DE69033301T2

DE69033301T2 - Erythropoietin- Analoge

Info

Publication number: DE69033301T2
Application number: DE69033301T
Authority: DE
Inventors: Thomas Edward Byrne; Steven George Elliott
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Current assignee: Amgen K A Inc
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1990-10-12
Publication date: 2000-04-20
Anticipated expiration: 2010-10-13
Also published as: IL125175A0; NO301832B1; PT95586B; ATE146187T1; DE69029370T3; GR3032089T3; LV12575B; CZ291488B6; DE69029370D1; KR100221066B1; NO912281D0; AU646822B2; FI912829A0; HK1010398A1; FI105688B; EP0668351B1; CN1051936A; JP2983629B2; IL125175A; JPH04502331A

Description

Die Erfindung betrifft Erythropoietin-Analoge, Verfahren zum Herstellen solcher Analoge und pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Analoge enthalten.

Hintergrund der Erfindung

Erythropoietin ist ein Glykoproteinhormon, das bei der Reifung von Erythrocytenvorläuferzellen zu Erythrocyten beteiligt ist. Es ist entscheidend für die Regulierung der Titer von Erythrocyten im Kreislauf. Auf natürliche Weise auftretendes Erythropoietin wird durch die Leber während des fötalen Lebens und durch die Nieren von Erwachsenen hergestellt und zirkuliert im Blut und stimuliert die Herstellung von Erythrocyten im Knochenmark. Anämie ist fast unveränderlich eine Folge eines Nierenversagens infolge verringerter Produktion von Erythropoietin durch die Niere. Man hat gefunden, daß rekombinantes Erythropoietin, das durch gentechnologische Techniken hergestellt wurde, die Expression eines Proteinprodukts von einer Wirtszelle, die mit dem Gen transformiert wurde, das für Erythropoietin codiert, umfassen, wirksam ist, wenn es bei der Behandlung von Anämie verwendet wird, die aus chronischem Nierenversagen resultiert.
Bis vor kurzem war die Verfügbarkeit von Erythropoietin sehr beschränkt. Obwohl das Protein im menschlichen Urin vorhanden ist, sind Exkretionstiter zu gering, um diesen zu einer praktikablen Quelle für Erythropoietin für die therapeutische Anwendung zu machen. Patienten, die unter aplastischer Anämie leiden, weisen erhöhte Titer von Urin-Erythropoietin auf verglichen mit gesunden Personen, aber ein beschränkter Nachschub dieses Urins machen auch eine solche Quelle unmöglich. Die Reinigung von Erythropoietin aus menschlichem Urin durch Miyake et al. in J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977) verwendete als Ausgangsmaterial Urin von aplastisch anämischen Personen.
Die Identifizierung, Klonierung und Expression von Genen, die Erythropoietin codieren, sind im US-Patent 4,703,008 von Lin beschrieben. Eine Beschreibung der Reinigung von rekom binantem Erythropoietin aus Zellmedium, das das Wachstum von Säugetierzellen unterstützte, die rekombinante Erythropoietinplasmide enthielten, ist enthalten in US-Patent 4, 667,016 von Lai et al. Die Expression und Aufbereitung von biologisch aktivem rekombinanten Erythropoietin aus Säugetierzellwirten, die das Erythropoietin-Gen auf rekombinanten Plasmiden enthalten, hat zum ersten Mal Mengen von Erythropoietin verfügbar gemacht, die für therapeutische Anwendungen geeignet sind. Zusätzlich hat die Kenntnis der Gensequenz die Verfügbarkeit größerer Mengen von gereinigtem Protein zu einem besseren Verständnis des Wirkmechanismus dieses Proteins geführt.
Die biologische Aktivität eines Proteins hängt von seiner Struktur ab. Insbesondere liefert die Primärstruktur eines Proteins (d. h. seine Aminosäuresequenz) Informationen, die die Bildung von Sekundär (d. h. α-Helix oder β-Faltblatt) und Tertiärstrukturen (gesamte dreidimensionale Faltung) durch ein Polypeptid während und nach seiner Synthese erlauben. Die Störung der geeigneten Sekundär- und Tertiärstrukturen durch die Einführung von Mutationen oder durch chemische oder enzymatische Behandlungen kann zu einer Verringerung der biologischen Aktivität führen.
In prokaryontischen Organismen werden die biologischen Aktvitäten von Proteinen weitgehend von den oben beschriebenen Strukturen bestimmt. Im Gegensatz zu Proteinen von prokaryontischen Zellen sind viele Zelloberflächen und sekretorische Proteine, die von eukaryontischen Zellen produziert werden, mit einer oder mehreren Oligosaccharidgruppen modifiziert. Diese Modifikation, als Glykosilierung bezeichnet, kann die physikalischen Eigenschaften von Proteinen dramatisch beeinflussen und kann auch für Proteinstabilität, Sekretion und subzelluläre Lokalisierung wichtig sein. Eine geeignete Glykosilierung kann entscheidend sein für biologische Aktivität. In der Tat ergeben einige Gene von eukaryontischen Organismen, wenn sie in Bakterien (z. B. E. coli) exprimiert werden, denen zelluläre Prozesse für das Glykosilieren von Proteinen fehlen, Proteine, die infolge ihrer fehlenden Glykosilierung mit geringer oder keiner Aktivität aufgearbeitet werden. Die Glykosilierung erfolgt an spezifischen Stellen entlang des Polypeptid-Rückgrats und ist gewöhnlich von zweierlei Art: O- verknüpfte Oligosaccharide werden an Serin- oder Threoninreste gebunden, während N- verknüpfte Oligosaccharide an Asparaginreste gebunden werden, wenn sie Teil der Sequenz Asn-X-Ser/Thr sind, wobei X irgendeine Aminosäure mit Ausnahme von Prolin sein kann. Die Strukturen von N-verknüpften und O-verknüpften Oligosacchariden und die Zuckerreste, die in einem jeden Typ gefunden werden, sind verschieden. Ein Typ von Zucker, der übli cherweise an beiden gefunden wird, ist N-Acetylneuraminsäure (hierin im folgenden als Sialinsäure bezeichnet). Sialinsäure ist gewöhnlicherweise der letzte Rest von sowohl N- verknüpften als auch O-verknüpften Oligosacchariden und infolge seiner negativen Ladung kann sie den Glykoproteinen saure Eigenschaften verleihen.
Sowohl aus Urin abgeleitetes Erythropoietin als auch rekombinantes Erythropoietin (exprimiert in Säugerzellen) mit der Aminosäuresequenz 1-165 von menschlichem Erythropoietin enthält drei N-verknüpfte und eine O-verknüpfte Oligosaccharidkette, die zusammen etwa 40 % des Gesamtmolekulargewichts des Glykoproteins ausmachen. N-verknüpfte Glykosilierung erfolgt an Asparaginresten, die an den Positionen 24, 38 und 83 angeordnet sind, während O- verknüpfte Glykosilierung an Serinresten auftritt, die an Position 126 (Lai et al. J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy et al. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)) angeordnet ist. Man hat gezeigt, daß Oligosaccharidketten mit terminalen Sialinsäureresten modifiziert sind. Enzymatische Behandlung von glykosiliertem Erythropoietin, um alle Sialinsäurereste zu entfernen, führt zu einem Verlust der in vivo-Aktivität, beeinflußt aber nicht die in vitro- Aktivität (Lowy et al. Nature 185, 102 (1960); Goldwasser et al. J. Biol. Chem. 249, 4202 (1974)). Dieses Verhalten ist durch eine schnelle Clearance von Asialo-Erythropoietin aus dem Kreislauf erklärt worden nach Wechselwirkung mit dem hepatischen Asialo- Glykoprotein-Bindungsprotein (Morrell et al. J. Biol. Chem. 243, 155 (1968); Briggs, et al. Am J. Physiol. 227, 1385 (1974); Ashwell et al. Methods Enzymol. 50, 287 (1978)). Somit besitzt Erythropoietin in vivo biologische Aktivitäten nur, wenn es sialiert ist, um seine Bindung durch das hepatische Bindungsprotein zu vermeiden. M. Takeuchi et al., J. Biol. Chem., 263, 1988, 3657-3663 und M. Goto et al., Biotechnology, 6, 1988, 67-71 vergleichen die Glykosilierung von Erythropoietin aus Urin und rekombinantem Erythropoietin.
Die Rolle der anderen Verbindungen in den Oligosaccharidketten von Erythropoietin ist nicht gut definiert. Man hat gezeigt, daß das nicht-glykosilierte Erythropoietin eine stark verringerte in vivo-Aktivität aufweist verglichen mit der glykosilierten Form, aber eine in vitro- Aktivität beibehält (Dordal et al., Endocrinology 116, 2293 (1985); Lin-Patent, siehe oben). In einer weiteren Studie verringert die Entfernung von N-verknüpften oder O-verknüpften Oligosaccharidketten einzeln oder zusammen durch Mutagenese von Asparagin- oder Serinresten, die Glykosilierungsstellen sind, deutlich die in vitro-Aktivität des geänderten Erythropoietin, das in Säugerzellen hergestellt wird (Dube et al. J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988)).
Glykoproteine wie Erythropoietin können in verschiedene geladene Formen aufgetrennt werden unter Verwendung von Techniken wie isoelektrisches Fokussieren (IEF). Verschiedene Gruppen haben über IEF-Studien von rohem oder teilweise gereinigtem Erythropoietinpräparaten berichtet (Lukowsky et al., J. Biochem. 50, 909 (1972); Shelton et al. Biochem. Med. 12, 45 (1975), Fuhr et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 98, 930 (1981)). Wenigstens drei oder vier Fraktionen mit Erythropoietin-Aktivität wurden durch IEF in diesen Studien unterschieden und keine wurden gekennzeichnet hinsichtlich des Kohlenhydratanteils. Zusätzlich wurde keine Korrelation zwischen den isoelektrischen Punkten der Fraktionen und deren biologischer Aktivität hergestellt.
Es wurde berichtet, daß während der Reinigung von Urin-Erythropoietin aus menschlichem Urin, wie von Miyake et al., oben, diskutiert, zwei Erythropoietin-Fraktionen aus der Hydroxylapatitchromatographie, die als II und IIIA bezeichnet wurden, dieselbe spezifische Aktivität aufwiesen. Eine nachfolgende Kohlenhydratanalyse von Fraktion II und IIIA zeigte, daß die Fraktion II einen größeren durchschnittlichen Sialinsäuregehalt als Fraktion IIIA aufwies (Doral et al., siehe oben).
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Analoge von menschlichem Erythropoietin bereitzustellen mit wenigstens einer zusätzlichen Polypeptidstelle zur Glykosylierung sowie eine Kohlenhydratkette, die an die zusätzliche Stelle gebunden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Moleküle aufweisen, würden therapeutische Wirkung zeigen.
EP-A-0 370 205 offenbart Polypeptide mit wenigstens einer zusätzlichen Kohlenhydratkette, die mittels rekombinanter Techniken hergestellt sind. Dort wird die Hinzufügung neuer Kohlenhydratketten an hGSF und Urokinase durch Einführen neuer Glykosilierungsstellen beschrieben.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden ein Analog von menschlichem Erythropoietin mit einer oder mehreren Änderungen in der Aminosäuresequenz von menschlichem Erythropoietin, wie gezeigt in Fig. 5, wobei die Änderung(en) wenigstens eine zusätzliche Polypep tidstelle zur Glykosilierung vorsieht/vorsehen, wobei eine Kohlenhydratkette an die zusätzliche Stelle gebunden wird, DNA-Sequenzen, die derartige Analoge codieren, eine eukaryontische Wirtszelle, die mit derartigen DNA-Sequenzen transfiziert ist, und pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzungen, die Erythropoietin-Analoge umfassen, vorgesehen.
Die Erfindung umfaßt auch Analoge von menschlichem Erythropoietin mit einer größeren Anzahl von Stellen für Kohlenhydratkettenbefestigung als menschliches Erythropoietin, wie [Asn&sup6;&sup9;] EPO, [Thr¹²&sup5;] EPO; [Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;] EPO; [Asn&sup6;&sup9;, Thr&sup7;¹] EPO und [Ser&sup6;&sup8;, Asn&sup6;&sup9;, Thr&sup7;¹] EPO.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Aminsosäuresequenz von menschlichem Erythropoietin. Quadrate zeigen Asparaginreste an, an die Kohlenhydratketten gebunden sind, und Sterne zeigen Threonin- und Serinreste mit modifiziertem Kohlehydrat an. Zusätzliche Glykosilierungsstellen, die in den Analogen von Beispiel 1 vorgesehen sind, sind angegeben durch Mutationen zu Aspargin Serin und Threonin.
Die Fig. 2A, 2B und 2C zeigen die Abfolge von Klonierungsschritten, die verwendet wurden, um Plasmide für die Konstruktion und Analyse von Analogen von menschlichem Erythropoietin zu erzeugen. Diese Analogen weisen geänderte Aminosäuren auf, wie in Fig. 1 gezeigt, die zusätzliche Glykosilierungsstellen vorsehen.
Fig. 3 zeigt eine Western Blot-Analyse von COS-Zellkulturüberständen von Erythropoietin mit der Sequenz vom Menschen und angegebenen Erythropoietin-Analogen. Die Analogen [Asn&sup9;, Ser¹¹], EPO, [Asn&sup6;&sup9;] EPO, [Asn¹²&sup5;, Ser¹²&sup7;] EPO und [Pro¹²&sup4;, Ihr¹²&sup5;] EPO werden konstruiert, wie in Beispiel 6 beschrieben. Die Analogen [Pro¹²&sup5;, Th¹²&sup7;] EPO, [Asn¹²&sup6;, Ser¹²&sup8;] EPO und [Thr¹²&sup5;, Ser¹²&sup7;] EPO, die keine zusätzlichen Kohlenhydratketten enthalten, werden zu Vergleichszwecken gezeigt.
Fig. 4 zeigt eine Western Blot-Analyse von COS-Zellkulturüberständen von Erythropoietin mit der Sequenz vom Menschen und angegebenen Erythropoietin-Analogen nach Behandlung mit N-Glykanase. Die Analogen [Thr¹²&sup5;] EPO und [Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;] EPO sind konstruiert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Analogen [Val¹²&sup6;] EPO, [Pro¹²&sup4;] EPO, [Pro¹²&sup5;] EPO, [Thr¹²&sup7;] EPO, [Pro¹²&sup5;, Ser¹²&sup7;] EPO und [Thr¹²&sup5;, Ser¹²&sup7;] EPO werden zu Vergleichszwecken gezeigt.
Fig. 5 zeigt ein Gel einer isoelektrischen Fokussierung der Pools 2, 3 und 4, die durch Q- Sepharose und C4-Umkehrphasenchromatographie von Zellmedium erhalten wurden, das das Wachstum von CHO-Zellen unterstützt, die mit Erythropoietin-cDNA, die die [Thr¹²&sup5;]- Mutation enthielten, transfiziert waren. Gereinigtes rekombinantes Erythropoietin, das eine Mischung aus Isoformen enthält, wird erhalten unter Verwendung von Verfahrensweisen, die im Beispiel 2 von Lai et al. (s. o.) beschrieben werden, mit der Ausnahme, daß DEAE- Agarosechromatographie durch Q-Sepharosechromatographie ersetzt wird, ist auch in der linken und rechten Spur des Gels gezeigt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Von der Erfindung umfaßt sind bestimmte Analoge von menschlichem Erythropoietin. Wie hierin verwendet bezeichnet die Formulierung "Analog von menschlichem Erythropoietin" Erythropoietin mit einer oder mehreren Änderungen in der Aminosäuresequenz von menschlichem Erythropoietin, was zu einer Erhöhung der Anzahl von Stellen für Sialinsäurebindung führt. Analoge werden erzeugt durch ortsspezifische Mutagenese mit Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäureresten, die Stellen ändern, die für eine Glykosilierung verfügbar sind. Derartige Analoge weisen eine größere Anzahl von Kohlenhydratketten auf als menschliches Erythropoietin.
Analoge, die zu erhöhter biologischer Aktivität führen, werden konstruiert durch Erhöhen des Sialinsäuregehaltes des Erythropoietinmoleküls. Analoge mit Gehalten an Sialinsäure größer als demjenigen, der bei menschlichem Erythropoietin gefunden wird, werden erzeugt durch Hinzufügen von Glykosilierungsstellen, die die Sekundär- oder Tertiär-Konformation nicht stören, die für biologische Aktivität erforderlich ist. Vorteilhafterweise weist das Analoge von menschlichem Erythropoietin 1, 2 oder 3 zusätzliche Stellen für N-Glykosilierung oder O- Glykosilierung auf. Z. B. wird ein Leucin an Position 69 ersetzt durch ein Asparagin, um die Sequenz Asn-Leu-Ser zu ergeben, welche als eine vierte Stelle für N-Glykosilierung dient. Eine derartige Änderung kann allgemein bis zu vier zusätzliche Sialinsäuren pro Molekül vorsehen. Beispiele für andere Änderungen, die zusätzliche N- oder O-Glykosierungsstellen vorsehen, sind Alanine an Positionen 125 und 127 zu Asparagin bzw. Serin, Alanin an Positi on 125 zu Threonin und Alanin an Positionen 124 und 125 zu Prolin bzw. Threonin. Wie von den Fachleuten anerkannt werden wird, kann die vorliegende Erfindung viele andere Analoge von menschlichen Erythropoietin umfassen, die zusätzliche Stellen zur Glykosilierung aufweisen.
Auch von der Erfindung umfaßt sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge eines spezifischen Analogen oder Mischung von Analogen zusammen mit einem geeignete Verdünnungsmittel, Adjuvans, und/oder Träger umfassen, das/der bei der Erythropoietin-Therapie nützlich ist. Eine "therapeutisch wirksame Menge" wie hierin verwendet, bezeichnet jene Menge, die eine therapeutische Wirkung für einen gegebenen Zustand und Verabreichungsregime vorsieht. Die Verabreichung von Erythropoietin- Analogen geschieht bevorzugterweise über die parenteralen Routen. Die ausgewählte spezifische Route wird von dem zu behandelnden Zustand abhängen. Die Verabreichung von Erythropoietin-Analogen wird bevorzugterweise als Teil einer Formulierung vorgenommen, die einen geeigneten Träger enthält, wie menschliches Serumalbumin, ein geeignetes Verdünnungsmittel, wie eine gepufferte Salinelösung und/oder ein geeignetes Adjuvans. Die erforderliche Dosierung werden Mengen sein, die ausreichend sind, um den Hämatokrit von Patienten zu erhöhen, und wird abhängig von der Schwere des zu behandelnden Zustandes, den verwendeten Verabreichungsverfahren und dergleichen schwanken.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um die Erfindung umfassender zu veranschaulichen, sollen aber nicht als deren Umfang beschränkend betrachtet werden.

Beispiel 1: Analoge von menschlichem Erythropoietin mit zusätzlichen Glykosilierungsstellen

A. Konstruktion von Analogen von menschlichem Erythropoietin.

Die Positionen von existierenden und vorgeschlagenen Kohlenhydratbindungsstellen innerhalb der Erythropoietin-Aminosäuresequenz sind in Fig. 1 gezeigt und das Verfahren zum Erzeugen dieser zusätzlichen Glykosilierungsstellen wird in den Fig. 2A-C zusammengefaßt und unten beschrieben.
Die folgenden Oligonukleotidprimer wurden zur Verwendung in der in vitro-Metagenese synthetisiert:
[Asn&sup4;, Ser&sup6;] EPO: 5' CGCCCACCAAACCTCAGCTGTGACAGCCGA 3'
[Asn&sup9;, Ser¹¹] EPO: 5' ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3'
[Asn&sup6;&sup9;] EPO: 5' GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3'
[Asn¹²&sup4;] EPO: 5' TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC 3'
[Asn¹²&sup5;, Ser¹²&sup7;] EPO: 5' CAGATGCGAACTCATCTGCTCCAC 3'
[ASn¹&sup6;³, Ser¹&sup6;&sup5;] EPO: 5' AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTG 3'
[Thr¹²&sup5;] EPO: 5' TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3'
[pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;] EPO: 5' CCTCCAGATCCGACCTCAGCTGC 3'
Die unterstrichenen Codons zeigen die fehlgepaarten Regionen, wo die in Klammern angegebenen Aminosäuren die Wildtyp-Aminosäuren ersetzen.
[Asn&sup4;, Ser&sup6;] EPO wurde konstruiert, um eine N-Glykosilierungsstelle an Asn&sup4; hinzuzufügen. [Asn&sup9;, Ser¹¹] EPO wurde konstruiert, um eine N-Glykosilierungsstelle an Asn&sup9; hinzuzufügen. [Asn&sup6;&sup9;] EPO wurde konstruiert, um eine zusätzliche N-Glykosilierungsstelle an Asn&sup6;&sup9; hinzuzufügen. [Asn¹²&sup5;, Ser¹²&sup7;] EPO wurde konstruiert, um eine N-Glykosilierungsstelle an Asn¹²&sup5; hinzuzufügen. [Thr¹²&sup5;] EPO und [Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;] EPO wurden konstruiert, um eine O- Glykosilierungsstelle an Thr¹²&sup5; hinzuzufügen.
Die folgenden Oligonukleotidprimer werden zur Verwendung bei der in vitro-Mutagenese synthetisiert:
[Asn&sup6;&sup9;, Thr&sup7;¹] PPO: 5' GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3'
[Ser&sup6;&sup8;, Asn&sup6;&sup9;, Thr&sup7;¹] EPO:
5' CAGGGCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3'
[Asn¹²&sup5;, Thr¹²&sup7;] EPO: 5' CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC 3'
[Asn¹²&sup5;, Thr¹²&sup7;, Thr¹³¹] EPO:
5' ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3'
[Pro¹²&sup4;, Asn¹²&sup5;, Ser¹²&sup7;] EPO: 5' CCAGATCCAAATTCATCTGCTCCACTC 3'
[Pro¹²&sup4;, Asn¹²&sup5;, Thr¹²&sup7;] EPO: 5' CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3'
[Thr¹²&sup5;, Thr¹²&sup6;] EPO: 5' CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3'
[Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;, Thr¹²&sup6;, Thr¹³¹] EPO:
Ausgehend von [Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;] EPO-cDNA, wird der Oligonukleotidprimer 5' AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3' verwendet, um [Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;, Thr¹²&sup6;] EPO zu erzeugen. Der Oligonukleotidprimer 5' TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3' wird verwendet, um [Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;, Thr¹²&sup6;, Thr¹³¹] EPO zu erzeugen.
[Asn&sup6;&sup9;, Th&sup7;¹] EPO und [Ser&sup6;&sup8;, Asn&sup6;&sup9;, Thr&sup7;¹] EPO werden konstruiert, um eine N- Glykosilierungsstelle an Asn 69 hinzuzufügen und um die N-Glykosilierung an der Stelle zu erhöhen. [Asn¹²&sup5;, Thr¹²&sup7;] EPO, [Asn¹²&sup5;, Thr¹²&sup7;, Thr¹³¹] EPO, [Pro¹²&sup4;, Asn¹²&sup5;, Ser¹²&sup7;] EPO und [Pro¹²&sup4;, Asn¹²&sup5;, Thr¹²&sup7;] EPO werden konstruiert, um eine N-Glykosylierungsstelle an Asn 125 hinzuzufügen und die Glykosylierung an der Stelle zu erhöhen. [Thr¹²&sup5;, Thr¹²&sup6;] EPO und [Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;, Thr¹²&sup6;, Ser¹³¹] EPO werden konstruiert, um eine O-Glykosylierungsstelle an Thr 125 hinzuzufügen und die Glykosilierung an der Stelle zu erhöhen.
Die Quelle für Erythropoietin-DNA für in vitro-Mutagenese war Plasmid Hu13, ein cDNA- Klon von menschlichem Erythropoietin in pUC 8 (Law er al. Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 6920 (1986)). Plasmid-DNA, die aus Hu13 abgeleitet ist, wurde mit BstEII- und BglII- Restriktionsenzymen verdaut, die resultierenden DNA-Fragmente wurden einer Agarosegel- Elekrophorese unterzogen und das 810 Basenpaar (bp) lange Erythropoietin-DNA-Fragment aus dem Gel unter Verwendung eines GeneCleanTM-Kit und Verfahren isoliert, die vom Hersteller bereitgestellt wurden (BIO 101, Inc.). Plasmid pBRgHuEPO enthält das genomische Erythropoietin-Gen als ein BamHI-Fragment, das in ein Derivat von pBR322 inseriert ist, wie in dem gemeinsam besessenen Lin-Patent beschrieben (siehe oben). pBRgHuEPO wurde auch mit BstEII und BglII verdaut, und das 6517 bp-Vektorfragment wurde gereinigt. Ligation dieser zwei Fragmente führte zu IGT1. Um pEC-1 zu konstruieren, wurde pDSVL (beschrieben in dem gemeinsam besessenen Lin-Patent, siehe oben und in Fig. 1B gezeigt) mit BamHI verdaut und das isolierte 2,8 Kilobasen (kb) BamHI-Fragment aus IGT1, das ErythropoietincDNA enthielt, wurde darin einligiert.
Um einzelsträngige DNA für in vitro-Mutagenese zu erzeugen, wurde pEC-1 mit BamHI und BgIII verdaut und das 820 bp-Erythropoietin-cDNA-Fragment isoliert. Es wurde in die Bam- HI-Stelle von m13mp18 ligiert, um m13-EC-1 zu ergeben. Einzelsträngige DNA wurde isoliert aus Überständen des E. coli-Stammes RZ1032, der mit m13-EC-1 infiziert war, wie beschrieben von Kunkel et al. Methods in Enzymol. 154, 367 (1987) und Messing, Methods in Enzymol. 101, 20 (1983). Für die in vitro-Mutagenese wurden etwa 1 ug einzelsträngige DNA und 0,2 pMol von einem der oben beschriebenen synthetischen Primer mit 6 ml Puffer (250 mM Tris pH 7,8, 50 mM MgCl&sub2; und 50 mM Dithiothreitol) gemischt. Zum Annelieren des Primers an die Matrize wurde das Reaktionsvolumen mit Wasser auf 10 ul eingestellt, die Mischung auf 65ºC für 5 Minuten erhitzt und dann auf Raumtemperatur abzukühlen erlaubt. Für die Elongationsreaktion wurden jeweils 2,5 ml von dTTP, dATP, dGTP, dCTP und ATP (alle mit 10 uM) hinzugegeben, gefolgt von 1 ul (1 Einheit) E. coli-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) und 1 ul (1 Einheit) T4-DNA-Ligase. Die Mischung wurde dann über Nacht bei 14ºC inkubiert und verwendet, um E. coli JM 109 (Yanisch-Perron et al. Gene 33, 103 (1985)) wie beschrieben zu transformieren (Messing, siehe oben).
Um Mutantenklone durch Differential-Hybridisierung zu identifizieren wurden Plaques auf Nutrient-Agar auf Gene Screen-Filter (New England Nuclear) überführt. Die Filter wurden unter einer Heizlampe getrocknet und dann für eine Stunde in 6x SSC, die 1% SDS enthielt, bei 60ºC inkubiert. Für die Hybridisierung wurde der obige Oligonukleotid-Primer (8 pMol) am Ende mit T4-Polynukleotidkinase und γ32P-markiertem ATP markiert und mit den Filtern über Nacht in 6x SSC, 0,5% SDS und 100 mg/ml Lachsspermium-DNA bei 37ºC für die [Asn¹²&sup4;]-Mutation, 55ºC für die [Asn&sup4;, Ser&sup6;]-Mutation, 65ºC für die [Thr¹²&sup5;]- und die [Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;]-Mutationen und 70ºC für die [Asn&sup9;, Ser¹¹] und [Asn¹&sup6;³, Ser¹&sup6;&sup5;]-Mutationen inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Filter dreimal mit 6x SSC bei Raumtemperatur gewaschen und einer Autoradiographie unterzogen. Sofern notwendig, wurden die Filter dann mit 6x SSC bei steigenden Temperaturen gewaschen, bis eine geringe oder keine Hybridisierung gegen Plaques mit der Wildtyp-Erythropoietin-cDNA-Sequenz nachgewiesen wurde. Klone, die unter diesen Bedingungen positive Hybridisierungssignale ergaben, wurden identifiziert und in JM109 wieder transfiziert, um einen reinen Klon zu isolieren. Die Dideoxy- Kettenterminationssequenz-analyse zeigte, daß die Mutationen zu Asparagin-, Serin-, Threonin- und Prolin-Resten vorhanden waren.
Doppelsträngige m13 EC-1-DNA, die die Änderungen [Asn&sup4;, Ser&sup6;], [Asn&sup9;, Ser¹¹], [Asn&sup6;&sup9;], [Asn¹²&sup4;], [Asn¹²&sup5;], [Ser¹²&sup7;], [Asn¹&sup6;³, Ser¹&sup6;&sup5;] [Thr¹²&sup5;] und [Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;] trugen, wurden aus JM109-transfizierten Zellen durch das Kochverfahren isoliert (Holmes et al. Anal. Biochem. 117, 193 (1981)). Die DNAs wurden mit BstEII und XhoII verdaut und die 810 bp Erythropoietin-DNA-Fragmente isoliert. pEC-1 wurde verdaut mit BstEII, gefolgt von einem Teilverdau mit BglII und die 5'-Enden der sich ergebenden Fragmente werden mit bakterieller alkalischer Phosphatase in 10 mM Tris, pH 8 bei 60ºC für 60 Minuten dephosphoryliert. Das 7 kb Vektorfragment, dem das 810 bp BstEII-BglII-Fragment fehlt, wurde isoliert und an die obigen Erythropoietin-Fragmente ligiert. Die sich ergebenden Plasmide (bezeichnet als pEC- X, wo X die besondere Mutation bezeichnet) enthalten menschliches Erythropoietin mit an den angegebenen Positionen geänderten Aminosäureresten.
cDNA-Klone der menschlichen Erythropoietinsequenz und Analoge entsprechend [Asn&sup4;, Ser&sup6;], [Asn&sup9;, Ser¹¹], [Asn&sup6;&sup9;], [Asn¹²&sup4;] [Asn¹²&sup5;, Ser¹²&sup7;], [Asn¹&sup6;³, Ser¹&sup6;&sup5;], [Thr¹²&sup5;] [Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;]-Erythropoietin-cDNA-Klone wurden in COS-1-Zellen (ATCC No. CRL-1650) durch Elektroporation transfiziert. COS-1-Zellen wurden von halbkonfluenten Schalen geerntet, mit Dulbecco's modifiziertem essentiellem Medium gewaschen, das 5% fötales Kälberserum und 1% L-Glutamin/Penicillin/Streptomycin (Irvine Scientific) enthielt, und zu 4 · 10&sup6; Zellen/ml resuspendiert. 1 ml der Zellen wurde in eine Elektroporationsküvette (Bio-Rad) überführt und mit Bio-Rad Gene PulserTM bei 25 uFarad und 1600 Volt in Gegenwart von 100 bis 200 ug Träger-DNA und 2 bis 20 ug Plasmid-DNA, die das Erythropoietin-Analog kodierte, elektroporiert. Die elektroporierten Zellen wurden zu 2 · 10&sup6; Zellen pro 60 mm Gewebekulturschalen in 5 ml Medium platiert. Zwei bis vier Stunden nach dem Plattieren wurde das Medium durch 5 ml frisches Medium ersetzt. Das konditionierte Medium wurde 3 bis 5 Tage nach der Elektroporation gesammelt.

B. Tests auf Erythropoietin-Analog-Aktivität

RIA wurden durchgeführt entsprechend Egrie et al., (Immunobiology 172, 213, (1986).
Die biologische in vivo-Aktivität von Erythropoietin-Analogen wurde bestimmt durch den exhypoxisch-polycythemisch Maus-Biotest (Cotes et al., Natur 191, 1065 (1961)).
Die in vitro-Erythropoietin-Aktivität wurde mit Modifikationen durch den Erythrocyten- Kolonie-Bildungstest bestimmt, wie beschrieben von Iscove et al. J. Cell Physiol. 83, 309- 320 (1974). Die mononnukleären Zellen von menschlichen Knochenmarkszellen wurden teilweise gereinigt auf einem Ficoll-Paque-Kissen und mit Iscove-Medium gewaschen, bevor ausplatiert wurde, um die adhärenten Zellen zu entfernen. Das Kulturmedium enthielt 0,9% Methylzellulose und umfaßte kein Rinderserumalbumin. Die Erythrocyten-Kolonien wurden nach acht- bis zehntägiger Kultur bewertet.
Die wie in Abschnitt A beschriebenen, in COS-Zellen transfizierten und exprimierten Erythropoietin-Analogen wurden in rohen COS-Zellüberständen durch RIA und durch den Erythrocyten-Koloniebildungstest analysiert. Erythropoietin mit der Sequenz vom Menschen weist eine in vitro-Aktivität auf, die vergleichbar mit der RIA-Aktivität ist, wie bestimmt durch die oben erwähnten Tests. Die Analogen [Asn&sup6;&sup9;] EPO, [Asn¹²&sup5;, Ser¹²&sup7;] EPO, [Thr¹²&sup5;] EPO und [Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;] EPO wiesen eine in vitro- Aktivität auf, die vergleichbar ist der RIA-Aktivität, und lieferten den Beweis dafür, daß sie zusätzliche Kohlenhydratketten aufwiesen (wie in Abschnitt C bestimmt). Diese Anlogen wurden weiter analysiert durch Transfizieren eines cDNA-Klons, der das Erythropoietin-Analog kodierte, in CHO-Zellen, Reinigen des Erythropoietin-Analogs und Messen der biologischen in vivo-Aktivität des gereinigten Analogs.

C. Western Blot-Analyse

Ein Kulturüberstandsvolumen, das 5-20 Einheiten von COS-Zellen enthielt, die mit Erythropoietin-Analog-cDNA, wie beschrieben in Abschnitt A, transfiziert waren, wurde über Nacht bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen Kaninchen-anti-Erythropoietin-Antikörper immunpräzipitiert. 20-80 ul von 1 : 1 Protein A-Sepharose in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) wurden zu dem Immunpräzipitat hinzugegeben und für eine Stunde bei Raumtemperatur zu Inkubieren erlaubt. Die Proben wurden zentrifugiert, mit PBS gewaschen und, wenn angegeben, das Pellet mit N-Glykanase behandelt, um N-verknüpfte Kohlenhydratketten zu entfernen. Die Proben wurden durch 15% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert, auf Nitrozellulose transferiert und einer Western Blot-Analyse unterzogen, wie beschrieben (Bur nette et al. Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981); Elliot et al. Gene 79, 167-180 (1989)), unter Verwendung einer Mischung von monoklonalen Maus-anti-Erythropoietin-Antikörpern. Ein derartiger Antikörper, 9G8A, ist beschrieben bei Elliot et al. (1989) Blood 74, Supp. 1, A. 1228.
Die Analyse von COS-Zellüberständen, die mit [Asn&sup6;&sup9;] EPO und [Asn¹²&sup5;, Ser¹²&sup7;] EPO-cDNA transfiziert waren, zeigte eine erhöhte Proteingröße verglichen mit Erythropoietin mit menschlicher Sequenz. Diese erhöhte Größe zeigt eine zusätzliche N-verbundene Kohlenhydratkette an (Fig. 7). Die Behandlung von Überständen von COS-Zellen mit N-Glykanase, die mit [Thr¹²&sup5;] EPO- und [Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5;] EPO-cDNA transfiziert waren, zeigte eine erhöhte Proteingröße verglichen mit Erythropoietin mit der menschlichen Sequenz. Diese erhöhte Größe zeigt eine zusätzliche O-verknüpfte Kohlenhydratkette an (Fig. 8).

D. Isolieren von Erythropoietin-Analog-Isoformen

Das Eryhtropoietin-Analog [Thr¹²&sup5;]-EPO wurde konstruiert, wie in Abschnitt A beschrieben. Ein 810 bp-Erythropoietin-cDNA-Fragment, das die [Thr¹²&sup5;]-Mutation trug, wurde isoliert durch Spalten des Plasmids pEC, das die [Thr¹²&sup5;]-Mutation enthielt, mit BstEII und BglII und Ligieren des Fragmentes in pDECΔ, einem Derivat von pDSα2. pDSα2 wird allgemein beschrieben in der gemeinsam besessenen US-Patentanmeldung 501,904, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. pDECΔ wurde abgeleitet von pDSα2 durch die folgenden Schritte:
(1) Die HindIII-Stelle von pDSα2 wurde deletiert durch Verdauen von pDSα2-DNA mit HindIII, Behandeln der HindIII-kohäsiven Enden mit E. coli-DNA-Polymerase (Klenow- Fragment) und dNTPs, und Religieren des glattendigen Vektors. Das sich ergebende Plasmid war pDSα2ΔH.
(2) pDSα2ΔH wurde mit SalI verdaut und ein synthetisches Oligonukleotid mit einem SV40-Splice-Signal mit einem an das 3'-Ende des Splice-Signals gebundenen SalI-Linker wurde daran ligiert. Das synthetische Oligonukleotid wies die folgende Sequenz auf:
5' TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGT
CTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCA
AAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGG
AAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC 3 '
Das sich ergebende Plasmid war pDSα2ΔH splice.
(3) pDSα2ΔH splice wurde mit SalI verdaut und glattendig gemacht durch Behandeln der kohäsiven Enden mit T4-DNA-Polymerase und dNTPs. Ein 820 bp BamHI-BgIII cDNA- Fragment von menschlichem Erythropoietin wurde glattendig gemacht durch das gleiche Verfahren und in das Plasmid ligiert. Das sich ergebende Plasmid war pDEC.
(4) pDEC wurde mit KpnI und PvuII verdaut und glattendig gemacht durch Behandeln der kohäsiven Enden mit mung bean-Nuklease. Das Plasmid wurde religiert, um das ausgeschnittene KpnI-PvuII-Fragment zu deletieren, was zum Plasmid pDECΔ führte.
Plasmid pDECΔ, das [Thr¹²&sup5;] Erythropoietin-cDNA enthielt, wurde in DHFR-defiziente CHO-Zellen transfiziert. 770 ml von konditioniertem CHO-Zellmedium wurden konzentriert unter Verwendung einer Membran mit einer Molekulargewichtsausschlußgröße von 10 000 Dalton und gegen 10 mM Tris-HCl, pH 8,6 auf ein Endvolumen von 34 ml diafiltriert. Ein Aliquot von 17 ml des Konzentrats wurde auf eine Q-Sepharose-Schnellaufsäule (Bettvolumen 5 ml) geladen, die in demselben Puffer äquilibriert war, und mit einem linearen Gradienten von 0-250 mM NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 8,6, eluiert. Aliquote von Säulenfraktionen, entweder unbehandelt oder verdaut mit N-Glykanase, wurden durch SDS-PAGE oder IEF analysiert und Pools (bezeichnet als 2, 3 und 4) wurden hergestellt auf der Grundlage der Isoform- und/oder Kohlenhydratzusammensetzung der Fraktionen. Ein jeder Pool wurde auf eine Vydac C4-Säule geladen (214TPB 2030; Durchmesser 1 cm; Bettvolumen 1,8-2,5 ml; 0,34 ml/min) und mit 2 Säulenvolumina 20% Alkohol in 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 gewaschen. Die Säulen wurden mit linearen Gradienten von 20-94% Ethanol, 10 mM Tris, pH 7,0 eluiert. Pools wurden hergestellt, in 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 verdünnt und auf Q- Sepharose-Schnellaufsäulen geladen. Nach einem Waschen mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, wurden die Proben mit 20 mM Natriumcitrat, 250 mM NaCl, pH 7,0 eluiert. Die gereinigten [Thr¹²&sup5;]-Pools wurden durch IEF analysiert und sind in Fig. 5 gezeigt. Das EPO-Analog wird auf biologische in vivo-Aktivität analysiert, wie oben beschrieben (Cotes et al., supra.)
Die Stammanmeldung (90311193.8) beschreibt allgemeine Verfahren betreffend die Isolierung und den Test auf Erythropoietin mit spezifischen Anzahlen von Sialinsäuren pro Molekül.

Claims

1. Ein Analog von menschlichem Erythropoietin mit einer oder mehreren Änderungen in der Aminosäuresequenz von menschlichem Erythropoietin, wie in Fig. 5 gezeigt, wobei die Änderung(en) wenigstens eine zusätzliche Polypeptidstelle für Glycosylierung einführt/einführen und wobei eine Kohlenhydratkette an die zusätzliche Stelle gebunden ist.

2. Das Analog von Anspruch 1, wobei eine/die zusätzliche Stelle für eine N-gebundene Kohlenhydratkette ist.

3. Das Analog von Anspruch 1, wobei eine/die zusätzliche Stelle für eine O-gebundene Kohlenhydratkette ist.

4. Das Analog von Anspruch 1, wobei die Änderungen in der Aminosäuresequenz Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäureresten sind.

5. Das Analog von Anspruch 2, wobei eine/die zusätzliche Stelle substituiert ist an Position 69 der Aminosäuresequenz von menschlichem Erythropoietin, wie in Fig. 5 gezeigt.

6. Das Analog von Anspruch 3, wobei die Stelle substituiert ist an Position 125 der Aminosäuresequenz von menschlichem Erythropoietin, wie gezeigt in Fig. 5.

7. Das Analog von Anspruch 1, wobei eine zusätzliche Kohlenhydratkette Stellen für die Bindung von Sialinsäure vorsieht.

8. Das Analog nach einem der vorangehenden Ansprüche, das das Expressionsprodukt einer exogenen DNA-Sequenz ist.

9. Ein Analog entsprechend Anspruch 1, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfaßt:

Asn&sup6;&sup9; EPO;

Asn&sup6;&sup9; Thr&sup7;¹ EPO;

Ser&sup6;&sup8;, Asn&sup6;&sup9;, Thr&sup7;¹ EPO;

Thr¹²&sup5; EPO; und

Pro¹²&sup4;, Thr¹²&sup5; EPO.

10. Eine DNA-Sequenz, die für ein Analog von menschlichem Erythropoietin nach einem der vorangehenden Ansprüche kodiert.

11. Eine eukaryontische Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 10 in einer Art und Weise transfiziert ist, die erlaubt, daß die Wirtszelle ein Analog von menschlichem Erythropoietin exprimiert.

12. Eine Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Erythropoietin- Analogs nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel, Adjuvans oder Träger umfaßt.