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DE10196565B4 - Rekombinantes Human-Parathyroidhormon erzeugender Hefe-Transformant und Verfahren zur Herstellung des Hormons - Google Patents

Rekombinantes Human-Parathyroidhormon erzeugender Hefe-Transformant und Verfahren zur Herstellung des Hormons Download PDF

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Dong Kook Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

Verfahren zur Erzeugung von rekombinantem human-Parathyroidhormon aus einem Hefewirt, umfassend die Schritte von:
Deletionsmutation in mindestens einem der Gene, die für die Proteasen Yapsin 1 und Yapsin 3 aus der Yapsinfamilie codieren;
Transformieren des Hefewirts mit einem Expressionsvektor, der ein für human-Parathyroidhormon codierendes Gen enthält; und
Züchten des transformierten Hefewirts in einem geeigneten Medium.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Erzeugung von human-Parathyroid-hormnon (nachstehend als „hPTH" bezeichnet). Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Mutantenstämmen von Saccharomyces cerevisiae, die genetisch in mindestens einer der Yapsinfamilie von Asparaginsäure-Proteasen YPS1, YPS2 und YPS3 aufgebrochen sind und mit einem Expressionsvektor, der an ein hPTH-Gen bindet, transformiert sind, beim Erzeugen des Hormons.
  • hPTH ist ein durch die Parathyroiddrüse (Nebenschilddrüse) erzeugtes Peptid, das aus 84 Aminosäureresten besteht. hPTH hält die Calciumhomöostase in Nieren und Knochen mit der physiologischen Funktion einer Förderung des Calciummetabolismus und Osteogenese aufrecht. In den USA und Europa wurden vorwiegend Östrogen oder Calcitonin als Therapeutikum für Osteoporose verwendet, jedoch zeigte es sich, dass sie die Knochenabsorption behindern. Folglich untersuchen führende pharmazeutische Firmen der Welt intensiv und umfassend hPTH zur Entwicklung von Therapeutikum gegen Osteoporose, durch Nutzung des Vorteils der Fähigkeit von hPTH, Osteogenese zu fördern. Insbesondere wird starke Aufmerksamkeit der Prophylaxe und Behandlung von Osteoporose gewidmet, da die moderne. Gesellschaft zu einer alternden Gesellschaft wird. Aus vorstehend genannten Gründen richtet sich die aktive Forschung nun auf die Entwicklung von Biotechnologieverfahren für die Massenherstellung von hPTH, von dem erwartet wird, dass es ein vielversprechendes therapeutisches Substitut für die herkömmlichen Therapeutika gegen Osteoporose darstellt.
  • Beispielsweise wurden verschiedene Versuche unternommen, um Verfahren zur Massenherstellung von rekombinantem hPTH unter Verwendung von E. coli als Wirtszelle zu entwickeln, weil die prokaryotischen Bakterien einen relativ hohen Expressionswirkungsgrad zeigen. Jedoch trifft man auf große Schwierigkeiten bei der Neufaltung und Reinigung des rekombinanten Proteins, das aus E. coli erzeugt wurde. Im Gegensatz dazu hat Hefe, ein einzelliger Eukaryot, den Vorteil, dass sie geeignet gefaltete und somit aktive Proteine exprimiert und ausscheidet, weil sie in den Gentranskriptions- und Translationssystemen und ihrem Proteinsekretionssystem höheren Arten sehr ähnlich ist. Außerdem ist Hefe als Wirt zur Erzeugung erwünschter Proteine dahingehend vorteilhaft, indem Hefe wenig extrazelluläres Protein sekretiert, wodurch die Gewinnung und Reinigung exogener Proteine erleichtert wird. Weiterhin ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae ein GRAS-Mikroorganismus (GRAS = allgemein als sicher anerkannt), der für den Körper nicht pathogen ist und keine Endotoxine erzeugt. Unter der Vorwegnahme, dass sie als Erzeuger von medizinisch rekombinanter hPTH sehr nützlich sei, wurde Saccharomyces cerevisiae beim Entwickeln von hPTH-Expressionssystemen untersucht. Trotz ihrer verschiedenen Vorteilen als Expressionswirt zur Erzeugung von rekombinanter hPTH, wird Saccharomyces cerevisiae industriell nicht als Wirt angewendet, weil das extrazellulär sekretierte, rekombinante hPTH durch endogene proteolytische Enzyme der Hefe selbst abgebaut wird, so dass nur eine kleine Menge des intakten Moleküls von hPTH gewonnen werden kann (Gabrielsen et al., Gene 90, 255(1990)).
  • In den letzten zehn Jahren wurden umfangreiche Untersuchungen zum Lösen des Proteolyseproblems von rekombinantem hPTH unternommen. Beispielsweise wurde, basierend auf dem Auffinden, dass hPTH zwischen Arg-25 und Lys-26 gespalten wird, was identisch ist mit der Erkennungsstelle von KEX2, einer Protease, die in Hefe-Golgi-Körpern vorliegt, eine Substitutionsmutante von hPTH, welche Glutamin an Postition 26 seiner Aminosäuresequenz anstelle von Lysin aufweist, mit dem Ziel der Verhinderung der Proteolyse von KEX2, welche eine mutmaßliche Protease zur Spaltung von hPTH darstellt, erzeugt (Reppe et al., J. Biol. Chem. 266, 14198 (1991)). Unter Verwendung von Gen-Rekombinationstechnologie wurde ein hPTH-verwandtes Protein direkt an das 3'-Ende des Hefe-Ubiquitin-Gens ligiert, unter Erzeugung eines nicht-spaltbaren hPTH-verwandten Proteins (Rian et al., Eur. J. Biochem., 213, 641 (1993)). Wenn Proteinmutanten medizinisch verwendet werden, gibt es allerdings erforderliche strenge Tests zur Erlangung der Erlaubnis ihrer medizinischen Anwendung, weil sie im Allgemeinen als neue Arzneimittel zugelassen werden müssen. Beim Anwenden von Gen-Fusionstechnologie ist es notwendig, die Fusionsstelle durch erwarteten Verdau zu entfernen, weil aufgrund des Vorliegens der Fusionsstelle die Proteine von Interesse nur in relativen Ausbeuten erzeugt werden können.
  • Im Ergebnis der Untersuchung zur Verhinderung von hPTH-Abbau ohne Zurückgreifen auf hPTH-Proteinmutanten oder -fusionen entwickelten die Erfinder ein Verfahren, bei dem hPTH-Spaltung einfach durch Zugeben von L-Arginin mit hohen Konzen-trationen zu den Kulturmedien in einem wesentlichen Ausmaß verhindert werden kann (Chung and Park, Biotechnol. Bioeng. 57, 245 (1998)). Die Tatsache, dass hPTH-Spaltung in einem wesentlichen Ausmaß durch das Vorliegen von L-Arginin in den Kulturmedien verhindert wird, weist aus, dass hPTH-Spaltung hauptsächlich durch extrazelluläre Proteasen, anstatt durch die intrazelluläre Protease Kex2p erfolgt. Aus diesem Auffinden folgern die Erfinder, dass Yap3p (Hefe-Asparaginsäure-Protease 3), welche – wie KEX2 – in der Lage ist, die C-terminalen oder Mittelstellen von basischen einfachen oder paarigen Aminosäuren zu spalten, und an die zytoplasmische Membran von Hefe zu binden, praktisch für die Spaltung von dem in Hefekulturmedien sekretierten hPTH verantwortlich ist. Auf der Grundlage dieser Folgerung präparierten die Erfinder einen YAP3-Gen-aufgebro-chenen Hefestamm (yap3Δ) und konstruierten ein hPTH-Erzeugungssystem durch Verwendung der Hefemutanten. Nach Züchten im Kolben wurde gefunden, dass das hPTH-Erzeugungssystem die Spaltung von hPTH mit einer Wirksamkeit von 80% verhindert, wodurch das intakte Molekül von hPTH mit hoher Ausbeute erzeugt wird (Kang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 187 (1998); Korean Pat. No. 0246932, erteilt am 8. Dezember 1999). Obwohl sie eine viel höhere hPTH-Produktivität als der Wildtypstamm zeigt, wurde beobachtet, dass sich die yap3Δ-Mutante hPTH in einem wesentlichen Ausmaß in der letzten Stufe des Hochkonzentrationszüchtens spalten lässt (Song and Chung, Process Biochem. 35, 503 (2000)), was anzeigt, dass hPTH durch Yap3p nicht, sondern durch andere Proteasen in dem späten Züchtungs- bzw. Kulturstadium gespalten wird. Es wird mitgeteilt, dass Saccharomyces cerevisiae die Asparaginsäure-Protease MKc7p aufweist, welche in der Struktur und Wirkung auf Yap3p sehr ähnlich ist (Komano und Fuller, Proc Natl Acad Sci, USA, 92, 10752 (1995)). Die Erfinder erzeugten eine Hefemutante, in der von den Genen beide aufgebrochen sind (yap3Δ/mkc7Δ), zur Verwendung bei der Beobachtung des Einflusses der Enzyme auf die hPTH-Spaltung in der terminalen Kulturstufe. Es wurden jedoch keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Mutanten yap3Δ und yap3Δ/mkc7Δ gefunden (Choi, et al., J. Microbiol Biotechnol 9, 679 (1999)). Diese Ergebnisse zeigten, dass MKc7p-Protease, indem sie eine hohe Homologie mit Yap3p (53% Homologie) aufweist und in das Verarbeiten von pro-α-kreuzendem Faktor, in Abwesenheit von Kex2p, einbezogen ist, nicht so sehr für eine hPTH-Spaltung verantwortlich ist.
  • Durch die Analyse von kürzlich offenbarter Genominformationen über Saccharomyces cerevisiae erfolgte eine Suche nach Genhomologen für YAP3 (kürzlich als YPS1 unbenannt), die im Ergebnis dazu führte, dass drei neue Gene, die für unbekannte Asparaginsäure-Proteasen codieren, zusätzlich zu PEP4 und BAR1 vorliegen (Olsen et al., Biochem. J. 339, 407 (1999)). Unter der Annahme, dass sie neue Mitglieder der Yapsinfamilie von Asparaginsäure-Proteasen, wie YPS1 und YPS2, codieren, wurden die drei neuen Gene YPS3, YPS6 bzw. YPS7 genannt. YPS3 weist 50% Homologie mit sowohl YPS1 als auch YPS2 auf, während 35% und 25% Homologie zwischen YPS6 und BAR1 und zwischen YPS7 bzw. PEP4 gefunden wurde. Aus der Homologie zwischen YPS3 und YPS1 ziehen die Erfinder den Schluss, dass die hPTH-Spaltung, die in dem terminalen Kulturstadium von dem yps1Δ-(früher yap3Δ)-Stamm auftritt, durch Yapsin3 erfolgen könnte.
  • Aus dem Aufsatz von Gu Young Song und Bong Hyun Chung „Overproduction of human parathyroid hormone by fed-batch culture of a Saccaromyces cerevisiae mutant lacking yeast aspartic protease 3", veröffentlicht in Process Biochemistry 35 (1999) 503 – 508 ist die Erzeugung von Human-Parathyroid Hormon (hPTH) in S. cerevisiae-Mutanten denen YAP Ziffer 3 fehlt, beschrieben. Darin ist auch die Tatsache beschrieben, dass obwohl eine YAP3-Mutante als Wirt verwendet wurde, das meiste des sekretierten hPTH in einem späteren Stadium der Vermentation abgebaut wurde, was den Einbezug von anderen Proteasen in die hPTH-Proteolyse anzeigt. Um diesen Abbau zu untersuchen, wurde eine mkcz- (d.h. Yapsin 2-) aufgebrochene Mutante erzeugt. Es wurde aber nicht gefunden, dass sie das Ausmaß der Proteolyse von hPTH verglichen mit dem Wildtyp vermindert. Dies zeigt an, dass die MKC7-Protease nicht in die Proteolyse von hPTH einbezogen ist, (S. 507, rechte Spalte). In dem Aufsatz wird geschlussfolgert, dass obwohl die yap3 aufgebrochene Mutante als Wirt verwendet wurde, das meiste von dem sekretierten bei einer späteren Stufe oder in späteren Stufen der Fermentation gespalten wurde. In dem in J Microbiol. Biotechnol. (1999) 9 (5), 679–682 veröffentlichten Aufsatz wird beschrieben, dass Mkc7p in keinen der proteolytischen Vorgänge von hPTH in S. cerevisiae einbezogen ist. Obwohl Doppelmutanten in diesem Versuch einbezogen wurden, war das mutiere Gen YPS1 und YPS2 (Mkc7) und nicht YPS3.
    •
  • Vor diesem Hintergrund hat die vorliegende Erfindung die Aufgabe der Bereitstellung eines Proteinexpressionssystems, das hPTH in hoher Ausbeute erzeugen kann.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Erzeugen von hPTH in hoher Ausbeute bereitzustellen.
  • Die Kenntnis über die posttranslationale Modifizierung von hPTH ermöglicht eine Modifizierung und Anpassung, was zu der vorliegenden Erfindung führt.
  • Im Ergebnis von intensiver und sorgfältiger Untersuchung hinsichtlich der biologischen Herstellung von hPTH fanden die Erfinder, dass das Aufbrechen von Yapsin-Genen zu einer überraschenden Senkung des endogenen Abbaus von rekombinantem hPTH in Saccharomyces cerevisiae führt.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Saccharomyces cerevisiae-Mutantenstamm bereitgestellt, bei dem sowohl YPS1- als auch YPS3-Gene oder alle von YPS1-, YPS2- und YPS3-Genen aufgebrochen sind.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Erzeugen von hPTH, unter Verwendung des Saccharomyces cerevisiae-Mutanten-stamms als ein Erzeuger, bereitgestellt.
  • Die vorstehenden und weiteren Aufgaben, Merkmale und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden im Einzelnen aus der nachstehenden Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen besser verständlich, wobei:
  • 1 ein Schema darstellt, das einen Vorgang zur Konstruktion einer Kassette zum Ausbrechen des YPS3-Gens durch Verwendung eines Pop-out-URA3-Selektions-markers zeigt;
  • 2 ein Schema darstellt, das einen Vorgang zum Aufbrechen des YPS3-Gens von Saccharomyces cerevisiae und Gewinnen des URA3-Selektionsmarkers zeigt;
  • 3 SDS-PAGE-Ergebnisse von hPTH-Molekülen zeigt, die aus den Kulturen von Saccharomyces cerevisiae 2805 (Bahn 1), Saccharomyces cerevisiae 2805/pG10-hPTH1 (Bahnen 2 und 3), Saccharomyces cerevisiae SY28Y3/pG10-hPTH1 (Bahnen 4 und 5) und Saccharomyces cerevisiae SY28Y4/pG10-hPTH1 (Bahnen 6 und 7), zusammen mit 1 μg nativem hPTH (C) und einem vorgefärbten Protein-Molekulargewichtsmarker (M), gewachsen für 24 Stunden (a) und 48 Stunden (b), worin Bande i für intaktes hPTH (1–84 a.a. [Aminosäuren]), Bande d1 für trunkiertes hPTH (27–84 a.a.) und Bande d2 für hPTH (1–80 a.a.) steht, erhalten werden;
  • 4 SDS-PAGE-Ergebnisse von hPTH-Molekülen zeigt, die aus den Kulturen von Saccharomyces cerevisiae L3262 (Bahn 1), Saccharomyces cerevisiae L3262/ pG10-hPTH1 (Bahnen 2 und 3), Saccharomyces cerevisiae SLH15/pG10-hPTH1 (Bahnen 4 und 5), Saccharomyces cerevisiae SLH16/pG10-hPTH1 (Bahnen 6 und 7), Saccharomyces cerevisiae SLH17/pG10-hPTH1 (Bahnen 9 und 9) und Saccharomyces cerevisiae SLH18/pG10-hPTH1 (Bahnen 10 und 11), zusammen mit 1 μg nativem hPTH (C) und einem vorgefärbten Protein-Molekulargewichtsmarker (M), gewachsen für 24 Stunden (a) und 48 Stunden (b), worin Bande i für intaktes hPTH (1–84 a.a.), Bande d1 für trunkiertes hPTH (27–84 a.a.) und Bande d2 für hPTH (1–80 a.a.) steht, erhalten werden; und
  • 5 zeigt SDS-PAGE-Ergebnisse von hPTH-Molekülen, die aus den Kulturen von Saccharomyces cerevisiae L3262 (Bahn 1), YPS1/YPS3-doppelt Disruptanten (Aufgebrochenen) von Saccharomyces cerevisiae L3262 (a): Saccharomyces cerevisiae L3262/pG10-hPTH1 (Bahnen 2 bis 7) und Saccharomyces cerevisiae SLH11/pG10-hPTH1 (Bahnen 8 bis 13), YPS1/YPS2/YPS3-dreifach Disruptanten (Aufgebrochenen) (b) von Saccharomyces cerevisiae L3262: Saccharomyces cerevisiae SLH16/pG10-hPTH1 (Bahnen 2 bis 7) und Saccharomyces cerevisiae SLH18/pG10-hPTH1 (Bahnen 8 bis 13), zusammen mit 1 μg nativem hPTH (C) und einem vorgefärbten Protein-Molekulargewichts-marker (M), gewachsen für 72 Stunden unter kontinuierlicher Zuführung von Galactose, wobei Bande i für intaktes hPTH (1–84 a.a.), Bande d1 für trunkiertes hPTH (27–84 a.a.) und Bande d2 für hPTH (1–80 a.a.) steht, erhalten werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem hPTH aus einem Hefewirt, der nicht in der Lage ist, mindestens eine der Yapsinfamilie von Proteasen YPS1, YPS2 und YPS3 zu erzeugen.
  • Indem sie Exoproteaseaktivität zum Spalten der Reste aus den C- oder N-Termini von hPTH zeigt, macht es die Protease Yapsin 1 (nachstehend als „YPS1" bezeichnet), Yapsin 2 (nachstehend als „YPS2" bezeichnet) oder Yapsin 3 (anschließend als „YPS3" bezeichnet) schwierig, das intakte hPTH-Molekül in dem Hefewirt zu erzeugen. Folglich umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des intakten Moleküls von hPTH mit einer hohen Ausbeute, unter Verwendung als einer Wirtszelle einer Hefemutante, die nicht in der Lage ist, mindestens eine von den drei Proteasen YPS1, YPS2 und YPS3, zu exprimieren.
  • Es wird angenommen, dass YPS1 und YPS2 ihre enzymatische Aktivität besonders bei der frühen Kulturstufe von Transformanten zum Erzeugen von hPTH zeigen, während YPS3 hPTH meist in dem späten Kulturstadium spaltet. Im Fall des yps1Δ-Stamms, worin das YPS1-Gen nicht funktionsfähig ist, kann hPTH in einer hohen Ausbeute in der frühen Kulturstufe erhalten werden, aufgrund des Mangels an YPS1, jedoch in einer schlechten Ausbeute in der späten Kulturstufe, aufgrund der unvermeidbaren proteolytischen Aktivität von YPS3.
  • Um die Herstellungsausbeute von hPTH während des gesamten Züchtens eines Hefewirts zu verbessern, wird folglich eine vorzugsweise in sowohl YPS1 als auch YPS3 (yps1Δ/yps3Δ) und bevorzugter in allen von YPS1, YPS2 und YPS3 (yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ) schadhafte Mutante als Wirt verwendet.
  • Deletion der Proteasen kann durch Aufbrechen von mindestens einem Gen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus YPS1, YPS2 und YPS3, durch Verwendung eines Enzymselektionsmarkers ausgeführt werden.
  • Der Hefeselektionsmarker ist nicht besonders begrenzt, ist jedoch vorzugsweise jener, der Pop-out kann. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein URA3-Selektionsmarker in Form einer Kassette bereitgestellt. Die Pop-out-Kassette, die einen Hefeselektionsmarker enthält, hat Genfragmente, die für N- und C-terminale Stellen von YPS1, YPS2 und YPS3 an ihren beiden Enden codieren, so dass die Zielgene in dem Genom der Hefe enthalten sind; d.h. YPS1, YPS2 und YPS3 können durch ein Homologierekombinationsverfahren aufgebrochen werden. Jeder Selektionsmarker kann verwendet werden, wenn er in der Lage ist, Hefe zu selektieren, welche die Kassette in ihrem Genom enthält. Hierin wird die Mutante yps3Δ, worin das yps3-Gen durch einen URA3-Selektionsmarker aufgebrochen wird, mit yps3::URA3 bezeichnet.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein hPTH-Gen in Hefe durch einen Expressionsvektor getragen. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor, in den ein hPTH-Gen inseriert wird. Der in der vorliegenden Erfindung verwendbare Expressionsvektor hat Mittel zum Exprimieren eines Gens in Hefe und Mittel zum Steuern der Expression. Vektorselektions- und Rekombinantenvektoraufbau sind für den Fachmann üblich und Einzelheiten davon werden in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Transformante, hergestellt aus yps1Δ/yps3Δ- oder yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ-Hefemutante, mit dem rekombinanten Expressionsvektor.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der rekombinante Vektor pG10-hPTH1 in Saccharomyces cerevisiae-Mutanten (yps1Δ/yps3Δ und yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ) transformiert, um Transformanten SLH16/pG10-hPTH und SLH18/pG10-hPTH zu erzeugen, welche in der Korean Collection for Type Culture of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) mit Bewertungsnummern KCTC 0815BP bzw. KCTC 0816BP am 6. Juli 2000 hinterlegt wurden.
  • Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung kann im Lichte der nachstehenden Beispiele erhalten werden, die zur Erläuterung angegeben werden, jedoch nicht so aufzufassen sind, dass sie die vorliegende Erfindung beschränken.
  • Für die Expression von hPTH in Saccharomyces cerevisiae wurde das Plasmid pG10-hPTH1 angewendet, das eine hPTH-Expressionskassette, zusammengesetzt aus GAL10-Promotor::ppL::hPTHdb?::GAL7-Terminator enthält (Chung and Park, Biotechnol. Bioeng. 57, 245 (1998)). Eine Pop-out-URA3-Selektionmarker-(URA3:ac5)-Kassette wurde aus einem 1,8 kB BamHI-Fragment, abgeleitet von pTcUR3 (Kang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 575–582 (2000)), hergestellt. Saccharomyces cerevisiae 2805 und Saccharomyces cerevisiae L3262a wurden als Stammzellen zum Herstellen von YPS3-gelöschten Mutanten verwendet (Kang et al., J. Microbiol. Biotechnol., 8, 42–48 (1998)). Auch die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zellen waren die Hefestämme SLH11 (Kang et al., App1. Microbiol. Biotechnol., 59, 187 (1998)), SLH12 und SLH14 (Choi et al., J. Biosci. Bioengin., 89, 77 (2000)), welche in dem YPS1-Gen (früher YAP3), dem YPS2-Gen (früher MKC7) oder beiden von ihnen schadhaft sind. Genetische Charakterisierungen der Hefestämme werden nachstehend in Tabelle 1 zusammengefasst.
  • TABELLE 1 In der Erfindung verwendete Saccharomyces cerevisiae-Stämme
    Figure 00090001
  • MEDIUMZUSAMMENSETZUNG UND KULTURBEDINGUNG
  • Beim Transformieren von Hefestämmen mit einer URA3-Kassette zum Aufbrechen des YPS3-Gens oder mit dem Expressionsvektor pG10-hPTH1 wurde das synthetische Medium SC-URA, das nur in Uracil schadhaft war, verwendet. Um den URA-Selektionsmarker aus der erhaltenen yps3::URA3-Mutante zu gewinnen, wurde ein 5-FOA-(5-Fluorotat)-Medium angewendet (Adams et al., Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997). Zur Verwendung bei der Einführung von hPTH-Expres-sion unter der Steuerung des GAL-10-Promotors wurden Kulturen 48 Stunden an YPDG-Medien (Hefeextrakt 1%, Bactopeptone 2%, Glucose 1%, Galactose 1%) wachsen lassen.
    •
  • BEISPIEL 1: Erstellung von YPS3-Gen-aufgebrochener Hefemutante
  • Der Aufbau eines rekombinanten Vektors, der eine URA3-Kassette enthält, zur Verwendung beim Aufbrechen des YPS3-Gens wird in 1 erläutert.
  • N- und C-terminale Fragmente des YPS3-Gens, die für die Homologierekombinationsführung zur Unterbrechung des YPS3-Gens notwendig sind, wurden durch PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) unter Verwendung von zwei Paaren von Primern erzeugt, welche auf der Grundlage der YPS3-Basensequenz von Saccharomyces cerevisiae synthetisiert wurden, eingetragen in der GenBank. Zu besseren späteren Genmanipulation wurde eine Reihe von Primern (5'-GACGAATTCCAGAAACGTCTGAGTGGAG-3' und 5'-GCAGGATCCGTACTCTACCGAATGCCG-3') zur Verstärkung des N-terminalen Fragments so konstruiert, dass sie Erkennungsstellen von EcoRI und BamHI an ihren entsprechenden 5'-terminalen Stellen (unterstrichene Teile) haben, während Schnittstellen von BamHI und XbaI in 5'-terminale Stellen einer Reihe von Primern (5'-CGCGGATCCCTATGCAGACCAGTGTGG-3' und 5'-CGCTCTAGACTGCATGCAAGGTCTGAC-3') zur Verstärkung des C-terminalen Fragments (unterstrichene Teile) eingeführt wurden. Das PCR wurde in einem Thermocycler ausgeführt, wie jener, hergestellt von Perkin Elmer, bezeichnet als „GeneAmp PCR 2400", mit 25 Wärmezyklen, jeweils bestehend aus 95°C/30 s zum Denaturieren, 55°C/30 s zum Anelieren und 72°C/30 s zum Verlängern, so dass aus der genomischen DNA von Saccharomyces cerevisiae 800 Bp und ein 700 Bp-DNA-Fragment erzeugt wird, das für einen N-terminalen bzw. einen C-terminalen Bereich des YPS3-Genbereichs codiert. Die PCR-Produkte; d.h. die YPS3-N-terminalen und C-terminalen Fragemente, wurden doppelt mit Restriktionsenzymen EcoRI/BamHI bzw. BamHI/XbaI verdaut (geschnitten), gefolgt von Ligieren der zwei Restriktionsenzymverdaue, zusammen mit dem pBluescript-II-KS(+)-Vektor (Stratagen), welcher vorher mit EcoRI/XbaI behandelt wurde. An die BamHI-Erkennungsstelle, die sich zwischen zwei terminalen Fragmenten des erhaltenen rekombinanten Vektors pB-YPS3NC befindet, wurde ein URA3-Pop-out-Selektionsmarker eingeführt, um den pB-yps3::URA3:ac5-Vektor zur Verwendung beim Ausbrechen des YPS3-Gens zu konstruieren.
  • Nun wurde das YPS3-Gen von Saccharomyces cerevisiae durch Verwendung der URA3-Kassetten aufgebrochen, gefolgt von Wiedergewinnen des URA3-Selektions-markers daraus, wie in 2 erläutert.
  • Im Einzelnen wurde, nachdem das DNA-Fragment, erhalten durch die Enzymrestriktions(-schnitt-)behandlung von dem Vektor pB-yps3::URA3:ac5 mit EcoRI/XbaI, in Saccharomyces cerevisiae-Stämme 2805, L3262a, SLH11 (yps1Δ), SLH12 (yps2Δ) und SLH14 (ypsΔ/yps2Δ) transfiziert wurde, primäre Selektion von Ura+-Transformanten an SC-URA-Selektionsmedien ausgeführt. PCR wurde durchgeführt, um herauszufinden, ob die Ura+-Transformanten in dem YPS3-Gen aufgebrochen waren, wonach die so selektierten yps3::URA3:ac5-Transformanten auf 5-FOA-Platten zum Selektieren der yps3:ac-Klone ausgebreitet wurden, die sich aus dem Pop-out des URA3-Gens durch Homologierekombination ergeben.
  • Die Aufbrechung (Disruption) des YPS3-Gens in den schließlich erhaltenen yps3Δ-Mutanten wurde wiederum durch PCR identifiziert, unter Gewinnung von yps3-Disrup-tanten, S28Y4, SLH15, SLH16, SLH17 und SLH18, welche gegebenenfalls in weiteren Yapsinproteasegenen schadhaft waren. Diese Mutantenstämme werden nachstehend in Tabelle 2 zusammengefasst.
  • TABELLE 2 Yps3-deletierte Hefestämme
    Figure 00110001
  • BEISPIEL 2: Erstellen von rekombinantem Hefestamm expressiv von hPTH und Analyse von hPTH-Expression
  • Saccharomyces cerevisiae-Wildtypstamm 2805 und L3262 und Saccharomyces cerevisiae-Mutanten S28Y4, SLH15 (yps3Δ). SLH16 (yps1Δ/yps3Δ), SLH17 (yps2Δ/yps3Δ) und SLH18 (yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ) wurden in den Expressionsvektor pG10-hPTH1 transformiert, gefolgt von der Selektion von Ura+-Transformanten. Diese rekombinanten Hefestämme, die hPTH-Expression ausführen können, werden hPTH-Expressions-analyse unterzogen.
  • Die Hefemutanten wurden bei 30°C für 24 Stunden in minimalen selektiven Brühen (Aminosäuremangel-Hefe-Stickstoffsubstrat 0,67%, Glucose 2%, Gasaminosäure 0,5%) vorgezüchtet. Jede der Kulturen wurde in einer Menge von 2% zu einem YPDG-Medium (Hefeextrakt 1 %, Bactopepton 2%, Glucose 1 %, Galactose 1 %) inokuliert und dann bei 30°C 48 Stunden inkubiert. Während dieser Inkubation wurden die Proben bei 24 Stunden und 48 Stunden abgezogen. 500 μl von jeder Probe wurden bei 5 000 U/min für 5 Minuten zum Abtrennen des Überstands von der Biomasse zentrifugiert. DOC (Desoxycholinsäure) und TCA (Trichloressigsäure) wurden jeweils in der Menge von einem Zehntel Volumen des Überstands zugegeben, welcher dann bei 0°C 30 Minuten stehen lassen wurde, um die darin enthaltenen Proteine auszufällen. Zentrifugation bei 12 000 U/min für 10 Minuten erzeugte ein Pellet bzw. Sediment, das dann mit Aceton gewaschen wurde, um die TCA-Lösung, die in dem ausgefallenen Protein verblieb, zu entfernen und in 25 μl eines Lysepuffers gelöst, gefolgt von Erhitzen auf 100°C für 5 Minuten, unter Gewinnung einer extrazellulären Proteinfraktion. 10 μ1 der extrazellulären Proteinfraktion wurden auf ein 15%iges Polyacrylamid-Trenngel (pH 8,8, 10 cm Breite, 8 cm Länge, 0,7 mm Dicke) gegeben, welches dann Elektrophorese bei 125 V und 25 mA für 1,5 Stunden unterzogen wurde. Der Proteinlauf auf dem Gel wurde durch Coumassieblau visualisiert. Die Elek-trophoreseergebnisse werden für die 24-Stunden-Probe in 3a und für die 48-Stunden-Probe in 3b gezeigt.
  • Wie aus diesen Elektrophoresephotogrammen ersichtlich, wird das rekombinante hPTH, das aus Saccharomyces cerevisiae-Stämmen sekretierte, an SDS-PAGE abgetrennt, auftretend als drei Banden: i für das intakte Molekül (1–84), d1 für ein am N-Ter-minus trunkiertes Molekül (27–84) und d2 für ein am C-Terminus trunkiertes Molekül (1–80). Die in der i-Bande und d1-Bande lokalisierten Proteine wurden auf eine PVDF-(Polyvinylidendifluorid)-Membran überführt. Die N-terminale Aminosäure, die für die Proteine mit Hilfe von Milligen/Biosearch M 600 Proteinsequencer sequenzierte, hatte die Aminosäuresequenzen Ser-Val-Ser-Glu-Ile und Lys-Leu-Gln-Asp-Val an den N-terminalen Bereichen der Proteine der i- bzw. d1-Banden, was ausweist, dass das Protein der i-Bande das intakte Molekül von hPTH ist, während das Protein der d1-Bande eine trunkierte Form (27–84) ist, welcher an 26 Aminosäureresten des N-terminalen Bereichs von hPTH mangelt. Wie für die d2-Bande, wurde ihr Protein, obwohl eine elektrophoretische Bande von 14 kDa größer als das intakte Molekül zeigend, als eine trunkierte hPTH-Form, der 4 bis 5 Aminosäurereste des C-Terminus (1–79, 80) fehlen, wie durch HPLC, MALDI Massenspektrometrie und C-terminales Aminosäuresequenzieren analysiert, gefunden. Das charakteristische elektrophoretische Muster wird als der Konformationsänderung des Proteins zuordenbar, welche sich aus der Entfernung des C-Terminus ergibt, angeführt (Vad et al., Protein Expr. Purif. 13:396–402 (1998)).
  • BEISPIEL 3: hPTH-Expressionsmuster in Yapsin-Protease-schadhaften Mutanten
  • Um die Wirkung der Disruption der YPS1- und YPS3-Genen auf hPTH-Expression zu prüfen, wurden hPTH-Moleküle, sekretiert aus dem nicht-transformierten Wildtyp Saccharomyces cerevisiae 2805, dem transformierten Wildtyp Saccharomyces cerevisiae 2805/pG10-hPTH1, der transformierten yps1Δ-Mutante S28Y3/pG10-hPTH1 und der transformierten yps3Δ-Mutante S28Y4/pG10-hPTH1, SDS-PAGE-Elektrophorese unterzogen. Die Elektrophoreseergebnisse werden in 3 gezeigt.
  • Wie in den Elektrophoresephotographien gezeigt, wurden keine hPTH-Mole-küle in dem nicht-transformierten Wildtypstamm (Bahn 1) exprimiert. Etwa 50% oder mehr von dem hPTH, exprimiert in dem transformierten Wildtypstamm 2805, lagen in der trunkierten d1-Form (Bahnen 3 und 4) vor. Im Fall von der yps1Δ-Mutante S28Y3 umfassten die trunkierten Formen von dem hPTH, sekretiert in die Medien, 5% oder weniger des gesamten hPTH, wenn es aus der 24-Stunden-Kultur erhalten wurde. Im Gegensatz dazu wurden, soviel wie etwa 30–40% des hPTH, erhalten aus der 48-Stunden-Kultur, in der d1-Form vorliegend gefunden. Der Stamm S28Y4, der nur an dem YPS3-Gen aufgebrochen war, war nicht verschieden von dem Wildtypstamm in den hPTH-Expressions-mustern: etwa 50% oder mehr von dem hPTH, das innerhalb 24 Stunden sekretierte, erwies sich als in trunkierten Formen vorliegend.
  • Die zusammengenommenen und in 3 gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass die Hauptprotease, die die Spaltung von hPTH in der frühen Kulturstufe verursacht, Yapsin 1 ist und andere Proteasen als Yapsin 1 für die Spaltung von hPTH in der späten Kulturstufe verantwortlich sind. Jedoch im Fall des Stamms, der nur an dem YPS3-Gen aufgebrochen ist, können keine wesentlichen Wirkungen erhalten werden, weil die Aktivität von Yapsin 1 bereits das hPTH in einem wesentlichen Ausmaß in der frühen Kulturstufe spaltet.
  • Folglich wurde eine Prüfung des Expressionsmusters der hPTH-Erzeugung ausgeführt, wenn das YPS3-Gen in Kombination mit anderen Yapsingenen YPS1 und YPS2 aufgebrochen wurde. Hierzu wurde hPTH in dem nicht-transformierten Wildtyp Saccharomyces cerevisiae L3262, der als eine Kontrolle diente, dem transformierten L3262/pG10-hPTH1, der transformierten yps3Δ-Mutante SLH15/pG10-hPTH1, der transformierten yps1Δ/yps3Δ-Mutante SLH16/pG10-hPTH1, der transformierten yps2Δ/yps3Δ-Mutante SLH17/pG10-hPTH1 und der transformierten yps1Δ/yps2Δ/yps2Δ-Mutante SLH18/pG10-hPTH1 exprimiert. Sekretierte Proteine wurden in der gleichen Weise wie vorstehend elektrophoretisch behandelt und die Elektrophoreseergebnisse werden für die Probe, gezogen nach 24 Stunden Inkubation, in 4a und die Probe, gezogen nach 48 Stunden Inkubation, in 4b gezeigt.
  • Wie in 4 ersichtlich ist, wurde kein hPTH in dem nicht-transformierten Stamm (Bahn 1) nachgewiesen. Soviel wie 50% des hPTH sekretierten aus dem transformierten Wildtypstamm (Bahnen 2 und 3), YPS3-aufgebrochenen Stamm (Bahnen 4 und 5) und YPS2- und YPS3-doppelt aufgebrochenen Stamm (Bahnen 6 und 7), die in der N-Terminus-trunkierten d1-Form vorlagen, wurden nach 24 Stunden gesammelt. Nach 48 Stunden erwies sich die hPTH-Spaltung als weiter erschwert, um die Erzeugung von trunkiertem hPTH zu erhöhen. Andererseits hatte interessanterweise keines von den aus dem YPS1- und YPS3-doppelt aufgebrochenen Stamm (Bahnen 6 und 7) und YPS1-, YPS2-, YPS3-dreifach aufgebrochenen Stamm (Bahnen 10 und 11) sekretierten hPTH-Molekülen die N-Terminus-trunkierte d1-Form, selbst wenn sie bei 48 Stunden erhalten wurde. Zusätzlich wurde bestätigt, dass die trunkierte Form von der d2-Bande etwa 20% des gesamten hPTH, sekretiert aus dem YPS1- und YPS3-doppelt aufgebrochenen Stamm, umfasste, während intaktes hPTH von der i-Bande, jedoch nicht d2-Banden-Protein, auch nach 48 Stunden Kultur des YPS1/YPS2/YPS3-dreifach aufgebrochenen Stamms, beobachtet wurde. Diese Ergebnisse zeigen, zusammengenommen, dass das hPTH-Abbauproblem, welches die Wildtyphefestämme aufweisen, fast vollständig durch Verwendung des Stamms gelöst werden kann, bei dem alle YPS1-, YPS2- und YPS3-Gene aufgebrochen sind.
  • BEISPIEL 4: hPTH-Expressionsmuster in Hochkonzentrationskultur
  • Ein Versuch wurde ausgeführt, um zu prüfen, ob das hPTH, exprimiert aus den Yapsinproteaseschadhaftstellen, die vorstehend erzeugt wurden, Proteolyse unterliegen oder nicht. In dieser Hinsicht wurde Galactose kontinuierlich in den Kolben gefüllt, um die Bedingungen für Hochkonzentrationskulturen in einem Fermentationsbad nachzuahmen. Nach Vorinkubation für 24 Stunden in YPDG-Brühen wurden die Stämme 72 Stunden weiter gezüchtet, während Galactose zu den Brühen in Intervallen von 24 Stunden eingeführt wurde, um die Galactosekonzentration der Brühen bei einem Niveau von 2% zu halten.
  • Unter diesen Bedingungen wurde hPTH in dem nicht-transformierten Wildtyp Saccharomyces cerevisiae L3262, der als eine Kontrolle diente, dem transformierten L3262/pG10-hPTH1, der transformierten yps1Δ-Mutante SLH11/pG10-hPTH1, der transformierten yps1Δ/yps3Δ-Mutante SLH16/pG10-hPTH1 und der transformierten yps1Δ/yps2Δ/yps2Δ-Mutante SLH18/pG10-hPTH1 exprimiert. Sekretierte Proteine wurden in der gleichen Weise wie vorstehend elektrophoretisch behandelt und die Elektrophoreseergebnisse werden für die Stämme L3262/pG10-hPTH1 und SLH11/pG10-hPTH1 in 5a und für die Stämme SLH16/pG10-hPTH1 und SLH18/pG10-hPTH1 in 5b gezeigt.
  • Wie in 5 ersichtlich, lagen soviel wie 50% des hPTH, sekretiert aus der Wildtyphefe (Bahnen 2–7, 5a), bereits in dem N-Terminus in trunkierter d1-Form vor, wenn bei 24 Stunden gesammelt wurde. Andererseits wurde hPTH im Fall der Kulturen der yps1Δ-Mutante (5a, Bahnen 8–13) und der yps1Δ/yps3Δ-Mutante (Bahnen 2–7, 5b) nicht in den 24-Stunden-Kulturen abgebaut, während der hPTH-Abbau in der 48-Stunden-Hochkonzentrationskultur als wesentlich beobachtet wurde, dem kontinuierlich Galactose zugeführt wurde. Im Gegensatz dazu wurde von den yps1Δyps2Δyps3Δ-Mutan-tenkulturen (Bahnen 8–13, 5b) gefunden, dass sie kein hPTH an der N-Terminus-trunkierten d1-Form mit wesentlicher Erhöhung von intaktem hPTH (i-Bande) aufwiesen, auch wenn bei 72 Stunden gesammelt wurde. Auch noch bei 144 Stunden wurde bei den Kulturen der dreifach aufgebrochenen Mutante beobachtet, dass sie keine trunkierten Formen hPTH aufweist. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass das hPTH-Abbauproblem, welches in der späten Hochkonzentrationskulturstufe vorkommt, vollständig durch Anwenden der Mutante gelöst werden kann, worin alle YPS1-, YPS2- und YPS3-Gene aufgebrochen sind.
  • Wie vorstehend hierin beschrieben, können Hefemutanten, die sowohl in Yap-sin 1- (früher YPA3) und Yapsin 3-Genen (yps1Δ/yps3Δ) oder in allen Yapsin1-, Yapsin2- (früher MKC7) und Yapsin3-Genen (yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ) aufgebrochen sind, intaktes hPTH, das als Therapeutikum für verschiedene Störungen verwendbar ist, aufgrund ihrer Unfähigkeit, das hormonelle Peptid abzubauen, bei hoher Ausbeute sekretieren.
  • Die vorliegende Erfindung wurde in einer erläuternden Weise beschrieben und es ist selbstverständlich, dass die verwendete Terminologie zur Beschreibung anstatt als zur Begrenzung vorgesehen ist. Viele Modifizierungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind im Lichte der vorstehenden Lehren möglich. Deshalb ist es selbstverständlich, dass innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche die Erfindung anderweitig als speziell beschrieben ausgeführt werden kann.

Claims (7)

  1. Verfahren zur Erzeugung von rekombinantem human-Parathyroidhormon aus einem Hefewirt, umfassend die Schritte von: Deletionsmutation in mindestens einem der Gene, die für die Proteasen Yapsin 1 und Yapsin 3 aus der Yapsinfamilie codieren; Transformieren des Hefewirts mit einem Expressionsvektor, der ein für human-Parathyroidhormon codierendes Gen enthält; und Züchten des transformierten Hefewirts in einem geeigneten Medium.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, unter Verwendung eines Hefeselektionsmarkers.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Hefewirt in allen Yapsin 1- und Yapsin 3-Genen eine Deletion aufweist.
  4. Hefestamm, hergestellt durch Transformieren einer Hefemutante yps1Δyps3Δ, mit einem Expressionsvektor, der ein human-Parathyroidhormon codiert.
  5. Hefestamm nach Anspruch 4, worin der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae SLH16/pG10-hPTH mit der Zugangs-Nummer KCTC 0815BP ist und der Expressionsvektor pG10-hPTH1 ist.
  6. Hefestamm, hergestellt durch Transformieren einer Hefemutante yps1Δyps2Δyps3Δ, mit einem Expressionsvektor, der ein human-Parathyroidhormon codiert.
  7. Hefestamm nach Anspruch 6, worin der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae SLH18/pG10-hPTH mit der Zugangsnummer KCTC 0816BP ist und der Expressionsvektor pG10-hPTH1 ist.
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