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DE3117212A1 - Verfahren zur herstellung des enzyms fructosyltransferase - Google Patents

Verfahren zur herstellung des enzyms fructosyltransferase

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Publication number
DE3117212A1
DE3117212A1 DE19813117212 DE3117212A DE3117212A1 DE 3117212 A1 DE3117212 A1 DE 3117212A1 DE 19813117212 DE19813117212 DE 19813117212 DE 3117212 A DE3117212 A DE 3117212A DE 3117212 A1 DE3117212 A1 DE 3117212A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
enzyme
culture medium
vol
yeast extract
sucrose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19813117212
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English (en)
Inventor
Susan J. 60525 LaGrange Park Ill. Luenser
Jay Allen 60515 Downers Grove Ill. Smith
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Unilever Bestfoods North America
Original Assignee
Unilever Bestfoods North America
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Filing date
Publication date
Application filed by Unilever Bestfoods North America filed Critical Unilever Bestfoods North America
Publication of DE3117212A1 publication Critical patent/DE3117212A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi

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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

PATENTANWÄLTE 311721?
DR. A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDERER R. F. MEYER-ROXL
DlPL-ING. (1934-1974) DIPL.-CHEM. DIPL.-ING
8000 MÜNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STRASSE
TELEFON: (089)472947 TELEX: 524624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT
31. März 19 81 3245
CPC International Inc. International Plaza, Englewood Cliffs, N.J. 07632, USA
Verfahren zur Herstellung des Enzyms Fructosyl-
transferase
Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Herstellung des Enzyms Fructosyltransferase durch die schwärze Hefe Aureobasidium pullulans.
Da Fructose süßer ist als Glucose oder Saccharose, sind erhebliche Anstrengungen gemacht worden, Verfahren zur Herstellung von Sirupen zu entwickeln, in denen mehr als 50 % . des Kohlenhydrats Fructose ist. In jüngerer Zeit ist ein neuer Weg zur Erzielung von Fructosesirup mit mehr als 50 % Fructosegehalt in der GB-PS 2 000 144 offenbart worden. Nach diesem Verfahren wird ein Saccharosesubstrat der Einwirkung einer Fructosyltransferase ausgesetzt, um die Saccharose in einen Zwischenprodukt-Sirup mit überwiegend Fructose-Polymeren und Glucose umzuwandeln. Dieser Sirup, in dem die Fructose in polymerer Form vorliegt, kann weiterbehandelt werden, um Fructose-Sirupe zu bilden, in denen mehr als 50 % des Kohlenhydrats Fructose ist. Eine wirtschaftli-
ehe Quelle für das Enzym Fructosyltransferase ist für die erfolgreiche Durchführung dieses Verfahrens wesentlich.
Die GB-PS 2 000 144 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung einer Fructosyltransferase aus der Fermentationsbrühe von Aureobasidium pullulans. Doch führt die nach dem Verfahren dieser Offenbarung durchgeführte Fermentation zu einer schwarzen, viskosen Brühe, die große Mengen des Polysaccharids Pullulan enthält. Umfangreiche Aufarbeitung ist nötig, um die Farbe und das Pullulan zu entfernen, bevor das Enzym Fructosyltransferase isoliert werden kann. Ferner ist die Menge des aus der Fermentationsbrühe erhaltenen Enzyms vergleichsweise gering. Es besteht somit Bedarf an einem verbesserten Verfahren zur Herstellung"eines Fructosyltransf erase-Enzympräparats .
Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung des Enzyms Fructosyltransferase. Bei diesem Verfahren wird ein Kulturmedium mit Zellen aus einem Stamm von Aureobasidium pullulans beimpft. Das Kulturmedium enthält etwa 16 bis etwa 24 Gew.-/Vol.-% Saccharose, etwa 1 bis etwa 2,4 Gew.-/Vol.-% Hefeextrakt oder dessen .Nährwertäquivalent und etwa 1 Gew.-/Vol.-% eines anorganischen Nitrats. Das Gemisch wird bei einem pH-Wert zwischen 6 und 8 bei einer Temperatur von 28 bis 32 C kultiviert,bis eine Fructosyltransf er ase-Enzymausbeute erzielt wird. Das Enzympräparat •wird dann aus dem Kulturmedium gewonnen.
Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung gelten folgende Definitionen für verschiedene hier verwendete Begriffe:
1. Enzympräparat
Der Begriff "Enzympräparat" wird hier zur Bezeichnung jeder Materialzusammensetzung verwendet, die die gewünschte Enzym aktivität zeigt. Der Begriff wird z.B. zur Bezeichnung von Zellextrakten, raffinierten und konzentrierten Präparaten aus diesen Zellen und aus KuItürflüssigkeiten verwendet. Das Enzympräparat kann auch ein Mittel umfassen, in dem das Enzym an einen inerten Träger gebunden oder adsorbiert ist.
2. Fructosyltransferase
Der hier verwendete Begriff bezieht sich auf jedes Enzym, das die übertragung einer Fructosylgruppe von einem Donor, z.B. Saccharose, auf einen Akzeptor katalysiert. Er umfaßt das aus Aureobasidium pullulans, ATCC 9348 (synonym mit Pullularia pullulans) stammende Enzympräparat.
3. Fructosyltransferaseeinheit
Eine Fructosyltransferaseeinheit ist definiert als die Menge Enzymaktivität, die zur Erzeugung eines .uMols eines reduzierenden Zuckers, berechnet als Glucose, pro min unter folgenden Bedingungen erforderlich ist: a) pH 5,5, . b) Temperatur 55°C und c) Substratkonzentration bei 60 g Saccharose von Nahrungsmittelqualität pro 100 ml eines wässrigen Reaktionsgemischs.
Reduzierender Zucker (berechnet als Glucose) wird mit einem "Technicon Autoanalyzer II" (Technicon, Inc., Tarrytown, New York) bestimmt. Die Analyse erfolgt nach einer herkömmlichen alkalischen Ferri-cyanidmethode, Analytical Biochemistry 45, Nr. 2, Seiten 517-524 (1972), angepaßt an die Anwendung im "Autoanalyzer II". Sofern nicht anders angegeben, erfolgen die Bestimmungen der Enzymaktivität
durch kontinuierliches Überwachen eines Reaktionsgemischs folgender Zusammensetzung:
7,5 ml einer 80 gew.-/vol.-%igen wässrigen Lösung von Saccharose von Nahrungsmittelqualität
2,3 ml 0,1 m Citratpuffer, pH -5,5
0,2 ml Enzymprobe mit der Menge Fructosyltransferase, die 5 bis 25 ,ug reduzierenden Zucker (berechnet als Glucose) pro min pro ml Reaktionsgemisch bildet.
Jeder Stamm von Aureobasidium pullulans, der eine Fructosyltransf erase zu produzieren vermag, kann im. erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Geeignete Stämme dieser Hefe sind z.B. NRRL 3937, ATCC 12535, NRRL 1673, NRRL Y 2311, NRRL YB 3892, ATCC 15223 und NRRL YB 3861. Ein besonders geeigneter Stamm ist ATCC 9348.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden herkömmliche Fermentationseinrichtungen und -arbeitsweisen angewandt. Im allgemeinen wird die Hefekultur auf Agar-Schrägkulturen gehalten oder aufbewahrt, wobei periodisch überführt wird, um die Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten. Bei der Inokulum-Entwicklung wird die Kultur von der Schrägkultur auf ein flüssiges Kulturmedium überführt, um eine aktive Kultur in ausreichendem Volumen zum Beimpfen des fertigen Produktionsmediums zu ■ liefern. Die Inokulum-Entwicklungsstufe kann in einer einzigen übertragung auf ein flüssiges Medium bestehen oder mehrere aufeinanderfolgende Übertragungen, je nach Bedarf, umfassen; um die Kultur zu aktivieren oder ein ausreichendes Volumen zum Beimpfen eines fertigen Produktionsmediums zu bilden. Im fertigen Produktionsmedium wird das gewünschte Enzym zur Verwendung erzeugt, entweder direkt oder nach weiterer Aufarbeitung oder Reinigung.
η. 311721
ϊ -
Die nach diesem Verfahren erzielten verbesserten Fructosyltransferase-Ausbeuten beruhen einesteils auf der Verwendung einer konzentrierteren Saccharoselösung als Kohlenhydratquelle für das Wachstum des Mikroorganismus. Erhöhte Ausbeuten an Fructosyltransferase werden durch die Verwendung von Kulturmedium erzielt, das etwa 16 bis etwa 24 Gew.-/Vol.-% Saccharose enthält. Ein bevorzugter Bereich der Saccharosekonzentration ist etwa 20 bis etwa 24 Gew.-/Vol.-%. Höhere Konzentrationen an Saccharose ergeben keine wesentlich erhöhten Ausbeuten des Enzyms.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren verbesserten Ausbeuten an Fructosyltransferase beruhen auch zum Teil auf der Verwendung erhöhter Konzentrationen an Hefeextrakt in dem Medium. Geeignete Hefeextrakt-Konzentrationen sind etwa 1 bis etwa 2 Gew.-/Vol.-%. Eine bevorzugte Konzentration an Hefeextrakt ist etwa 2,0 Gew.-/Vol.-%. Ein geeigneter Hefeextrakt ist der von den Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan, erhältliche. Andere Präparate, die das Nährstoff-Äquivalent von Hefeextrakt sind, können an dessen Stelle treten. Beispielsweise Amber BYF 5OX, eine reine, autolysierte Brauereihefefraktion, erhältlich von den Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin, kann in einer Konzentration von etwa 5 bis etwa 10 Gew.-/Vol.-% anstelle des Hefeextrakts verwendet werden.
.Für die erfolgreichste Herstellung von Fructosyltransferase nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird auch ein wasserlösliches anorganisches Nitrat dem Kulturmedium zugesetzt, in dem die Zellen von Aureobasidium pullulans gezüchtet werden. Jedes der gewöhnlichen Nitrate, wie Natriumnitrat, ist geeignet. Eine bevorzugte Konzentration des Salzes ist etwa 1 Gew.-/Vol.-%.
Der pH-Wert des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Kulturmediums wird auf einen Wert zwischen 6 und 7 eingestellt und das Medium wird durch 0,5- bis 2-stündiges Erhitzen auf 120°C vor dem Beimpfen mit der Zellkultur sterilisiert. Der pH-Wert des Kulturmediums wird zwischen 6/0 und 8/0 während der Fermentation durch Zugabe von verdünnter Säure oder Base je nach Notwendigkeit, erhalten. Ein bevorzugter Bereich für die Fermentation ist etwa 6,5 bis etwa 7/5. Wenn das erfindungsgemäße Fermentationsmedium verwendet wurde, neigte der pH-Wert des Mediums eher zum Ansteigen oder Konstantbleiben als zum Senken, wie es der Fall war bei den Fermentationen nach den bekannten Verfahren.
Ein weiteres unerwartetes Ergebnis der Verwendung des erfindungsgemäßen Fermentationsmediums war die Feststellung, daß das bei den früheren Fermentationen gebildete schwarze Pigment nicht erhalten wurde. Dadurch wurden die Unbequemlichkeit und Kosten einer getrennten Fällungsstufe zum Entfernen dieses Pigments, bevor das Enzym isoliert werden konnte, vermieden.
Ein weiterer unerwarteter Vorteil ergibt sich aus dem erfindungsgemäßen Verfahren. Es wurde festgestellt, daß nahezu kein viskoses Polysaccharid, Pullulan,gebildet wurde. Beim herkömmlichen Verfahren war eine kostspielige und zeitraubende Stufe erforderlich, um dieses hochmolekulare Produkt zu entfernen, bevor das Enzym abgetrennt werden konnte. Da dieses Produkt nicht mehr entfernt und das schwarze Pigment nicht mehr gefällt werden muß, ist die Isolierung des Enzyms stark vereinfacht.
Das erfindungsgemäße Fermentationsverfahren wird bequem bei einer Temperatur von etwa 28 bis etwa 32°C durchgeführt. Ein bevorzugter Temperaturbereich ist etwa 30 bis etwa 31°C. ·
Wenngleich die Fermentation unter 28 C und über 32 C durchgeführt werden kann, ist die Ausbeute an Fructosyltransferase, die gebildet wird, wenn die Fermentation in diesen Temperaturbereichen durchgeführt wird, wesentlich geringer als bei der Fermentation bei Temperaturen zwischen 28 und 32°C.
Eine zufriedenstellende Ausbeute an Fructosyltransferase liegt gewöhnlich nach einer Fermentation über etwa 100 h vor. Die Optimalzeit für die Fermentation schwankt jedoch etwas in Abhängigkeit von der genauen angewandten Temperatur sowie von der Konzentration der eingesetzten Nährstoffe.
Bei diesem neuen Verfahren liegen über 80 % der Fructosyltransferase in der Brühe vor. Dies steht im Gegensatz zur herkömmlichen Fermentation, bei der nahezu die Hälfte des Enzyms an Zellen gebunden war. Da die überwiegende Masse des Enzyms nun in der Brühe vorliegt, ist eine einfache Enzymgewinnung möglich.
Ein für zahlreiche Anwendungen geeignetes Fructosyltransferase-Enzympräparat kann durch einfaches Entfernen der Hefezellen aus dem Fermentationsgemisch erhalten werden. Diese Trennung kann nach jeder herkömmlichen Weise erfolgen, wie durch Zentrifugieren oder Filtrieren. Die Enzymlösung kann, wenn gewünscht, durch Eindampfen bei Temperaturen unter denen, die Inaktivierung des Enzyms verursachen, konzentriert werden. Dies erfolgt bequemerweise an einem Rotationsvakuumverdampfer bei Temperaturen unter 50 C.
Wenn ein festes Enzympräparat erwünscht ist, kann das Enzym an Diatomeenerde adsorbiert werden. Dies erfolgt einfach durch Zugeben der Diatomeenerde zur zellfreien Fermentationsbrühe. Zugabe eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels, wie von 2-Propanol oder Aceton, läßt das Enzym ausfallen und an die Diatomeenerde adsorbiert werden. Dieser Verbund von
Diatomeenerde und Fructosy!transferase wird dann durch Filtrieren oder Zentrifugieren isoliert.
Die erfindungsgemäße Arbeitsweise wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, in denen alle Teile auf das Gewicht bezogen sind und alle Prozentsätze Gew.-/VoI.-Angaben sind, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben.
Beispiel 1
Das für die Inokulum-Entwicklung verwendete Medium ist folgendes:
0,5 % zweibasiges Kaliumphosphat 0,1 % Natriumchlorid
0,02 % Magnesiumsulfat-Heptahydrat 0,06 % Ammoniumnitrat
0,3 % Hefeextrakt (Difco Laboratories) 6 % Saccharose
pH des Mediums eingestellt auf 6,8
Die Keimkolben, 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml sterilem Medium, werden von einer Schrägkultur der schwarzen Hefe Aureobasidium pullulans beimpft. Der speziell verwendete Hefestamm wurde im Katalog der American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) als ATCC 9348 bezeichnet. Die Keimkolben wurden nach der Entwicklung auf einem Wechselschüttler für 48 h bei 30 C zum Beimpfen von Keimkolben zweiter Stufe verwendet. 5 ml des Inokulums aus dem ersten Keimkolben wurden zu 100 ml frischem sterilem Medium in einen zweiten 500 ml-Erlenmeyer-Keimkolben gegeben. Die zweiten Keimkolben wurden auf einem Wechselschüttler 24 h bei 30°C entwickelt, bevor der gesamte Inhalt eines Kolbens zum Beimpfen von 4 1 sterilen Mediums in einem 7,5 1-Fermentator verwendet wurde. Die für die verschiedenen Ansätze verwendeten Medien sind in der folgenden Tabelle angegeben:
311721?
Tabelle I
Fermentationsmedien Zusammensetzung, Gew.-/Vol.-%
Ansatz
Bestandteil 1 2 3 4 5
K2HPO4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
MgSO4·7H2O 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
NaNO3 1/0 1/0 1/0 1,0 1,0
Hefeextrakt
(Difco Labs.)		 2,0 2,4 2,4 2,0 —
Amber BYF 50X
(Amber Labs.)		 — — — — 8,0
Saccharose 20 24 20 20 20
Antischaum
mittel a)		 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025
a) Das Antischaummittel war Polypropylenglykol, MG 2.000
Bei jedem Ansatz wurde der pH-Wert vor dem Beimpfen aus dem Keimkolben auf 6,5 eingestellt. Die Ansätze 1, 2 und 3 erfolgten bei 30 - 31°C. Die Ansätze 4 und 5 erfolgten bei 33 bis 34°C. Die Fermentationen erfolgten mit einer Rührgeschwindigkeit von 580 ü/min und mit 4 1 Luft pro min durch das Gemisch hindurch. Beim Ansatz 4 mußten nach 27 h 75 ml 2 η HCl zugesetzt werden, um den pH-Wert von 7,5 auf 6,5 zu senken. Nach 50 h wurden weitere 3O ml 2 η HCl dem Ansatz 4 zugesetzt, um den pH-Wert von 7,5 auf 6,5 zu senken. In periodischen Abständen wurden dem Fermentator Proben entnommen, die Brühe wurde von den Zellen abzentrifugiert und auf Fructosyltransferase-Enzymaktivität analysiert. Die Ergebnisse dieser Analysen zeigt Tabelle II.
Tabelle II Fructosyltransferase-Enzymbildung
Einheiten/ml in der Brühe
Zeit (h) 1 2 Ansatz 4 5
77 58 3 59 39
27 145 126 56 79 88
42 178 171 123 81 106
50 238 234 158 104 144
66 290 355 221 144a) 159a)
90 440 438 302 — _
114 380
a) Die Fermentation wurde nach 90 h gestoppt, als das Medium sehr schwarz wurde.
Die Ergebnisse zeigen, daß bei über 33 C durchgeführte Fermentationen (Ansätze 4 und 5) viel weniger befriedigend für die Erzeugung von Fructosyltransferase sind als die Ansätze bei 30 bis 31 C. Diese Ergebnisse zeigen ferner, daß weder steigende Saccharosekonzentration im Medium über 20 % (Ansatz 2) noch steigende Hefeextrakt-Konzentration im Medium über 2 % (Ansätze 2 und 3) die Produktion von Fructosyltransferase bei der Fermentation steigern. Ein Vergleich der Ansätze 4 und 5 zeigt, daß bei der Fermentation ein anderer Nährstoff an die Stelle von Hefeextrakt treten kann.
Vergleichstest 1
(Stand der Technik)
Die Impf stoff entwicklung erfolgte wie in Beispiel 1. Der gesamte Inhalt eines Keimkolbens zweiter Stufe wurde zum Beimpfen von 4 1 sterilen Mediums in einem 7,5 1-Fermentator verwendet.
311721? - 1/f -
Das verwendete Meditun hatte folgende Zusammensetzung:
0,5 % zweibasiges Kaliumphosphat
0,1 % Natriumchlorid
0,02 % Magnesiumsulfat-Heptahydrat
0,06 % Ammoniumnitrat
0,3 % Hefeextrakt (Difco Laboratories)
12 % Saccharose
0,025% Propylenglykol, MG 2000
Der pH-Wert des Mediums wurde vor dem Beimpfen aus den Keimkolben auf 6,8 eingestellt. Die Fermentation erfolgte bei 30 C mit einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min und mit 4 1 Luft pro min durch das Gemisch hindurch. Der pH-Wert des Gemischs fiel nach 32,5 h auf 4,2 und blieb während der übrigen Reaktion bei 4,2 + 0,1. In periodischen Abständen wurden dem Fermentator Proben entnommen, die Brühe wurde von den Zellen abzentrifugiert und auf Fructosyltransferase-Enzymaktivität analysiert. Die Ergebnisse dieser Analysen sind wie folgt:
Fructosyltransferase-Enzymproduktion Einheiten/ml in der Brühe
19,5 26,2 31,7 40,6 47,6 49,7 53,4
Das Reaktionsgemisch war sehr schwarz. Dieser Vergleichstest veranschaulicht die vergleichsweise niedrigen Enzymausbeuten und die stark pigmentierten Reaktionsgemische, die nach dem herkömmlichen Verfahren erhalten wurden.
Zeit (h)
19
25 /5
43
67
72
90
150

Claims (9)

31. März 1981 3245 31172 Patentansprüche
1. Verfahren zur Erzeugung eines Fructosyltransferase-Enzympräparats, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kulturmedium mit Zellen eines Stammes von Aureobasidium pullulans beimpft wird, das etwa 16 bis etwa 24 Gew.-/Vol.-% Saccharose, etwa 1 bis etwa 2,4 Gew.-/Vol.-% Hefeextrakt und etwa 1 Gew.-/Vol.-% eines anorganischen Nitrats enthält, und daß das Gemisch bei einem pH-Wert zwischen 6 und '
8 bei 28 bis 32°C bis zur Erzielung einer Fructosyltransferase-Enzymausbeute kultiviert wird, wobei das Enzympräparat aus dem Kulturmedium ohne die Notwendigkeit des Entfernens schwarzen Pigments oder viskosen Polysaccharids in hohen Ausbeuten gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einer Saccharose-Konzentration von 20 bis 24 Gew.-/-VoI.-% durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es mit etwa 2 Gew.-/Vol.-% Hefeextrakt durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Kulturmediums zwischen 6 ,5 und 7,5 gehalten wird.
«. w t» -C O ι*
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium bei einer Temperatur zwischen 30 und 310C gehalten wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einer Konzentration der Saccharose im Kulturmedium von etwa 20 Gew.-/Vol.-%, bei einer Konzentration von Hefeextrakt von etwa 2 Gew.-/Vol.-%, bei einem pH-Wert des Gemischs, der zwischen 6,5 und 7,5 gehalten wird, und bei einer Temperatur des Kulturmediums von 30 bis 310C durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle des Hefeextraktes etwa 5 bis etwa 10 Gew.-/Vol.-% Amber BYF 5OX verwendet werden.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium durch Zentrifugieren von Zellen befreit wird, bevor ein Teil der Flüssigkeit zu einem konzentrierten Fructosyltransferase-Enzympräparat eingedampft wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium zum Entfernen von Hefezellen zentrifugiert, der zellfreien Flüssigkeit
; Diatomeenerde zugesetzt, das Enzym auf der Diatomeenerde durch Zugabe eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels ausgefällt und der enzymhaltige Feststoff abgetrennt, wird.
DE19813117212 1980-05-19 1981-04-30 Verfahren zur herstellung des enzyms fructosyltransferase Withdrawn DE3117212A1 (de)

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