht von 325 berechnet. Wie Fig. 1 anzeigt, fusionieren sowohl DOTMA : DOPE- als auch DODAC : DOPE-Vesikel in einem ähnlichen Ausmaß bei allen Ladungsverhältnissen und zeigen optimale fusogene Eigenschaften bei einem Ladungsverhältnis von 1, was dem optimalen Ladungsverhältnis für die Transfection beider Spezien entspricht (siehe Fig. 4).

5.2. Fusion von Lipid-DNS-Komplex mit Rote-Blutkörperchen(RBC)- Ghosts.

Kationische Vesikel, die jeweils mit 0,5% von Rho-PE und NBD-PE markiert wären, wurden mit einem 7 kB-β-gal-Plasmid in 20 mmolaren HEPES-pH 7,4-Puffer gemischt. Der Lipid-DNS-Komplex wurde dann zu einer Lösung von RBC-Ghosts hinzugefügt. Die Fusion mit der Ghost- Membran würde zu einer Sonden-Verdünnung und einem Anstieg in der NBD-Fluoreszenz führen. RBC-Ghosts wurden wie zuvor in der Literatur beschrieben erzeugt (siehe Wood, Methods in Enzymology, 149: 271-280 Academic Press (1987)). Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der Lipid/ DNS- Komplex-RBC-Ghost-Fusionsexperimente unter Verwenden dreier verschiedener Ladungsverhältnisse und vier verschiedener kationischer Lipide (DDAB, DOTMA, OSDAC und DODAC). Wie Fig. 2 veranschaulicht, besitzen ungesättigte Derivate, DOTMA, DODAC und OSDAC überlegene Fusionseigenschaften in Bezug auf biologische Membranen im Vergleich zu dem gesättigten Derivat DDAB. Zusätzlich zeigen DODAC und OSDAC bessere fusogene Eigenschaften mit RBC-Ghosts als DOTMA, welches das am meisten allgemein verwendete kommerzielle Transfections-Lipid ist.

BEISPIEL 6

Dieses Beispiel liefert eine Prozedur, durch die BHK-Zellen unter Verwenden eines β-gal-Plasmids transfiziert werden können, und liefert auch einen Vergleich der relativen Transfections-Wirksamkeiten DODAC-, DDAB-, DOTMA- und OSDAC-enthaltender Vesikel.

6.1 Erzeugung von kationischen Liposomen

Kationische Liposomen wurden aus DOPE und DODAC, DDAB, DOTMA oder OSDAC durch das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren erzeugt. Die kationischen Lipide wurden jeweils mit DOPE vermischt, um Vesikel zu bilden, die Ladungsverhältnisse von 0,25, 0,5, 3 und 4 (jeweils für die vier Paare von Mischungen) besaßen.

6.2 Transfection von BHK-Zellen

Ein allgemeines Lipofections-Protokoll wurde wie folgt ausgeführt:
Am Tag 1 wurden BHK-Zellen mit 104 Zellen/Schälchen einer 24-Schälchen-Platte in 0,5 ml Medium (5% FBS in DMEM) angesetzt. Am zweiten Tag wurden Lipid : DNS-Komplexe in 24-Schälchen-Platten durch zuerst Verteilen von H&sub2;O in die Schälchen und dann Hinzufügen des Lipids erzeugt. Die DNS wurde in H&sub2;O präpariert und dann in die Schälchen hinzugefügt, zum Mischen geschüttelt und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Während der Inbubations-Dauer wurden die Medien von den Zellen entfernt und die Zellen wurden in PBS gewaschen. Nach dem Waschen wurden 750 ul SF-DMEM hinzugefügt.
Die Lipid : DNS-Komplexe (200 ul) wurden in die geeigneten Schälchen, die die BHK-Zellen enthielten, hinzugefügt, und die Platte wurde zum Mischen geschüttelt, dann bei 37ºC 4 Stunden lang inkubiert. Die Transfections-Medien wurden mit 0,5 ml von 5% FBS in DMEM ersetzt. Am Tag 3 wurden die Medien entfernt und die Zellen wurden gefärbt, einer Standardprozedur für die histochemische Färbung für β-Galactosidase folgend. Am Tag 4 wurde das Färbemittel entfernt und die Zellen wurden mit PBS gewaschen, mit 70%-igem Ethanol bedeckt und gezählt.

6.3 Histochemisches Färben auf β-Galactosidase

Die zum histochemischen Färben erforderlichen Lösungen umfassen Vorratspuffer, Fixativ, Waschlösung und Färbemittel. Diese Lösungen wurden wie folgt erzeugt und gelagert:
1. Vorratspuffer wurden als wässrige Lösungen unter Verwenden von destilliertem, deionisiertem Wasser erzeugt. Die Lagertemperaturen sind wie angezeigt. Die Lösungen umfassen: 47%-iges Glutaraldehyd, 4ºC; 1-molares MgCl&sub2;, RT; 100-mmolares EGTA, pH 7,2, RT; 10 %-iges Natriumdesoxycholat, RT; 10%-iges NP40, RT; 1-molares HEPES, 4ºC; 50-mmolares K&sub3;Fe(CN)&sub6;, 4ºC, im Dunklen bis zu drei Monate lang gelagert; 50-mmolares K&sub4;Fe(CN)&sub6;, 4ºC, im Dunkeln bis zu drei Monate lang gelagert; 5-molares NaCl, RT; und X-gal, ein Feststoff, wurde bei -20ºC gelagert.
2. Die Fixativ-Lösung besaß Endkonzentrationen von 0,2% Glutaraldehyd, 2-mmol MgCl&sub2; und 5-mmol EGTA und wurde durch Kombinieren von 220 ul von 47%-igem Glutaraldehyd, 100 ul MgCl&sub2;- Lösung und 2,5 ml 100-mmolares EGTA bei pH 7,2, und Angleichen des Gesamtvolumens auf 50 ml mit PBS erzeugt.
3. Die Waschlösung wurde durch Kombinieren von 100 ul MgCl&sub2;-Lösung; 500 ul 10%-iges Natriumdesoxycholat und 100 ul 10%-iges NP40 erzeugt und das Gesamtvolumen wurde auf 50 ml angeglichen. Dies führte zu Endkonzentrationen von 2-mmol MgCl&sub2;, 0,1% Natriumdesoxycholat und 0,02% NP40.
4. Das Färbemittel wurde durch Kombinieren von 2,2 ml 1-molares HEPES, 3,0 ml 50-mmolares K&sub3;Fe(CN)&sub6;, 3,0 ml 50-mmolares K&sub4;Fe(CN)&sub6;, 150 ul 5-molares NaCl, 65 ul 1-molares MgCl&sub2; und H&sub2;O erzeugt, um ein Gesamtvolumen von 50 ml zu liefern. Die Lösung wurde auf 42ºC erwärmt und 12,5 mg X-gal in 100 ul DMF (0,4% Endvolumen) wurde hinzugefügt und aufgelöst. Alternativ kann das X-gal im DMF bei 125 ug/ul erzeugt und bei -20ºC in Folie gelagert werden. Die Endkonzentrationen der Spezien in Lösung betrugen 44 mmol HEPES, 3 mmol K&sub3;Fe(CN)&sub6;, 3 mmol K&sub4;Fe(CN)&sub6;, 15 mmol NaCl, 1,3 mmol MgCl&sub2; und 0,5 mg/ml X-gal.
Die Zellen wurden wie folgt gefärbt:
Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen. Fixativ (5 ml) wurde zu jeder Platte hinzugefügt und die Zellen wurden bei RT für fünf Minuten inkubiert. Das Fixativ wurde entfernt und die Zellen wurden zweimal mit Permeabilisierungs-Lösung (jeweils 3 Minuten lang) gewaschen. X-gal- Färbemittel (500 ul pro Schälchen) wurde zu den Zellen hinzugefügt, welche dann über Nacht bei 37ºC in einer Kohlendioxid-Atmosphäre inkubiert wurden. Der pH all dieser Lösungen wurde bei 7,5 bis 8,0 gehalten, um Hintergrund-Interferenz endogener β-Galactosidase zu vermeiden.

6.4 Ergebnisse

Fig. 3 liefert einen Überblick über die relativen Transfections- Wirksamkeiten der vier Lipide DDAB, DOTMA, OSDAC und DODAC bei vier Ladungsverhältnissen (0,25, 0,5, 3 und 4). Die relative Transfections- Wirksamkeit ist die durchschnittliche Anzahl von transfizierten Zellen auf 25 willkürlichen Flächen auf der Zell-Platte. DODAC zeigt signifikant bessere relative Transfections-Wirksamkeiten bei Ladungsverhältnissen im Überschuss von 1, wohingegen DDAB, DOTMA und OSDAC alle ähnlich sind. Alle Präparate haben niedrige Transfections-Wirksamkeiten unterhalb eines Ladungsverhältnisses von 1. Der Vergleich zwischen DDAB und DODAC ist besonders wichtig, da es den Effekt von Nichtsättigung auf die Transfections-Wirksamkeit demonstriert.
Die Transfections-Wirksamkeit, ausgedrückt in der Anzahl transfizierter Zellen zur Gesamtzahl der Zellen, von DODAC und DOTMA bei verschiedenen Ladungsverhältnissen ist in Fig. 4 gezeigt. Eine optimale Transfection für beide Systeme tritt bei Ladungsverhältnissen zwischen 1 und 2 auf, und schwächt sich bei höheren Ladungsverhältnissen ab. Die Transfections-Wirksamkeit bei Ladungsverhältnissen unter 1 ist beträchtlich geringer, in Übereinstimmung mit den in Fig. 3 dargestellten Ergebnissen.

BEISPIEL 7

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung verschiedener kationischer Liposom-Vesikel, um die Transfection von kultivierten Myoblasten zu liefern.
Ein signifikantes Interesse entwickelte sich bei der Verwendung einer Therapie mit genetisch veränderten Myoblasten zur Behandlung von Erbkrankheiten, wie beispielsweise Duchenne's Muskel-Dystrophie oder Hämophilie A oder B. Dieser ex-vivo-Ansatz bedient sich des Vorteils der Fähigkeit von Myoblasten, mit Myotuben zu fusionieren, wenn sie in Skelettgewebe injiziert werden. Auf diese Weise können genetisch veränderte Myoblasten verwendet werden, um Korrektiv-Gene auf Muskelfasern zu transferieren. Virale Vektoren oder nackte DNS sind die am meisten verwendeten Vektoren, um Muskelzellen zu transfizieren. Die starken Immunantworten, die aus der Verwendung viraler Vektoren resultiert, limitiert ihre Verwendung. Die Injektionen nackter DNS sind sehr ineffizient beim Transfizieren von Muskelzellen.

7.1 Zellen und Kultur-Bedingungen

H9C2(2-1), eine Muskelzelllinie, die aus fötalem Rattenherz erhalten ist, wurde aus ATCC erhalten. Die Zellen wurden in α-Minimal Essential Medium (α-MEM) vermehrt, mit 10%-igem fötalem Rinderserum (FBS) und 10 mg/ml Gentamicin (Normalwachstumsmedium) ergänzt. Die Kulturen wurden bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; gehalten. Transfectionen wurden in 24-Schälchen-Platten (2 cm² Oberfläche) ausgeführt. Die Zellen wurden in drei verschiedenen Stufen transfiziert: 50% konfluente Myoblasten, 100% konfluente Myoblasten und differenzierte Myotuben. Myoblasten wurden am Tag vor der Transfection mit ungefähr 3 · 10&sup4; und 7 · 10&sup4; Zellen/cm² für sub-konfluente bzw. konfluente Dichten angesetzt. Die Myotubenbildung wurde durch Ersetzen des Normalwachstumsmediums mit Fusionsmedium (α-MEM, das 2% FBS und 10 mg/ml Gentamicin enthält) induziert, wenn die Zellen konfluent waren. Nach 4 Tagen im Fusionsmedium wurden die Myotuben transfiziert.

7.2 Plasmid

pCMVβ (von Clonetech) ist ein Plasmid, das das β-Galactosidase-Gen enthält, das durch den CMV-Promotor und den SV40-Enhancer angetrieben wird. pCMVβ wurde Standardtechniken folgend gezogen und mittels Qiagen Maxi-Säulen gereinigt (Qiagen, Chatworth, Kalifornien, USA).

7.3 Kationische Liposomen

Liposom-Formulierungen bestanden aus DODAC : DOPE (3 : 7 mol/mol) oder DODAC : DOPE (3 : 7 mol/mol), die 2 oder 5 mol-% PEG-Cer-C&sub1;&sub4; enthielten. Kommerziell erhältliches LIPOFECTAMINE® (von Gibco, polykationische Liposome, die DOSPA (2,3-Dioleyloxy-N-(2- spermincarboxamid) ethyl)-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoracetat) und DOPE in einem 3 : 1 molaren Verhältnis enthielten) wurde zum Vergleich verwendet.

7.4 Transfectionen

Plasmid-DNS (290 ng) in 15 ul eines Puffers aus 20-mmolarem HEPES, pH 7,4 wurde zu 10 ul serumfreien Medium (α-MEM) hinzugefügt. Die resultierende Mischung wurde dann zu 20 ul serumfreien Medium, das die erwünschte Menge kationischer Liposomen enthielt, hinzugefügt. Die Mischung wurde 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann auf 200 ul Gesamtvolumen mit serumfreien Medium oder mit α- MEM, das 12,5% oder 2,5% FBS für Myoblasten bzw. Myotuben enthielt, verdünnt. Zellen, die in einer 24-Schälchen-Gewebekulturplatte wuchsen, wurden zweimal mit serumfreien Medium gespült und dann 5 Stunden lang in Anwesenheit der Transfectionsmischung inkubiert. Der 5 Stunden Inkubation folgend wurden 200 ul eines α-MEM, das zweimal die normale Menge von FBS enthielt, hinzugefügt. Nach 24 Stunden wurde das Medium durch 500 ul frisches Medium ersetzt. Nach weiteren 24 Stunden wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung zweimal gespült und dann mit 100 ul eines Zell-Lyse-Puffers (von Promega, Madison, Wisconsin, USA) lysiert. Die β-Galactosidase-Aktivität wurde wie oben beschrieben gemessen. Der Bradford-Proteinassay (von Pierce, Rockford, Illinois, USA) wurde verwendet, um die Proteinkonzentration der Lysate zu ermitteln. Die β-gal-Aktivität wurde auf die Proteinkonzentration jeder Probe normiert.

7.5 Ergebnisse

Wie in Fig. 5 bis 7 gezeigt ist, sind DODAC-enthaltende Liposomen fähig, H9C2-Myoblasten und -Myotuben zu transfizieren. Die Transfection ist abhängig von der Menge des kationischen Liposoms, das zu den Zellen gegeben wird, wie auch von dem Zustand der Konfluenz und der Differentiation. Außerdem kann die Transfection in Anwesenheit eines Serums ausgeführt werden. Zusätzlich sind, wenn die Transfectionen in Anwesenheit von Serum ausgeführt werden, die DODAC-enthaltenden Liposomen effizienter beim Transfizieren von Myoblasten und Myotuben als die optimalen Mengen des kommerziell erhältlichen LIPOFECTAMINE®. Bis jetzt war LIPOFECTAMINE® die einzige kationische Liposom-Formulierung, für die erkannt wurde, dass sie die Fähigkeit hat, Zellen in Anwesenheit von Serum zu transfizieren. Diese Ergebnisse, insbesondere die Fähigkeit, Myotuben in Anwesenheit von Serum zu transfizieren, zeigen an, dass die DODAC-enthaltenden Systeme Gene an Muskelzellen direkt in vivo liefern können.

BEISPIEL 8

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung verschiedener kationischer Liposomvesikel, um Lymphozyt- und Makrophagen-Zelltypen in vitro zu transfizieren.
Strategien für die Behandlung viraler Infektionen, wie beispielsweise HIV- 1 (AIDS) werden zunehmend auf Gentherapie-Ansätze gerichtet, aufgrund des Fehlens von Arzneimitteln oder Vakzinen, die eine Langzeit- Wirksamkeit in vivo zeigen. Ein Poly-TAR/Anti-Tat-anti-HIV-I-Gen-System wurde entwickelt, das bewirkt, dass die HIV-I-Replikation verhindert wird (siehe Lisziewicz, et al., J. Virol. 69: 206-212 (1995)). Nichtsdestotrotz bleibt die Zuführung des Gens an die Zielstelle ein Problem. Die hauptsächlichen Zielzellen sind CD4&spplus;-T-Lymphozyten und Makrophagen, da diese die Zellen sind, die dem Virus Unterschlupf gewähren. Dieses Beispiel veranschaulicht die Fähigkeit kationischer Liposomen, Gene an diese Zelltypen in Kultur zu liefern.

8.1. Tiere

Blutsverwandte C57BL/6-Mäuseweibchen (von Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA) wurden in dieser Studie verwendet. Die Mäuse wurden im Alter von 5 Wochen erworben und fünf pro Käfig in einem Kolonie- Raum (ohne Stessbedingung) gehalten, in dem ein Tag-Nacht (12 Stunden)-Zyklus über künstliche Beleuchtung aufrechterhalten wurde. Die Tiere erhielten während des Experimentes freien Zugang sowohl zu Futter als auch zu Wasser und mindestens eine einwöchige Akklimatisierungs- Periode vor den experimentellen Manipulationen.

8.2. Bildung von Transfections-Komplexen

DODAC : DOPE (1 : 1 mol/mol) Liposomen in Wasser (1-mmolare Konzentration) wurden durch die Extrusions-Prozedur erzeugt, wie oben beschrieben. pCMVβ (von InVitrogen, San Diego, Kalifornien, USA) wurde von E. coli-Lysaten unter Verwenden des Qiagen-Verfahrens (Qiagen, Chatworth, Kalifornien, USA) gereinigt.
Zur Bildung der Transfections-Komplexe wurden 20 ug pCMVβ (62 nmol Phosphat) in einem Volumen von 500 ul Wasser zu 186 nmol DODAC : DOPE in 500 ul Wasser hinzugefügt. Dieses Verhältnis von Lipid : DNS führte zu einem Ladungsverhältnis von 1,5 (+/-). Die Suspension wurde 20 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.

8.3 Mitogen-Stimulationsassay

Sieben Wochen alte Mäuse wurden durch Genickbruch getötet. Die Milz, die Thymusdrüse und das Knochenmark wurden entfernt und einzelne Zellsuspensionen wurden erzeugt. Die Zellularität dieser lymphoiden Organe wurde durch einen Trypanblau-Ausschlußtest ermittelt. Zellsuspensionen wurden auf die erwünschte Konzentration angeglichen (5 · 10&sup6;/ml für die Milz; 1 · 10&sup7;/ml für die Thymusdrüse und 2 · 10&sup6;/ml für das Knochenmark) und wurden in 48-Schälchen-Platten, 0,5 ml/Schälchen angesetzt. Die Zellen wurden sofort mit 50 ul von DODAC : DOPE/pCMVβ oder nach 48 Stunden mitogenischer Stimulation mit Concanavalin A (1, 2,5 und 5 ug/ ml; Sigma) und Lipopolysaccharid (2,5 und 5 ug/ml; Sigma) transiiziert. Die Zellen wurden für 48 Stunden in Anwesenheit des Transfectionsmittels inkubiert, wonach sie für die β-gal- Expression wie oben beschrieben gefärbt wurden. Getrennte Schälchen wurden für geeignete Kontrollen hergerichtet: keine Behandlung, nacktes pCMVβ oder DODAC : DOPE in Abwesenheit der Plasmid-DNS.

8.4 Ergebnisse

Die Transfection von primären Splenozyten, Thymozyten und Knochenmarkzellen unter Verwenden der kationischen Liposomen führte zu einem niedrigen Niveau von β-gal-positiven Zellen (< 5%). Die erreichten Niveaus lagen signifikant über jenen, die mit der reinen DNS-Kontrolle erhalten wurden, welche nur wenige β-gal-positiven Zellen (< 0,01%) besaßen und mit den nicht behandelten Zellen vergleichbar waren. In einigen Experimenten wurden nicht aneinander hängende Splenozyten von aneinander hängenden Zellen vor dem Fixieren und dem Färben auf β-gal-Aktivität getrennt. In mindestens zwei Experimenten färbten sich > 80% der aneinander hängenden Splenozyten (morphologisch Makrophagen ähnelnd) positiv auf β-gal-Aktivität. Wenige Zellen in der nicht aneinander hängenden Zellfraktion färbten sich auf β-gal-Aktivität. Diese Zellen, die klein und rund waren, ähnelten Lymphozyten. Beide, nichtstimulierten und stimulierten Zellen ergaben ähnlich niedrige Niveaus der Transfection. Die Expressions-Niveaus des pCMVβ-Expressionsvektors in Primärzellen wird als ziemlich niedrig eingeschätzt (basierend auf der Zeit, die für die Zellen zum Blauwerden erforderlich ist). β-gal-Assays sind relativ insensitiv, wobei sie mehrere hundert Kopien pro Zellen erfordern, um eine blaue Zelle zu erfassen. Deshalb sind mindestens für Primärzellen stärkere Säugetier-Expressionsvektoren erforderlich, um die Messung der β-gal-Reporter-Gen-Expression zu vereinfachen. Die immunologische Charakterisierung der Zellen ist erforderlich, um die Zellen, die transfiziert werden, zu identifizieren. Dieser in-vitro-Assay, in dem gemischte Primärzellkulturen verwendet wurden, die aus ganzen Organen erhalten wurden, ist sehr nützlich, um diese fusogenen kationischen liposomischen Systeme zum Gentransfer in Makrophagen und CD4&spplus;-T-Lymphozyten, den Zielzellen für ein Anti-HIV-Gen-Therapieprogramm, zu optimieren.

BEISPIEL 9

Dieses Beispiel liefert einen Vergleich der Transfectionseigenschaften einer DODAC : DOPE-Lipidmischung und einer DOTMA : DOPE-Lipidmischung.
Wenn kationische Lipide verwendet werden, um die tranzellulare Zuführung genetischer Konstrukte in vivo zu vermitteln, beinhaltet die Standardprozedur das Hinzufügen vorgeformter Vesikel zu einer DNS-Lösung und nachfolgendes Injizieren des Vesikel/DNS-Komplexes in das Tier. Unten ist ein Vergleich einer DODAC : DOPE-Lipidmischung mit einer DOTMA : DOPE (LIPOFECTIN®)-Lipidmischung angegeben.

9.1 Kationische Lipide

Die monokationischen Lipide, Dioleyldimethylammoniumchlorid (DODAC, Molekulargewicht = 584,6 g/mol) und 1,2-Dioleyloxy-3-(N,N,N- trimethylamin)propanchlorid (DOTMA, Molekulargewicht = 670 g/mol) wurden durch die hier beschriebenen Verfahren synthetisiert und durch eine Angleichung an das Verfahren im U.S. Patent Nr. 4,946,787 synthetisiert. Kurz gesagt wurde in dem in U.S. Patent Nr. 4,946,787 beschriebenen Verfahren Methylchlorid durch Methyliodid in Anwesenheit eines Überschusses von wässrigem Natriumhydroxid ersetzt. Das Iodidion wurde aus dem Produkt entfernt und gegen Chloridion durch Waschen des Produktes mit HCl, gefolgt von einer Salzlösung, ausgetauscht. DOPE wurde von Avanti Polar Lipids und von Northern Lipids bezogen.

9.2 Vesikelbildung

Ein dünner Lipid-Film wurde durch zuerst Mischen der Lipide in CHCl&sub3; und dann Entfernen des Lösemittels unter einem Strom von Stickstoffgas gebildet. Der Film wurde dann unter Vakuum 2 Stunden lang belassen, um restliches organisches Lösemittel zu entfernen. Eine multilamellare Vesikel-Suspension wurde durch Hydratisieren des Lipid-Films in destilliertem Wasser gebildet. Nach fünfmaligem Ausfrieren der MLV- Suspension unter Verwenden von flüssigem Stickstoff und 60ºC- Wasserzyklen, wurden die Vesikel durch zwei gestapelte Nukleopore-Filter mit einer Porengröße von 100 nm Durchmesser extrudiert.

9.3 Bildung eines kationischen Lipid/DNS-Komplexes

Die kationischen Vesikel und DNS wurden auf gleiche Volumina (600 ul) mit 5%-iger Glukose (Endkonzentration) verdünnt. Die Vesikel und die DNS würden dann schnell miteinander vermischt und für ein Minimum von 30 Minuten vor der Injizierung stehengelassen, aber innerhalb von 3 Stunden nach dem Mischen verwendet. Die Verwendung von Glas-Test- Röhrchen wurde vermieden, da DNS an Glas haftet. Wenn mehr als 1,2 ml des Komplexes benötigt wurde, wurden die Komplexe in 1,2 ml Aliquoten hergestellt und in einen Pool gebracht, da die Zugabe der Vesikel und der DNS zusammen in großen Volumina aufgrund ungleichen Mischens zu einer partikulären Lösung führt. Die Komplexe wurden typischerweise in 50 ug DNS/400 ul erzeugt.

9.4 Ladungsverhältnis-Berechnungen

Die physikalischen Eigenschaften der Komplexe (Fusion und DNS-Kondensation), wie auch die in-vitro Transfections-Daten sind als (+/-)- Ladungsverhältnisse ausgedrückt. Zum Beispiel beträgt das Molekulargewicht von DODAC : DOPE (1 : 1, Molverhältnis) 664 g/mol und das durchschnittliche Molekulargewicht eines DNS-Nukleotids beträgt 325 g/mol. Da ein DNS-Nukleotid eine negative Ladung besitzt, wird Komplexen, die mit 50 ug DNS und 0,92 umol oder 0,61 mg DODAC : DOPE gebildet sind, ein Ladungsverhältnis von 3 zugemessen.

9.5 CAT-Assay

pCMV&sub4;CAT (ein Geschenk von Dr. Hugh O'Brodovitch von The Sick Children's Hospital of Toronto, Toronto, Ontario, Canada) wurde als das Reporter-Gen in diesen Studien verwendet. Ein radioaktiver Phasenverteilungs-CAT-Enzymassay (wie unten beschrieben) wurde zum Bestimmen des Grades der Transfection verwendet.

Materialien:

250-mmolares Tris HCl/5-mmolarer EDTA-Puffer pH 7,8; Leupeptin- und Aprotinin (von Boehringer)-Vorratslösungen (0,1%), wiege jeweils 0,0025 g aus und füge beide zu 2,5 ml destilliertem Wasser hinzu. Mische, teile in Aliquote auf und lagere bei -20ºC bis zu 6 Monate lang oder lagere 1 Woche lang bei 4ºC; Phenylmethylsulfonylchlorid-Vorratslösung (PMSF) 10 mg/ml, hergestellt aus 0,05 g PMSF und 5 ml Isopropanol (lagere im Dunkeln bei Raumtemperatur bis zu 1 Jahr); vollständiger Homogenisierungs-Puffer (aus Tris HCl/EDTA-Puffer (100 ml), PMSF-Vorratslösung (350 ul, Endkonzentration 35 ug/ml), und Leupeptin/Aprotinin- Vorratslösung (50 ul, Endkonzentration 0,5 ul/ml)); BSA-Puffer, erzeugt aus dem vollständigen Homogenisierungs-Puffer + 2 mg/ml BSA, Fraktion V; n-Butyryl-Co-Enzym A(Sigma B1508 lyophilisiertes Pulver, das auf 5 mg/ml verdünnt ist und bei -20ºC in kleinen Aliquoten gelagert ist, um übermäßiges Ausfrieren zu vermeiden); CAT-Enzym (Sigma C8413 Chloramphenicol-Acetyltransferase); ¹&sup4;C-Chloramphenicol (NEN NEC-408A Chloramphenicol, D-threo-[Dichloracetyl-1,2-¹&sup4;C]-CAT-Assay-Qualität (TLC basierend), gelagert bei 4ºC und 1 : 10 in BSA-Puffer kurz vor der Verwendung verdünnt); gemischte Xylole (Aldrich); Paraoxon (Diethyl-n- nitrophenylphosphat, von Sigma ist eine Flüssigkeit mit 90%-iger Reinheit)-Vorratslösung wird durch Verdünnen der urspünglichen Flüssigkeit 1 : 80 in Isopropanol hergestellt (beachte: zum Erreichen einer End- Paraoxon-Konzentration von 5 umol in 130 ul der Reaktionsmischung, wird eine weitere 1 : 200-Verdünnung im Homogenisierungs-Puffer durchgeführt und 3,3 ul dieser 0,8-mmolaren Paraoxon-Lösung wird zu der Reaktionsmischung hinzugefügt); BCA-Protein-Reagens.

Verfahren:

A. Gewebe-Homogenisierungs-Prozedur:

Mäuse werden getötet, indem sie in einem Container gegeben werden, der mit Kohlendioxid geflutet ist. Die geeigneten Gewebe werden gesammelt und auf Eis gehalten oder im flüssigen Stickstoff gefroren. Ein Homogenisatiierungs-Puffer wird zu den Geweben hinzugefügt und die Mischung wird homogenisiert, um eine 25%-ige (0,25 g/ml)-Lösung mit Milz- und Leber-Geweben oder eine 40%-ige Lösung mit Lungen-Gewebe zu bilden. Die Mischungen werden unmittelbar in Mikrozentrifugen-Röhrchen transferiert und in flüssigem Stickstoff gefroren. Mit Leber-Proben ist es einfacher, eine 50%-ige Lösung zu homogenisieren, dann verdünne ein Aliquot zweimal, um eine 25%-ige Lösung zu erhalten. Ein Zell-Extrakt wird aus dem Gewebe-Homogenat durch dreimaliges Ausfrieren unter Verwenden von flüssigem Stickstoff und 37ºC-Wasser-Zyklen gebildet. Der resultierende Extrakt wird bei 10.000 U/min (hohe/volle Mikrozentrifugen- Geschwindigkeit) 10 Minuten lang zentrifugiert, um die Zell-Debris zu pelletisieren. Der Überstand wird dann wie oben zentrifugiert (10000 U/min 10 Minuten lang) und in eine neues Mikrozentrifugen-Röhrchen transferiert und bei -70ºC gelagert, bis er für einen Assay auf CAT- Aktivität bereit ist.

B. Proteinassay des Zell-Extraktes

Ein Proteinassay wird benötigt, um die Menge der CAT-Aktivität zu normieren. Unter Verwenden des BCA-Proteinassays und BSA als den Standard, sind typische Proteinkonzentrationen der Gewebeextrakte 5 bis 10 mg/ml für die Leber und die Milz und 10 mg/ ml für die Lungen. Daher werden Lungen-Extrakte zwanzigmal verdünnt und Leber- und Milz- Extrakte werden fünfzehnmal in destilliertem Wasser verdünnt. BSA- Standards werden mit Konzentrationen von 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 und 0,8 mg/ml hergestellt. Zehn ul der Standards oder Proben werden zu 48- Schälchen-Platten (doppelt oder dreifach) hinzugefügt und 190 ul des BCA-Reagens wird in die Schälchen hinzugefügt. Nach 20 Minuten wird die Absorbanz bei 540 nm unter Verwenden eines Platten-Lesers abgelesen.

C. CAT-Standardkurve

Das CAT-Enzym, das durch Sigma geliefert wurde, hat eine Aktivität von 110 Einheiten pro 10 ul (eine Einheit von CAT wird 1 nanomol Chloramphenicol und Acetyl-CoA zu Chloramphenicol-3-acetat und CoA pro Minute bei pH 7,8 und 25ºC umwandeln).
Für den CAT-Assay wird eine Inkubationsmischung durch Zusammenführen von 25 ul n-Butyryl-CoA, 50 ul verdünntem ¹&sup4;C-Chloramphenicol, 55 ul BSA-Puffer oder Kontroll-Gewebeextrakt und 3,3 ul 0,8-mmolares Paraoxon hergestellt. Die Standardkurve wird durch Hinzufügen zusätzlicher 10 ul der verschiedenen CAT-Standards zu der Inkubationsmischung erzeugt. Die Mischungen werden bei 37ºC 2 Stunden lang inkubiert. Xylol (300 ul) wird hinzugefügt und die Mischung wird 30 Sekunden lang verwirbelt und dann 3 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert. Die obere Xylol-Phase wird in ein frisches Mikrozentrifugen-Röhrchen überführt, das 750 ul Homogenisierungspuffer enthält, und wie oben verwirbelt und zentrifugiert. Ein Aliquot (125 ul) der oberen Phase wird in ein Szintillations-Glasfläschchen überführt und gezählt.

9.6 Ergebnisse

Nach der intravenösen Verabreichung wird die in-vivo-Transfections- Aktivität der kationischen Vesikel/DNS-Komplexe ermittelt. Es wurde gefunden, dass DODAC : DOPE (1 : 1 Molverhältnis), DODAC : DOPE (1 : 1 Molverhältnis) mit 2% PEG-Cer-C&sub2;&sub0;, DODAC : DOPE (3 : 7) und DOTMA : DOPE alle die Transfection bei einem Ladungsverhältnis von 2,5 vermitteln. Die CAT-Aktivität wurde 2 bis 3 Tage nach der Injektion bestimmt. Zusätzlich waren Komplexe, die bei Ladungsverhältnissen von 2,5 und 3,0 erzeugt wurden, alle aktiv, aber jene, die bei einem Ladungsverhältnis von 0,5 erzeugt wurden, waren nicht aktiv.
Im Hinblick auf die nötigen Mengen der DNS wurde gefunden, dass 25 ug DNS eine messbare CAT-Aktivität ergab (500-2000 Zerfalle/min (dpms) oberhalb des Hintergrunds in der Milz). Was die CAT-Aktivität pro mg Gewebe betrifft, umfassten die Organe, die Transfections-Aktivität zeigten, Milz > > Lunge und Herz > Leber. Keine Aktivität wurde in dem Blut nach 2 Tagen gefunden. Paraoxan (1 umol) muss in dem Lebergewebe-Extrakt enthalten sein, um eine Messung der CAT-Aktivität zu ermöglichen, aufgrund hoher Niveaus anderer miteinander konkurrierender acetylierender Enzyme.
Typischerweise wurden Komplexe bei einem Ladungsverhältnis von 3, die 50 ug DNS enthielten, in einem 350-400 ul-Volumen erzeugt. Bei dieser Konzentration sind die Komplexe 200-400 nm im Durchmesser groß. Wenn die Komplexe bei höheren Konzentrationen erzeugt werden, bildet sich eine partikuläre Lösung (> 1 um Durchmesser). Jedoch spaltet die Zugabe von Plasma diese großen Aggregate und bildet Teilchen, die in vitro transfectionsaktiv sind. Es wurde gefunden, dass die Injektion entweder einer partikulären Lösung (50 ug DNS/100 ul) oder einer verdünnteren Lösung (50 ug DNS/400 ul) eine vergleichbare CAT-Aktivität in vivo (siehe Fig. 8) ergab, was vermuten lässt, dass die großen Präzipitate Zeit haben, sich im Kreislauf in ihre Bestandteile zu zerlegen.

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung zum Einbringen eines Polyanions in eine Zelle, wobei die Zusammensetzung eine kationische Verbindung der Formel (I)

worin

R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander C&sub1; bis C&sub3; Alkyl sind,

Y und Z jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-, -CH=CHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH=CHCH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH&sub2;CH=CHCH&sub2;-, -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH=CH-, -CH=CHCH=CHCH&sub2;-, -CH=CHCH&sub2;CH=CH- und -CH&sub2;CH=CHCH=CH-, unter der Bedingung, dass Y und Z nicht beide -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;- sind, ausgewählte Mitglieder sind,

n und q unabhängig voneinander ganze Zahlen von 3 bis 7 sind, und

m und p unabhängig voneinander ganze Zahlen von 4 bis 9 sind unter der Bedingung, dass die Summen n + m und q + p jeweils ganze Zahlen von 10 bis 14 sind, und

X&supmin; ein pharmazeutisch annehmbares Anion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chlorid, Bromid, Fluorid, Jodid, Nitrat, Sulfat, Phosphat, Acetat, Benzoat, Citrat, Glutamat und Lactat ist,

wenigstens ein neutrales Lipid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylethanolamin, Ceramid und Sphingomyelin, und

einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das neutrale Lipid 1,2-sn-Dioleoylphosphatidylethanolamin ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin R¹ und R² Methyl sind, Y und Z unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus -CH=CHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH=CHCH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH&sub2;CH=CHCH&sub2;- und -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH=CH- ausgewählte Mitglieder sind.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin R¹ und R² Methyl sind, Y und Z beide -CH=CHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;- sind, n und q beide 7 sind und m und p beide 5 sind.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin X&supmin; Cl&supmin; ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die eine liposomische Zusammensetzung ist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die kationische Verbindung DODAC ist und das neutrale Lipid 1,2-sn-Dioleoylphosphatidylethanolamin ist.

8. Verfahren zum Einbringen eines Polyanionenmaterials in eine Zelle, umfassend:

(a) in Kontakt Bringen des Polyanionenmaterials mit einer Zusammensetzung umfassend eine kationische Verbindung der Formel I:

worin

R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander C&sub1; bis C&sub3; Alkyl sind,

n und q unabhängig voneinander ganze Zahlen von 3 bis 7 sind, und

und wenigstens ein neutrales Lipid, um einen Polyanionenmaterial-Liposom-Komplex zu bilden, und

(b) in Kontakt Bringen des Polyanionenmaterial-Liposom- Komplexes in vitro mit einer Zelle für einen Zeitraum, der ausreicht, dass das Polyanionenmaterial in die Zelle eingebracht wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Polyanionenmaterial ein aus der Gruppe bestehend aus DNS und RNS und einem Protein ausgewähltes Mitglied ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Polyanionenmaterial ein aus der Gruppe bestehend aus DNS und RNS ausgewähltes Mitglied ist, R¹ und R² Methyl sind, Y und Z unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus -CH=CHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH=CHCH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH&sub2;CH=CHCH&sub2;- und -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH=CH- ausgewählte Mitglieder sind und das neutrale Lipid ein aus der Gruppe bestehend aus Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylethanolamin, Ceramid und Sphingomyelin ausgewähltes Mitglied ist.

11. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Polyanionenmaterial ein aus der Gruppe bestehend aus DNS und RNS ausgewähltes Mitglied ist, R¹ und R² Methyl sind, Y und Z beide -CH=CHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;- sind, n und q beide 7 sind, m und p beide 5 sind, und das neutrale Lipid 1,2-sn-Dioleoylphosphatidylethanolamin ist.

12. Verfahren zur Herstellung eines Polyanionenmaterial-Liposom- Komplexes zum Einbringen eines Polyanionenmaterials in eine Zelle umfassend:

in Kontakt Bringen des Polyanionenmaterials mit einer Zusammensetzung umfassend eine kationische Verbindung der Formel I:

worin

R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander C&sub1; bis C&sub3; Alkyl sind,

Y und Z jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-, -CH=CHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH=CHCH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH&sub2;CH=CHCH&sub2;-, -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH=CH-, -CH=CHCH=CHCH&sub2;-, -CH=CHCH&sub2;CH=CH- und -CH&sub2;CH=CHCH=CH-, unter der Bedingung, dass Y und Z nicht beide -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;- sind, ausgewählte Mitglieder sind,

n und q unabhängig voneinander ganze Zahlen von 3 bis 7 sind, und

und wenigstens ein neutrales Lipid, um einen Polyanionenmaterial- Liposom-Komplex zu bilden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Polyanionenmaterial ein aus der Gruppe bestehend aus DNS, RNS und einem Protein ausgewähltes Mitglied ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Polyanionenmaterial ein aus der Gruppe bestehend aus DNS und RNS ausgewähltes Mitglied ist, R¹ und R² Methyl sind, Y und Z unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus -CH=CHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH=CHCH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH&sub2;CH=CHCH&sub2;- und -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH=CH- ausgewählte Mitglieder sind und das neutrale Lipid ein aus der Gruppe bestehend aus Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylethanolamin, Ceramid und Sphingomyelin ausgewähltes Mitglied ist.

15. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Polyanionenmaterial ein aus der Gruppe bestehend aus DNS und RNS ausgewähltes Mitglied ist, R¹ und R² Methyl sind, Y und Z beide -CH=CHCH&sub2;CHaCH&sub2;- sind, n und q beide 7 sind, m und p beide 5 sind, und das neutrale Lipid 1,2-sn- Dioleoylphosphatidylethanolamin ist.