DE2108760B2 - Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von jodinin - Google Patents

Description

In den letzten Jahren ist gefunden worden, daß Jodinin (l,6-Phenazindiol-5,10-dioxyd) eine von etwa 20 Phenazinverbindungen ist, von denen bekannt ist, daß sie durch Mikroorganismen erhalten werden. Die jüngsten Entwicklungen auf dem Gebiet der Antibiotika haben Jodinin besonders interessant gemacht, da es in das neue und pharmazeutisch wertvolle Antibiotikum Myxin umgewandelt werden kann. Myxin wird auch durch Fermentation einer besonderen Species von Sorangium hergestellt Dieses zuletzt erwähnte Fermentationsverfahren leidet jedoch unter dem Nachteil, daß das gewünschte Endprodukt in schlechten Ausbeuten erhalten wird. Es liegt daher auf der Hand, daß ein Verfahren zur Herstellung von Jodinin, das zu guten Ausbeuten unter Ausnutzung von bereits erhältlichen Ausgangsmaterialien führt, eine wesentliche Bereicherung der Technik darstellen wird.

Die Entwicklung von synthetischen Wegen zu Myxin unter Verwendung von Jodinin als Ausgangsmaterial stellt eine wesentliche Stufe dar, um das wertvolle Antibiotikum Myxin in Ausbeuten zu erhalten, die wirtschaftlich vertretbar sind. Das Nichtvorliegen von großen Jodininmengen steht jedoch einer wirtschaftlichen Entwicklung des zuletzt erwähnten Syntheseweges im Wege. Es besteht daher ein Bedürfnis an einem leistungsfähigen Verfahren zur Herstellung des Ausgangsproduktes Jodinin in genügender Reinheit und in Ausbeuten, die groß genug sind, um den Anforderungen, die an ein wirtschaftliches Herstellungsverfahren für Myxin gestellt werden, zu genügen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Jodinin, das zu einem genügend reinen Produkt und zu Ausbeuten führt, die ausreichen, um den Anforderungen, die an eine wirtschaftliche Herstellung von Myxin zu stellen sind, zu genügen.

In der Vergangenheit sind zwei grundsätzliche Wege zur Herstellung von Jodinin beschritten worden. In jedem Fall aber hat sich gezeigt, daß — zusammen mit den damit verbundenen technischen Schwierigkeiten — das Verfahren insofern unzureichend ist, als die Ausbeuten — obwohl sie für experimentelle Zwecke ausreichen — für wirtschaftliche Zwecke viel zu niedrig sind. Der erste Weg besteht in einer chemischen Synthese, bei der Jodinin durch Oxydation von 1,6-Dihydroxyphenazin erhalten wird. Die Leistungsfähigkeit dieser Synthese wird jedoch durch die Schwierigkeiien beeinträchtigt, die mit dem Schützen der Hydroxylgruppen verbunden sind und mit der schlechten Löslichkeit der Reaktionspartner. Beim zweiten Weg sind verschiedene Fermentationsverfahren in dem Bemühen angewandt worden, ein leistungsfähiges Verfahren zur Jodininherstellung zu entwickeln. Diese Verfahren haben verschiedene Mikroorganismen benutzt, von denen gefunden wurde, daß sie Jodinin erzeugen, nämlich Brevibacterium iodinum, Microbispora aerata und Streptomyces thioluteus. Für deren Wachstum wurden verschiedene Wachstumsmedien und Fermentationsbedingungen angewandL In den meisten Fällen enthielt das Nährmedium etwa 1 % Difco Bacto Hefe und etwa 1% Glukose.

In jedem Fall war das Fermentationsverfahren zeitraubend (es dauert etwa 2 Wochen), das Wachstumsmedium war außerdem sehr teuer für eine Verwendung im großen Maßstab und die Ausbeuten waren für wirtschaftliche Zwecke viei zu niedrig (d. h. geringer als 0,2 g/Liter).

Wegen der bekannten Bedeutung von Myxin und dessen Verwendungsmöglichkeiten im großen Maßstab, ist die Entwicklung eines Herstellungsverfahrens für Jodinin, das zu wirtschaftlichen Ausbeuten führt, von großer Wichtigkeit auf dem Gebiet der Antibiotika.

Es wurde nun gefunden, daß durch Ausnutzung von hochentwickelten Mikrobenstämmen des Organismus Brevibacterium iodinum und durch Züchtung dieser hochentwickelten Stämme in einem bestimmten Kulturmedium die Ausbeuten von Jodinin so gesteigert werden können, daß sie für wirtschaftliche Zwecke ausreichend sind.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Jodinin (l,6-Phenazindiol-5,10-dioxyd). Das gewünschte Endprodukt Jodinin hat die Formel:

HO O

Diese Verbindung ist besonders interessant und wichtig wegen ihrer Strukturähnlichkeit mit dem bekannten pharmazeutisch wertvollen Antibiotikum Myxin und wegen der Entwicklung eines wirtschaftlich vertretbaren Syntheseweges von Jodinin zum Myxin.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung solche Stämme dieses Mikroorganismus selektiert werden, die eine tiefpurpurne Farbe beim Koloniewachstum zeigen und daß diese unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Nährmedium kultiviert werden, das etwa 0,2 — 5,0 Gew.-% eines hydrolysierten Saatmehls und/oder hydrolysierten Bohnenmehls und/oder hydrolysierten Milchproduktes und/oder hydrolysierten Fleischproteins und/oder hydrolysierten Fischproteins, etwa 1,0 bis 10,0 Gew.-% Kohlenhydrate und etwa 0,5 — 10,0 g/Liter eines oberflächenaktiven Mittels enthält.

Ein erfindungsgemäßes Merkmal bezieht sich daher auf eine einfache und leistungsfähige Methode zur Herstellung von wesentlichen Jodininmengen durch Kultivierung von ausgewählten Stämmen des Organismus Brevibacterium iodinum.

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus Brevibacterium iodinum wurde nach einem eingehenden Studium unter den verschiedenen bekannten Jodinin erzeugenden Organismen ausgewählt aufgrund seiner überlegenen Jodinin erzeugenden Leistung.

Die hier beschriebene Species Brevibacterium iodinum umfaßt alle Stämme des Organismus, die das gewünschte Jodinin zu erzeugen vermögen, und die nicht mit Sicherheit von den obenerwähnten Stämmen ό unterschieden werden können, sowie deren Subkulturen, einschließlich der Mutanten und Varianten. Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner die Verwendung der aus dem beschriebenen Organismus durch verschiedene Mittel erhaltenen Mutanten, wie durch chemische ' Mutationsmittel, ultraviolette Strahlen, Röntgenstrahlen, Aussetzen von Phagen u.dgl. Eine Kultur des Organismus Brevibacterium iodinum ist in der Mikroorganismensammlung des US-Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, unter der Registriernummer 1536 erhältlich.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird das Fermentationsverfahren unter Ausnutzung hochentwikkelter Mikrobenstämme des Organismus Brevibacterium iodinum ausgeführt. Aus der Mutterkultur werden die deutlich Jodinin erzeugenden Stämme entfernt und subkultiviert. Das Subkultivieren wird periodisch durchgeführt, so daß nur Mikroorganismen mit einer guten Jodinin erzeugenden Leistung beim Fermentetionsprozeß verwendet werden.

Die Auswahl der stark Jodinin erzeugenden Mikroorganismen wird wie folgt durchgeführt Eine Kultur des Mikroorganismus Brevibacterium iodinum wird in einer sterilen Anreicherungsbrühe suspendiert. Wenn die Mikroorganismen gut in der Anreicherungsbrühe wachsen, wird eine kleine Menge der Brühe, die das Mikrobenwachstum enthält, auf angereicherte Nährbodenplatten aufgestrichen. Durch die Aufstreichimpfung werden einzelne Organismen auf den Nährboden gebracht, die sich anschließend zu Kolonien entwickeln. Jede Kolonie stellt eine relativ reine Kultur dar.

Die Kolonien, die eine tiefpurpurne Farbe haben, sind Stämme des Mikroorganismus Brevibacterium iodinum, die eine gute Jodinin erzeugende Leistung aufweisen. Ein kleiner Anteil der einzelnen Kolonien, die diese tiefpurpurne Farbe haben, wird anschließend von der Nährbodenplatte genommen und in eine sterile Nährbrühe gebracht. Das Mikrobenwachstum, das sich in dieser Nährbrühe entwickelt, kann anschließend dazu verwendet werden, die Fermentationsbrühe zu inokulieren, die zur Kultivierung des Mikroorganismus Brevibacterium iodinum verwendet wird.

Stark Jodinin erzeugende Stämme des Brevibacterium iodinum können auch durch ultraviolette Strahlen oder chemische Behandlung einer Suspension von Bakterienzellen erhalten werden. Die chemische Behandlung kann unter Verwendung von Substanzen, wie beispielsweise Nitrosoguanidin, Stickstofflost, Natriumnitrit u. dgl. erfolgen. Nitrosoguanidin wird bevorzugt. Die Überlebenden einer Population, von -der über 99% der Zellen durch Bestrahlung oder chemische Behandlung getötet worden sind, werden anschließend, wie oben beschrieben, kultiviert, um das bei der Fermentation verwendete Inokulum herzustellen.

Ein wichtiges Kennzeichen der vorliegenden Erfindung ist die Zusammensetzung des zur Kultivierung des Mikrooreanismus Brevibacterium iodinum v*rwende-

C)S ten Nährmediums. Es wurde gefunden, daß bestimmte Bestandteile, die im Nährmedium enthalten sind, wesentlich sind, um die gewünschten hohen Jodininmengen zu erhalten.

Ein Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht daher in der Kultivierung, bis eine wesentliche Jodininmenge gebildet ist, des Mikroorganismus Brevibacterium iodinum unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Nährmedium, das etwa 0,2 — 5,0 Gew.-% eines komplexen stickstoffhaltigen Produktes, nämlich eines hydrolysierten pflanzlichen und/oder tierischen Proteins, etwa 1,0 bis 10,0 Gew.-% Kohlenhydrate und etwa 0,5 — 10,0 g/Liter eines oberflächenaktiven Mittels, und zwar eines polymeren Organosilikons, enthält, und im Abtrennen des so erhaltenen Jodinins aus der Fermentationsbrühe.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft das wäßrige Nährmedium zur Kultivierung des Mikroorganismus Brevibacterium iodinum unter aeroben Bedingungen, um in wirtschaftlichen Ausbeuten Jodinin zu erhalten. Dieses Nährmedium besteht aus Wasser, etwa 0,2 — 5 Gew.-% eines komplexen stickstoffhaltigen Produktes, und zwar eines hydrolysierten Saatmehls und/oder hydrolysierten Bohnenmehls und/oder hydrolysierten Milchproduktes und/oder hydrolysierten Fleischproteins und/oder hydrolysierten Fischproteins, etwa 1,0 — 10,0 Gew.-% Kohlenhydrate, und zwar Glukose und/oder technische Glukose und/oder Invertmelasse und/oder Restmelasse, sowie etwa 0,5 — 10,0 g/Liter eines oberflächenaktiven Mittels, und zwar eines polymeren Organosilikons.

Die wesentlichen Bestandteile des Nährmediums sind folgende:

1. Eine Stickstoffquelle. Die Stickstoffquelle für das Fermentationsmedium kann aus verschiedenen im Handel erhältlichen Hefen und aus von Hefen abgeleiteten Produkten, wie beispielsweise Difco Bacto Hefeextrakt und Brewers getrocknete Hefe, sowie aus verschiedenen komplexen stickstoffhaltigen Produkten, die sich von Hausabfällen, Milchprodukten, Saat- und Bohnenmehl u. dgl. ableiten, ausgewählt werden.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß eine Stickstoffquelle, die ein hydrolysiertes Protein enthält, die Jodininausbeute am meisten vergrößert. Bevorzugte Proteinquellen sind entfettete Saat- oder Bohnenmehle, wie beispielsweise Erdnußmehl, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl u. dgl., entfettete Milchprodukte, wie beispielsweise Milchpulver oder Fleisch- oder Fischproteine. Die Hydrolyse dieser Proteinquellen kann durchgeführt werden, indem die an Protein reichen Materialien mit Enzymen behandelt werden, die reich an Proteasen sind. Geeignete Beispiele für proteolytische Enzyme, die sich für diese Zwecke eignen, sind Pflanzenproteasen (wie Feigenprotease, Bromelin, Papain), Bakterienprotease, Pilzprotease, Pepsin, tierische Diastase, Trypsin und Pancreatin oder deren Gemische. Die proteolytische Hydrolyse kann am besten ausgeführt werden, indem die Proteinquelle in einem wasserhaltigen Auflösungsmittel mit dem proteolytischen Enzym gemischt wird, das Gemisch inkubiert wird, um die Verdauung des Proteins zu ermöglichen, und das erhaltene Verdaute in eine für die Zugabe zum Fermentationsmedium geeignete Form gebracht wird. Das Verdaute kann beispielsweise unmittelbar dem Medium zugesetzt werden oder es kann zunächst zu einem festen Stoff gefriergetrocknet und anschließend zugesetzt werden. Im Bedarfsfalle kann die Proteinzubereitung zunächst vor der Zugabe

des proteolytischen Enzyms zum Sieden erhitzt werdea Dieses Sieden trägt dazu bei, das Protein zu denaturieren, unterstützt die Herabsetzung der mikrobiellen Verunreinigungen während der Verdauung und fährt eine teilweise Zersetzung des Protease inhibierenden MateriaJes herbei, das in bestimmten Proteinquellen gefunden wird.

Neben den oben beschriebenen bevorzugten Proteinquellen gibt es auch im Handel erhältliche hydrolysierte Proteinquellen. Im Handel erhältliche Produkte, die für >° die Zwecke der vorliegenden Ei findung geeignet sind, sind Enzym-hydrolysierte entfettete Rindermuskeln (Amber Laboratories, Enzym-hydrolysiertes Fleischprotein), durch Enzym-hydrolysiertes entfettetes Sojaprotein (Sheffield Chemical Corp, Sojapepton), hydro- '5 lysierte Hausabfälle (packing house wastes) (Wilson Laboratories, Proto Peptone 366), Maiseinweichwasserfeststoffe und Baumwollsaatproteinhydrolysat Von diesen Stickstoffquellen ist das Enzym-hydrolysierte entfettete Sojabohnenmehl am bevorzugtesten.

1. Die Stickstoffquelle liegt im fertigen Nährmedium in Mengen von etwa 0,2 — 5 Gew.-%, vorzugsweise etwa 2,0 — 4,0 Gew.-% vor.

2. Kohlenhydratquelle. Die Kohlenhydratquelle kann aus verschiedenen Zucker- oder Stärkeprodukten, wie *s Glukose, Maltose, Sukrose, Laktose, Restmelasse, Invertmelasse, Mais- und Kartoffel-Stärke u. dgl, oder deren Gemischen ausgewählt werden. Es ist gefunden worden, daß für die Zwecke der vorliegenden Erfindung die leistungsfähigsten Kohlenhydratquellen Glukose, technische Glukose, Restmelasse und Invertmelasse sind. Glukose und technische Glukose sind die bevorzugtesten Bestandteile.

Die Kohlenhydratquelle liegt in einer Menge von etwa 1 — 10 Gew.-%, vorzugsweise etwa 2 — 5 Gew.-%, bezogen auf das fertige Nährmedium, vor.

3. Spurennährstoffe. Es wurde gefunden, daß die Zugabe von bestimmten Aminosäuren oder von B-Vitaminen zum Nährmedium die Jodininausbeute beträchtlich steigert Zusätzliche Spurennährstoffe, die die Jodininprodukiion anregen, sind 1-Valin, 1-Leucin, !-Lysin, 1-Methionin, 1-Tryptophan, 1-Phenylalanin, 1-Tyrosin, Calciumpantothenat und Folinsäure. 1-Vqlin und 1-Leucin führen zu den größten Ausbeutesteigerungen. Dem Medium kann ein Gemisch von Metallionen, wie K, Ca, Mg, Mn, Cu, Co, Zn, Fe, Mo, usw. sowie Anionen, wie PO, zugesetzt werden, um das Wachstum und die Produktion zu steigern, wenn diese Ionen nicht bereits in dem natürlichen Medium vorliegen. Die Spurennährstoffe werden dem Nährmedium in einer Konzentration von etwa 0,001 — 1 g/Liter einverleibt.

4. Oberflächenaktive Mittel. Durch die Zugabe von bestimmten oberflächenaktiven Verbindungen, d. h. von Verbindungen, die die Oberflächenspannung verändern, zum Fermentationsmedium wird oie Jodininerzeugung beträchtlich angeregt. Es wurde besonders gefunden, daß oberflächenaktive polymere Organo-Silikone die wirksamsten oberflächenaktiven Mittel sind, um die Erzeugung von Jodinin anzuregen, wobei nichtionische Polyalkylenoxydsilan-Emulsionen am meisten bevorzugt werden. Die oberflächenaktiven Mittel werden dem Nährmedium in einer Menge von etwa 0,5 — 10,0 g/Liter einverleibt. Die bevorzugte Konzentration beträgt etwa 1,0 — 5,0 g/Liter.

Der Anfangs-pH der Fermentationsbrühe muß im Bereich von etwa 5,0 — 9,0 liegen. Während der Fermentation liegt das pH-Optimum im Bereich von 6,5 — 8,5. Der pH der Brühe wird durch Zugabe eines ' Alkalihydroxyds, wie Natriumhydroxyd, oder durcl Zugabe einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure, einge stellt

Ein weiteres Merkmal des Verfahrens der vorliegen den Erfindung betrifft die Kultivierung des Mikroorga nismus Brevibacterium iodinum unter aeroben Bedin gungen in einem flüssigen Nährmedium, das eine Stickstoffquelle aus hydrolysierten pflanzlicher und/oder tierischen Proteinen, eine Kohlenhydratquelk und ein oberflächenaktives Mittel enthält bei einei Temperatur von etwa 20 — 40⁰C über einen Zeitraurr von etwa 2 — 12 Tagen, die Entfernung der Feststoffe aus der Brühe durch Zentrifugieren, Dehydratisierung der erhaltenen nassen Aufschlämmung durch Waschen mit niedermolekularem aliphatischen, wasserlöslichen Alkohol, Trocknen des Rückstandes und Extrahieren des Jodinins aus den abgetrennten Feststoffen der Brühe mit einem nichtreagierenden organischen Lösungsmittel.

Das Fermentationsverfahren der vorliegenden Erfindung wird ausgeführt indem ein oder mehrere Stämme des Brevibacterium iodinum in einem Nährmedium, wie es oben beschrieben ist bei einer Kuiturtemperatur von etwa 20-40⁰C, vorzugsweise etwa 25 - 32° C, kultiviert werden. Um optimale Jodininausbeuten zu erhalten, muß die Fermentation geschüttelt und belüftet werden. Die Jodininerzeugung findet aber auch — wenn auch langsam — in einem Medium statt, das nicht geschüttelt wird und mit atmosphärischem Sauerstoff in Berührung ist Eine Jodininerzeugung erfolgt nicht oder wird deutlich inhibiert wenn atmosphärischer Sauerstoff vollständig abwesend ist Die Inkubationszeit beträgt etwa 2 bis 12 Tage, vorzugsweise etwa 4 bis 9 Tage.

Das durch Fermentation erzeugte Jodinin kann anschließend gewonnen werden, indem eines von mehreren einfachen Gewinnungsverfahren angewendet wird. Nach einem solchen Gewinnungsverfahren, kann die Brühe mit suspendierten Feststoffen unmittelbar extrahiert werden, indem ein geeignetes nichtreagierendes organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Methylenchlorid oder Chloroform, verwendet wird. Jodininkristalle können in guten Ausbeuten aus dem konzentrierten Lösungsmittelextrakt durch Verdampfung des Lösungsmittels und Entfernung der Feststoffe durch Filtration oder durch Zentrifugieren erhalten werden. Nach einem anderen Verfahren, das für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugt wird, weil es weniger Lösungsmittel erfordert, werden zuerst die Feststoffe durch Zentrifugieren aus der Brühe entfernt. Die gewonnene nasse Aufschlämmung wird dehydratisiert, indem sie mehrere Male mit einem niedermolekularen aliphatischen, wasserlöslichen Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Butanol, Isobutanol, Aceton u.dgl., gewaschen wird. Den lösungsmittelfeuchten Rückstand läßt man an der Luft trocknen, und die getrockneten Feststoffe werden in einer Flüssigkeit-Feststoff-Extraktionsapparatur (Soxhlet) mit einem nichtreagierenden organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Chloroform, Methylenchlorid oder Toluol, extrahiert.

Nach einem bevorzugten Verfahren der Erfindung, enthält das Nährmedium etwa 20 g/Liter Enzym-hydrolysiertes entfettetes Sojaprotein, etwa 30 g/Liter technische Glukose, 1 — 5 g/Liter nichtionische Polyalkylen-Siloxan-Emulsion (Union Carbide Corp ; Präparat SAG 4988) und etwa 1 g/Liter 1-Valin. Das Medium wird mit destilliertem Wasser auf sein Volumen gebracht. Narh

Jer Herstellung des Nährmediums wird der pH durch Zugabe eines Alkalihydroxyds, wie Natriumhydroxyd, jder durch Zugabe von Schwefelsäure auf 6,0 — 9,0 :ingestellt und das Medium, beispielsweise 20 bis 30 Minuten bei 120⁰C, sterilisiert. Damit ist das Nährmedijm fertig, um für den oben beschriebenen Fermentationsprozeß verwendet zu werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung von Stammkulturen
Brevibacterium iodinum-Stämme, die nach

der

Aufstreichmethode auf angereicherte Nährbodenplatten, wie oben beschrieben, selektiert worden waren, wurden auf Nährbodenschrägflächen gehalten, die folgende Bestandteile in g/Liter enthielten:

Enzym-hydrolysiertes

entfettetes Sojaprotein^a) 20

Technische Glukose^b) 30

Bakteriennährboden 20

mit destilliertem Wasser auf das entsprechende

Volumen aufgefüllt.

^a) Sheffield Chemicals Corp., Sojapepton T-1,

^b) Com Produkts Corp., Cerelose.

Der pH wurde vor der Sterilisation während 20 — 30 Minuten bei 120⁰C auf 6,8 — 7,2 eingestellt. Inokulierte Schrägflächen wurden vor der Verwendung 2 — 5 Tage bei 28° C inkubiert. Die Stammkulturen wurden nach einer 2- bis 3tägigen Inkubationszeit im Eisschrank gekühlt.

Beispiel 2

Standardverfahren für
Kolbenschütteluntersuchungen

40

100 ml Anteile des Nährmediums, das die Bestandteile enthielt, die im Hinblick auf ihre Wirksamkeit auf die Jodininausbeute ausgewählt wurden, wurden in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gebracht, die mit einem locker sitzenden Baumwollstopfen verschlossen waren, und 20 _4S bis 30 Minuten bei 120° C im Autoklav sterilisiert.

Das Inokulum für Kolbenuntersuchungen wurde hergestellt, indem das Wachstum einer passenden Anzahl von replizierten Schrägflächen, die analog Beispiel 1 hergestellt wurden, in sterilem, destilliertem Wasser unter Verwendung von etwa 10 ml Wasser pro Nährboden suspendiert wurde. Jeder Kolben wurde mit 1 ml dieser Zellensuspension inokuliert

Während der Inkubierung (gewöhnlich bei 28° C) wurden die Kolben dauernd auf einer New-Brunswick-Scientific-DrehschOttelapparatur geschüttelt, die eine kreisförmige Drehbewegung auf einer 2^4 cm Umlaufbahn bei 240 — 280 UpM ausführte.

Für die Versuche wurden 3 — 5 ml Proben aseptisch und periodisch aus dem jeweiligen Kolben entfernt

Bei spie! 3 Standardverfahren für Behälteruntersuchungen

Schrägbodenkulturen wurden wie im Beispiel 1 beschrieben, hergestellt und verwendet Saatinokulum wurde in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben, die 100 ml Medi-

60 um enthielten, das mit dem in Beispiel 1 verwendeten identisch war, zur Schrägflächenherstellung unter Weglassung des Nährbodens hergestellt. Nach 3- bis 5tägigem Inkubieren auf einer Drehschüttelapparatur bei 28°C wurden 20 ml Mengen der entwickelten Kultur zu 2-Liter-Mengen des Mediums des Saatinokulums gegeben, das für Kolbenuntersuchungen in Beispiel 2 hergestellt worden war und in 6-Liter-Saatkolben enthalten war, die am Boden mit Rohren zum aseptischen Überleuen des Inhaltes ausgerüstet waren. Nach der Inokulation wurden die 6-Liter-Saatkolben auf einer Drehschüttelapparatur, die mit einer Geschwindigkeit von 200 UpM arbeitete, inkubiert. Die Inkubation wurde 3 — 5 Tage fortgesetzt.

Ein nichtrostender Fermentationsstahlbehälter mit einem Fassungsvermögen von 400 Liter, der mit einer Rührvorrichtung, Belüftung und Temperaturkontrolle versehen war, wurde mit 200 Liter Medium von der gleichen Zusammensetzung wie die Saatkolben gefüllt, mit der Ausnahme, daß anstelle von destilliertem Wasser Leitungswasser verwendet wurde. Außerdem wurden 0,025% Dow-Corning-Silicon-A-Paste zugesetzt, um das Schäumen während der Sterilisation unter Kontrolle zu halten.

Die Sterilisation wurde durchgeführt, indem Behälter und Inhalt 30 — 45 Minuten auf 120⁰C gehalten wurden und anschließend schnell auf Inkubationstemperatur abgekühlt wurde.

Die Inokulierung wurde durchgeführt, indem der Inhalt von zwei 6-Liter-Saatkolben, die geschüttelt wurden, aseptisch in den Behälter überführt wurde.

Die Schüttelgeschwindigkeit (Achsengeschwindigkeit) wurde anschließend auf 200 — 250¹JpM eingestellt und die Belüftung auf 0,142 m³/Min. gehalten, während eine konstante Temperatur von 28° C beibehalten wurde.

Das Schäumen wurde im Bedarfsfalle durch Zugabe einer sterilen 30%igen wäßrigen Suspension von Dow-Corning-Silicon-Antischaum-Emulsion A kontrolliert.

Aus dem Behälter wurden periodisch zur analytischen und mikrobiologischen Kontrolle Proben gezogen.

Beispiel 4
Analytische Standardmethoden

Proben der Brühe aus Kolben und Behälter wurden nach dem folgenden Verfahren untersucht:

Ein 2,0 ml aliquoter Teil einer gut geschüttelten Probe wurde zu 40 ml Chloroform von Reagenzqualität gegeben, welches in einem mit Glasstopfen versehenen 50-ml-Rohr enthalten war, und heftig geschüttelt Die erhaltene Emulsion wurde anschließend bei etwa 2 000 UpM 5 Minuten zentrifugiert, um die Emulsion zu brechen.

Ein 1,0 ml aliquoter Teil der klaren Chloroformschicht wurde abpipettiert und in passender Weise mit frischem Chloroform verdünnt Die erhaltene Chloroformlösung wurde gemessen bei einer Wellenlänge von 535 ΐημ in einem Beckman-DU-Spektrophotometer oder in einem Bausch-und-Lomb-Spectronic-20-Colorimeter.

Die abgelesene optische Dichte wurde in meg/m! Jodinin umgerechnet unter Verwendung einer Eichkur ve oder unter Verwendung des Wertes Em 535 = 6350 : Molekulargewicht = 244.

Aufgrund wiederholter Versuche ergab sich, daß die Analysen der Brühe bis auf etwa ± 6% genau sind. Es

wurde gefunden, daß die Kulturbrühen von Brevibacterium iodinum keine analytisch nennenswerten Mengen von verunreinigenden Phenacinen enthalten, die in der Nähe von 535 ηιμ absorbieren.

B e i s ρ i e 1 5

100 g gemahlenes entfettetes Erdnußmehl wurde in 300 ml destilliertem Wasser suspendiert und der pH mit 5 N-Natriumhydroxyd auf 8,5 eingestellt. Zwei Gramm handelsübliche Bakterienprotease (Maxatase), die in 40 ml destilliertem Wasser suspendiert waren, wurden eingerührt und die Masse nach dem Durchmischen mit destilliertem Wasser auf 500 ml gebracht. Nachdem wieder auf pH 8,5 eingestellt worden war, wurde das Material auf einen Inkubationsschüttler gestellt und langsam geschüttelt, während eine Temperatur von 40^cC aufrechterhalten wurde. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden wurde ein 100 ml aliquoter Teil ~^l entfernt und lyophilisiert zu einem frei fließenden Feststoff.

Ein wäßriges Medium wurde hergestellt, das 2% lyophilisierte Feststoffe und 3% technische Glukose (Cerelose) enthielt Nachdem das Medium auf pH 7,0 eingestellt worden war. wurden 100 ml Anteile in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gebracht, 30 Minuten bei 120°C ii.i Autoklav behandelt und nach dem Abkühlen mit einer Suspension von 3 Tage alten Zellen von Brevibacterium iodinum inokuliert, die nach der oben ^Λ° beschriebenen Aufstreichmethode auf die angereicherten Nährbodenplatten selektiert worden waren. Nach der Inokulation wurden die Kolben auf einen Drehschüttler, der mit 280 UpM arbeitete, gestellt und 8 Tage bei 28^CC inkubiert. Die nach dieser Zeit gezogenen Proben zeigten einen Jodiningehalt von 1930 mg/Liter.

Beispiel Beispiel 6

100 g entfettetes Sojabohnenmehl (Sovalose 103) wurden in 400 ml destilliertem Wasser suspendiert und der pH mit 5 N-Schwefelsäure auf 5,0 eingestellt. Nach der pH-Einstellung wurde die Suspension 20 Minuten zum Sieden erhitzt und anschließend abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurde die Suspension mit destilliertem Wasser auf 450 ml verdünnt und 50 ml einer wäßrigen Suspension, die 2 g Pepsin enthielt, zugesetzt. Nach der Zugabe des Enzyms wurde der Kolben auf einen Inkubationsschürtier gestellt, der auf 40" C gehalten wurde und leicht geschüttelt Nach einer 72stündigen Inkubationszeit wurde der Kolbeninhalt wieder auf pH 7,0 eingestellt und lyophilisiert

Ein wäßriges Medium wurde hergestellt, das 2% lyophilisierte Feststoffe und 3% technische Glukose (Cerelose) enthielt Der pH wurde auf 7,0 eingestellt und 100 ml aliquote Teile in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben portioniert Nach der Sterilisierung über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 12O⁰C wurden die Kolben mit einer wäßrigen Suspension von 3 Tage alten Zellen von Brevibacterium iodinum inokuliert, die nach der oben beschriebenen Auf Streichmethode auf die angereicherten Nährbodenplatten selektiert worden warea Man ließ bei 28° C auf einem Drehschüttler, der mit 280 UpM arbeitete, inkubierea Nach einer lOtägigen Inkubation wieder die gezogenen Proben einen Gehalt von 1460 mg Liter Iodinin auf.

Baumwollsaatmehl wurde 48 Stunden bei pH 6.0 mit einer in Beispiel 5 beschriebenen Protease enthaltenden tierischen Diastase behandelt. Anschließend wurde ein wäßriges Medium hergestellt, das 2% lyophilisierte Feststoffe und 3% technische Glukose (Cerelose) enthielt. Es wurde analog den Verfahren im Beispiel 5 sterilisiert und inokuliert. Nach einer Inkubationszeit von 7 Tagen hatte sich Jodinin in einer Menge von 1230 mg/Liter gebildet.

Beispiel 8

Entfettete getrocknete Milchfettstoffe wurden wie im Beispiel 5 mit einer Bakterienprotease 48 Stunden bei pH 8.5 behandelt. Ein wäßriges Medium wurde anschließend hergestellt unter Verwendung der analog Beispiel 5 erhaltenen lyophilisienen Feststoffe. Nach einer Inkubationszeit von 8 Tagen hatte sich Jodinin in einer Menge von 925 mg/Liter gebildet.

Beispiel 9

Entfettetes Erdnußmehl wurde mit Pancreatin 4S Stunden bei pH 8.5, wie im Beispiel 6 beschrieben. behandelt. Ein mit lyophilisienen Feststoffen analog Beispiel 6 hergestelltes Medium lieferte in 10 Tagen 1615 mg/Liter Jodinin.

Beispiel 10

Der Einfluß der oberflächenaktiven Mittel auf die Jodininerzeugung

Brevibacterium iodinum N RRL-1536 Stamm 1302B.

■K der nach der oben beschriebenen Aufstreichmethode auf angereicherte Nährbodenplatten selektiert worden war. ließ man 3 Tage bei 28¹C auf fünf Nährbodenschrägflächen wachsen, die 20 g/Liter hydrolysiertes Sojabohnenmehl. 30 g/Liter technische Glukose unc 20 g/Liter Nährboden enthielten. Mit destillierten": Wasser wurde auf das entsprechende Volumen aufgefüllt. Vor der Sterilisation wurde der pH auf 6.S — '■-eingestellt. Das Wachstum der Schrägflächen wurde in destilliertem Wasser suspendiert, vereinigt und auf 50 ml verdünnt

1 ml aliquote Teile dieser Zellensuspension wurden in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben überführt Jeder Kolben enthielt 100 ml Medium, das 20 g/Liter hydrolysiertes Sojabohnenmehl und 30 g/Liter technische Glukose enthielt Die inokulierten Kolben unterschieden sich voneinander hinsichtlich der Mengen und Arten der oberflächenaktiven Verbindungen, die sie enthielten. Die Aufstellung der Verbindungen, ihre Konzentrationen und die damit erhaltenen Jodininausbeuten sind in

Tabelle i zusammengestellt

Bei der Durchsicht der Tabelle I zeigt sich, daß in einer Fermentationszeit von 7 Tagen eine Ausbeute von 4100 mg/Liter Jodinin erhalten wurde, und zwar in einem Medium, das als oberflächenaktive Verbindung 1 g/Liter Union Carbide Silicon-Antischaummittel L-78 enthielt Ein Medium, das 5 g/Liter Union Carbide Polyalkylensiloxan SAG 4988 enthielt ergab eine Ausbeute von 4200 mg/Liter. Andere nichtionische

oberflächenaktive Verbindungen erzeugen zwar auch deutlich Iodinin, jedoch regen sie etwas weniger die Ausbeute an.

Tabelle 1

Einfluß oberflächenaktiver Mittel auf die Ausbeute von Jodinin

Zubereitung	Im Medium	Erhaltene	Jodininzu-
	verwendete	Iodinin-	nahme in
	Menge in	ausbeute	% gegen
	g/Liter zur	in mg/Liter	über der
	Erzielung		Ver
	einer maxima		gleichs-
	len Wirkung		probe
Vergleichsmedium		2500
UCO-L-782)	1	4100	61
UCO-L-782)	5	3900	52
UCO-SAG-4712)	1	3800	48
UCO-SAG-49882)	5	4200	67
UCO-SAG-54402)	1	3200	24
UCO-S AG-544 Ρ)	1	3200	27
Stauffer SS-2013)	1	3900	52
Hodag K-57<)	5	3000»)	43
Hodag K-364)	1	2500*)	17
Pluronic L-815)	5	3500**)	33
Tween-806)	5	2500***)	16
MYRJ-456)	1,5	2800**·)	29
MYRJ-596)	5	2700·**)	26

Beispiel 11

Der Einfluß der Temperatur auf die
Jodininherstellung

Das Fermentationsverfahren folgt dem Verfahren, wie es in Beispiel 2 angeführt ist. Die Fermentationen wurden in 100 ml Mengen Nährmedium in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben ausgeführt, indem kontinuierlich bei 240 UpM auf einer kreisförmigen 2,54-cm-Umlaufbahn geschüttelt wurde. Das Nährmedium, das 2% hydrolysiertes Sojaprotein und 3% technische Glukose enthielt, wurde in destilliertem Wasser hergestellt und vor der Sterilisierung auf pH 6,8 - 7,2 eingestellt. Die Kolben wurden mit 1 Vol.-°/o/Volumen einer wäßrigen Suspension des Wachstums einer 3 Tage alten Schrägfläche von Brevibacterium iodinum Stamm 1302B in 10 ml sterilem destillierten Wasser inokuliert. Die Inkubationstemperatur wurde bei jeder Fermentation variiert, um den Einfluß der Temperatur auf die Anregung der Jodininerzeugung festzustellen. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle 11

Einfluß der Temperatur auf die Jodininherstellung

s Inkubationstemperatur
(in "C)

Hersteller: Union Carbide Corp.
Hersteller: Stauffer Chemical Corp.
Hersteller: Hodag Chemical Corp.
Hersteller: Dow Chemical Corp.
Hersteller: Atlas Chemical Industries Ltd.
Die Kontrolle bei diesem Versuch ergab 2090 mg/Liter Die Kontrolle bei diesem Versuch ergab 2360 mg/Liter. *) Die Kontrolle bei diesem Versuch ergab 2140 mg/Liter. Maximale jodinin-

ausbeute

(in mg/Liter)

Alter

(in Tagen)

<800

2700
2100
2400
1400

sehr langsames

Wachstum

Eine Durchsicht der Daten in Tabelle H zeigt, daß bei Inkubationstemperaturen von 25 — 32°C die Jodininausbeuten am höchsten sind.

Beispiel 12

Einfluß von im Handel erhältlichen komplexen stickstoffhaltigen Nährstoffen auf die Ausbeute von Jodinin

Die Fermentationen werden nach den in Beispiel 2 angeführten Verfahren ausgeführt Das Basismedium, das mit destilliertem Wasser hergestellt wurde, enthielt 1 % Glukose m Form von technischer Dextrose. Der pH wurde vor der Sterilisierung auf 6,8 bis 7,2 eingestellt Verschiedene im Handel erhältliche komplexe stickstoffhaltige Nährstoffe wurden im Hinblick auf ihren Einfluß auf die Jodininerzeugung untersucht, indem diese Produkte dem Fermentationsmedium zugesetzt wurden. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle III aufgeführt.

Eine Durchsicht der Tabelle 111 zeigt, daß verschiedene stickstoffhaltige Nährstoffe höhere Jodininausbeuten liefern. Enzym-hydrolysiertes entfettetes Sojaprotein Baumwollsaatprotein und Enzym-hydrolysierte entfettete Rindermuskeln liefern die besten Ergebnisse.

Beispiel 13 Einfluß von Kohlenhydratquellen auf die Ausbeute von Jodinin

Die Fermentationen wurden nach den in Beispiel 2 angeführten Verfahren ausgeführt Das Basismedium, das mit destilliertem Wasser hergestellt wurde, enthielt 2% hydrolysiertes Sojaprotein (Sojapepton T-I, Sheffield Chemicals Corp.). Vor der Sterilisierung wurde der pH auf 6,8 - 7,2 eingestellt Verschiedene im Handel erhältliche Kohlenhydratquellen wurden im Hinblick auf ihren Einfluß auf die lodininerzeugung ausgewählt indem diese Produkte zu dem Fermentationsmediun gegeben wurden. Die Ergebnisse dieser Untersuchunj sind in Tabelle TV aufgeführt

Bei der Durchsicht von Tabelle IV zeigt sich, dal verschiedene Kohlenhydrate höhere Jodininausbeutei liefern. Mit Glukose, technischer Glukose und Rest oder Invertmelasse erhält man die besten Ausbeuten.

Tabelle 111

Einfluß von im Handel erhältlichen komplexen stickstoffhaltigen Nährstoffen auf die Jodininausbeute

Produkt	Im	Maximale	Alter
	Medium	Ausbeute	(in Ta
	verwen	an Jodinin	gen)
	dete %	in mg/Liter
Hydrolysiertes Soja	2	1200	4
protein2)
(Sojapepton T-I)
Peptonisierte Milch2)3)	2	360	4
Hydrolysierte Hausab	4	550	4
fälle (Protopepton 366)<)
Maiseinweichwasser	2	620	7
feststoffe
Enzym-hydrolysierte	2,5	2300	10
entfettete Rinder
muskeln3)5)
Baumwollsameti-	2	1400	10
protein3)5)

Hersteller: Sheffield Chemicals Corp.

3% Glukose in Form technischer Dextrose enthaltendes Medium.

Hersteller: Wilson Laboratories.

Hersteller: Amber Laboratories; Enzym-hydrolysiertes

Fleischprotein.

Hersteller: Amber Laboratories Amber CTPH.

Eine Durchsidn von Tabelle V zeigt, daß mehrere dei untersuchten Aminosäuren und B-Vitamine eine bedeu tende Erhöhung der Jodininausbeute ergeben. L-Valin 1-Leucin und Ca'ciumpantothenat liefern die bester

Beispiel 15

Brevibacterium iodinum NRRL 1536 Stamm 1302B ließ man auf einer Nährbodenschrägfläche, wie im Beispiel 1 beschrieben, wachsen. Eine Saatkultur wurde hergestellt, indem ein schleifenartiges 3 Tage altes Schrägflächenwachstum in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben überführt wurde, der 100 ml Medium enthielt, das 20 g/Liter Sojabohnenmehlhydrolysat und 30 g/Liter technische Glukose enthielt Mit destilliertem Wasser wurde auf 1 Liter aufgefüllt. Der inokulierte Kolben wurde auf einen Drehschütteltisch gestellt, der eine kreisförmige 2,54-cm-Umlaufbahn beschreibt, und mit 280 UpM geschüttelt, während eine Temperatur von 28° C aufrechterhalten wurde. Die Inkubation wurde 3 Tage fortgesetzt

10 ml Mengen dieser Saatkultur wurden zu 2-Liter-Mengen Saatmedium gegeben, die sich in zwei 6-Liter-Erlenmeyer-Kolben befanden, die am Boden für die Entleerung der Kolben mit Rohren versehen waren. Diese 6-Liter-Saatkolben wurden auf einer Drehschüttelvorrichtung, die 200 UpM beschrieb, 3 Tage bei 28°C inkubiert. Der Inhalt der Kolben wurde anschließend in ein 400-Liter-Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl überführt, das mit

Tabelle IV

Einfluß von Kohlenhydratquellen auf die Ausbeute von Jodinin

Tabelle V

Anregende Einflüsse auf die Jodininausbeute von verschiedenen Aminosäuren oder B-Vitaminen

Produkt	Ver	2	2	Jodinin	Alter in	Zusatzstoff	40	1-Valin	Konzen	Stimulie	Fermen
	wendete	2	1	ausbeute in	Tagen bei		1 -Leucin	tration	rung der	tations-
	Menge im	1	1	mg/Liter	der maxi		1-Lysin	in g/Liter	Jodinin-	dauer
	Medium	5			malen		4S 1-Methionin		ausbeute	(in
	%	Maisdextrin (Amidex) 5			Ausbeute	1 -Tryptophan		in %	Tagen)
Glukose, C. P.	2	Saccharose	Beispiel	1800	8	1-Phenylalanin	1	80	10
Technische Glukose 5	Lösliche Stärke	1800	8	1 -Tyrosin	1	73	10
Restmelasse	Laktose	1500	8	1-Glutaminsäure	0,5	42	9
lnvertmelasse		1400	8	50 Calciumpantothenat	0,5	41	10
Kartoffelstärke		900	5	Folinsäure	0,5	36	9
Maltose		310	5	Cyanocobalamin	0,5	30	9
200	5	Pyridoxin	0,5	30	9
200	5		0,5	16	9
210	5	0,025	46	!0
190	5	0,010	43	10
		0,001	13	10
		0,01	Ί2	10
14

Anregende Einflüsse auf die Jodininausbeute von verschiedenen Aminosäuren oder B-Vitaminen

Die Fermentationen wurden nach den im Beispiel 2 angegebenen Verfahren ausgeführt Das Basismedium enthielt 2% hydrolysiertes Sojabohnenmehl und 3% technische Glukose, aufgefüllt mit destilliertem Wasser, und vor der Sterilisierung auf pH 6,8 bis 7,2 eingestellt Verschiedene Aminosäuren und B-Vitamine wurden im Hinblick auf ihren Einfluß auf die Jodininerzeugung untersucht, indem diese Produkte zu dem Fermentationsmedhim gegeben wurden. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle V aufgeführt

Einrichtungen zum Schütteln, Belüften und zur Temperaturkontrolle versehen war. Der Behälter e'ithielt 200 Liter eines sterilisierten Mediums, das mit Leitungswasser aufgefüllt worden war und das 20 g/Liter Sojabohnenhydrolysat und 30 g/Liter technische Glukose enthielt Der pH wurde vor der Sterilisierung auf 7,2 eingestellt Vor der Sterilisierung wurden 50 g Dow-Corning-Silicon-Antischaumemulsion-A-Paste zugesetzt um das Schäumen unter Kontrolle zu halten. Nach der Inokulation wurde der Ansatz bei 28° C inkubiert und mit einer Geschwindigkeit von 0,142 m³/ Min. belüftet, während mit einer Achsengeschwindigkeit von 250 UpM geschüttelt wurde. Nach 9 Tagen hatten sich 1900 me/Liter Iodinin pehilcfct.

Der Ansatz wurde durch Zentrifugieren in einer Sharples-Industrie-Modell-Zentrifuge gesammelt Die erhaltene nasse Aufschlämmung (8,65 kg) wurde mit 48 Liter Lösungsmittel auf«?eschlämmt, das aus 50% Äthanol und 50% Isopropanol bestand. Die Lösungsmittelsuspension wurde zentrifugiert, um die Feststoffe zu entfernen, die wiederum in 45 Liter frischem Lösungsmittelgemisch suspendiert wurden. Die Fest-

stoffe wurden wieder durch Zentrifugieren entfernt und der lösungsinittelnasse Brei zur Trocknung in offenen flachen Schalen ausgebreitet Die getrockneten Feststoffe hatten ein Gewicht von 1,9 kg und enthielten 107 g/kg Iodinin. 170 g 97%iges Jodinin wurden aus den getrockneten Rohfeststoffen durch kontinuierliche Chloroformextraktion in einer großen Soxhlet-Extraktionsapparatur erhalten. Die Ausbeute betrug 84%.

Claims (1)

1. ' Patentanspruch:

   Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Jodinin mit Hilfe von Brevibacterium iodinum, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung solche Stämme dieses Mikroorganismus selektiert werden, die eine tiefpurpurne Farbe beim Koloniewachstum zeigen und daß diese unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Nährmedium kultiviert werden, das etwa 0,2 — 5,0 Gew.-% eines hydrolysierten Saatmehls und/oder hydrolysierten Bohnenmehls und/oder hydrolysierten Milchproduktes und/oder hydrolysierten Fleischproteins und/oder hydrolysierten Fischproteins, etwa 1,0 bis 10,0 Gew.-% Kohlenhydrate und etwa 0,5 — 10,0 g/Liter eines oberflächenaktiven Mittels enthält