DE68927009T2 - EXPRESSION UND PROZESSIERUNG VON ACETYLIERTEN FGFs IN HEFEN - Google Patents

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Produktion menschlicher Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) unter Verwendung von DNA- Rekombinationstechniken und insbesondere die Expression authentischer FGF- Proteine in Hefe-Zellen.
TECHNISCHER HINTERGRUND
• FGF wurde erstmals in den siebziger Jahren als mitogenes Hypophysen- Hormon identifiziert (Gospodarowicz, D., Nature 249 (1974), 123-127). Danach zeigte sich, daß hauptsächlich im Gehirn und in Hypophysen-Geweben vorkommende Faktoren das Wachstum einer Anzahl verschiedener Zelltypen stimulieren können, zu denen Endothel-Zellen, Fibroblasten-Zellen, Netzhaut- Zellen und andere gehören. Durch die Clonierung von Genen, die verschiedene Wachstumsfaktoren codieren, ist erst vor kurzem klar geworden, daß sich die meisten der Aktivitäten in zwei Proteinen befinden, die in geringfügigem Maße heterogen sind, nämlich den basischen und sauren FGFs (vgl. Gospodarowicz, D., Mol. and Geil. Endocrin. 46 (1986), 187-204, wobei der Inhalt dieses Artikels durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen wird).
• Jetzt sind basische und saure FGFs aus vielen unterschiedlichen Quellen und mit Hilfe verschiedener Reinigungsverfahren isoliert worden. Obwohl durch die Erzeugung von FGF-Vorläufer codierenden cDNAs und genomischen Clonen gezeigt worden ist, daß die verschiedenen Wachstumsfaktoren von der Art her gleich sind, sind neue Fragen hinsichtlich ihrer Biologie aufgeworfen worden. Beispielsweise enthielten die cDNA-Clone für FGF-Proteine keine klassischen Signalsequenzen, die im allgemeinen mit sezernierten Proteinen assoziiert sind. Von verschiedenen Forschungsgruppen sind auch unterschiedliche NH&sub2;- terminale Aminosäuren beschrieben worden, ebenso wie unterschiedliche Längen der Gesamt-FGF-Proteine.
• Zur Aufklärung der unterschiedlichen biologischen Merkmale von in geringfügigem Maße heterogenen FGF-Formen, falls es diese überhaupt gibt, ist die Etablierung rekombinanter Expressionssysteme zur Produktion der verschiedenen FGF-Formen erforderlich. Die Expressionssysteme sollten zur nativen posttranslationalen Modifikation einschließlich Amino-terminaler Acetylierung fähig sein. Idealerweise sollten die Systeme auch auf insgesamt ökonomisch vertretbare Weise hohe Expressionsmengen der Proteine in Formen liefern, die sich leicht aufreinigen lassen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere Anforderungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung stellt Mittel und Verfahren zur Produktion menschlicher basischer und saurer FGF-Proteine in Hefe bereit, die typischerweise im wesentlichen am Amino-Terminus acetyliert sind. Diese am Amino-Terminus authentisch prozessierten Proteine werden in Hefe intrazellulär in hohen Mengen (ohne Sekretion) exprimiert und können leicht zur weitgehenden Homogenität aufgereinigt werden. Bei menschlichen basischen FGF-Polypeptiden wurde eine spezifische Aktivität von mindestens etwa 9,3 x 10&sup5; Einheiten/mg erhalten. Bei menschlichen sauren FGF- Polypeptiden wurde eine spezifische Aktivität von mindestens etwa 0,61 x 10&sup5; Einheiten/mg erhalten.
• Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Produktion posttranslational authentisch modifizierter Formen menschlicher FGF-Proteine umfassen die folgenden Schritte:
• a) Transformation von Hefe mit einem Expressionsplasmid, das ein Gen umfaßt, das ein FGF mit etwa 155 Aminosäuren einschließlich eines Nterminalen Methionin-Restes codiert, wobei das Gen unter der Transkriptionskontrolle eines in Hefe funktionellen Promotors steht;
• b) Züchtung der transformierten Hefe unter Bedingungen, die zur Expression des FGF-Gens geeignet sind, wobei im wesentlichen keine Sekretion auftritt und wobei am N-Terminus acetylierte FGF-Polypeptide produziert werden; sowie
• c) Abtrennung der FGF-Polypeptide von der Hefe-Kultur.
• Auf diese Weise sind typischerweise 30% bis 100% der FGF-Polypeptide am Amino-Terminus acetyliert. Die FGF-Polypeptide sind häufig in geringfügigem Maße heterogen und enthalten etwa zwei bis etwa fünf modifizierte Formen. Jedes dieser Polypeptide kann zur Homogenität aufgereinigt werden, z.B. mit Hilfe einer Heparin-Affinitätssäule und/oder einer HPLC-Säule.
• Erfindungsgemäße DNA-Konstrukte sind Konstrukte, die in Hefe die intrazelluläre Expression eines am Ende prozessierten menschlichen basischen oder sauren FGF (1-154) oder deletierter Formen davon steuern. Stromaufwärts eines Transkriptions-Startcodons, das mit einem das gewünschte FGF-Protein codierenden Gen verbunden ist, können die Konstrukte auch einen DNA- Bereich mit einem Hefe-Promotor zur Transkription umfassen. Stromabwärts schließt sich dem Gen typischerweise ein Transkriptions-Terminator an. Im allgemeinen kann das Konstrukt nicht die Sekretion von Polypeptiden aus der transformierten Hefe-Wirtszelle steuern.
• Erfindungsgemäße acetylierte menschliche FGF-Proteine enthaltende Mittel weisen im wesentlichen allesamt die Primärstruktur-Konformation nativer FGF-Proteine sowie eine oder mehrere der damit natürlicherweise im Zusammenhang stehenden biologischen Eigenschaften auf. Die Mittel sind im wesentlichen frei von bakteriellen Proteinen oder anderen Säuger-Proteinen und enthalten typischerweise nicht Methionin als ersten Aminosäure-Rest.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
• Figur 1 zeigt die Aminosäuresequenz und die entsprechende bevorzugte synthetische Nucleotidsequenz für menschlichen basischen FGF (1-154).
• Figur 2 zeigt die Aminosäuresequenz von menschlichem sauren FGF (1-154).
• Figur 3 ist eine schematische Darstellung der zur Expression von FGF- Proteinen von Rind und Mensch verwendeten Plasmidkonstruktionen. (a) Das von ptac5SOD stammende ptac5SOD/bFGF ermöglicht die Transkription von hSOD zusammen mit den in Form einer dicistronischen mRNA vorliegenden RNAs für sauren Rinder-FGF (1-140) und basischen Rinder-FGF (1-146). (b) Die Hefe- Sekretionsplasmide pAB24a/GaF-baFGF (1-140) und pAB24A/GaF-bbFGF (1-146) zur Expression und Prozessierung von Fusionsproteinen aus α-Faktor-Leader und bFGF in S. cerevisiae. Die Transkription wird durch den Glucoseregulierbaren ADH-2/GAPDH-Promotor gesteuert. (c) Die Plasmide pAB24 A/G- haFGF und pAB24 a/G-hbFGF zur Glucose-regulierbaren intrazellulären Expression menschlicher FGF-Vorläufer. Wiederum wird die Transkription durch den ADA-2/GAPDH-Promotor gesteuert. Der Hefe-Elternvektor pAB24 enthält die Gene LEU2 und URA3 zur Selektion von Transformanten unter Bedingungen, bei denen Leucin bzw. Uracil fehlen. Die genauen DNA- Sequenzen und die davon codierten Aminosäuresequenzen um den Promotor und die Sekretionssignal-FGF-Fusionen herum sind in Figur 4 gezeigt.
• Figur 4 stellt synthetische DNA und die dadurch codierten Aminosäuresequenzen von Verbindungsstellen in Gene für basischen FGF (A- C) und sauren FGF (D-F) enthaltenden Konstrukten zur Expression in E. coli (A, D), Sekretion aus S. cerevisiae (B, E) und intrazellulären Expression in S. cerevisiae (C, F) dar.
• Figur 5 zeigt eine SDS-Gel-Analyse von exprimierten "kurzen" rhbFGFs. Durch Lyse von Hefezellen unter Verwendung von Glasperlen wurden Extrakte hergestellt und einer 1-stündigen Ultrazentrifugation bei 50 000 U p m unterworfen. Aliquots dieser aufgereinigten Extrakte wurden mittels SDS- Gelelektrophorese untersucht. Die rhbFGFs wurden mittels Chromatographie auf einer Heparin-5-PW-HPLC-Säule aufgereinigt. Teile der gereinigten Proteine wurden auch einer Elektrophorese unterworfen.
• Figur 6 zeigt eine Umkehrphasen-HPLC-Analyse der "kurzen" rhbFGFs (9-154) und (10-154). Ein Teil der aufgereinigten rhbFGFs wurde mittels Chromatographie auf einer Umkehrphasen-Säule Vydac C-4 bei Raumtemperatur untersucht.
• Figur 7 zeigt die Behandlung von rhbFGF mit alkalischer Phosphatase. Aliquots der mittels Gelelektrophorese aufgereinigten, 17,5 kDa und 19,5 kDa großen rhbFGF-Proteine wurden 2 Stunden bei 37ºC in Gegenwart oder Abwesenheit von alkalischer Kälberdarm-Phosphatase inkubiert, mit Probenpuffer gemischt und auf einem 15%-igen SDS-Gel einer Elektrophorese unterworfen.
• Figur 8 zeigt eine Umkehrphasen-HPLC-Analyse von rhbFGF-Proteinen bei erhöhter Temperatur. Teilabbildungen A-C: Aliquots von rhbFGF (Charge Hb16) wurden mittels Chromatographie auf einer Vydac-C-4-Säule bei Raumtemperatur (Teilabbildung A) und bei 50ºC (Teilabbildungen B und C) untersucht. Die Teilabbildung C zeigt einen flacheren Gradienten als A und B. In Teilabbildung D wurde eine Probe von rhbFGF (Charge Hb19) bei 50ºC auf einer Polymer-Labs-PLRP-S-Säule mit einer Porengröße von 300 Ångstrom untersucht.
BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
• Es werden Verfahren und Mittel zur effizienten Expression authentischer FGF-Polypeptide bereitgestellt, insbesondere saurer und basischer FGFs, die während der intrazellulären Expression in Hefe am Amino-Terminus acetyliert werden. Bei den Verfahren werden DNA-Sequenzen, die die Aminosäuresequenzen der gewünschten FGFs codieren, zusammen mit einem zur Expression in Hefe-Zellen optimierten Translationsstart-Bereich eingesetzt. Die Gene werden in einen Vektor insertiert, der zur intrazellulären Expression fähig ist (d.h. im wesentlichen ohne Sekretion), so daß die FGF-Polypeptide erst nach Lyse der Zellen gewonnen werden. Danach können die FGFs zur Verwendung in verschiedenster Hinsicht aufgereinigt werden, wozu die Verbesserung des Wachstums empfänglicher Zellen in vitro und die Verwendung als Arzneimittel gehören.
• Die erfindungsgemäßen Mittel umfassen typischerweise acetylierte menschliche FGFs. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Acetylierung" bedeutet die Anlagerung einer Acetyl-Gruppe an den Amino- Terminus von Proteinen, wie in dem US-Patent 5,066,591 offenbart, dessen ursprüngliche Anmeldung am 5. November 1984 eingereicht wurde.
• Eine Acetylierung ist aus einer Reihe von Gründen wünschenswert, hauptsächlich, um ein Produkt mit der entsprechenden nativen Struktur und Konformation bereitzustellen. In Arzneimitteln verwendete acetylierte FGFs besitzen daher bei Verabreichung an einen Wirt eine wesentlich geringere oder überhaupt keine Immunogenität. Weiterhin geht man davon aus, daß acetylierte Polypeptide bei Verwendung in vivo stabiler und widerstandsfähiger gegenüber einem Abbau sind und deshalb eine längere Verweilzeit im Wirt ermöglichen. Erfindungsgemäße Mittel können 100%-ig acetylierte Polypeptide umfassen. Typischerweise liegt die Acetylierung jedoch im Bereich von etwa 70% bis 50%, kann jedoch je nach Wunsch nur 30% oder weniger betragen.
• Die erfindungsgemäßen FGFs gehören zu zwei allgemeinen Klassen, nämlich den basischen FGFs und den sauren FGFs. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten basischen FGFs weisen im allgemeinen einen isoelektrischen Punkt (I.P.) von etwa 9,0 bis 10,0, vorzugsweise von etwa 9,6 auf und können Heparin binden. Ein basisches FGF-Protein ist ein angiogener Faktor und wirkt bei verschiedensten normalen diploiden, vom Mesoderm und Neurocrista stammenden Zellen einschließlich Granulozyten, Nebennieren- Zellen, Chondrozyten, Mydoblasten, Hornhaut- und Gefäß-Endothelzellen sowie Gefäßzellen glatter Muskeln mitogen (vgl. US-Patent 5,155,214, dessen ursprüngliche Anmeldung am 31. Dezember 1987 eingereicht wurde). Erfindungsgemäß ist basischer FGF in verschiedenen gespaltenen Formen produziert worden. Eine bevorzugte Form ist jedoch ein am Amino-Terminus acetylierter basischer FGF (1-154), wobei die Numerierung mit dem Alanin-Rest beginnt, der sich direkt dem Startcodon anschließt, wie in Figur 1 für menschlichen basischen FGF gezeigt (vgl. die am 26. März 1987 veröffentlichte Internationale Patentanmeldung WO 87/01728).
• Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "saurer FGF" bedeutet ein Protein, das einen pI-Wert aufweist, der erheblich unter 7,0 und typischerweise bei etwa 5,0 bis etwa 6,0 liegt, und das auch zur Bindung an Heparin fähig ist. Im allgemeinen wirkt ein saurer FGF auf viele der gleichen Zelltypen mitogen, auf die auch basischer FGF wirkt, wie z.B. Fibroblasten, Gefäß- und Hornhaut-Endothelzellen, Chondrozyten, Osteoblasten, Myeloblasten, glatte Muskel-Zellen und Glia-Zellen. Wie in Figur 2 für menschlichen sauren FGF gezeigt (vgl. die am 16. März 1988 veröffentlichte Europäische Patentanmeldung EP-P-0259953), besteht ein bevorzugter saurer FGF ähnlich wie basischer FGF aus etwa 154 Aminosäuren, wenn das gleiche Numerierungssystem verwendet wird.
• Sowohl von sauren als auch basischen FGFs gibt es bekanntlich verschiedene Formen, die in geringfügigem Maße heterogen sind, d.h. die 154 Aminosäuren können insbesondere einer Proteolyse unterworfen sein, jedoch auch ebenso weiteren Modifikationen. Weitere Formen, die nur als Beispiel dienen und die Erfindung nicht beschränken, umfassen daher die menschlichen sauren FGF-Proteine (9-154), (13-154) und (16-154) sowie die menschlichen basischen FGF-Proteine (9-154) und (10-154). Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "am Amino-Terminus authentisch prozessierte FGFs" bedeutet daher solche Formen, die in geringfügigem Maße heterogen sind, wobei einige davon typischerweise acetyliert sind. Dem Fachmann ist natürlich klar, daß die erfindungsgemäßen FGFs auch Allel- Unterschieden und normalen Mutationen unterworfen sein können, wie Deletionen interner Sequenzbereiche, Anlagerungen oder Austausch vieler der Aminosäure-Reste, vorausgesetzt, daß eine oder mehrere der gewünschten biologischen Aktivitäten erhalten bleiben.
• Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen FGF-Polypeptide in Hefe müssen geeignete, die Polypeptide codierende DNA-Sequenzen entweder isoliert oder durch den Zusammenbau von Nucleotidbasen entsprechend Standardverfahren chemisch synthetisiert werden. Vorzugsweise wird eine chemische Synthese verwendet, wobei alle Nucleotide, die den Sequenzen beider Stränge des gewünschten Gens entsprechen, in überlappenden Abschnitten synthetisiert werden, die anschließend zu den Genen voller länge zusammengefügt werden.
• Sobald die Gene erhalten sind, werden sie in Vektoren insertiert, wie z.B. in extrachromosomalen Hefe-Elementen, die einen Hefe-Promotor enthalten, der die intrazelluläre Expression der gewünschten Proteine steuern kann. Typischerweise enthalten die Vektoren auch ein Startcodon, das sich unmittelbar stromaufwärts vom Gen befindet, und ein Terminationscodon, das sich unmittelbar stromabwärts vom Gen befindet. Geeignete starke Promotoren umfassen die Promotoren der Gene für Alkoholdehydrogenase 1 und 2 und Triosephosphat-Isomerase sowie andere wohlbekannte Promotoren. Zur Sicherung einer ausreichenden Acetylierung werden jedoch typischerweise keine Sekretions-Signalsequenzen verwendet. Eine allgemeine Hefe- Terminationssequenz, wie z.B. der TPI-1-Terminator, kann auch verwendet werden. Alle diese DNA-Fragmente können entsprechend wohlbekannten Verfahren, z.B. den in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, beschriebenen Verfahren, ligiert werden.
• Nach Herstellung des gewünschten DNA-Konstrukts transformiert man den gewünschten Wirt mittels Standardverfahren mit dem Vektor. Ein bevorzugter Wirt ist S. cerevisiae mit verringerten Protease-Mengen, vorzugsweise jedoch ein Stamm, der keine NAT 1 (N-terminale Acetyltransferase)-Minus-Mutante ist. Ein besonders bevorzugter S. cerevisiae-Stamm ist der als JSC302 bezeichnete Stamm, der bei American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, hinterlegt worden ist. Durch Überproduktion von NAT 1 und ARD 1 ("arrest defective"), die zur Bereitstellung zusätzlicher Acetylase- Aktivität offensichtlich zusammen überexprimiert werden müssen, können wesentlich erhöhte Mengen an acetylierten FGF-Proteinen produziert werden. Um eine solche Überexpression zu erhalten, werden NAT 1 und ARD 1 unter der Kontrolle starker Promotoren getrennt in Wirte integriert, die danach zur Bildung von Diploiden, die zur Transformation mit dem gewünschten, ein FGF- Gen enthaltenden Expressionsvektor geeignet sind, gepaart werden.
• Die transformierten Hefezellen können durch Züchtung auf üblichen komplexen Medien selektiert werden, die sich in Abhängigkeit vom verwendeten Vektor deutlich unterscheiden. Sobald die Vektoren enthaltenden Transformanten selektiert sind, werden sie cloniert. Es werden Stämme mit hohen Produktionsmengen selektiert und danach in geeigneten Medien weitergezüchtet.
• Wenn die Hefezellen bis zur gewünschten Dichte gezüchtet worden sind, können die intrazellulären erfindungsgemäßen FGFs gewonnen werden, indem man zuerst die Zellen lysiert und danach das gewünschte Protein mit Hilfe von Standard-Aufreinigungsverfahren isoliert. Solche Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt. Dazu gehören Affinitäts-Chromatographie (insbesondere auf der Basis von Heparin), Elektrophorese, Dialyse, HPLC oder andere säulenchromatographische Verfahren und dergleichen. Die FGFs können zur Homogenität aufgereinigt werden. Typischerweise werden sie bis zu einer Reinheit von etwa 95% und sogar bis zu einer Reinheit von 98% bis 99% oder mehr aufgereinigt.
• Die erfindungsgemäßen sauren und basischen FGFs weisen im wesentlichen die gleichen Aminosäuresequenzen auf wie die natürlich vorkommenden Proteine. Wie vorstehend erwähnt, kann die in geringfügigem Maße auftretende Heterogenität zur Abspaltung unterschiedlicher Aminosäure- Abschnitte vom Protein, typischerweise vom Amino-terminalen Ende, führen. Aus einer einzelnen Hefe-Kultur können fünf oder mehr Formen eines FGF- Polypeptids aufgereinigt werden. Es ist jedoch typischer, daß zwei oder drei Formen produziert werden. Meistens werden mindestens etwa 50% oder mehr der FGF-Formen acetyliert, wobei der Anteil der anderen Formen zwischen mindestens 2% - 5% und etwa 40% - 50% schwankt.
• Besonders bevorzugte Mittel enthalten nur eine einzige FGF-Form. Ein solches Mittel kann durch weitere Chromatographie- oder Elektrophorese- Verfahrensschritte aus FGF-Präparaten gewonnen werden, die in geringfügigem Maße heterogen sind. In einer anderen Ausführungsform kann menschlicher basischer FGF (9 - 154) in Hefe exprimiert werden, ohne daß diese geringfügige Heterogenität auftritt.
• Die im wesentlichen reinen erfindungsgemäßen FGF-Polypeptide können mit pharmazeutisch verträglichen Trägern zur Herstellung von Arzneimitteln kombiniert werden, die dem Patienten entweder intravenös, subcutan, intramuskulär oder oral verabreicht werden können. Die erforderlichen Dosen richten sich natürlich nach der zu behandelnden speziellen Erkrankung, der Schwere der Erkrankung und der Dauer der gewünschten Behandlung. Geeignete Konzentrationen unterscheiden sich auch beträchtlich und liegen meistens bei etwa 1 mg/ml bis 50 mg/ml, vorzugsweise bei etwa 10 mg/ml bis 100 mg/ml. Eine therapeutisch wirksame Menge, die zur Beschleunigung des Auftretens und der Vermehrung neuer Fibroblasten in vivo ausreicht, liegt im Bereich von 1 ml bis 5 ml konzentriertes Präparat. Ähnliche Konzentrationen, die jedoch typischerweise niedriger sind, können zur Verbesserung des Wachstums oder der Lebensfähigkeit von FGF-aufnahmefähigen Zellen in vivo verwendet werden, wie z.B. in einer Zellkultur.
• Die Proteine werden oft in Form pharmazeutisch verträglicher nichttoxischer Salze verabreicht, wie Säure-Additionssalze oder Metall-Komplexe, z.B. von Zink, Eisen oder dergleichen. Die erfindungsgemäßen Proteine sollten unter ärztlicher Kontrolle verabreicht werden. Auf Wunsch können die Proteine entweder zusammen mit geeigneten Trägern und Verdünnungsmitteln in Stabilisierungsmitteln oder mit anderen Arzneimitteln verabreicht werden, wie z.B. anderen Mitogenen einschließlich des von Thrombozyten stammenden Wachstumsfaktors, des Epidermis- Wachstumsfaktors, Insulin-ähnlicher Faktoren und eines der wohlbekannten transformierenden Wachstumsfaktoren, z.B. TGF-a, TGF-, oder dergleichen.
• Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen aufgereinigten rekombinanten authentischen FGFs in verschiedenen Systemen wirksam sind. Diese umfassen Standardtests zur Vermehrung von Zellen, wie z.B. Fibroblasten und Endothel-Zellen, ebenso wie Tests bei Angiogenese-Modellen. Die FGFs können daher bei verschiedenartigsten Anwendungen eingesetzt werden, bei denen die Wirkung von FGFs gezeigt worden ist. Diese umfassen in vivo-Modelle zur Nervenregeneration, Wundheilung, Ischämie und Heilung von Hornhautverletzungen. Als neurotrophische Faktoren, die das Überleben und die Differenzierung von Neuronen fördern können, ermöglichen die erfindungsgemäßen FGFs außerdem die Entwicklung von Arzneimittel- Produkten, die sich beim zentralen und peripheren Nervensystem beispielsweise zur Behandlung von altersbedingten Zellveränderungen, Neuronen-Rückbildung und Zelltod einsetzen lassen.
• Die folgenden Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung und beschränken nicht die Erfindung.
EXPERIMENTELLER TEIL I. Materialien und Verfahren
• Zur Herstellung von DNA-Konstrukten und zur Expression der erfindungsgemäßen FGF-Proteine wurden die folgenden allgemeinen Materialien und Verfahren verwendet. Dabei werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
• baFGF bedeutet sauren Rinder-FGF, haFGF sauren menschlichen FGF, bbFGF basischen Rinder-FGF und hbFGF basischen menschlichen FGF.
A. DNA-Synthese und Gen-Zusammenbau.
• Oligonudeotide wurden mit Hilfe des Phosphoramidit-Verfahrens unter Verwendung der Synthesevorrichtung 380A von Applied Biosystems synthetisiert. Zur Synthese von Oligonudeotiden mit unterschiedlichen längen von 18 bis 45 Basen wurden Cyanethoxyphosphoramidit-Zwischenverbindungen (American Bionetics, Hayward, Kalifornien) und ein o-Nitrophenyltetrazolaktivierendes Mittel (American Bionetics) verwendet. Typischerweise umfaßte ein vollständiges Gen etwa 22 solcher Oligonudeotide, wobei komplementäre Oligonudeotide maximal überlappten. Die Aufreinigung und Phosphorylierung der jeweiligen Oligonudeotide sind von Urdea, M., et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80 (1983), 7461-7465, beschrieben worden. In einem 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM Dithiothreit enthaltenden Puffer wurden die gemischten Oligonudeotide auf 90ºC erhitzt. Danach ließ man sie über eine Zeitspanne von 3 h auf 25ºC abkühlen. Nach Anlagerung wurde das Gemisch auf 3 mM ATP eingestellt. Einer 15-minütigen Ligierung bei 25ºC mit T4-DNA-ligase (5 mL, New England Biolabs, 4 x 10&sup5; E/ml) schlossen sich eine Ethanol-Präzipitation und eine Spaltung mit Xba I und Sal I an. Jedes synthetische Rinder-Gen wurde mittels Elektrophorese auf einem 7%-igen Polyacrylamid-Gel aufgereinigt, elektroeluiert und in pHG100 cloniert, der mit Xba I und Sal I gespalten worden war. Die entsprechenden menschlichen Gene wurden in ähnlicher Weise in pBS100 (Barr, P., et al., Vaccine 5 (1987), 90-101) cloniert, der mit Nco I und Sal I gespalten worden war. Die Plasmide wurden mit Bam HI gespalten, um Expressions-"Kassetten" freizusetzen, die in das Hefe-Plasmid pAB24 cloniert wurden, das mit Bam HI gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war (Figur 3). Mit Hilfe des M13-Didesoxy- Sequenzierungsverfahrens wurden Gensequenzen und die sich anschließenden Verbindungsstellen mit dem Expressionsvektor überprüft. Für mehrere besonders G-C-reiche Bereiche der basischen FGF-Gene wurde das dGTP-Analog 7-Deaza-dGTP verwendet, um verdichtete Bereiche der Sequenzinformation zu trennen (Barr, P., et al., BioTechniques 4 (1986), 428-432).
B. Plasinide.
• pHg100 ist ein von pBR322 stammendes Plasmid-Analog von pAB114 (Brake, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 (1984), 4642- 4646). Jedes Plasmid enthält den Promotor des α-Faktors von S. cerevisiae, die in pAB114 das α-Faktor-Strukturgen flankierenden Leader-und Terminator-Sequenzen sowie ein synthetische Gen von pHG100, das menschliches Interleukin-2 (hIL-2) codiert. Außerdem wurde pHG100 durch stille Mutationen so modifiziert, daß unmittelbar neben das 5'-Ende der reifes hIL-2 codierenden Sequenz eine nur einmal vorkommende Xba I- Clonierungsstelle eingeführt wurde (Figur 4). Für Expressions- Untersuchungen wurden die den α-Faktor-Leader und das synthetische Gen enthaltenden Konstrukte zusammen mit dem ADH-2/GAPDH-Promotor (Barr, P., et al., Vaccine 5 (1987), 90-101) verwendet, wobei als pA/Gα-Faktor-bFGFs bezeichnete Vektoren erhalten wurden (Figur 3[b]). pBS100 enthält eine Bam HI-Expressions-"Kassette", die aus dem ADH-2/GAPDH-Hybridpromotor und dem GAPDH-Transkriptions-Terminator besteht. Diese Kontrollelemente flankieren einen Bereich, der das env-Gen des menschlichen Immunschwäche-Virus (HIV) enthält (Barr P., et al., Vaccine 5 (1987), 90- 101). Clonierungsstellen in diesen Konstruktionen sind die Nco I- Erkennungsstelle, die das Methionin codierende Startcodon enthält (Figur 4[c]), und die Sal I-Erkennungsstelle, die sich stromabwärts von den Terminationscodons des zu exprimierenden Gens befindet. Das von Barr, P., et al. in BioTechnology 5 (1986), 486-489, beschriebene Hefe-Plasmid pAB24 enthält selektierbare Marker zum Wachstum in Medien, denen entweder Uracil oder Leucin fehlt (Figur 3). Die Verwendung von ptac5SOD zur Expression von hSOD-Fusionsproteinen in E coli ist von Steimer, K., et al. in J. Virol. 58 (1986), 9-16, beschrieben.
C. Stämme.
• Zur Transformation von E. coli und Expression darin wurde der Stamm D1210 verwendet (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Iaboratory Manual (1982), Gold Spring Harbor Laboratory, Gold Spring Harbor, New York). Die verwendeten S. cerevisiae-Stämme waren wie folgt: AB110 (Mata, leu 2-3 112ura3-52 pep4-3, his4-580 [cir]); 2150-2-3 (Mata, leu2 adel, [cir]); AB116 (Mata, leu2, trp-1, ura3-52, prB1-1122, pep4-3, prCl- 407 [cir]). Die Transformation von Hefe wurde wie zuvor von Hinnen, A., et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75 (1978), 1919-1933, beschrieben durchgeführt.
DC Aufreinigung von FGFs aus rekombinanten Bakterien- und Hefe-Kulturen.
• Jedes rekombinante FGF wurde mittels Heparin- Sepharose-Chromatographie (Shing, Y., et al., Science 223 (1984), 1296-1299) aufgereinigt. Kurz gesagt, wurden Extrakte lysierter Bakterien oder Hefen in 10 mM Tris-CL-Puffer, pH-Wert 7,0, und 1 mM EDTA direkt auf Heparin- Sepharose-Säulen (Pharmacia) geladen und mit 0,6 M NaCl (saure FGFs) bzw. 1,0 M NaCl (basische FGFs) eluiert. Bei aus F. coli stammendem baFGF wurde vor der Heparin-Säulenchromatographie eine Chromatographie auf CM- Sephadex (Pharmacia) durchgeführt. Zur Elution von Heparin-Sepharose wurden NaCl-Gradienten mit Konzentrationen bis 2,0 M (saure FGFs) bzw. 3,0 M (basische FGFs) verwendet. Aus E coli stammender bbFGF wurde zum Schluß mittels Gelfiltration auf Ultrogel AcA54 (LKB) in 20 mM Tris-CL- Puffer (pH-Wert 7,5, 0,1 mM EDTA, 0,3 M NaCl) aufgereinigt.
• Die am N-Terminus acetylierten und nicht-blockierten hbFGF-Formen wurden mittels Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac-C-4-Säule (0,46 x 25 cm) getrennt. Die Säule wurde mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) äquilibriert. Die hbFGF-Proteine wurden unter Verwendung eines Gradienten von 32% bis 34% Acetonitril eluiert. Unter Verwendung der Gasphasen-Sequenziervorrichtung 470A von Applied Biosystems mit einer rechnergestützten HPLC-Analyse der PTH-Aminosäuren wurde eine Nterminale Sequenzanalyse aller aufgereinigten FGFs durchgeführt.
E. Peptid-Kartierung.
• Die mittels HPLC getrennten zwei hbFGF-Formen wurden mit DTT reduziert und zur Blockierung der Cystein-Reste mit Vinylpyridin behandelt. Nach Spaltung mit der Staphylococcus aureus- Protease V8 wurden die Peptide in 0,1% TFA mittels HPLC auf einer Vydac-C- 18-Säule (0,46 x 25 cm) getrennt, wobei ein 50-minütiger Gradient von 10% bis 40% Acetonitril verwendet wurde. Jede Peak-Fraktion wurde gesammelt und anschließend durch Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung identifiziert.
F. Massenspektrometrie.
• Proteine (1 - 2 nmol) wurden in Ammoniumhydrogencarbonat (150 ml, 50 mM, pH 7,8, 0,1 mM Ca²&spplus;) gelöst. Dazu wurde Trypsin (1 Gew.-%) gegeben. Die Proben wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 1 h wurde ein weiteres Gew.-% Trypsin zugegeben und die Spaltung wurde für eine weitere Stunde fortgesetzt. Die Spaltung wurde durch Einfrieren und Lyophilisierung beendet.
• Die Bestimmung von Molekül-Ionen der N-terminalen Peptide, an die Protonen angelagert worden waren, erfolgte über positive Ionen unter Verwendung einer Kratos-MS505-Doppelfokussierungs-Vorrichtung, die mit einem Magneten mit großer Feldstärke, einer LSIMS-Quelle und einem Nachbeschleuniger-Detektor (10 KeV) ausgerüstet war (Aberth, W., et al., Anal. Chem. 54 (1982), 2029-2034). Die Proben wurden auf die Sondenspitze aufgetragen und im Vakuum getrocknet. Vor Einführung der Sonde wurde eine Salzsäure (0,1 mM) enthaltende Matrix aus Thioglycerin und Glyzerin (1:1) in die Quelle gegeben. Spektren wurden aus m/z 3000-300 gescannt.
G. Test von FGFs auf mitogene Wirkung.
• Die mitogene Aktivität der verschiedenen FGFs wurde unter Verwendung menschlicher Vorhaut- Fibroblasten (HFF) mit fixierter Dichte, Gefäß-Endothelzellen und Kapillar- Endothelzellen getestet. HFF-Zellen wurden in nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMFM) mit 5% fötalem Rinderserum (Hyclone, Ogden, Utah) auf Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert (1 x 10&sup4; Zellen/Vertiefung). Nach 5 Tagen wurden verschiedene verdünnte FGF- Präparate in 10 ml serumfreiem DMEM zugegeben. Nach etwa 18 Stunden wurde ³H-Thymidin (1 mCi/Vertiefung; Amersham, 25 Ci/mmol, 103 mCi/mg) zugegeben. Dann wurden die Platten 24 h inkubiert. Danach wurden die Kulturen mit Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalz- Lösung (PBS) gewaschen. Über eine Zeitspanne von 15 Minuten wurde Trichloressigsäure (5%) in die Vertiefungen gegeben und anschließend 15 Minuten lang Methanol. Die Platten wurden dann mit Methanol überflutet und an der Luft getrocknet. Der Inhalt jeder Vertiefung wurde danach in 50 ml 0,3 N NaOH solubilisiert und zur Bestimmung der Anzahl radioaktiver Impulse in Gefäße überführt, die Szintillationsflüssigkeit enthielten. Jede verdünnte FGF-Probe wurde dreifach getestet. Eine Aktivitäts-Einheit ist die FGF-Menge, die erforderlich ist, um die Hälfte des maximalen ³H-Thymidin- Einbaus zu stimulieren. Die spezifische Aktivität der verschiedenen Präparate wurde bestimmt, indem der umgekehrte Wert der Verdünnung, die die Hälfte des maximalen Einbaus bewirkt, durch die Protein- Konzentration geteilt wurde.
• Die biologischen FGF-Aktivitäten wurden auch in Modellen bestimmt, mit denen sich differenzierte Funktionen kontrollieren lassen. Diese umfassen die Neuriten-Bildung von PC12-Zellen (Gospodarowicz, D., et al., J. Cell Physiol. 127 (1986), 121-136), die Prolactin-Freisetzung durch GH3- Zellen (Gospodarowicz, D., et al., J. Biol. Chem. 257 (1982), 1266-12278) sowie die Aromatase-Aktivität in Fibroblasten und Granulosa-Zellen (Gospodarowicz, D., Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrata for Serum Free Animal Cell Culture (1984), S.275-293, Alan R. Liss, Inc., New York). Die angiogene Aktivität der Wachstumsfaktoren wurde an Hühner-Chorioallantois-Membranen (Gospodarowicz, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 (1984), 6963-6967), Ratten-Hirn (Gimbrone, M., et al., J. Natl. Cancer Inst. 52 (1974), 413-427) und Nierenkapseln (Risua, W., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (1986), 3855-3859) getestet.
II. BEISPIELE
• Es wurden die 435 bp und 456 bp großen Gene für baFGF (1-140) (entsprechend Gimenez-Gallego, G., et al., Science 230 (1985), 1385-1388, numeriert) bzw. bbFGF (1-146) (entsprechend Esch, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (1985), 6507-6511, numeriert) synthetisiert. Die Konstrukte enthielten in der Nähe des 5'-Endes des bFGF-Gens bzw. des bbFGF-Gens nur einmal vorkommende Zielsequenzen für die Restriktionsenzyme Hind III und Nar I. Das ermöglichte die leichte Übertragung beider Gene in die gewünschten Expressionssysteme unter Verwendung synthetischer Adapter. Das Gen für den haFGF-Vorläufer (Jaye, M., et al., Science 233 (1986), 541-545) wurde unter Verwendung von Oligonudeotiden mit Längen von 29 bp bis 44 bp in ähnlicher Weise synthetisiert und cloniert. Da sich die reifen basischen FGF-Proteine von Rind und Mensch nur durch zwei Aminosäuren unterscheiden, wurden für das synthetische Gen für den hbFGF-Vorläufer nur sieben neue Moleküle mit 18 bp bis 43 bp synthetisiert. Die Oligonudeotide wurden zusammen mit vorher synthetisierten geeigneten Oligonucleotid-Sequenzen ligiert, wobei das hbFGF- Gen (Abraham, J., et al., EMBO J. 5 (1986), 2523-2528) erhalten wurde.
BEISPIEL 1 Expression von Rinder-FGF-Genen.
• Die synthetischen Gene für bbFGF (1- 146) und baFGF (1-140) wurden in E. coli unter Verwendung einer dicistronischen mRNA exprimiert, die unter Kontrolle des tac-1-Promotors (Hallewell, R., et al., Nucleic Acids Res. 13 (1986), 2017-2033) transkribiert worden war (Figur 3 [a]). Es ist zuvor gezeigt worden, daß durch die Verwendung einer dicistronischen mRNA Probleme bei der Inituerung der Translation beseitigt werden können, die auf die Bildung von "stern loop"- Strukturen um die Ribosomen-Bindungsstelle herum zurückzuführen sind (Schoner, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 (1984), 5403-5407). Das hochexprimierte Gen für menschliche Superoxiddismutase bildete das erste Cistron der mRNA. Dem Gen schloß sich eine neue Ribosomen-Bindungsstelle, ein Stoppcodon und ein Startcodon für das jeweilige Rinder-FGF-Gen an (Figur 4). Die Induktion von Zellen des E coli-Stamms D1210, die mit diesen Plasmiden transformiert worden waren, mit IPTG ermöglichte eine akzeptable Expression der Rinder-FGFs.
• Die Gene wurden auch als Fusionen mit der Leader-Sequenz des zur Paarung benötigten Hefe-α-Faktor-Pheromons (Brake, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 (1984), 4642-4646) exprimiert. Zur Verknüpfung des jeweiligen Gens mit den Sequenzen, die dieses Sekretions- und Prozessierungs-Signal codieren, wurden synthetische Adapter verwendet (Figur 4). Dieses Hybridgen wurde vom Glucose-regulierbaren Alkoholdehydrogenase 2 (ADH-2)/ Glycerin- aldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH)-Hybridpromotor, der in Cousens L, et al., Gene(Amst.) 61 (1987), 265-275, und Barr, P., et al., J. Exp. Med. 165 (1987), 1160-1171, beschrieben worden ist, und vom Transkriptionsterminator des α-Faktors (Brake, A., et al., Proc. Natl. Sci. U.S.A. 81 (1984), 4642-4646) flankiert. In jedem Fall wurden die sezernierten FGF-Proteine mittels SDS- PAGE-Analyse von Proteinen, die aus TCA-behandelten Medien präzipitiert worden waren, sowie mittels eines biologischen Testes im Überstand von Hefe- Kulturen nachgewiesen.
• Zur genauen Bestimmung der N-terminalen Aminosäure-Strukturen und spezifischen Aktivitäten jedes rekombinanten Rinder-FGF-Proteins wurde jedes Protein sowohl aus E. coli-Zellen als auch S. cerevisiae-Kulturmedien aufgereinigt. Dies wurde mit Hilfe einer Heparin-Sepharose-Chromatographie erreicht. Unter Anwendung dieses Verfahrens wurden FGF-Proben mit einer Reinheit von mehr als 98% gewonnen. Bei jeder dieser aufgereinigten Proben wurde eine Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
• Ein homogener N-Terminus wurde nur bei dem in E. coli exprimierten baFGF-Protein (1-140) festgestellt. Selbst dieses Protein stellte jedoch kein authentisches baFGF (1-140)-Molekül dar, da der vom Startcodon stammende N- terminale Methionin-Rest in vivo nicht entfernt wurde, wie bereits für das in E. coli exprimierte baFGF-Protein berichtet wurde (Linemeyer, D., et al., Biotechnology 5 (1987), 960-965). Obwohl das von E. coli stammende bbFGF (1- 146)-Protein in bezug auf die Entfernung von Methionin- Resten quantitativ prozessiert wurde, wurde es weiter zu einem heterogenen Gemisch von bbFGF- Proteinarten abgebaut (Tabelle 1). Es zeigte sich, daß beide Rinder-FGF-Proteine bei Sekretion aus Hefe und anschließender Aufreinigung daraus in ähnlicher Weise heterogene N-Termini aufwiesen. Neben der natürlichen Spaltung an der aus gepaarten basischen Aminosäuren bestehenden Prozessierungsstelle, die durch das Produkt des kex-2-Gens vermittelt wird (Julius, D., et al., Cell 37 (1984), 1075-1089), erfolgte ein weiterer Abbau von baFGF am N-Terminus (Tabelle 1). Es stellte sich auch heraus, daß sezerniertes bbFGF hauptsächlich eine Proteinart enthielt, die zusätzlich zum authentischen bbFGF einen von der Prozessierungsstelle stammenden Arginin-Rest enthielt (Tabelle 1). Diese ungewöhnliche Prozessierung wird der kex-2-Protease zugeschrieben, die die zwischen den Arginin- und Prolin-Resten erforderliche Spaltung nicht effizient durchführen kann. Die zwischen Lysin- und Arginin-Resten festgestellte Spaltung erfolgt höchstwahrscheinlich durch eine Hefe-Protease, die nicht die kex-2-Protease ist.
BEISPIEL 2
• Expression menschlicher FGF-Vorläufervroteine. Da die rekombinanten Rinder-FGF-Proteine heterogene N-Termini aufwiesen, wurden die entsprechenden menschlichen FGF-Proteine unter Verwendung eines intrazellulären Hefe-Expressionssystems als Vorläufer-Formen exprimiert. Unter Verwendung von Startcodons, die aus einer Proteincanalyse abgeleitet worden waren (Story, M., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 142 (1987), 702-709) und DNA-Sequenzdaten von haFGF (ECGF) (Jaye, M., et al., Science 233 (1986), 541-545) bzw. hbFGF (Abraham, J., et al., EMBO J. 5 (1986), 2523-2528, wurden die synthetische Gene für die Vorläufer-Proteine direkt mit dem ADH--
• 2/GAPDH-Hybridpromotor verbunden (Figur 4[c]). Diese Sequenzen enthaltende Plasmide (Figur 3[c]) wurden zur Transformation von Hefe unter Leucinselektions-Bedingungen verwendet. Gleichzeitig mit der Glucose- Verringerung im Hefe-Medium während des Kulturwachstums erfolgte eine Induktion der FGF-Gen-Expression (Cousens L., et al., Gene(Amst.) 61 (1987), 265-275). Die Zellen wurden gewonnen und wie vorstehend beschrieben auf FGF-Expression untersucht. Da bei in vitro-Säuger-Modellsystemen FGF- Proteine mit Zellen assoziiert sind, wurden die Überstände der Hefe-Kulturen auf sezernierte FGF-Proteine untersucht. In jedem Fall lieflen sich FGF-Proteine nur in der löslichen Fraktion aufgeschlossener Hefe-Zellen feststellen. Wie bei Säuger-Systemen enthielten die Kulturmedien nur sehr geringe FGF-Mengen (weniger als etwa 5% des Gesamtproteins).
BEISPIEL 3
• Sequenzanalyse von in Hefe exprimierten menschlichen FGF- Proteinen. Die löslichen haFGF- und hbFGF-Polypeptide ließen sich unter Verwendung von Heparin-Sepharose leicht aufgereinigen. Die Wirkung endogener Proteasen aus Hefe-Vakuolen wurde unter Verwendung des pep4-3- Wildtyp-Stammes 2150 untersucht. Dabei wurde zwischen dem in AB116 exprimierten haFGF-Protein und dem in 2150 exprimierten Protein ein deutlicher Unterschied in der gelelektophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit festgestellt. Dementsprechend wurde jedes aufgereinigte haFGF-Protein einer N-terminalen Sequenzanalyse und einer Massenspektrometrie unterworfen. Es stellte sich heraus, daß der haFGF- Vorläufer wie LSOD (Hallewell, R., et al., Biotechnology 5 (1987), 363-366) am N- Terminus quantitativ blockiert war. Eine massenspektrometrische Analyse von Trypsin-Fragmenten des Polypeptids zeigte ein Molekül-Ion mit einem angelagerten Proton, das dem acetylierten N-terminalen Peptid Ac- AEGEITTFRALTEK bei m/e 1552 entsprach. Es wurde kein m/e 1510 entsprechendes Peptid (nicht-blockierter Terminus) festgestellt. Es zeigte sich, daß die Blockierungs-Gruppe wie bei natürlichem hSOD, von Hefe stammendem rekombinantem hSOD (Hallewell, R., et alc, Biotechnology 5 (1987), 363-366), natürlichem haFGF (Burgess, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (1986), 7216-7220) und baFGF (Prostatropin) (Crabb, J. et al., Biochemistry 25 (1986), 4988-4993) eine Acetyl-Einheit war. Zusammen mit den Ergebnissen der Aminosäure-Sequenzanalyse zeigten diese Daten, daß die endogene Hefe- Methionylaminopeptidase den vom Startcodon stammenden Methionin-Rest vor der Acetylierung wirksam abspalten konnte.
• Es zeigte sich, daß das aus dem Hefe-Stamm 2150 aufgereinigte haFGF- Protein zusammen mit dem blockierten Vorläufer (54%) ein Gemisch aus drei hauptsächlich vorhandenen Protein-Arten enthielt, die nach den Resten Phe8 (26%), Thr12 (11%) bzw. Phe15 (7%) gespalten worden waren. Diese Beobachtung unterstreicht die Anfälligkeit N-terminaler FGF-Aminosäure- Sequenzen für eine Proteolyse durch Aspartylproteasen, wie z.B. für bbFGF beschrieben (Klagsbrun, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (1987), 1839- 1842).
• Die Aufreinigung und Analyse der exprimierten menschlichen basischen FGF-Vorläufer zeigte, daß der N-terminale Methionin-Rest quantitativ entfernt wurde. Trotz der homologen N-Termini der FGF-Proteine zeigten jedoch Peptid- Kartierungs-Experimente, quantitative Aminosäure-Sequenzanalyse und Massenspektrometrie überraschenderweise, daß hbFGF nur teilweise durch Acetylierung modifiziert wurde. Eine Umkehrphasen-HPLC von hbFGF, der über Heparin-Sepharose aufgereinigt worden war, führte daher zur Isolierung von zwei deutlich ausgeprägten Polypeptid-Formen in einem ungefähr äquimolaren Verhaltnis. Die Isolierung und Identifizierung der nach Protease- V8-Behandlung erhaltenen Peptide zeigte unterschiedliche N-terminale Peptide. Bei Untersuchung von Trypsin-Spaltprodukten des hbFGF-Gemischs mittels Massenspektrometrie wurde ein protonisiertes Molekül-Ion bei m/e 2537 festgestellt, daß dem acetylierten N-terminalen Peptid Ac- AAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFK entsprach. Außerdem wurde die nichtblockierte Protein-Art bei m/e 2495 festgestellt. In Übereinstimmung mit den HPLC-Daten deuteten die relativen Peak-Höhen darauf hin, daß die zwei Protein-Arten ungefähr in äquimolaren Mengen vorlagen. Diese Situation entspricht in gewisser Weise den Ergebnissen einer Isolierung basischer FGFs aus Säuger-Gewebe, da es sich herausstellte, daß hbFGF aus gutartigem menschlichen hyperplastischen Prostata-Gewebe einen nicht-blockierten N- Terminus enthielt (Story, M., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 142 (1987), 702-709). Es stellte sich jedoch heraus, daß aus einem menschlichen Hepatom isoliertes und aufgereinigtes Material ebenso blockiert war (Klagsbrun, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (1987), 1839-1842) wie ein ähnliches bbFGF- Protein höheren Molekulargewichts aus Rinder-Hypophyse (Ueno, N., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 138 (1986), 580-588).
BEISPIEL 4 Biologische Aktivitäten rekombinanter FGFs.
• Zur quantitativen Beurteilung der spezifischen Aktivität jedes Polypeptids oder Gemisches aus verwandten Polypeptiden wurde deren mitogene Aktivität auf menschliche Vorhaut-Fibroblasten getestet. Die spezifischen Aktivitäten der verschiedenen Präparate sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Fähigkeit der rekombinanten Proteine, die Vermehrung von Endothel-Zellen zu stimulieren, läßt sich nicht von der nativer Mitogene unterscheiden. Auch rekombinanter hbFGF wurde getestet, wobei es sich zeigte, daß er bei Tests auf Angiogenese, Neunten-Bildung, Neuronen-Überleben in vitro und Regulation differenzierter Funktionen von Granulosa-Zellen und Fibroblasten wirksam war.
BEISPIEL 5
• Konstruktion modifizierter ("kurzer") rhbFGFs. Die menschlichen basischen FGFs (9-154) und (10-154) können durch Modifikation des N- Terminus des entsprechenden FGF-Gens im Plasmid pAB24 A/G-hbFGF hergestellt werden, wobei die am Anfang befindlichen acht bzw. neun Aminosäure-Reste entfernt werden. Aus dem Plasmid wurde das Nco I- Nar I- Fragment herausgeschnitten und die folgenden synthetischen Oligonudeotide wurden insertiert, wobei jedes überhängende Nco I- und Nar I-Spaltsequenzen aufweist:
• Mit diese Plasmiden lassen sich in Hefe die gewünschten FGF-Formen exprimieren, wobei hbFGF (10-154) eine partielle Acetylierung zeigt. Die Gene können unter Verwendung des früher beschriebenen ADH 2/GAPDH-Promotors (Barr, et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 16471-16478) exprimiert werden.
BEISPIEL 6 Expression und Charakterisierung "kurzer" rhbFGFs.
• Die rhbFGFs wurden wie in Beispiel 5 gelehrt, intrazellulär in Hefe exprimiert und dann aufgereinigt, wobei mit Zellaufschluß und Zentrifugation begonnen wurde. Wie in Figur 5 gezeigt, war rhbFGF auf einem Gel mit gereinigten Hefe-Extrakten zu sehen, fehlte jedoch in Zell-Extrakten, die ein Kontrollplasmid enthielten. Die Proteine wurden mittels Heparin-5PW-HPLC-Chromatographie aufgereinigt, wobei nahezu homogenes Material erhalten wurde (vgl. Figur 5). Wenn zum Nachweis von schwach ausgeprägten Banden größere rhbFGF-Mengen (etwa 15 µg) einer Elektrophorese unterworfen wurden, waren zwei sehr schwache Verunreinigungen hohen Molekulargewichts zu sehen. Ein Äquivalent des 19,5 kDa großen rhbFGF-Proteins war jedoch nicht zu sehen. Die kurzen rhbFGFs konnten normal an Heparin binden, was ihre Wirksamkeit anzeigte. Bei der (9- 154)-Form waren die exprimierten Proteinmengen höher als bei der (10-154)- Form. Ebenso wie für rhbFGF (1-154) ist JSC302 der bevorzugte Wirt für beide Formen. Es wurde geschätzt, daß die in JSC302 exprimierte Menge von rhbFGF (9-154) bei 24 mg pro Liter Hefe-Kultur und damit im gleichen Bereich wie die exprimierte Menge von rhbFGF (1-154) lag (etwa 35 mg/Liter).
• Die aus JSC302-Zellen aufgereinigten rhbFGF (9-154)- und rhbFGF (10-154)- Proteine wurden mittels Umkehrphasen-Chromatographie auf einer C-4-Säule untersucht. Wie in Figur 6 ersichtlich, eluierten beide Proteine als einzelne große Peaks mit etwa der gleichen prozentualen Acetonitril-Konzentration wie rhbFGF (1-154). Auch zwei kleine, früh eluierende Peaks waren sichtbar, bei denen es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um rhbFGF-Formen mit Disulfid- Brücken handelte. Es ist jedoch bezeichnend, daß der große rhbFGF-Peak scharf ausgeprägt ist und kein Dublett wie bei dem rhbFGF (1-154)-Protein voller Länge. Eine Amino-terminale Sequenzierung der ersten 22 Reste der (9-154)- Form zeigte die erwartete Sequenz "PALPEDGGSGAFPPGHFKDAPKR". Es wurden keine weiteren schwach ausgeprägten Sequenzen nachgewiesen. Es scheint daher, daß die (9-154)-Form einen homogenen N-Terminus aufweist. Der scharf ausgeprägte HPLC-Peak legt nahe, daß das Protein keine signifikante Mikroheterogenität aufweist. Das rhbFGF (9-154)-Protein besitzt am N-Terminus einen Prolin-Rest, von dem sich nicht erwarten läßt, daß er acetyliert wird, während die (10-154)-Form mit einem Alanin-Rest beginnt, der ein bevorzugter Rest für Acetylierung ist.
BEISPIEL 7 Identifizierung des 19.5 kDa großen rhbFGF.
• Die 19,5 kda große rhbFGF- Form ist eine nur in Spuren vorkommende Protein-Art, die mit geringerer Geschwindigkeit wandert als die hauptsächlich vorkommende rhbFGF-Form mit einer Größe von 17,5 kDa. Proben der über ein Gel gereinigten 17,5 kDa und 19,5 kDa großen rhbFGF-Proteine wurden mit alkalischer Kälber-Phosphatase inkubiert, um direkt zu testen, ob die verringerte Wanderungsgeschwindigkeit des 19,5 kDa großen rhbFGF-Proteins durch Phosphorylierung verursacht wird. Wie in Figur 7 zu sehen ist, hatte diese Behandlung keine Wirkung auf das 17,5 kDa-Protein. Jedoch wurde ein Teil des 19,5 kDa-Proteins in die 17,5 kDa- Form umgewandelt. Auf der rechten Seite von Figur 7 zeigt die elektrophoretische Auftrennung von Proben des 19,5 kDa-Proteins, daß ein großer Teil des 19,5 kDa-Proteins nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase in das 17,5 kDa-Protein umgewandelt wurde. (Da Phosphoproteine schlechte Substrate für alkalische Phosphatase sind, ist es nicht überraschend, daß nicht das gesamte 19,5 kDa große rhbFGF-Protein in die 17,5 kDa-Form umgewandelt wurde.) Dieses Experiment zeigte, daß Phosphorylierung die Ursache für die anomale elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit des 19,5 kDa großen rhbFGF-Proteins ist.
BEISPIEL 8 Verbesserte Trennung von acetylierten und nicht-acetylierten rhbFGF-Proteinen.
• Obwohl sich die zwei rhbFGF-Formen mittels einer Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac-C-4-Säule mit einem sehr flachen TFA/Acetonitril-Gradienten trennen lassen, ist die Auftrennung bei Raumtemperatur schwach und die Aufspaltung der beiden Peaks geht nicht bis zur Grundlinie (Figur 8A). Wie in Figur 8B und C gezeigt, führte nur die Verwendung des TFA/Acetonitril-Puffers und der Vydac-C-4-Säule bei 50ºC zu einer Aufspaltung der Peaks der zwei rhbFGF-Formen fast bis zur Grundlinie. Leider konnte die Vydac-C-4-Säule den höheren Temperaturen höchstens einen Tag lang standhalten.
• Daher wurden Umkehrphasen-Säulen auf Polymer-Basis (Polymer PLRP-S, 0,46 x 25 cm, Porengröße 300 Ängstrom) in diesem System getestet. Wie in Figur 8D ersichtlich, verbesserte sich die Auftrennung der zwei rhbFGF-Formen gegenüber der Vydac-C-4-Säule bei Raumtemperatur erheblich. Die Säule auf Polymer-Basis konnte hohen Temperaturen besser standhalten. Das Verfahren zur Auftrennung von acetylierten und nicht-acetylierten rhbFGF-Formen unter Verwendung einer Polymer-Umkehrphasen-Säule bei 50ºC sollte auch bei der Trennung von kurzen rhb-FGF-Formen, die in geringfügigem Maße hetrogen sind, anwendbar sein.

Claims (30)

1. Zusammensetzung, umfassend einen rekombinant hergestellten am Aminoende acetylierten menschlichen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) mit der an den Positionen 1-154 oder 10-154 der Figur 1 angegebenen Aminosäuresequenz.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend einen nicht-acetylierten menschlichen basischen FGF.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der acetylierte FGF etwa 50 % des gesamten FGF umfaßt.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die spezifische Aktivität des FGF mindestens etwa 9,3 x 10&supmin;&sup5; Einheiten/mg ist.

5. Zusammensetzung, umfassend einen rekombinant hergestellten am Aminoende acetylierten menschlichen sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) mit einer an den Positionen 1-154 der Figur 2 angegebenen Aminosäuresequenz.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, weiterhin umfassend einen nicht-acetylierten menschlichen sauren FGF.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, wobei der acetylierte FGF etwa 50 % des gesamten FGF umfaßt.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, weiterhin umfassend mindestens einen menschlichen sauren FGF aus der Gruppe FGF (9-154), FGF (13-154) und FGF (16-154) mit den an den Positionen 9-154, 13-154 bzw. 16-154 der Figur 2 angegebenen Sequenzen.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei die spezifische Aktivität der menschlichen sauren FGF- Polypeptide mindestens etwa 0,61 x 10&supmin;&sup5; Einheiten/mg ist.

10. Verfahren zur Produktion eines menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (FGF), dessen Aminoende acetyliert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

a) Transformation von Hefe mit einem Expressionsplasmid, umfassend ein einen menschlichen FGF codierendes DNA-Molekül, das unter der Transkriptionskontrolle eines in Hefe funktionellen Promotors ist;

b) Züchtung der transformierten Hefe unter für die Expression von FGF geeigneten Bedingungen, wobei der FGF intrazellulär produziert wird; und

c) Abtrennung von FGF aus den transformierten Hefezellen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei mindestens 30 % der FGF-Polypeptide am Aminoende acetyliert sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei mindestens 50 % der FGF-Polypeptide am Aminoende acetyliert sind.

13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei im wesentlichen alle FGF-Polypeptide am Aminoende acetyliert sind.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei der FGF basischer FGF ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der FGF eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch die Aminosäurereste 1-154 der Figur 1 dargestellt ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei der FGF saurer FGF ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der FGF eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch die Aminosäurereste 1-154 -der Figur 2 dargestellt ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, umfassend als weiteren Schritt die Reinigung des abgetrennten FGF mittels einer Heparin-Affinitätssäule.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18, umfassend als weiteren Schritt die Reinigung des abgetrennten FGF mittels einer HPLC-Säule.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 19, umfassend als weiteren Schritt die Abtrennung des acetylierten FGF von nicht-acetyliertem FGF.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, umfassend als weiteren Schritt die Behandlung des FGF mit Phosphataseenzym.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 21, wobei die Hefewirtszelle vor der Transformation von dem S. cerevisiae-Stamm AB 110, AB 116, 2150 oder JSC302 stammt.

23. DNA-Konstrukt, das die intrazelluläre Expression davon in Hefe zum Erhalt eines prozessierten Fibroblasten- Wachstumsfaktors (FGF) veranlassen kann, umfassend stromaufwärts eines Initiationscodons einen transkriptionellen Promotor-DNA-Bereich aus Hefe, ein FGF codierendes DNA-Molekül und einen Transkriptionsterminator, wobei der Promotor an seinem 3'-Ende mit einem 5'-Ende des DNA-Moleküls verbunden ist und an das DNA-Molekül stromabwärts der Transkriptionsterminator anschließt, und wobei das DNA-Konstrukt die Sekretion des FGF aus Hefe nicht veranlassen kann.

24. DNA-Konstrukt nach Anspruch 23, wobei der Promotor durch Glucose regulierbar ist.

25. DNA-Konstrukt nach Anspruch 24, wobei der Promotor ein Hybridpromotor ist, umfassend Promotorsequenzen der Alkohol-Dehydrogenase-2 und der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase.

26. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei das DNA-Molekül einen menschlichen FGF codiert, umfassend eine Aminosäuresequenz, die durch die Aminosäurereste 1-154 der Figur 1 oder 2 dargestellt ist.

27. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei das DNA-Molekül einen menschlichen basischen FGF codiert, umfassend eine Aminosäuresequenz&sub1; die durch die Aminosäurereste 9-154 oder 10-154 der Figur 1 dargestellt ist.

28. Hefewirtszelle, die mit dem DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 23 bis 27 transformiert ist.

29. Hefewirtszelle nach Anspruch 28, wobei die Zelle vor der Transformation von dem S. cerevisiae-Stamm AB 110, AB 116, 2150 oder JSC302 stammt.

30. Hefewirtszelle nach Anspruch 29, wobei der Hefestamm JSC302 (ATCC 20967) ist.