DE1767653A1 - Verfahren zur Erzeugung von Isoamylase - Google Patents

Description

Hayashibara AG. 31. Mai 1968

Okayama / Japan SJ/Hu

Hao 7014

Verfahren zur Erzeugung von Isoamylase

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung hochaktiver Isoamylase durch Kultivierung einer neuen Art von Bakterien der Gattung Pseudomonas.

Isoamylase spaltet bekanntlich spezifisch die glukosidische Alpha-1,6-Bindung amAnsatzpunkt der Verzweigung der Polysaccharide vom Stärketyp. Das Enzym wurde zuerst von Kobayashi u. Maruo aus Hefe gewonnen, Peat u. Mitarb, fanden es in Bohnen und Kartoffeln. Bender u. Wallenfels stellten 1961 fest, daß das pullulanzerlegende Enzym, nämlich Pullulanase, das aus Aerobacter aerogenes gewinnbar ist, ähnliche Wirkungen wie Isoamylase hat.

Die Bakterien der Gattungen Aerobacter und Pseudomonas sind nicht sporenbildende Gramnegative Stäbchen. Jedoch bestehen zwischen beiden Gattungen deutlich abgegrenzte taxonomische Unterschiede, und zwar in der Hinsicht, daß die erstgenannten Arten der Gattung peritrich, während jene der letztge-

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nannten Gattung polar^sott begeißelt sind. Die erstere Gattung zerlegt verschiedene Zucker aerobisch und anaerobisch, während die letztgenannte Gattung die Zucker nur aerobisch zerlegt.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht in der Entwicklung eines einfachen und wirksamen Verfahrens zur Erzeugung hochaktiver Isoamylose mit hoher Ausbeute.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man von einer Kohlenhydrate und Stickstoffverbindungen enthaltenden Kultur von Pseudomonas amyloderamosa, die nachstehend gekennzeichnet wird, ausgeht, und in dieser in an sich bekannter Weise das Enzym anreichert.

Pseudomonas amyloderamosa unterscheidet sich deutlich in verschiedener Hinsicht von den Arten der Gattung Aerobacter und den übrigen Gattungen der Familie Enterobacteriaceae. Ein wesentlicher Unterscheid ist auch in den Eigenschaften zwischen der erfindungsgemäß gewonnenen Pseudomonas-Isoamylase und der bekannten Aerobacter-Isoamylase, nämlich dem Enzym PuI-lulanase, festzustellen. Beispielsweise ist der optimale pH-Wert für die Wirkung des letzteren Enzyms gleich 6, während der für die Wirkung des früheren Enzyms von 2,5 bis 5^5 reicht,

Die kennzeichnenden Merkmale von Pseudomonas amyloderamosa

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"SB-iy wurden nach den im Bergey: "Manual of determinative Bakteriology", 7. Aufl., sowie gemäß "Journal of Japan Agricultural Chemical Society", j>6, 663-674 (1962) angegebenen Methoden bestimmt. Man erzielte folgende Ergebnisse:

1) Form

2) Größe

3) Sporen
4-) Geißeln

5) Gram-Färbung

6) Säurefestigkeit

7) Agar-Streifenkultur:

8) Agar-Plattenkultur:

9) Agar-Stichkultur:

10) Bouillonkultur:

11) Gelatine-Stichkultur:

Stäbchen

0,4--0,6/Ji χ 1,2-4,5 μ keine
polar
negativ
negativ

glatte, glänzende Oberfläche, gelbliche Zellen

runde, zusammenfließende, glatte, glänzende Oberfläche, leicht gehoben, gelblich und oapk lineares gutes Wachstum nahe der Oberfläche

wird trübe, leichte Fällung, Bildung sehr dünner Oberflächenhaut

lang/i same Verflüssigung in Krater-("crateri") Form

(Kulturen 7)bis 10)wurden mit Bouillon von 30⁰C, Kultur 11) mit Bouillon von 20⁰C durchgeführt.)

BAD ORfOlNAt.

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12) Kartoffelnährboden:

13) Lackmusmilch

14) Pigmenfbildung

15) Ammoniakbildung ßchwefel-

16) Wasserstoff-Bildung

17) Indol-Bildung

18) Nitrat-Reduktion

19) Bildung von Acetylmethyl-carbinol

20) Katalase-Nachweis

21) Harnstoff-Spaltung

22) Verwertung von Kohlenhydraten und Säurebildung

bräunlich, glänzend, feucht wird alkalisch, aber keine Änderung der Milch keine wasserlöslichen Pigmente; die Zellen werden aber leicht gelblich positiv negativ negativ negativ

negativ positiv positiv Säuren aerobisch ausArabinose, Glukose, Mannose und Maltose (aber keine Gasbildung); Fruktose, Galaktose, Laktose, Cellobiose, Rohrzucker, Trehalose, Salicin, a-Methylglukosid, Dextrin und Stärke aerobisch als Kohlenstoffquelle verwertet (aber keine Säurebildung); Xylose, Rhamnose, Cellulose, Dextran und Inulin nicht verwertet

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23) Verwertung von SorMt, Mannit, Inosit und Glycerin negativ

24-) Verwertung von Benzoe<$ p-Oxybenzoe--· und Salicylsäure oder sonstigen aromatischen Verbindungen negativ

25) Verwertung von Ammoniumsalzen und Nitraten als Stickstoffquellen nur in Gegenwart organischer Stickstoffverbindungen (Glutaminsäure, Asparaginsäure , Amino säurehydrolysate)

26) optimale Wachstumstemperatur 25 - 30⁰G (kein Wachstum bei 37°O)

27) optimales Wachstums-pH 6,5 - 7*5

28) Lethaltemperatur 70⁰G (in 10 min)

29) Sauerstoffbedarf aerobisch (anaerob kein Wachstum).

Es ergab sich, daß die untersuchte Bakterien-Art zur Gattung Pseudomonas gehört; denn sie ist ein aerobes nicht Sporen bildendes Gram-negatives Stäbchen mit einer einzigen polaren Geißel. Sie ähnelt in der färbstoffbildenden Pseudomonas-Gruppe der Pseudomonas ochracea, in dem sie Gelatine verflüssigt, Nitrate nicht reduziert und Milch alkalisch macht.

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Dennoch unterscheidet sie sich von Pseudomonas ochracea in folgenden Eigenschaften: Letztere erzeugt Indol und Schwefelwasserstoff, Pseudomonas amyloderamosa dagegen tut dies nicht. Bei Pseudomonas ochracea liegt die optimale Wachstumstemperatur bei 35⁰O? wächst auch noch bei 37°C Bei Pseudomonas amyloderamosa liegt die optimale Wachstumstemperatur zwischen 25 und 30⁰C; bei 37⁰O erfolgt kein Wachstum. Ferner verwertet P. ochracea Xylose, nicht aber Rohrzucker und Laktose, während P. amyloderamosa Rohrzucker und Laktose, aber keine Xylose verwertet. Hinzu kommt, daß erstere Salicyl-, Benzoe- und p-Oxybenzoesäure verwerten kann; dies kann p. amyloderamosa jedoch nicht.

Aufgrund dieser Ergebnisse stellte man fest, daß das erfindungsgemäß benutzte Bakterium eine neue Art ist, die Pseudomonas amyloderamosa genannt wurde.

Isoamylase wird erfindungsgemäß induktiv erzeugt.

Das Kulturmedium kann als Kohlenhydratquelle enthalten: Stärke, lösliche Stärke, Dextrin, Säure- und Enzymhydrolyzate von Stärke, Maltose und andere Stoffe mit glukosidischer Alpha-1,4- oder Alpha-1,6-Bindung.

Als Stickstoffquellen können dienen: Ammoniumsalze, Nitrate und Harnstoff mit Glutaminsäure, Asparaginsäure und andere organische Stickstoffverbindungen wie Pepton, Maisaufquellungen,

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Hefeextrakte und Proteinhydrolysate. Die organischen Stickstoffverbindungen lassen sich für sich allein als Stickstoff quelle verwenden. Reine Naturstoffe, die im wesentlichen aus Reis- oder Süßkartoffelpulver bestehen und in denen die Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen in geeigneter Weise vermengt sind, lassen sich ebenfalls anwenden. In jedem Fall muß die Menge der benutzten Stickstoffverbindung so gewählt sein, daß es ein optimales Ergebnis ergibt, da die Anwesenheit einer zu großen Menge an Stickstoffverbindungen für die Erzeugung der Isoamylase nicht günstig ist. In synthetischen Medien sollten anorganische Salze zusätzlich zu den genannten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zugesetzt werden.

Erfindungsgemäß werden folgende Kulturbedingungen eingehalten:

Das angewandte Kulturmedium wird auf pH 6 bis 8 eingestellt und mit P. amyloderamosa inokuliert; danach wird unter Rütteln oder Bewegen durch Belüftung bei 20 bis 30⁰O 1 bis 5 Tage lange kultiviert. Wenn der pH-Wert während der Inkubationszeit in alkalisch umschlägt, sollten saure Bedingungen eingehalten werden, um eine hohe Isoamylase-Ausbeute zu erhalten. Nach der Inkubation werden die Zellen von der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt. Kalt gelagert ist die überstehende unreine Enzymlösung ziemlich stabil.

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Aus dieser Enzymlösung kann durch Lösungsmittelfällung Aussalzen, Adsorption, Konzentrieren oder andere Verfahren Isoamylasezubereitungen mit höherer Zahl an Einheiten erhalten werden; sowie durch Trocknen Isoamylase in Pulverform. Der optimale pH-Wert für die Reaktion dieses rohen Enzyms liegt bei etwa 3,0; das Enzym ist innerhalb des Bereiches der pH 3 bis 6 stabil.

Die erfindungsgemäß gewonnene Isoamylase kann beispielsweise zur Erzeugung von Amylose aus Stärke sowie von Maltose aus Stärke verwendet werden, indem Stärke der gleichzeitigen Einwirkung von Isoamylase und Beta-Amylase unterworfen wird.

Die Bestimmung der Isoamylase-Aktivität erfolgte im wesentlichen nach der von Maruo u. Kobayashi im "Journal Agricult. Ghem.Sve. Japan", 2£, 115-120 (194-9) beschriebenen Methode und zwar in folgender Weise:

Ein Eeaktionsgemisch, bestehend aus

5,0 ml einer 1,0% löslicher klebriger Reisstärkelösung 1,0 ml einer O,5N-Essigsäure-Pufferlösung (pH4p) und 1,0 ml Enzymlösung,

wird bei 40⁰C in geeigneten Zeitabschnitten inkubiert. Zu 1 ml des inkubierten Gemisches setzt man 1 ml einer 0,01N Jodkalium-Jodid-Lö sung zu, verdünnt mit Wasser auf 25 ml und läßt 15 min stehen. Sodann wird der Extinktionskoeffizient der Lösung bei 610 mti unter Anwendung einer Einzentimeterzelle

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■bestimmt, wobei die Enzymmenge, die die Zunahme des Extinktionskoeffizienten um 0,1 in der Stunde bewirkt, als 10 Einheiten gewertet wird.

Beispiel 1:

Ein mit einem auf pH 7 eingestellten Leitungswasser bei'eitetes Kulturmedium der Zusammensetzung 2,0 % Maltose

0,2 % Natriumglutamat

0,3 %
0,1 %
0,05% MgSO₄.₂

wird mit einem SB-15-Stamm von Pseudomonas amyloderamosa inokuliert und unter Rütteln bei 30°0 120 h kultiviert. Nach der Inkubation bestimmte man, wie oben angegeben, die Isoamylase-Aktivität. In der Kulturflüssigkeit werden Aktivitäten von 180 bis 220 Einheiten/ml entwickelt. Durch Zentrifu- . gieren mit 10,000 U/min werden in 10 min die Zellen abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit rein erhalten. Unter Kühlen und Rühren der Flüssigkeit setzt man kalte.s Aceton bis zu einer Konzentration von 75% mit dem Ziel zu, eine Ausfällung des Enzyms zu bewirken. Der abgeschleuderte Niederschlag wird im Vakuum kalt getrocknet. Man erhält Isoamylase iijPulverform. Ausbeute 80 bia 90%. Die erhaltene lüoamylase ist bei trockener Lagerung hochstabil. Durch Kombination der obigen Arbeits-

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- -ίο -

weise mit dem Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder einer ande ren Behandlung kann die Amylase weiter gereinigt werden.

Beispiel 2;

Ein ebenfalls mit einen auf pH 7 eingestellten Leitungswas ser bereitetes Kulturmedium der Zusammensetzung

1,0 % löslicher Stärke

0,1 %

0,1 % Polypepton

wird mit dem P. ä.myloderamosa inokuliert und unter Rütteln bei 30°C 72 h kultiviert.Das erhaltene KuIturfiltrat, dessen Isoamylase-Aktivität 164 Einheiten beträgt, behandelt man gemäß Beispiel 1. Ausbeute an Isoamylase-Aktivität aus 100 ml Kulturflüssigkeit 82 %.

Beispiel 3?

Es wird eine Reihe Kulturmedien zubereitet, auf pH 7 eingestellt und in 5 ml Anteilen in konische 30 ml-Kolben gegeben. Man inokuliert das Medium in jedem Kolben mit 0,1 ml der Suspension des P. amyloderamosa und kultiviert unter Rütteln bei 30⁰C. Nach 4 Tagen werden die Zellen durch Zentrifugieren mit 10 000 U/min in 10 min ausgefällt und in der überstehenden Kulturflüssigkeit die Isoamylase-Aktivität bestimmt. Die Zu-

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ii -

sammcnaetzung der Kulturmedien und die Ausbeute an Isoamylase sind in der !Tabelle angegeben. Die Trübung war bei 1Ofacher Verdünnung mit einer Wellenlänge von 610 rau gemessen.

Tabelle

Kohlenhydrat Salze

Trübung End- IsoamylasepH Aktivität

Einheit./ml

1% Maltose

0,1% Monp-Na-

glutamat

0,1% (O

HPO 0,1%

0,05% MgSO.. 7HO ^

0,519

1% Isomaltose	de sgl.	O,	605	5	,1	12
2% Malzextrakt	-	O,	120	,0	26
2% klebriges Reispulver	-	o,	658	,9	55

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Claims (1)

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   31. Mai 1968 SJ/Hu

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   Patentanspruch

   Verfahren zur Erzeugung von Isoamylase, dadurch gekennzeichnet, daß man von einer Kohlenhydrate und Stickstoffverbindungen enthaltenden Kultur von Pseudomonas amyloderamosa ausgeht, und in dieser in an sich bekannter Weise das Enzym anreichert.

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