DE3850535T2

DE3850535T2 - Topisch aktive Doppelstrang-RNS-Zusammensetzungen.

Info

Publication number: DE3850535T2
Application number: DE3850535T
Authority: DE
Inventors: William Carter
Original assignee: HEM Pharmaceuticals Corp
Current assignee: HEM Pharmaceuticals Corp
Priority date: 1987-08-12
Filing date: 1988-08-12
Publication date: 1995-01-12
Anticipated expiration: 2008-08-13
Also published as: IE66830B1; HUT47855A; FI883734A; AU1736592A; RU2061470C1; DE3850535D1; NZ225755A; JP2714021B2; IE882398L; PT88248B; IL87415A0; NO883564D0; CN1031325A; KR970007904B1; EP0303516A2; EP0303516B1; ZA885874B; HU209749B; AU1001395A; JPH01139531A

Description

Diese Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen für die topische Anwendung, die unpassende (mismatched) doppelstrangige Ribonucleinsäuren (dsRNAs) und biologisch aktive Fragmente von unpassenden dsRNAs in einer als ternären Komplex mit einem oberflächenaktiven Mittel stabilisierten Form enthalten. Die Zusammensetzungen sind lagerstabil und bleiben als antivirale und andere Mittel topisch aktiv.
Nichtionische Tenside (oberflächenaktive Substanzen) haben sich als spemizid wirksam erwiesen und stellen die Wirkstoffe in verschiedenen frei erhältlichen (rezeptfreien) kontazeptiven Cremen und Schäumen dar. In hohen Konzentrationen zeigen die Tenside offensichtliche toxische Wirkungen auf Zellen, was ihre mögliche Verwendbarkeit einschränkt; derartige Konzentrationen sind aber zur Erreichung einer Wirksamkeit gegen Herpes-Virus notwendig, da sie ein Aufreißen der Virushülle bewirken. Von Tensiden wurde berichtet, daß sie bestimmte Stämme des Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) zumindest in vitro inaktivieren.
Eine andere Klasse von Makromolekülen, die in vivo gegen Viren, Krebs und Infektionszellen aktiv sind, sind dsRNAs, die zwar relativ untoxisch, jedoch bei Körpertemperatur (37ºC) biologisch instabil sind, wodurch ihre Verwendbarkeit und Leichtigkeit der Handhabung eingeschränkt sein können. In flüssiger Form müssen bestimmte dsRNAs beispielsweise sorgfältig bei 4ºC gelagert werden, um die Zerstörung ihres Moleküls zu verhindern. Aus diesen Gründen werden die dsRNAs durch Injektion in die Blutbahn des Patienten verabreicht. Ich habe nun gefunden, daß ich durch Herstellung von Mischungen von oberflächenaktiven Substanzen und dsRNAs in physiologisch verwendbaren Trägern mehrfache unerwartete Eigenschaften erreichen kann. Diese neuen Eigenschaften umfassen: (a) Stabilisierung der dsRNAs gegen Temperatur-assoziierte enzymatische Zerstörung, (b) eine synergistische biologische Wirkung, die tatsächlich das antimikrobielle Spektrum der kombinierten Produkte im Vergleich zu jeder Verbindung allein erweitert, und (c) eine erleichterte Aufnahme durch lokal verfügbare Zellen, was zu einer höheren intrazellulären Konzentration des bioaktiven Materials auf Grund eines erleichterten Membran-Durchtritts von ternären und quaternären Komplexen, die um ein negativ geladenes dsRNA-Kernmolekül aufgebaut wurden, führt. Besonders wichtig ist, daß die kombinierten Produkte eine unüblich hohe spezifische Bioaktivität gegen HIV ebenso wie gegen bestimmte andere venerisch übertragene Pathogene, inklusive Mitgliedern der Familie der Herpes-Viren, zeigen. Somit beschreibe ich eine neue Serie von ternären Komplexen (2 Stränge von komplementär unpassender RNA plus einem oberflächenaktiven Mittel, das eine Mizelle rund um die dsRNA bildet), die neue biophysikalische und biologische Eigenschaften aufweisen. Allein oder mit komplementären Lymphokinen und/oder Inhibitoren von reverser Transkriptase bieten diese Produkte erhöhte Möglichkeiten der Feindabwehr an den Eintrittsöffnungen für die verschiedenen Pathogene. Diese und andere Merkmale der Erfindung werden detailliert im folgenden beschrieben.
Die verwendeten oberflächenaktiven Substanzen können anionischer, kationischer oder nichtionischer Natur sein. In der Regel wurde die Wirksamkeit dieser Mittel bei topischer Anwendung ihrer Möglichkeit zugeschrieben, verschiedene Lipid-enthaltende Membranen aufzulösen und darin ihre Fähigkeiten entfalten zu können, als Spermizide zu wirken und die Nucleocapsid-Strukturen von Herpes-Virus - 1 und -2 aufzulösen; vgl. US-PS Nr. 4 507 281 von Asculai et al. sowie die darin zitierten Patente.
Insbesondere haben sich die nichtionischen oberflächenaktiven Stoffe als beträchtlich wirksam erwiesen, wenn sie in Vaginal-Kontrazeptiva als Spemizide eingesetzt wurden, und ein spezielles nichtionisches Tensid mit der Bezeichnung Nonoxynol-9 (NP 9) erfreut sich einer breiten Anwendung in kontrazeptiven Cremen und Schäumen. Es muß jedoch Sorgfalt bei der Anwendung derartiger oberflächenaktiver Substanzen angewendet werden, da sie in normalen Zellen Toxizität verursachen können (Asculai et al., Antimicrob. Agents and Chemo., Band 13, Seite 686, 1978). Rapp et al. beobachteten eine synergistische Wirkung von humanem alpha-Interferon (einem Protein) mit Nonoxynol-9 hinsichtlich der Inhibition speziell von HS-Typ 2 (Rapp et al., Antimicrnb. Agents and Chemo., Bd. 28, S. 449, 1985). Auch Hicks et al. (Lancet, Bd. 2, 21/28. Dez., S. 1442, 1985) beschrieben eine in vitro Inaktivierung von HTLV-III (HIV, früher HIV-Virus) durch Konzentrationen von Nonoxynol-9 (bei alleiniger Verwendung), die 0,05% oder mehr betrugen. Hicks beobachtete auch eine Toxizität von Nonoxynol-9 an normalen Lymphozyten, die bei Konzentrationen von mehr als 1% deutlicher wurde. Es sei festgehalten, daß das Nonoxynol-9, da seine Konzentrationen in handelsübliche Spermiziden im Bereich von 1% bis 5% liegen (Voeller, Lancet, Bd. 1, S. 1153, 17. Mai 1986), sehr wohl die normalen Zellen des Urogenitaltrakts schädigen kann, während es möglicherweise "freies" HIV oder HIV innerhalb von Lymphozyten angreift. Da die Entwicklung eines AIDS Impfstoffs noch mehrere Jahre in der Zukunft liegen kann (vgl. Fauci, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83, S. 9278, 1986), sollten rasch verschiedene Schritte zur Kontrolle seiner Verbreitung unternommen werden. Wie Fauci hervorhebt: "ein wichtiger Punkt ist die Frage, in wem der Impfstoff-Kandidat geprüft werden soll, auch wenn dieser sich als sicher und wirksam erweist, . . . .selbst bei männlichen Homosexuellen . . . . wären die Studien schwierig." Dies unterstreicht die Wichtigkeit der sofortigen Entwicklung bestimmter topisch brauchbarer Verfahren zur Herabsetzung des Risikos einer Übertragung von Viren oder anderen Mikroorganismen bei der Gelegenheit sexueller Beziehungen, um die weitere Verbreitung derselben in der gesamten Bevölkerung zu verhindern. Zum Beispiel schätzt Fauci, daß die "Spitze des Eisbergs" 150.000 Fälle (HIV) in den Vereinigten Staaten allein sein kann.
Topische Zusammensetzungen zur Behandlung viraler Zustände sind in der Patentliteratur beschrieben. Zusammensetzungen zur Behandlung von Herpes simplex-Infektionen, die humanes Interferon, ein antivirales nichtionisches oberflächeaktives Mittel (Nonylphenoxypolyethoxyethanol) und einen Träger enthalten, sind in der US-PS 4 507 281 von Asculai et al. beschrieben. Polynucleotide, die Interferon induzieren, wie die dsRNA Polyriboinosinsäure:Polyribocytidylsäure oder Poly I.C, sind in der US-PS 4 283 393 von Field et al. beschrieben, worin ein Interferon-Induziermittel (Poly I.C) mit einem wasserlöslichen Polymer homogen gemischt wird, um eine gesteuerte Abgabe bei topischer Anwendung zur Behandlung von Virus-infiziertem Haut-, Augen- und Schleimhautgewebe, das für eine Behandlung mit Interferon zugänglich ist, zu erzielen. Levy beschreibt in der US-PS 4 024241 Nuclease-resistente, hydrophile Komplexe von Poly I.C, komplexiert mit einem Poly-I-Lysin und Carboxymethylzellulose. Einfache Mischungen von Poly I.C in wässerigen Lösungen, Salben, Cremen oder flüssigen Zubereitungen sind in der US-PS 4 124 702 von Lampson et al. beschrieben.
Die Toxizität von Poly I.C wird in der Literatur berichtet (Adamson, Nature, Bd. 223, 16. August 1969) und aus diesem Grund wurde von der therapeutischen Verwendung von Poly I.C weitgehend Abstand genommen. Im Gegensatz dazu sind die unpassenden (mismatched) dsRNAs, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, relativ wenig oder nicht toxisch. Außerdem berichtet der Erfinder hier, daß Abbauprodukte (Fragmente) der unpassenden dsRNAs, wie sie unvermeidbar bei langzeitlicher Lagerung auftreten, während eines beträchtlichen Zeitraums bioaktiv bleiben und in manchen Fällen aktiver sind als die Stammverbindungen.
Der Vollständigkeit halber sei festgehalten, daß zumindest zwei verschiedene Bezeichnungen für das HIV-Virus existieren: LAV ist die Bezeichnung für das HIV-Virus, das an dem Institut Pasteur in Paris, Frankreich, isoliert wurde, und HTLV-III ist die Bezeichnung für das HIV-Virus, das an dem National Institute of Health, Bethesda, Maryland, USA, isoliert wurde. In diesem Text wird häufig auf das Virus in allgemeiner Art oder unter der Bezeichnung HIV oder HTLV-III oder LAV bezug genommen, ohne daß die Absicht besteht, zwischen diesen eine Unterscheidung zu treffen. Außerdem umfaßt der Ausdruck "HIV" in der Beschreibung und in den Ansprüchen alle anderen Viren, die bei der Verursachung von HIV-Infektionen im Menschen beteiligt sein können, inklusive der seropositiven asymptomatischen Träger, des AIDS-bezogenen Komplexes oder ARC und des erworbenen Immundefizienz-Leidenssyndroms oder AIDS, unabhängig ob diese bereits isoliert sind oder nicht.
In der Europäischen Patentanmeldung, die am 11. März 1987 unter der Veröffentlichungsnummer 0 213 921 und mit dem Titel "Modulation von Virus-bezogenen Ereignissen durch doppelstrangige RNAs" herausgegeben wurde, beschreibt der Erfinder die Inhibierung von HIV in humanen Zellkulturen durch dsRNAs, insbesondere bei Verwendung von Ampligen R als ein Prototyp von dsRNA.
Kationische oberflächenaktive Substanzen sind bevorzugte Tenside; es können jedoch nichtionische oder an ionische Tenside in gleicher Weise verwendet werden. Geeignete anionische Tenside umfassen Natrium-Alkylsulfonate und Natrium-Alkylbenzolsulfonate. Geeignete kationische Tenside umfassen quaternäre Ammonium-Detergentien, inklusive Cetylpyridiniumchlorid und Benzoalkoniumchloride. Im Gegesatz zu den kationischen und an ionischen Tensiden enthalten die nichtionischen Tenside keine ionisierbaren Gruppen und haben keine molekulare Ladung; ihre Oberflächenaktivität hängt im allgemeinen von ihrem gesamten Molekül ab.
Es kann jedoch fast jede hydrophobe Verbindung, die in ihrer Struktur eine Carboxy-, Hydroxy-, Amid- oder Aminogruppe mit einem freien, an den Stickstoff gebundenen Wasserstoff enthält, mit Ethylenoxid umgesetzt werden, um ein nichtionisches Detergens zu bilden. In meiner Erfindung beschreibe ich den neuen ternären Komplex von unpassender dsRNA, die mit Tensiden komplexiert ist; dsRNAs haben auch ein hydrophobes Merkmal, das die Ursache dafür ist, daß die Nucleotidbasen in den beiden komplementären Strängen eine feste, doppel-helikale Struktur bilden. In meiner vorliegenden Erfindung bin ich imstande, einen ternären Komplex zu bilden, d. h. RNA Strang "1" plus dem (komplementären) RNA Strang "2" plus der oberflächenaktiven Substanz, um einen ternären (aus drei Mitgliedern bestehenden) Komplex mit vollständig neuen biophysikalischen und therapeutsich wichtigen biologischen Eigenschaften zu erzielen.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Darstellung einer unpassenden dsRNA allein, eines binären Komplexes von zwei RNA-Strängen, der eine über alles gehende negative Ladung auf der Oberfläche der dsRNA-Masse aufweist; und
Fig. 2 ist eine Darstellung des ternären Komplexes der unpassenden dsRNA (zwei komplementäre, jedoch unpassende RNA-Stränge, umgeben von einem kationischen Tensid) gemäß der vorliegenden Erfindung mit dem positiv geladenen Teil der kationischen Tensidpartikel, die um die negativ geladene Oberfläche der dsRNA orientiert sind, wobei sich der nichtpolare Rest des Tensids weg von der dsRNA-Masse erstreckt.
Die relative Konzentration des Tensids (kationisch in dieser Darstellung) steuert die relative Polarität des entstehenden Komplexes, die für verschiedene therapeutische Anwendungen unterschiedlich sein kann. Durch einen Überschuß an Tensid kann, sobald der ternäre Komplex einmal gebildet ist, eine Ausfällung des Komplexes auftreten, was wünschenswerte Eigenschaften für bestimmte topische Anwendungen beitragen kann.
Ein Schlüssel zu der vorliegenden Erfindung ist der Aufbau einer Mizelle an der oder rund um die dsRNA (in gleicher Weise mit einem neutralen, anionischen oder kationischen Tensid), um zu einem neuen therapeutischen Merkmal - nämlich einer hohen (lokalisierten) biologischen Wirksamkeit - beizutragen. Eine Mizelle ist definiert als die Struktur, die durch Addition von Molekülen mit bifunktionellen Molekülgruppen an sonst wässerige (wasserkompatible) Substrate, wie dsRNA, gebildet wird. Bifunktionalität bezeichnet im vorliegenden Zusammenhang ein Molekül mit einem polaren Ende (d. h. mischbar mit Wasser, das polar ist) und einem anderen Ende, das nichtpolar ist (d. h. das mehr Affinität für Lipide - den Grundbestandteilen von Zellmembranen - hat). Der gewünschte Zweck des Aufbaus eines derartigen ternären Komplexes, der zu einer Mizelle führt, liegt darin, daß dieser durch zwei oder mehrere Eigenschaften therapeutisch aktiver wird und es ihm (dem entstehenden Komplex) nun ermöglicht wird, die Zellmembranen der Zielzellen (Krebszellen, Virusinfizierten Zellen, Immunzellen etc.) leichter zu durchsetzen:
Eigenschaft 1: Ein Schlüsselmerkmal für erleichterten Transmembran-Transfer ist die entstehende gewünschte Oberflächenladung des ternären (mizellaren) Komplexes im Verhältnis zu unkomplexierter (binärer) dsRNA und die erhöhte Hydrophobizität, die eine Annäherung an die Zellmembran und eine tatsächliche physikalische Fusion mit derselben und somit eine raschere Aufnahme bewirkt.
Eigenschaft 2: Die unten beschriebene teilchenförmige Natur des ternären Komplexes (der die mizellaren Komplexe einschließt, jedoch nicht auf sie beschränkt ist) wird die Zellaufnahme weiter erleichtern, indem eine zusätzliche Eigenschaft der zellulären Phagozytose ermöglicht wird, die ohne Mizellenbildung in minimaler Weise auftritt. Phagozytose ist jener Prozeß, bei welchem eine Ausstülpung der Zelle (genannt pinozytotische Vakuolen, etc.) zu einem physikalischen Verschlingen der teilchenförmigen dsRNAs in den ternären (oder quaternären) Komplexen führt und dadurch deren Transfer in das intrazelluläre (im Gegensatz zum extrazellulären) Abteil beschleunigt, was ein notwendiger Schritt ist, um maximale Bioaktivität im Menschen zu erreichen. Dieser Prozeß der Phagozytose kann auch mit biofragmentierten dsRNAs, z. B. unpassenden dsRNAs, auftreten.
Der Molenbruch (relative Konzentration) des Tensids steuert die relative Polarität des entstehenden Komplexes, die für verschiedene therapeutische Anwendungen variieren kann. Indem man, sobald der ternäre Komplex einmal gebildet ist, einen Überschuß an Tensid zur Verfügung stellt, kann eine Ausfällung des Komplexes die Folge sein, die für bestimmte topische Anwendungen wünschenswerte Eigenschaften beitragen kann.
Ein Spezialfall, der die Einsetzbarkeit der vorliegenden Erfindung illustriert, ist der ternäre Komplex, der sich zwischen einem kationischen Tensid, wie Cetyl-trimethyl-ammoniumbromid (abgekürzt CTAB) und dsRNA bildet. Wegen der basischen Natur seiner polaren Reste wird es sich auf der RNA selbst in einer Weise orientieren, daß die dsRNA einen negativ geladenen Kern bildet, um welchen sich das positiv geladene Detergens (mit seinen sauren Gruppen) anlagert (vgl. das Diagramm). Jedes basische (kationische) Detergens kann das CTAB ersetzen und kann zu einer Mizelle führen, die wesentlich besser stabilisiert und bioaktiver ist, als wenn beispielsweise die dsRNA innerhalb einer einfachen Lipidstruktur (z. B. einem Liposom) eingebracht ist, die nur durch wesentlich schwächere, hydrophobe Bindungen zusammengehalten wird. Als Folge davon hat in der regulierenden Mizelle die polare Natur des Detergens die negativ geladene Oberfläche der dsRNA auf ein Minimum reduziert, so daß der nun im wesentlichen unpolare ternäre Komplex einen vereinfachten Transport durch die Zellmembran erfährt. Eine weitere Spezifität in der Mizellenaufnahme kann dadurch entstehen, daß eine noch zusätzliche Spezifität auf Zielzellen geschaffen wird, wie durch Aufbau eines quaternären Komplexes, in welchem die vierte Komponente einen spezifischen Tropismus oder eine Attraktion für eine bestimmte Zellklasse schafft, z. B. durch Einbau des HIV-Proteins gp120, um den entstehenden Komplex auf T4 Lymphozytenzellen zielgerichtet zu machen, wenn es das primäre Ziel ist, ein Retrovirus zu behandeln oder zu verhindern.
Die Darbietung der dsRNA als einen ternären Komplex, insbesondere als eine Mizelle, stabilisiert und schützt nicht nur, wie oben erklärt worden war, die hitzelabile dsRNA, sondern erleichtert auch die Aufnahme der dsRNA und verstärkt die Wirkung der unpassenden dsRNA. Die Mizellenstruktur liefert einen verstärkten Kontakt der Wirkstoffsubstanz mit der Zelloberfläche. Die reine Oberflächenladung auf der Mizelle ist für die meisten Zellen stärker anziehend und/oder stärker kompatibel. Im Gegensatz dazu hat die "nackte" unpassende dsRNA eine hohe negative Ladung und kann von der Zelle physikalisch abgestoßen werden. Die ternäre dsRNA-Komplex-Mizelle bietet sich durch Ladungsanziehung dar und wird durch diese von der Zelle angenommen. Zweitens ermöglicht die Mizellenstruktur, daß die dsRNA teilchenförmige Komplexe bildet, die ihrerseits neue Mechanismen der Phagozytose erbringen, die oben im Detail erklärt worden ist. Wann immer ein Träger/ternärer Komplex gebildet wird, ist es unvermeidbar, daß sich einzigartige bioaktive Fragmente von unpassender dsRNA bilden, und diese bioaktiven Fragmente sind erwünscht. Der Grund dafür sind - Ribonucleasen, die chemische Ursache, warum solche Fragmente gebildet werden, ist ubiquitär und es werden sich tatsächlich mehr oder weniger solche Fragmente unabhängig davon bilden, woraus der Komplex hergestellt wird. Die Fähigkeit, Mizellen mit diesen bioaktiven Fragmenten zu bilden, stellt eine kritische Ausführungsform der Erfindung zur Verstärkung ihrer Verwendbarkeit dar.
Es werden unvermeidbar qualitative biophysikalische Veränderungen auftreten, wenn das pharmazeutische Präparat (Creme, Lotion oder dergl.) im Lager der Apotheke darauf wartet, unter die Leute gebracht zu werden. Die Lagerung kann bei -4ºC, 7ºC oder bei Raumtemperatur (in der Regel bei etwa 20ºC) erfolgen. Weit davon entfernt, ein negatives Merkmal zu sein, wurden diese Veränderungen von meiner Erfindung vorweggenommen: in einer bevorzugten Ausführungsform beginnt das Produkt mit einem Kern aus dsRNA der unpassenden Art, wobei es das Ziel ist, einen ternären oder quaternären Komplex aus diesem Ausgangsmaterial aufzubauen. Das bedeutet in der Praxis, daß der unvermeidbare Zerfall der makromolekularen RNA bioaktive Reste freisetzen wird, Materialien mit niedrigerem Molekulargewicht, die mit dem anwesenden Tensid Komplexe bilden werden, die zu geringfügig unterschiedlichen mizellaren Komplexen mit ähnlichen gewünschten pharmakologischen Eigenschaften führen.
Mit der Zeit fährt das Produkt fort, eine biologische therapeutische Wirksamkeit aufzuweisen, obwohl die Anzahl der RNA-Kerne ständig abnimmt, da die Anzahl der bioaktiven Fragmente der Eltern-dsRNA ständig zunimmt, wenn die RNA-Kerne abgebaut werden. Somit bleibt die biologische Kraft ständig erhalten oder steigt sogar mit der Zeit leicht an, da wirksame bioaktive Fragmente der dsRNA dauernd weiter freigesetzt werden. Somit bedeutet der Ausdruck "stabil", wie er hier verwendet wird, daß das Produkt mit der Zeit seine therapeutische Wirksamkeit beibehält.
Die in meiner vorliegenden Erfindung einsetzbaren nichtionischen oberflächenaktiven Substanzen zerfallen in zumindest drei Gruppen: (1) jene, die entweder eine Etherbrücke haben (wie zwischen dem hydrophilen und dem hydrophoben Teil des Moleküls), wie etwa Polyoxyethylenalkohole, Polyoxyethylenester von Fettsäuren, Polyoxyethylen-Alkylphenole oder -Merkaptane oder -Alkylamine; (2) jene, die eine Ester- oder Ether-Esterbrücke aufweisen; und (3) jene, die eine Amidbrücke aufweisen. Ionische Detergentien können auch verwendet werden, wie ich es an anderer Stelle in der Anmeldung beschreibe, insbesondere bei der Bildung neuer Mizellen, die rasch zu hohen intrazellulären Konzentrationen von dsRNAs und deren bioaktiven Fragmenten führen. Ether- oder Amidbrücken sind die bevorzugten Ausführungsformen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung und einige Beispiele sind: Nonoxynol-9 (Nonylphenoxypolyethoxy-ethanol); TritonR -X-100 (p-Diisobutylphenoxypolyethoxy-ethanol); Polyoxyethylen-oleylether (auch Br&ijlig;R 97 genannt); und Onyx-OL (auch Onyx-OL 345 genannt). In den im folgenden beschriebenen Erfindungen variieren die Mengen an eingesetztem Tensid zwischen 0,01% und 20%, obwohl der bevorzugte Bereich unterhalb von 12 Gew.-% liegt, wobei die endgültige Formulierung auch eine Funktion des relativen Gehalts der jeweiligen unpassenden dsRNA sowie des therapeutischen Ziels (z. B. ist Chlamydia etwas resistenter gegen den ternären Komplex als HSV-2) und der besonderen Form der pharmazeutischen Darstellung ist. Vorzugsweise liegt die Menge an unpassender dsRNA im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 10 Gew.-% oder mehr der Zusammensetzung in Abhängigkeit von der besonderen Formulierung (die Löslichkeit der dsRNA ist beispielsweise kein begrenzender Faktor in Supsensionen) und dem Zustand oder den Zuständen, der bzw. die durch das Produkt behandelt werden soll(en). Wenn dsRNA-Fragmente verwendet werden, kann die obere Grenze der Konzentration einigermaßen hoch sein, da alle Löslichkeitsbeschränkungen aufgehoben sind. Wie immer der relative Gehalt an dsRNA zu Tensid in der Formulierung ist, kann das Gleichgewicht der pharmazeutischen Zusammensetzung im allgemeinen einfach durch einen inerten, pharmakologisch verträglichen, pharmazeutisch verwendbaren Träger erreicht werden.
Hintergrund der dsRNA. Ich habe dieses Gebiet vor kurzem aus historischen Sicht beschrieben (Carter et al., J. Biol. Resn. Modifiers, Bd. 4, die Artikel beginnend mit Seite 495-613, auf die hier bezug genommen wird). Die dsRNAs wurden als mögliche Antikrebs- und Antivirus-Arzneimittel wegen der vielen klinischen Toxizitäten und dem Mangel an Wirksamkeit im Zusammenhang mit der ersten klinisch untersuchten dsRNA, der Polyinosin- Polycytidyl-Säure (Poly I.C oder rIn.rCn) klinisch weitgehend unbeachtet gelassen. Jedoch habe ich früher gezeigt daß unpassende dsRNA-Helices, die wesentliche weniger Anregung zur Bildung von Tumornekrose-Faktor (TNF), einem zu Cachexie führenden, hochtoxischen Lymphokin (Protein), geben, sowohl die therapeutische Wirksamkeit erhöhen als auch eine geringere Toxizität aufweisen. Tatsächlich ist die dsRNA wirkungsvoller als das Interferon gegen verschiedene Tumoren und Viren, inklusive HIV (Carter et al., Lancet, 6. Juni 1987 und hier genannte Literaturstellen). Jedoch hat sich die pharmakologische "Formulierung" und die Lagerung von unpassender dsRNA, jener Form von dsRNA, die bisher das günstigste therpeutische Verhältnis bei Untersuchungen am Menschen aufwies, als ein schwer zu überwindendes Problem oder Hindernis erwiesen, welches Merkmal ich jedoch im Zusammenhang mit meiner vorliegenden Erfindung imstande war zu überwinden. Die Ergebnisse zeigen, daß die unpassende dsRNA, sobald sie einmal in eine wässerige Lösung eingebracht wurde, innerhalb von 4 Stunden in einen zur Aufnahme bestimmten Menschen oder ein Tier injiziert oder aber weggeworfen werden muß. Dieser Schritt der "raschen Verwendung oder Verwerfung" ist notwendig, da das Arzneimittel bei Temperaturen von etwa 4ºC einen fortschreitenden Abbau erleidet, der teilweise auf das Vorliegen von verschiedenen RNasen, d. h. Enzymen, die dsRNA abbauen und auf die die unpassenden dsRNAs besonders empfindlich sind, zurückzuführen ist. Derartige Enzyme sind in der Natur überall anzutreffen und sind daher auf den Händen, im Speichel, in sterilem Wasser, auf Glaswaren etc. vorhanden. Demzufolge war der einzige modus operandi - bis zu der hier beschriebenen vorliegenden Erfindung - die sichere Konservierung von Produkten aus unpassender dsRNA in Form von gefriergetrockneten (lyophilisierten) Produkten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung konnte ich dieses lange bestehende Hindernis durch Bildung einer neuen Gruppe von ternären Komplexen mit wesentlich gesteigerter Stabilität bei verschiedenen Raumtemperaturen überwinden. Unpassende dsRNAs sind auf Nuclease-Angriff sehr empfindlich, doch bleiben die Abbauprodukte der dsRNA, wenn sie von dem Tensid umgeben und mit ihm (unter Bildung eines ternären Komplexes) komplexiert sind, in ihrer Wirkung bestehen und sind oft, wie im folgenden beschrieben, wirksamer als die Eltern-Verbindungen.
In einem anderen Artikel, den ich vor kurzem veröffentlichte (Brodsky, Carter et al., J. Biol. Res. Mod., Bd. 4, S. 669, 1985); vgl. insbesondere Fig. 1, S. 673, erwähne ich, daß (a) wegen Labilität/Instabilität sogar RNase-Inhibitoren zu allen Röhrchen zugegeben werden müssen, in welchen Proben von unpassender dsRNA vorliegen, und daß (b) die Stabilität von dsRNA in vivo sehr gering ist, wobei sie in der Größenordnung von nur Minuten gemessen wird. Tatsächlich wird die T1/2 (Halbwertszeit) von injizierter dsRNA (z. B. rIn.r(C&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub4;U)n, das auch AmpligenR genannt wird, eine Handelsmarke von HEM Research, Inc.) in Humanserum auf 20 min + 15 min geschätzt. Verschiedene humane Patienten haben unterschiedliche Mengen hydrolytischer Enzyme, wie ich in meinen früheren Studien auf diesem Gebiet beobachtet habe alle Menschen, die ich bisher untersucht habe (etwa 115 Personen) haben jedoch signifikante Gehalte von Enzymen (Endo- oder Exonucleasen), die die dsRNA rasch abbauen.
Diese Erfindung besteht in einer topisch anwendbaren pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Zuständen, die auf eine Behandlung mit unpassender dsRNA empfänglich oder empfindlich sind, wie etwa virale Infektionen und Hautkrebs, bei welchen die dsRNA topisch in bioaktiver Form angewendet wird. Die normalerweise hitzelabile unpassende dsRNA wird als ternärer Komplex von zwei Strängen der RNA, die nach obiger Definition unpassend (mismatched) sind, komplexiert mit einem anionischen, nichtionischen oder kationischen Tensid oder Detergens angeboten. Oft bildet der aktive Bestandteil eine Mizelle mit der oberflächenaktiven Substanz und kann wie die verglichene Elternverbindung (unpassende dsRNA) oder in Form von bioaktiven Fragmenten der Elternverbindung vorliegen.
Zustände, die durch die topischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung behandelt werden können, umfassen jene, von denen es bekannt ist, daß sie auf eine Therapie mit unpassender dsRNA empfänglich sind, sowie jene Zustände, für welche unpassende dsRNA die einzige Art der Verabreichung darstellt. Diese Zustände umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: (1) humane Retrovirus-Infektionen inklusive HIV, (2) Mitglieder der Familie der Herpes-Viren, z. B. Herpes simplex und Herpes Zoster; (3) Cytomegalovirus oder CMV (manchmal als Virus vom Typ Herpes-Virus klassifiziert), (4) lokale Hautkrebse mit und ohne viraler Etiologie, (5) empfindliche, sexuell übertragene Virus-Zustände und venerische Infektionen, inklusive Chlamydien (viele der oben zusammengestellten Zustände werden auf sexuellem Weg übertragen) und (6) venerische Infektionen, in welchen das verursachende virale Agens von einer anderen venerischen Infektion selbst primär oder sekundär ist und das unempfindlich oder nicht ausreichend bekämpft ist mit unpassender dsRNA, wobei die Sekundärinfektion durch eine andere therapeutische Modalität (wie gleichzeitige Gonorrhoe-Infektion, für die der Patient eine Tetracyclin-Therapie erhält) behandelt wird.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen pharmazeutische Präparate, wie Flüssigkeiten - Lösungen, wie isotonische Augentropfen und Nasentropfen oder Sprays, Lotionen, Cremen, Schäume, Gele und viskose Flüssigkeiten, inklusive Gleitmittel, die vom Urogenitalsystem gut vertragen werden, und/oder Spemizide, die vom Urogenitalsystem gut vertragen werden; feste und halbfeste Präparate - Salben, ophthalmische Salben oder Cremen, andere Cremen, Balsame, Suppositorien (sowohl rectal als auch vaginal), Stifte, wie Lippenstifte, die zur Behandlung von Herpes-simplex-Wunden verwendet werden, und Augeneinsätze.
Unter "unpassenden (mismatched) dsRNAs" werden solche verstanden, in welchen die Wasserstoffbindung (Basenpaarung) zwischen den gegenüberliegenden Strängen relativ intakt ist, d. h. daß sie im Mittel an weniger als einem Basenpaar in jeweils 29 aufeinanderfolgenden Basenresten unterbrochen ist. Unpassendheit (mismatching) ist eine Unterbrechung der normalen Geometrie der RNA-Doppelhelix durch Einbauchen (oder Ausbauchen) der Stränge, was auf eine Verletzlichkeit der dsRNA durch Abbau mit Ribonucleasen hindeutet. Der Ausdruck "unpassende (mismatched) dsRNA" sollte dementsprechend verstanden werden.
Die dsRNA kann ein Komplex von Polyinosinat und ein Polycytidylat mit einem Gehalt an Uracilbasen oder Guanidinbasen z. B. von 1 in 5 bis 1 in 30 solcher Basen sein (Poly I.Poly (C&sub4;&submin;&sub2;&sub9;x > U oder G).
Die dsRNA kann die allgemeine Formel rIn.(C&sub1;&sub2;U)n haben. Andere geeignete Beispiele der dsRNA werden weiter unten besprochen.
In der bevorzugten unpassenden dsRNA, rIn.(C&sub1;&sub2;,U)n, dient ein Bereich, der aus einer ununterbrochenen Erstreckung von 6 bis 12 Basenpaaren besteht, d. h. eine halbe bis eine ganze Wendung einer RNA- Schraube, sowohl als ein Biotrigger, der die Freisetzung von Lymphokinen verursacht, als auch als ein obligater intrazellulärer Co-Faktor für Enzyme, wobei die natürlichen antiviralen Pfade umfaßt sind. Die unpassenden Bereiche, die aus Uracil-Resten bestehen, werden periodisch in den Polypyrimidin-Strang eingesetzt, um die dsRNA-Hydrolyse zu beschleunigen und somit Toxizität zu verhindern.
Die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugten dsRNAs basieren auf Copolynucleotiden, die ausgewählt sind aus Poly(Cn,G), worin n eine ganze Zahl mit dem Wert von 4 bis 29 ist, und sind unpassende Analoga von Komplexen von Polyriboinosinsäure und Polyribocytidylsäure, die durch Modifikation von rIn.rCn gebildet sind, um ungepaarte Basen (Uracil oder Guanidin) entlang des Polyribocytidylat- (rCn)-Stranges einzubauen. Andererseits kann die dsRNA von Poly (I).Poly (C) dsRNA stammen, indem das Ribosylrückgrat der Polyriboinosinsäure (rIn) z. B. durch Einschluß von 2'-O-Methylribosylresten modifiziert wird. Diese unpassenden Analoga von rIn.rCn, von denen bevorzugte die der allgemeinen Formeln rIn.r(C11-14,U)n und rIn.r(C&sub2;&sub9;,G)n sind, werden von Carter und Ts'o in den US-PSen 4 130 641 und 4 024 222 beschrieben, auf deren Offenbarungen hier bezug genommen wird. Die darin beschriebenen dsRNAs sind allgemein zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet.
Andere Beispiele von unpassenden dsRNAs zur Verwendung in der Erfindung umfassen:
Poly (I).Poly (C&sub4;,U)
Poly (I).Poly (C&sub7;,U)
Poly (I).Poly (C&sub1;&sub3;,U)
Poly (I).Poly (C&sub2;&sub2;,U)
Poly (I).Poly (C&sub2;&sub0;,G)
Poly (I).Poly (C&sub2;&sub9;,G) und
Poly (I).Poly (Cp)23 G > p
Die Erfindung kann durch Zusatz eines anderen Lymphokins zu dem ternären Komplex in die Praxis umgesetzt werden - wobei es der Zweck dieses Additivs ist, die Anzahl und die Natur der Zellen zu modifizieren, die zur Reaktion mit topisch angewendeter dsRNA zur Verfügung stehen. Zum Beispiel wird der Zusatz von Interleukinen zu dem ternären Komplex ein weiteres Verfügbarmachen von T-Lymphozyten ebenso wie das Potential für ein synergistisches therapeutisches Wechselspiel mit dsRNA bewirken. Ähnliche Gründe für zusätzliche Verwendbarkeiten können aus den Kombinationen mit anderen Lymphokinen stammen, wie Interferonen und Tumor-Nekrose-Faktoren, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein. Diese Lymphokine können von besonderer Nützlichkeit bei der Behandlung von topischen Krebsformen und bestimmten viralen Infektionen sein. In manchen Fällen können spezifische virale Inhibitoren, wie Azodithymidin oder Gangcyclovir, ebenfalls zugesetzt werden.
Zur Verdeutlichung der Möglichkeiten für entstehende quaternäre Komplexe habe ich pharmazeutische Lotionen bereitet (mit der Bezeichnung A in dem Text), die 5.000 - 20.000 Einheiten IL-2 und 10 mg dsRNA enthielten. Ich habe großzügige Mengen der Lotion auf die Haut von athymischen (haarlosen) Mäusen unmittelbar auf den Bereich aufgebracht, welcher zuvor mit Humanmelanom- (Hautkrebs) -Zellen infiziert worden war. Unbehandelt wachsen derartige subkutan injizierte Turnorzellen so, daß das Tier von der Tumormasse kosmetisch verformt wird. Die Tiere, die jedoch die Lotion mit IL-2/dsRNA/Tensid erhalten hatten, zeigten eine rasche Tumorregression und waren in besserem Zustand als ihre unbehandelten Gegenstücke.
Ich war auch imstande, einen systemischen Effekt dieser Behandlung zu dokumentieren, indem Immunzellen-Subpopulationen in ihren Milzen analysiert wurden, wobei das Verfahren der Strömungszytometrie verwendet wurde, bei welchem spezifische Mengen von immunologisch relevanten Zellen bestimmt werden können. Im Vergleich mit den nicht behandelten Tieren waren die Inkremente folgende: NK (Natürliche Killer) Zellen - 63% dsRNA allein gegenüber 87% durch Kommbination mit Interleukin-2 (der Antikörper-Marker, der in der Vorrichtung der Strömungszytometrie verwendet wurde, war ASGM1); LAK (Lymphokin-aktivierte Killer) Zellen - 228% dsRNA allein gegenüber 412% durch Kombination mit Interleukin-2 (der Antikörper, der bei der Strömungszytometrie verwendet wurde, war Thy 1.2); und T4 Lymphozytenzellen - keine signifikante Änderung durch dsRNA allein gegenüber 263% durch Kombination mit Interleukin-2 (der Antikörper-Marker, der bei der Strömungszytometrie verwendet wurde, war L3T4). Als negativen Vergleich hielt ich fest, daß keine der topisch aufgebrachten Lotionen die Anzahl der T8 Lymphozyten (Suppressor) Zellen bei Messung in der Milz beeinflußte.
Wie hier besprochen, werden die Lymphokine imstande sein, die Interferone, vorzugsweise Interferon alpha, die Interleukine, insbesondere Interleukin-2 (IL-2) und rekombinantes Interleukin-2 (rIL-2) sowie Tumornektose-Faktor (TNF) zu umfassen. Ebenso umfaßt sind Lymphokin-aktivierte Killer (LAK) Zellen, die in Tieren als Reaktion auf die Einwirkung eines Lymphokins gebildet werden. Inhibitoren der reversen Transkriptase, wie das 3'-Azido-3'-deoxythymidin (AZT), können in den Formulierungen zusätzlich oder anstelle eines Lymphokins enthalten sein.
Wenn Interferon (alpha) als das Lymphokin verwendet wird, wird eine Menge von 0,01 bis 100.000 IRU pro Milliliter Körperflüssigkeit des Patienten eingesetzt. Wenn IL-2, vorzugsweise rIL-2, das Lymphokin ist, liegt die verabreichte Menge innerhalb eines Bereichs von etwa 10² IL-2 Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht des Patienten bis zu einem Wert, der unannehmbar hohe Toxizität in diesem Patienten verursacht, was bei einem Wert in der Höhe von 10&sup6; IL-2 Einheiten liegen kann. Die wirksamsten, hinsichtlich der Toxizität vertretbaren Werte sind jedoch in dem Bereich von etwa 10³ bis etwa 104 IL-2 Einheiten pro kg Körpergewicht.
Die üblichen verabreichten Mengen von dsRNA schaffen einen Spiegel von 0,1 bis 1.000 Mikrogramm dsRNA pro Milliliter Körperflüssigkeit des Patienten. Der Ausdruck Körperflüssigkeit ist so gedacht, daß die Lösung von Serum, Salzen, Vitaminen etc. umfaßt ist, die innerhalb des Organismus zirkuliert und die Gewebe umspült. Wenn beide Mittel (dsRNA und ein Lymphokin und/oder Inhibitor der reversen Transkriptase) verabreicht werden, werden sie üblicherweise als Mischung verabreicht, können jedoch auch getrennt und gleichzeitig, oder aber auch aufeinanderfolgend verabreicht werden.
Die Verabreichung einer dsRNA und eines Lymphokins "in Kombination" umfaßt Darbietungen, in welchen beide Mittel gemeinsam als eine therapeutische Mischung verabreicht werden, sowie auch Verfahren, bei welchen die beiden Mittel getrennt, aber gleichzeitig verabreicht werden. Verabreichung "in Kombination" umfaßt weiters die getrennte Verabreichung eines der Arzneimittel, wobei eines der Arzneimittel zuerst und das zweite rasch anschließend verabreicht wird.
Ich habe eine früher nicht beobachtete biochemische Anomalie festgestellt, in welcher ein Schlüsselenzym (RNase L) gemeinsam mit dem körpereigenen Abwehrmechanismus sowohl gegen Krebs als auch gegen Viruserkrankungen in einer beschleunigten und offensichtlich ungesteuerten Weise arbeitet. Diese und andere Beobachtungen sind in der Europ. Patentanmeldung 88306419.8, die den Titel "Doppelstrang RNA Korrektur von abweichenden Stoffwechselpfaden in Kombination mit unkontrollierten Wachstumszyklen von Tumorzellen und Viren" trägt, beschrieben. In getrennten Versuchen habe ich die relativen Fähigkeiten dieser beiden verschiedenen Zellen (Zellen mit abnormaler RNase L) im Widerstand gegen viralen Angriff verglichen.
Ich habe beobachtet, daß die Titer (Ausbeuten) der Folgegenerationen von Retroviren signifikant höher bei jenen Zellen mit der abnormalen RNase L Aktivität waren, die NCP so rasch erzeugten.
Doppelstrangige RNAs, insbesondere unpassende dsRNAs, stellen die Normalität von RNase L Kinetik und Abbauprodukten wieder her, wie in meiner oben angegebenen US-Patentanmeldung vom 17. Juli 1987 berichtet wurde. Außerdem kann die Geschwindigkeit, mit der die Normalität durch doppelstrangige RNA wiederhergestellt werden kann, durch vorhergehende Einwirkung von Lymphokinen beschleunigt werden.
In den unten beschriebenen Versuchen wurden die dsRNAs zuerst aus lyophilisierten (gefriergetrockneten) Pulvern rekonstituiert und dann mit Lösungen verschiedener Tenside, mit Betonung der Verwendung von nichtionischen Tensiden, gemischt. Bei manchen Versuchen habe ich einen inerten Träger verwendet, insbesondere wenn es das Ziel war, den entstehenden Komplex in einem oberflächlichen oder biologischen Hohlraum etc. aufzubringen. Der Komplex aus dsRNA/Tensid wurde über Nacht inkubiert und die Mischung dann bei manchen der in den Tabellen 1 und 2 beschriebenen Versuche mit einer Salzlösung eines Standardmediums verdünnt.
Es ist ersichtlich, daß diese neuen pharmazeutischen Zusammensetzungen topisch in einer großen Vielzahl von Verfahren angewendet werden können. Beispielsweise können die Zusammensetzungen in Form von Mikrokapseln an den befallenen Bereich oder in prophylaktischer Weise an den noch nicht befallenen Bereich herangebracht werden, wie durch Verwendung von Lipiden oder lipidartigen Vesikeln. Sie können auch als Schaum, Spray, Tampon, Vaginal- oder Rektalsuppositorium oder direkt in einem oder auf ein Kondom während dessen Herstellung aufgebracht werden. Die letztgenannte Weise (Einführung in ein Kondom) wäre ohne diese Erfindung nicht möglich, wodurch nun eine verlängerte Stabilität und fortdauernde Bioaktivität der unpassenden dsRNA oder der biologisch aktiven Fragmente derselben bei Raumtemperatur (20ºC - 23ºC) möglich geworden ist und ein verläßliche Produktlagerzeit erhalten wird. Zum Beispiel kann die vorliegende Erfindung in einfacher Weise durch Einbringen des Komplexes aus dsRNA/Tensid unter Verwendung des mechanischen, von Reddy in der US-PS 4415 548 beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden, bei welchem die Herstellung eines mit Gleitmittel versehenen spermiziden männlichen Kontrazepetivs beschrieben ist.
Eine topische pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann eine spermizid wirksame Menge eines Spermizids enthalten. Die Menge wird von der Art der Zusammensetzung und des Spermizids abhängen und kann vom Fachmann leicht festgelegt werden. Das Spermizid kann zum Beispiel im Bereich von 0,1 Gew.-% bis 15 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegen.
Insbesondere kann die vorliegende Erfindung auch einige der unerwünschten Wirkungen bestimmter Spermizide zu vermeiden helfen, wie des gebräuchlichen Nonoxynol-9 (Nonylphenoxypolyethoxyethanol), da es meine Entdeckung gestattet, die wirksame Konzentration von Nonoxynol-9 zumindest bei bestimmten Indikationen herabzusetzen, wie dies detaillierter in der Folge beschrieben wird (vgl. Tabelle 2).
Vaginitis ebenso wie placentale Nekrose und die Möglichkeit der Embryotoxizität wurden bei diesem Spermizid beschrieben (Tryphones et al., Toxicology, Bd. 39 (2), Mai, S. 177, 1986). Ich habe ähnliche Versuche mit anderen Spermiziden durchgeführt, wie u. a. mit Aryl-4-guanidinobenzoaten (NPGB), Inhibitoren von Sperm-Acrosin, einem Enzym mit einer essentiellen Funktion im Fertilisationsprozeß; derartige NPGB Moleküle, die zur Synthese aus FDA-approbierten Phenolen befähigt sind, werden von Kaminski et al. in J. Med. Chem. (Apr) Bd. 29 (4), S. 514, 1986) beschrieben. Andere Spermizide, die mit meiner Erfindung kompatibel sind, umfassen Chlorhexidin-Diacetat (beschrieben von Shannan et al., Fertil. Steril., Bd. 45 (2) Febr. S. 259, 1986); Menfegol (vgl. Lamptey et al., Contracention, Bd. 32(5) Nov. S. 445, 1985); Benzalkoniumchlorid (nicht durch die Vaginalwände absorbiert wie das Nonoxynol-9, wie von Zufferey, J. Gynecol. Obstet. Biol. Reprod (Paris) Bd. 14 (3), S. 359, 1985, beschrieben wurde); sowie das in letzter Zeit beschriebene zweiphasige Nonoxynol-9-System, bei welchem ein Gleitmittelsystem eine Silikonflüssigkeit plus Nonoxynol-9 plus einer spermiziden Creme enthält (vgl. Rodgers-Meame et al., Fertiliz. Steril. Bd. 43 (6), Juni, S. 931, 1985). Im letztgenannten Fall ist es offensichtlich, daß etwa 2,0 mg dsRNA jedem (oder beiden) der Substanzen im Gleitmittelsystem, bestehend aus 0,45 ± 0,1 ml Silikonflüssigkeit mit einem Gehalt an 6,6% ± 0 5% Tensid, oder der spermiziden Cremebasis, bestehend aus 0 45 ± 0,1 ml Polyethylenglykol 400 (etwa 63%) und Polyethylenglykol 3350 (etwa 30%), zugesetzt werden kann. Die obigen Beispiele sind einfach nicht einschränkende Beispiele der Kompatibilität meiner Erfindung als Zusatz zu verschiedenen kontrazeptiven Möglichkeiten.
Es ist wichtig festzuhalten, daß die beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen I sowohl antimikrobielle als auch antivirale Wirkung entfalten (vgl. zum Beispiel Tabelle 2). Obwohl dies auch erkennbar ist in Asculai und Rapp, US-PS 4 507 281 (worin sie Interferon mit Nonoxynol-9 kombinieren), sind die gegenständlichen Fakten die, daß Interferone, allein oder in Mischung mit derartigen Tensiden, relativ inert gegen Viren, insbesondere die humanen Immundefizienz-Viren, sind. Es besteht kein Hinweis auf ein neues makromolekulares Aggregat, wie ich es beschreibe, mit einer dramatischen Verschiebung in beiden biologischen Eigenschaften und einer gleichzeitigen Verschiebung in bestimmten biophysiologischen Eigenschaften. Obwohl ich eine Steigerung im scheinbaren Molekulargewicht des ternären Komplexes durch Verwendung einer Laserlicht-Streuung mit niedrigem Winkel beobachtet habe (und durch Verwendung der untersuchten Gleichung auf S&sub2;&sub0;W korrigiert habe), konnte ich keine Veränderung im scheinbaren Molekulargewicht bei der analytischen Ultrazentrifugierung feststellen, was möglicherweise auf den "Hemm"-Effekt der neuen Hydratationshüllen des ternären Komplexes zurückzuführen ist, der das offensichtliche Ansteigen der Molekularmasse wettmacht.
Die Tabellen 1 und 2 zeigen die typischen Ergebnisse meiner Erfindung. Die Ergebnisse sind außerordentlich dramatisch, sowohl hinsichtlich der neuen biophysikalischen Eigenschaften (gesteigerte thermische Stabilität der ternären Komplexe) als auch hinsichtlich der neuen biologischen Eigenschaften (erweiterter antiviraler und antimikrobieller Bereich). TABELLE I Stabilisierung der biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften von dsRNA im Komplex mit oberflächenaktiven Substanzen Formulierung/Konzentration Zeit (in 25% Humanseren) Mol.Gew. Spez. Aktivität Mismatched nicht feststellbar Mismatched dsRNA (2,5 mg/ml) plus Nonylphenoxypolyethoxyethanol (Nonoxynol-9 mit 1% in physiol. Puffer) 3. Mismatched dsRNA (2,5 mg/ml) plus Polyoxyethylenoleylether (1%) nicht feststellbar
Legende: ¹ Gepoolte humane Seren von normalen Freiwilligen wurden als Quelle für endo- und exonuecleolytisches Enzym verwendet;
² Mol.Gew.-Bestimmung wie oben beschrieben (Carter et al., J. Mol. Biol., Bd. 70, S. 567, 1972);
³ Oligo 2'-5' A Synthetase-Induktion gemessen in diploiden humanen Fibroblastzellen- Extrakten unter Vewendung von Poly I.C als Vergleich (100%) wie oben beschrieben (Carter et al., J. Biol. Resp.Mod., 4, S .613, 1985). TABELLE 2 Formulierung von Komplexen von dsRNA/oberflächenaktiven Substanzen erweitert das theraneutische Spektrum gegen Pathogene, inklusive Viren Formulierung Konzentration HIV Titer¹ HSV-2 Titer² Chlamydia³ (Anzahl der Elementarkörper) Mikrogramm Nonoxynol-9 Prozent dsRNA/Nonoxynol-9 30 Mikrogramm/5%
Legende: ¹ Es wurde ein ID&sub5;&sub0; Assay nach der Beschreibung von Hicks (Lit. oben genannt) verwendet. Kurz gesagt wurde ein Mikrokultursystem zur Titration von HIV Infektionen im Anschluß an die Einwirkung auf periphere Blutzellen von normalen Personen in Anwesenheit oder Abwesenheit der oben genannten Formulierungen verwendet; die Kulturen wurden nach 21 Tagen beendet und die überstehenden Flüssigkeiten geerntet und unter Verwendung von Standardmethoden auf HIV reverse Transkriptase untersucht.
² HS-2 wurde in konfluenten HEL Zellen unter Verwendung der Plaque-Bildung nach einer Methylzellulose-Überschichtung gemessen (Rapp et al., Antimicrob. Agents and Chemo., Bd. 28, S 449, 1985).
³ Es wurde ein Elementarkörper-Assay verwendet, bei dem eine Quantifizierung in McCoy Zell-Monoschichten in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen erfolgte; es wurden standardisierte Inokula mit einem Gehalt an einer bekannten Anzahl von inklusionsbildenden Einheiten zu jeder Vertiefung zugesetzt und 60 min mit den verschiedenen Formulierungen inkubiert (Kappres et al, Sexually Transmitted Diseases, Band 13, S. 134, 1986).
Die folgenden sind typische Beispiele von geeigneten Formulierungen, die ein nichtionisches Tensid 1,2,3 und dsRNA enthalten:

Pharmazeutische Creme A

gereinigtes Wasser 41,00 Gramm
kristallines Wachs 3,00 Gramm
Lanolin 10,00 Gramm
Petrolatum 41,00 Gramm
Sorbit-Monooleat 4,75
Polysorbat 80 0,25 Gramm
dsRNA 10-180 mg

Pharmazeutische Lotion

gereinigtes Wasser 7,00 ml
Ölsäure 1,50 Gramm
Polyethylenglykol-Monostearat 10,50 Gramm
Carbopol-934 42,25 Gramm
Propylenglykol 24,75 ml
Triethanolamin 1,00 ml
Silikonflüssigkeiten 10,00 ml
dsRNA 10-180 mg

Pharmazeutische Creme B

Spermaceti 7,5%
Wachs 12,0%
Mineralöl 56,0%
Natriumborat 0,5%
Sorbit-Monooleat 5,0%
Wasser 19,0%
dsRNA 1-200 mg
Die verwendeten Arten von Tensiden sind die folgenden:
¹ Typische Ester- oder Ether-Ester-Bindungen, wie Sorbitane (Mono- oder Tristearate), Sorbit- Monooleate, -sesquioleate, -trioleate, Polyoxyethylen, Sorbit-Monolaurat, Sorbit-Monoplamitat.
² Typische Ether-Amid-Bindungen, wie Fettsäure-Alkanolamide, inklusive Onyx-ol, Unamid, Monoamin und Laurinsäure-Diethanolamid, wie Polysorbat 20, Polysorbat 80, Onyx-ol, p-Diisobutylphenoxypolyethoxy-ethanol, Nonylphenoxypolyethoxy-ethano 1, Polyoxyethylen-oleylether, etc.
³ Ether-Bindungen, wie sie im Text beschrieben sind und umfassen: Polyoxyethylen-Alkylphenole, Polyoxyethylen-Alkohole, Polyoxyethylen-Ester von Fettsäuren, Polyoxyethylen-Merkaptane und Polyoxyethylen-Alkylamine, etc.
Ich habe auch mehrere komplexe Zusammensetzungen bewertet, inklusive solcher, die Lymphokine oder dsRNA-verwandte Mediatorsubstanzen enthalten, um deren Kompatibilität mit der vorliegenden Erfindung zu bestimmen. Insbesondere führte ich in topische Zubereitungen, in diesem Fall in Lotionen, Interferone und/oder bestimmte 2'-5' A Kern-Moleküle, inklusive der drei 2,5-Phosphorothioat-Trimeren Kerne mit RpRp, SpRp und RpSp, ein, intemucleotide Bindungen, von denen ich vor kurzem gezeigt habe, daß sie eine Aktivierung von RNase L gemeinsam mit intrazellulären Feindabwehr-Wegen verursachen. Derartige Produkte mit geeigneten Vektoren, wie einlamellare Liposome, monoklonale Antikörper, rekonstituierte virale Hüllen etc., könnten intrazellulär angeliefert werden, um eine zusätzliche Schicht von antiviralen, immunologischen und Antikrebs-Eigenschaften zu bilden,

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Zustands, der zugänglich oder empfindlich ist für die Behandlung mit unpassender (mismatched) dsRNA, welche Zusammensetzung in einem pharmazeutisch verwendbaren topischen Träger eine wirksame Menge einer unpassenden dsRNA in einem ternären Komplex von zwei unpassenden RNA-Strängen, die mit einem oberflächenaktiven Mittel komplexiert sind, enthält.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, in welcher der ternäre Komplex eine Mizelle ist, in welcher die unpassende dsRNA von dem oberflächenaktiven Mittel umgeben ist.

3. Spermizide und antiviral aktive topische pharmazeutische Zusammensetzung, die 0,01 Gew.-% bis 10 Gew.-% einer unpassenden dsRNA, berechnet auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, in einem ternären Komplex von zwei unpassenden RNA-Strängen, die mit einer spermizid wirksamen Menge eines Spermizids, das ein oberflächenaktives Mittel ist, komplexiert sind, enthält.

4. Spermizide und antiviral aktive topische pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, die außerdem ein den menschlichen Urogenitaltrakt nicht irritierendes Gleitmittel enthält.

5. Kondom, das mit der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4 beschichtet ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in welcher die Menge der dsRNA etwa 0,001 Gew.-% bis 10 Gew.-% der Gesamtzusammensetzung und die Menge des oberflächenaktiven Mittels von 0,005 Gew.-% bis 20 Gew.-% der genannten Gesamtzusammensetzung beträgt.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in welcher die unpassende dsRNA ein Komplex von Polyinosinat und Polycytidylat mit einem Gehalt von 1 in 5 bis 1 in 30 Uracil- oder Guanidinbasen ist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in welcher die dsRNA Bindungsbruchbereiche enthält und die dsRNA die Eigenschaft des günstigen therapeutischen Verhältnisses von rInr(C&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub4;,U)n hat.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in welcher die dsRNA rIn.r(C&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub4;,U)n ist.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Behandlung von Virus-befallenem Haut-, Augen- oder Schleimhautgewehe.