DE3112539A1

DE3112539A1 - Verfahren zur auftrennung von waessrigen proteingemischen

Info

Publication number: DE3112539A1
Application number: DE19813112539
Authority: DE
Inventors: Surendar Mohan 02172 Watertown Mass. Jain
Original assignee: Ionics Inc
Current assignee: Veolia WTS Systems USA Inc
Priority date: 1980-10-16
Filing date: 1981-03-30
Publication date: 1982-05-27
Also published as: GB2085446A; FR2492270B2; FR2492270A2; US4321192A; IT1142464B; IT8148007A0; JPS5772916A; CA1142175A; GB2085446B

Description

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IONICS, Incorporated

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Beschreibung

Verfahren zur Auftrennung von wäßrigen Proteingemischen

•Biologische.Flüssigkeiten wie Blutplasma oder-serum," Molke, Urin usw. enthalten ein Gemisch von verschiedenen Proteinen. Ζ* B. enthält Blutplasma Albumin (3,5 - 4,5 g/100 ml, MG 66 000), Fibrinogen (0,20 - 0,45 g/100 ml, MG 340 000), oL -Globuline ( 0,4 - 1,0 g/100 ml), β -Globuline (0,8 - 1,8 g/100 ml, MG 160 00), IgM (0,06 - 0,25 g/100 ml, MG 950 000) usw. (Frank · W. Putnam, The Trace'Components of Plasma, An Overview). Die Immunoglobuline (Ig*s) sind sehr wichtig, da sie an den Schutz- und Abwehrmechanismen gegenüber Infektionskrankheiten (infektiöse Organismen), beteiligt sind. Klinische Erkrankungen,

sind/
die gekennzeichnet durch ein Ungleichgewicht dieser Systeme von Proteinen, z, B. entweder in der Fähigkeit eindringende Organismen zu erkennen oder körpereigene (indigenous) Proteine oder Nucleinsäuren zu erkennen, haben das grundlegende Verständnis der klinischen Aspekte der "Wissenschaft von der Immunität gefördert. Es ist bekannt, daß abnorme immunologische .Reaktionen ein weites Spektrum von Erkrankungen hervorrufen. Beispiele für Erkrankungen, von denen bekannt ist, daß sie mit Immunkomplexreaktionen verbunden sind, sind z. B. Serumkrankheit, Glomerulonephritis und Myasthenia gravis. Die Plasmapherese (Viederzuführung von Blut nach Waschung in physiologischer Kochsalzlösung unter Ausscheiden des Blutplasmas) ist ein Verfahren, das angewandt wird, um den immuno- '

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pathologischen Prozeß, der mit zirkulierenden hurooralen Antikörpern und/oder Immunkonplexen des Plasmas verbunden ist, zu beschränken, günstig zu beeinflussen oder zu unterbrechen (Glassman, Rationale for Plasmapheresis, "Plasma Therapy" Bd. 1 Nr. 1, S. 13 (1979)).

Ein bekanntes Verfahren besteht darin, ungefähr k Liter Blut innerhalb eines Zeitraums von 2-4 Stunden eier Plasmapherese zu unterwerfen durch Zentrifugieren oder Kreuzfiltration (cross-flow Filtration). Das auf diese Weise von dem Patienten entfernte Blutplasma wird üblicher Weise verworfen und durch Albumin und entweder physiologische Kochsalzlösung oder Ringer's Lösung versetzt, um das Gleichgewicht zwischen Proteinen, Elektrolyten und Wasser wiederherzustellen. Das ist ein aufwendiges Verfahren. Bei einem anderen Verfahren wird der Ersatz des entfernten Plasmas erreicht, indem frisches oder gefrorenes (und aufgetautes ) Plasma (pool plasma) zu^geführt wird, und obwohl diese Methode weniger aufwendig ist, besteht hier die Gefahr der übertragung von Hep atit is viren auf den Patienten. Mit Hilfe, des erfindungsgemäßen Verfahrens (das als Immunopherese bezeichnet wird) werden diese Probleme überwunden, indem

Euglobuline oder Euglobulin-Antigen-Komplexe, die die Erkrankung verursachen oder durch sie entstanden sind, selektiv entfernt und gleichzeitig der Hauptanteil von Albumin, Elektrolyt (Salz) und Wasser ersetzt, und so dem Patienten sein eigenes Plasma (im wesentlichen befreit von Ig oder Ig-Antigen-Komplex), das das entsprechende Protein enthält, wieder zuführt, ohne daß die Gefahr von Hepatitisübertragung besteht, da kein zusätzliches Albumin oder Spenderplasma erforderlich ist.

Der Antihämophile Faktor oder äntihämophiles Globulin (Faktor VIII, AHF oder AHG) ist einer der Bestandteile, die bei der Koagulation des Blutes eine Rolle spielten. Eine angeborene (erbliche) Störung der Blutkoagulation, nämlich Hämophilie,

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führt zu profusen Blutungen der Gelenke, Muskeln oder inneren Organe aufgrund einer geringen Verletzung. Diese Kraakheit scheint auf einem Mangel an spezifischen Plasmaproteinen AHF zu beruhen. Von dieser Krankheit betroffene Patienten müssen bereits nach kleinen Verletzungen häufig ärztlich behandelt werden. Wenn eine Operation erforderlich ist, wird die Gerinnungsanomalie ausgeglichen durch die Transfusion von frischem Plasma oder durch Injektion eines Faktor-VIII-Konzentrats, wobei das letztere Vorgehen bevorzugt ist, da hierdurch eine Hyperproteinamie und mögliche Nierendysfunktion, die bei hohen TransfusionsVolumina auftreten kann, vermieden wird.

Bekannte Verfahren zur Bildung bzw.' Gewinnung von AHP bestehen z. B. darin, daß man von Plasma (pool-plasma) ausgeht, in der Kälte einen Niederschlag (Kryopräzipitat) bildet, den Niederschlag, der hauptsächlich aus einem Gemisch aus AHF und Fibrinogen besteht, abzentrifugiert, das Fibrinogen entfernt und durch Lyq±iilisieren ein AHF-Konzentrat bildet. Diese Verfahren besitzen den Nachteil, daß sie lang und mühsam sind und die Gefahr der Übertragung von Hepatitis bestehti da Spenderplasma verwendet werden muß. Auch durch das Vorhandensein von Fibrinogen als Verunreinigung wird es schwierig, die AHF-Konzentrate in Lösung zu bringen. Außerdem tritt aufgrund der Tatsache, daß zwischen der Blutspende und der Anwendung des Plasmas einige Tage vergehen, ein beträchtlicher Verlust an AHF-Aktivität auf. Eine AHF-Einheit ist definiert als die in 1 ml eines durchschnittlichen, normalen, menschlichen Serums, das weniger als 1 Stunde alt ist, vorhandene Aktivität (100 % AHF-Gehalt). So kann der Verlust an Aktivität in flüssigem Plasma außerhalb des Körpers nach 6 Stunden bis zu 80 % betragen. Ein- schnelles Verfahren zur Verarbeitung von AHF würde diesen Aktivitätsverlust verhindern. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung werden diese Probleme überwunden, da hier ein geeignetes (on-line real-time) Verfahren vor-

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liegt. Daher kann die Gewinnung an AHF bis zu 4 bis 5 Mal so hoch sein, wie es mit den zur Zeit angewandten Verfahren, bei uenen lange Zeiten vergehen, möglich ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ist anwendbar auf kleinere Mengen von gesammelten Blut. 2. B. können 2-3 hepatitisfreie Familienmitglieder des an Hämophilie Erkrankten Plasma spenden und das AHF kann sofort innerhalb kurzer Zeit gewonnen werden, wobei man ein hepatitisfreies AHF mit sehr hoher Aktivität erhält. Die erfindungsgemäßen on-line Verfahren können auch angewandt werden zur Gewinnung von Faktor VIII von Spendern während der Plasmapherese.

Die erfindungsgemäß angewandten grundlegenden Techniken, d.h. die Plasmapherese, das Aussalzen und die Dialyse führen, wenn sie in Kombination in neuartiger Weise,wie hier beschrieben wird, angewandt werden, zu Synergismus, d.h. die Wirksamkeit jeder Stufe und der Kombination der einzelnen Stufen wird in unerwarteter Weise verbessert und sie werden außerordentlich gut geeignet, besonders für in situ therapeutische Anwendungen für Plasmapherese-Patienten, bei denen die Entfernung von Ig's oder ihrer Komplexe erforderlich ist.

Das erfindungsgemäße- Verfahren wird für die Verwendung von Plasmaproteinen als bevorzugte Beispiele beschrieben, es kann jedoch auch auf andere biologische Flüssigkeiten oder Proteine angewandt werden. Diese Verfahren der Proteintrennung können als sehr wirksames Mittel in der Hand des Proteinchemiker dienen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auftrennung von Proteingemischen in Proteinfraktionen mit deutlich unterscheidbaren Zusammensetzungen, wie sie durch bekannte physikalische und chemische Verfahren bestimmt werden können. Die Erfindung umfaßt die Kombination der Plasmapherese; Aussalzen von Proteinen und anschließende Dialyse zur Entfernung und/oder Wiederherstellung des Plasmagleichgewichts. Dieses Verfahren ist geeignet wenn die Therapie

die Entfernung von Immunoglobulinen und ihren Komplexen erfordert und die Rückführung im wesentlichen des gesamten (und nur des) Albumins des Patienten. Hierdurch wird die Gefahr der Hepatitisübertragung· vermieden und .die Behandlung wesentlich verbilligt, da Albuminersatz sehr teuer ist.

Nach der Befreiung des Bluts von geformten Elementen (.FE) wird das Aussalzmittel zu dem entstandenen Plasma unter konstantem Rühren in Form einer stark konzentrierten Salzlösung zugegeben. Die Salzzugabe führt dazu, daß verschiedene Proteine₍eines nach dem anderen₍mit zunehmender Ionenstärke (Salzkonzentration) ausfallen. Das Aussalzmittel wirkt offensichtlich durch Verringerung der Aktivität des Wassers in dem Lösungsmittelgemisch, wodurch die hydrophilen Gruppen des Proteinmoleküls dehydrätisiert werden, was zu einer Ausfällung des Proteins führt. Die zugesetzte Salzmenge hängt von den speziellen zu entfernenden Proteinen ab. So wird, wenn eine 50 bis 60 %±ge Entfernung der Glo.bulinfraktion erwünscht ist, das Aussalzmittel wie Na₂SO^ bis zu einer Natriumsulfat-Normalität des Plasmas von ungefähr 1 bis 1,3 zugesetzt. Die bei dem Aussalzen auftretende Trübung bzw. die die Trübung verursachenden Feststoffe werden z.B. durch Abfiltrieren entfernt. Die verbleibende Lösung wird dann gegen einen geeigneten Puffer dialysiert, um das. zugesetzte Na₂SO^-SaIz zu entfernen und dann nach Wiederzugabe der vorher entfernten Blutkörperchen oder geformten Elemente dem Patienten wieder zugeführt. Ein solches Verfahren einer Kombination von Plasmapherese und Aussalzen mit anschließender Wiederherstellung der normalen Elektrolytkonzentration ist für einen therapeutischen Plasmaaustausch geeignet, wobei die Notwendigkeit Albumin oder frisches oder gefrorenes Spenderplasma zu verwenden,überflüssig wird. Die Entfernung von Immunoglobulinen durch Aussalzen wird hier;als Immunpherese bezeichnete

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Dialyse wird verbreitet auf dem Gebiet der Biologie angewandt zum Entsalzen oder Zusetzen von Elektrolyten. Die Dialyse ist ein Membran-Trenn-Verfahren, bei dem die treibende Kraft ein Gradient des chemischen Potentials z.B. ein Konzentrations- oder Aktivitätsgradient der gelösten Stoffe über die die beiden Lösungen trennende Membran ist. Die Membran ist für Wasser und niedermolekulare gelöste Stoffe permeabel. Derartige gelöste Stoffe diffundieren durch die Membran hindurch bis der Konzentrationsgradient über die Membran vernachlässigbar gering ist. So kann die Dialyse ein wirksames Verfahren darstellen in Situationen wo hohe Konzentrationsgradienten auftreten. Die Hauptanwendung der Dialyse liegt auf dem Gebiet der · Nierendialyse., wo niedermolekulare gelöste Stoffe wie Harnstoff und bestimmte Salze entfernt werden. Derartige Dialysesysteme sind bekannt (z.B. US-PS 4192 748, 4 191 646, 4 213 859, 3 960 730 und andere). Ihre Anwendung im Zusammenhang mit dem Aussalzen von Immunglobulinen und der Plasmapherese ist jedoch vollständig neu. Der durch die Kombination dieser Verfahren auftretende Synergismus erhöht die Wirksamkeit dieser Kombination besonders, wenn sie auf die therapeutische Anwendung der Immunpherese angewandt wird.

In Fig. 1 ist ein erfindungsgemäßes Immunpherese-Verfahren angegeben. In dieser Zeichnung ist das angegebene Proteingemisch Blut. Das Verfahren kann jedoch ebensogut auf andere Proteingemische angewandt werden. Zunächst wird zu dem Patienten-Blut (1) ein Antikoagulans zugesetzt und von dem das Antikoagulans enthaltenden Blut werden die geformten Elemente (FE), die im wesentlichen aus roten Blutkörperchen, weißen Blutkörperchen und Plättchen bestehen, entfernt (3) mit Hilfe eines Membranfilters oder einer Zentrifuge (2) wodurch ein klarer Plasmastrom (15) entsteht. Eine konzentrierte Lösung eines Auaealzmittels (18) wie Natriumsulfat wird direkt unter Mischen zu dem Plasma

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zugesetzt. Wenn eine ungefähr 50%ige Entfernung von IgG erwünscht ist, wird Salz zugesetzt bis das Plasma ungefähr 1,1 "bis 1,2 η an Na₂SO^ wird. Wenn eine größere Menge (%) IgG entfernt werden soll und/oder wenn die Entfernung von IgM und IgA erwünscht ist, sollte die zugesetzte Salzmenge größer sein«

Im folgenden Beispiel wird diese Fraktionierung beschrieben»

Beispiel 1

Eine 6 η Na₂SO^Lösung wurde nach und nach unter konstantem Rühren zu 300 ml Plasma mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 10 bis 15 ml/min zugegeben. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden kleine Proben des Plasmas entnommen und der Proteingehalt und die Salzkonzentration bestimmt. Die Ergebnisse, die die prozentuale Proteinentfernung (d.h. Albumin und Ig's) als Punktion der Salznormalität in der Plasmalösung zeigen, sind in Fig. 2 angegeben. Es ist festzustellen, daß bei einer· Salzkonzentration von 2 η im wesentlichen das gesamte IgG aus dem Plasma entfernt ist, zusammen mit einer 25%igen Entfernung (Verlust) von Albumin.

Die durch die Salzzugabe entstandene Trübung bzw. die die Trübung verursachenden Feststoffe (IgVs) werden entfernt (17) mit Hilfe einer Zentrifuge oder eines Filters (7). Diese Entfernung kann'kombiniert werden mit Kühlen (nicht gezeigt)_y um eine schnellere Entfernung der Trübung zu erleichtern. Die Zugabe des Aussalzmittels .wird vorzugsweise bei physiologischer Temperatur von 37°C durchgeführt, kann jedoch auch bei Raumtemperatur oder .darunter durchgeführt werden, unter geeigneter Auswahl des Aussalzmittels.

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Die nach Entfernung der ausgefällten Ig¹S und ihrer Komplexe verbleibende Lösung (8) ist reich an Albumin aber enthält eine hohe Konzentration an Ausseizmittel, die durch eine Dialysevorrichtung (21) entfernt wird. Die Albuminlösung wird gegen einen geeigneten Puffer (23) dialysiert z.B. PBS (0,1 η NaCl, 0,1 η K₂HPO^). Die Dialysestufe kann aus einer Anfangsdialyse (21) (zur Verringerung des Na₂SO^-Gehalts auf geringe Vierte) und einer Enddialyse (2^) bestehen, um daa Elektrolytgleichgewicht für die Infusion wieder herzustellen. Da die Aufgabe der Anfan^sdialyse darin besteht, das überschüssige Salz zu entfernen aber das Albumin in der Lösung zu halten, kann die Dialysemembran wie Cellulose so gewählt werden, daß eine hohe Entfernung des Ausslzmittels eintritt. Das Aussalzmittel kann aus einem Gemisch von Salzen z.B. Na₂SO^ und NaCl bestehen, wie in dem..folgenden Beispiel gezeigt wird.

Beispiel 2

Ein Aussalzmittel,bestehend aus einem Gemisch aus 6 η Na₂SO^- und 6 η NaCl-Lösung wurde zu 300 ml Plasma auf die in dem vorigen Beispiel angegebene Weise zugesetzt. Die Ergebnisse dieser Proteinfraktionierung sind in Form einer Kurve in Fig. 3 angegeben. Es ist zu bemerken, daß bei einer Salzkonzentration in der Lösung (supernatant) von ungefähr 4 η eine ungefähr 90%ige Entfernung von IgG eiriritt mit einer Entfernung (Verlust) von ungefähr 15 % Albumin. Beim Vergleich dieser Ergebnisse mit denjenigen des Beispiels 1 ist festzustellen, daß eine höhere Salzkonzentration erforderlich ist, um die Ig»s zu entfernen, wenn ein Salzgemisch angewandt wird, obwohl auch der Verlust an Albumin geringer zu sein scheint. Die Auswahl des Aussalzmittels hängt von der jeweiligen gewünschten Zurückhaltung oder Entfernung eines speziellen Proteins oder einer Gruppe von Proteinen ab. Beispiele für andere Aussalzmittel, die erfindungsgemäBe angewandt werden

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können sind z.B. (Na^^SO^, K₂SO^ und Natriumeitrat, Kaliumacetat, MgSO^, NaCl usw. sowie deren Gemische.

Nach Entfernung der Aussalzmittel durch Dialyse (21) auf eine angemessene Konzentration wird die entsalzte Proteinlösung (8)(hauptsächlich Albumin) mit dem entsprechenden Elektrolyten durch direkte Salzzugabe oder durch Dialyse (24) wieder ergänzt, mit den geformten Blutbestandteilen (3) vermischt und dann dem Patienten als wiederaufbereitetes Blut· (12) verabreicht.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann angewandt werden als on-line-Verfähren wenn ein ausreichend großer Dialysebereich mit einer Membran zur Salzentfernung vorgesehen ist. Das Verfahren kann ferner leicht angewandt werden als billiges off-line-Verfahren. So werden während der ersten Plasmapheresebehandlung ungefähr 3 1. Patientenplasma auf übliche Weise ersetzt, d.h. durch 1,5 1 5%ige Albuminlösung und 1,5 1 Salzlösung. Während der zweiten Plasmapheresebehandlung wird ausreichend Albumin aus den 3 1 Plasma von der ersten Plasmapheresebehandlung durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnen. Dieses Albumin von der ersten Behandlung wird angewandt, um das zweite Volumen Plasma zu ersetzen und so wird bei jeder folgenden Behandlung das vorher regenerierte Albumin anstelle von zusätzlichem Albumin von fremden Quellen verwendet. Wenn es sich um das eigene Albumin des Patienten handelt, besteht bei diesem Verfahren nicht die Gefahr der Hepatitis übertragung.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Auftrennung von wäßrigen Proteingemischen in Fraktionen mit deutlich unterschiedlichen Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß man im wesentlichen die gesamten eine Trübung verursachenden Feststoffe von dem Proteingemisch entfernt, anschließend eine Lösung eines Aussalzmittels in einer Menge zwischen ungefähr 2 "bis 30 Vol-% bezogen auf das Proteingemisch zusetzt, um die Ionenstärke des Gemisches ausreichend zu verändern, daß ein oder mehrere Proteine in dem Gemisch zumindest teilweise destabilisiert werden und ausfallen bzw. eine Trübung bilden, anschließend im wesentlichen alle die Trübung verursachenden Feststoffe entfernt, während die Temperatur des Gemisches während dieser Trennung im Bereich von ungefähr O bis 40⁰C gehalten wird_;und anschließend das Aussalzmittel durch Dialyse entfernt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η ή zeichnet , daß die Ionenstärke des Gemisches verändert wird, indem man die Ionen-konzentration um mindestens 10 % erhöht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man die Ionenstärke des Gemisches verändert, indem man den pH~Wert im wesentlichen auf den isoelektrischen Punkt mindestens eines der Proteine hin verändert.

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4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ionenstärke des Gemisches verändert, indem man im wesentlichen die Konzentration an einwertigen und/oder nicht einwertigen Ionen erhöht.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die die Trübung verursachenden Feststoffe nach der Abtrennung wieder in Lösung bringt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man von einem wäßrigen Proteingemisch ausgeht, das Plasmaproteine enthält, und davon als Niederschlag bzw. Trübung verursachende Feststoffe Fibrinogen und Antihämophilen Faktor abtrennt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß man von eine» wäßrigen Proteingemisch, ausgeht, das im wesentlichen nicht denaturierte Plasmaproteine enthält, und davon Immunoglobuline abtrennt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das abgetrennte Fibrinogen und den Antihämophilen Faktor wieder in Lösung bringt und durch Zusammenbringen mit Körnern eines Ionenaustauscherharzes und/oder Geldurchdrinnungskörnern in eine/ Fibrinogenieiehe und eine an Antihämophilem Faktor reiche Fraktion trennt.

9. Verfahren nach Anspruch^ 1 bis, 5, dadurch g e k e η η -

als ιrubung zeichnet., daß die/abgetrennten Feststoffe Albumin enthalten.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die abgetrennten Feststoffe wieder in Lösung bringt und als Plasmastreckmittel verwendet.

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11. Verfahren nach Anspruch 1 "bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß man zu einem wäßrigen Probeingemisch, das Plasmaproteine enthält, lösliche Salze aus der Gruppe der Sulfate, Citrate, Phosphate, Chloride, Acetate und löslichen Gemische dieser Salze zugibt und die entstehende Trübung,die im wesentlichen nicht Albumin-Proteine enthält abtrennt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß man das Aussalzmittel zugibt, indem man das von Feststoffen befreite Gemisch durch eine Dialysevorrichtung leitet, die zumindest zwei gegenüberliegende Dialysemembranen umfaßt, die eine Durchflußkammer bilden.