DE2404041A1

DE2404041A1 - Blut-fraktionierungsverfahren

Info

Publication number: DE2404041A1
Application number: DE2404041A
Authority: DE
Inventors: Walter C Kehm
Original assignee: Baxter Laboratories Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1973-01-30
Filing date: 1974-01-29
Publication date: 1974-08-01
Also published as: ES422566A1; BE809088A; IT1054150B; US4073886A; ZA739603B; NL7400230A; AU6495574A; IL43925A0; CA984747A; FR2215240A1; JPS49108216A

Description

PATENTANWÄLTE

Dipl.-Ing. P. WIRTH ■ Dr. V. SCHMIED-KOWARZIK D!pl.-lng. G. DANNENBERG · Dr. P. WEINHOLD · Dr. D. GUDEL

281134 6 FRANKFURTAM MAIN

TELEFON (06115

287014 GR. ESCHENHEIMER STRASSE 39

28. Januar 197A

Wd/Eh

BAXTER LABORATORIES,!^. Morton Grove, Illinois U.S.A. ~~~

Blut-Fraktionierungsverfahren

Die vorliegende Erfindung "betrifft ein Yerfahren zum Trennen proteinartiger und lipider Materialien von Blutserum und Blutplasma.

Blut besteht aus einer Flüssigkeit, die die roten und weissen Blutkörperchen sowie die Blutplättchen enthält. Das Plasma oder der flüssige Teil des Blutes enthält etwa 90 ψ Wasser und 10 io Feststoffe. Diese Feststoffe bestehen im wesentlichen aus etwa 7 bis 9 $ Proteinen, 1 $> Salzen und der Rest aus lipiden bzw. lipoider

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Stoffen und anderen Substanzen. Frisch entnommenes Blut gerinnt innerhalb weniger Minuten. Die Bildung des Gerinnsels ist ein komplizierter Vorgang, bei dem das Protein, Fibrinogen, in unlösliches Fibrin umgewandelt wird. Blutserum ist Plasma, aus dem dieses Fibrin entfernt wurde.

Die Fraktionierung von Blutplasma und -serum sowie die Verwendung der getrennten Blutkomponenten im Laboratorium und für klinische Zwecke ist heutzutage allgemein üblich. Beispiele für Komponenten, die vom Blut getrennt werden, sind Albumin, eC,-Globuline, oCg-Globuline, ß-Globuline, ψ -Globuline, Fibrinogen, Prothrombin, antihämophiles Globulin, Lipoproteine, Thromboplastin, Komplementär-Komponenten, Isοagglutinine, Cholesterin, Phosphatide und zahlreiche Enzyme, wie Amylase, Fibrinolysin, Esterase und Phosphatase. Es sind bereits viele Verfahren zur Trennung und Reinigung der genannten und anderer Blutkomponenten bekannt. Es wird dabei im allgemeinen eines oder mehrere der nachstehenden Verfahren angewendet:

(a) fraktionierte Ausfällung mit Arrsiaoniumsulfat und ähnlichen Salzen;

(b) Organische Lösungsmittel-Ausfällung mit kaltem Äthanol oder

Aceton und anderen ähnlichen Alkoholen und Ketonen;

(c) selektive Adsorption an Calciumphosphat-Gelen oder mit Bariumsulfat;

(d) isoelektrische Ausfällung durch Regulierung des pH-Wertes bis zu dem Punkt, an dem das jeweilige Protein keine Nettoladung aufweist; und

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(e) Chromatographie unter Verwendung von Adsorptionsmitteln, wie GM- oder DEAB-Zellulose, oder durch "Sephadex"-Gelfiltration.

Bei anderen, neueren Verfahren zur selektiven Fraktionierung und Reinigung von Blutproteinen werden Aminosäuren, wie Glycin und ß—Alanin, wasserlösliche organische Polymerisate, wie Polyäthylenglykol und Polypropylenglykol, sowie wasser-unlösliche PoIyelektrolyt-Polymerisate, die basische Aminogruppen, z.B. die Dimethylaminopropylimidgruppe, enthalten, verwendet.

Von diesen, bereits angewendeten Polymerisaten haben sich die Polyäthylenglykole, die von.Albertsson in "Partition of Cell Particles and Macromoleeules" (John Wiley & Sons, Inc., Stockholm und Hew York, 1960) allgemein als Blutprotein-Ausfällungsmittel und weiterhin von Poison et al in "Biochim. Biophys. Acta 82", Seiten 463 bis 475 (1964), sowie in der USA-Patentschrift 3 415 804 beschrieben werden, als besonders brauchbar für Blut-3Praktionierungsverfahren erwiesen. Obgleich diese Polymerisate eine gute Trennung der Komponenten bewirken und im wesentlichen für Menschen nicht toxisch sind, besitzen sie jedoch nicixt die in der Praxis gewünschte optimale löslichkeit und Stabilität, und vorzugsweise sollte ein möglichst grosser Teil des Polymerisates aus der abgetrennten Fraktion entfernt werden, "bevor diese Menschen verabreicht wird.

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Die vorliegende Erfindung schafft nun ein neues und verbessertes Verfahren zum Trennen proteinartiger und lipider Materialien von Blutserum und Plasma. Dieses Verfahren besteht in der selektiven Ausfällung mit bestimmten Blockmischpolymerisaten, die Äthylenoxyd-Propylenglykol-Kondensationsprodukte sind. Die Abtrennung der Blutkomponenten nit Hilfe dieser Blockmischpolymerisate hat sich als wesentlich besser erwiesen als die Verfahren unter Verwendung von polymerem Polyäthylenglykol. Diese Verbesserungen bestehen in erhöhter Ausbeute und höherer Reinheit der ausgefällten Proteinsubstanzen, grösserer Klarheit und Stabilität der erhaltenen überstehenden flüssigen Serumprodukte und rascherer Trennung der gewünschten Komponenten.

Die erfindungsgemässe Verwendung dieser Blockmischpolymerisate besitzt ausserdem den Vorzug, dass es nicht nur unnötig ist, praktisch das gesamte Polymerisat aus der abgetrennten Blutfraktion zu entfernen, bevor diese bei Mensehen angewendet werden kann, sondern dass es sogar erwünscht ist, einen kleinen Teil des Polymerisates in der Fraktion zurückzuhalten. Die Anwesenheit einer gewissen Menge des Blockmischpolymerisates, z.B. 1% bis 2 % oder sogar der Bruchteil eines Prozentes, erleichtert die Aufnahme des verabreichten Blutproteins und bewirkt eine raschere Assimilierung innerhalb des Körpers und/oder Organs.

Es wird angenommen, dass die erwähnte Wirksamkeit der erfindungsgemässen Blockmischpolymerisate wenigstens zum Teil auf der

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Bildung von Assoziations-Komplexen mit den Blutproteinen durch Wasserstoffbindung beruht, die eine Hydroxylgruppe des Glykol-Anteils in dem Polymerisat und ein fest gebundenes ("non-labile") Wasserstoffatom des Proteins umfasst.

Die erfindungsgemäss verwendeten Äthylenoxyd-Propylenglykol-Kondensationsprodukte können hergestellt werden, indem man Äthylenoxyd mit Polyoxypropylen kondensiert. Eine genaue Beschreibung der Herstellung dieser Blockmischpolymerisate ist der USA-Patentschrift 2 674 619 zu entnehmen. Die Blockmischpolymerisate können durch die folgende Strukturformel dargestellt werden:

HO(CH₉CH₉O)₀(CHCH₉O), (CH₉CH₉O) H

C. C. ςΧ χ C. VJ C. C. C

Pur die erfindungsgemässen Zwecke ist es erwünscht, dass diese Blockmischpolymerisate wenigstens 50 % Äthylenoxyd im Molekül 'aufweisen und einen hydrophoben Polyoxypropylen-Anteil mit einem Molekulargewicht von wenigstens 900 und vorzugsweise zwischen 950 und 1750 enthalten. Materialien, die weniger als 50 fo Äthylenoxyd enthalten, sind zu toxisch, und Produkte, bei denen das Molekulargewicht des hydrophoben Anteils weniger als 900 beträgt, besitzen nicht die gewünschte Löslichkeit. In dieser Hinsicht sind die erfindungsgemäss verwendeten Block mischpolymerisate den Materialien, die in den USA-Patentschriften 3 450 502, 3 577 522 und 3 590 125 als Blutplasma-Ersatz

* = "base"

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und zum Inbetriebsetzen einer Herz-Lungen-Maschine beschrieben werden, ähnlich.

Beispiele für geeignete Blockmischpolymerisate sind die "PLUROIiIC"-Polyöle (Wyandotte Chemicals Corp.) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 2000 bis etwa 16 000, wie F-38, das etwa 80 Jo hydrophile Polyoxyäthylen-Einheiten im Molekül aufweist und dessen hydrophobe Polyoxypropylen-Anteil ein Molekulargev/icht von 950 besitzt, sowie F-68, das ebenfalls 80 $> hydrophile Polyoxyäthylen-Einheiten aufweist, wobei das -Molekulargewicht des hydrophoben Anteils jedoch 1750 beträgt.Das durchschnittliche Molekulargewicht dieser beiden ¹¹PLURONIC"-Polyole ist 4750 bezw. 8750. Eine genaue Beschreibung dieser Polyole ist dem Bericht der Wyandotte Chemicals Corp., "The Pluronic Grid", 6. Ausgabe, zu entnehmen.

Die bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwendete Menge an Blockmischpolymerisat kann variieren und hängt zum Teil von der jeweils aus dem Blutplasma oder -serum auszufällenden proteinartigen oder lipiden Fraktion ab. Im allgemeinen ist eine Menge von etwa 1 $> bis etwa 35 $ Mischpolymerisat — bezogen auf das Gewicht pro Volumen des Plasmas oder Serums — ausreichend, um die Fraktion auszufällen. Relativ kleine Mengen an Bloekmischpolymerisat, z.-B. etwa 1 $ bis etwa 20 $, werden im allgemeinen zum Fraktionieren bestimmter Proteinmaterialien für Laboratoriumszwecke oder zur klinischen Verwendung eingesetzt,

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wie z.B. die verschiedenen Blutplasma-Faktoren. Höhere Konzentrationen des Blockmischpolymerisates, z.B. mehr als etwa 20 % bis etwa 30 56, werden bevorzugt, wenn praktisch alle unerwünschten proteinartigen und feinzerteilten lipiden Stoffe aus dem Blutplasma oder -serum entfernt v/erden sollen. Dies wird erreicht, indem man ein Produkt bei dieser Konzentration des Blockmischpolymerisates ausfällt, das von dein genannten lipiden* Material abgetrennt werden kann,welches löslich ist und in der überstehenden Flüssigkeit zurückbleibt. Die Ausfällung kann dann erneut gelöst werden und bildet ein kristall-klares Serum.

Die Produktausfällung kann mittels einer Reihe von Stufen erfolgen, wobei die Konzentra-tion des Blockmischpolymerisates jeweils auf die, zum Fraktionieren einer Reihe von gewünschten

Komponenten aus dem ursprünglichen Blutserum oder -plasma auf verschiedene Werte eingestellt wird.Die Abtrennung der gewünschten Komponenten aus jeder beliebigen Stufe erfolgt dann mittels

bekannter Verfahren, z.B. durch Filtrieren, Zentrifugieren, Dekantieren und dgl.

Die Ausfällung kann bei Zimmertemperatur (etwa 25°) durchgeführt werden; im allgemeinen werden jedoch kältere Temperaturen bevorzugt, da proteinartige Materialien bekanntlich einer Wärme-Denaturierung unterliegen und die optimale Wirksamkeit des proteinartigen Materials bei Temperaturen von etwa 4° bis etwa 25 beibehalten wird.

* "lipid particulate"

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Die Wiederauflösung der Ausfällung kann erfolgen,indem man sie mit einem verträglichen Medium,im allgemeinen einem physiologisch brauchbaren Medium,wie z.B. Wasser,Kochsalzlösung,citrathaltige Kochsalzlösung,glycincitrat-haltige Kochsalzlösung oder ähnlichen wässrigen Medien, in jeder beliebigen Menge mischt, wobei die genaue Menge von der gewünschten Konzentration der abgetrennten Blutkomponenten in der Mischung abhängt.

Die abgetrennte Blutkomponente kann auch getrocknet werden, z.B. durch Gefriertrocknen, Lyophilisierung und dgl.; hierdurch wird ein lagerungsbeständiges Produkt erhalten, das vor der Verwendung in die ursprüngliche Form gebracht werden kann.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch mit anderen Blutfraktionierungsverfahren kombiniert werden, z.B. mit den oben beschriebenen bekannten Verfahren. In einigen Fällen ist es zweckmässig, die Blockmischpolymerisate zusammen mit bestimmten anderen Substanzen anzuwenden, die als Ausfällungs- oder Absorptionsmittel bekannt sind. Besonders vorteilhaft ist die Kombination von Glycin, Tricalciumphosphat und Diatomeenerde mit diesen Blockmischpolymerisaten. Bei welcher Stufe des Trennverfahrens und in welcher Menge diese anderen Mittel eingesetzt werden, hängt zum Teil von dem auszufällenden proteinartigen oder lipiden Material ab. Im allgemeinen sind in diesen Fällen etwa 0,5 $ bis 2 $ Tricalciumphosphat, etwa 0,1 i» bis 0,5 % Diatomeenerde und etwa 2 bis 3 Mol Glycin zweckmäßig.

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Andere Ausfällungsmittel, z.B. Methanol, Äthanol, Äther und PoIyäthylenglykol, sowie andere Absorptionsmittel, wie Aluminiumhydroxyd oder dgl., können ebenfalls bei dem erfindungsgemässen Verfahren mitverwendet werden.

Die nachstehenden Beispiele erläutern das erfindungsgemässe Verfahren, insbesondere im Hinblick auf die Herstellung von antihämophilem Globulin und Prothrombin-Gerinnungsfaktoren, Thromboplastin-Kontrollen, klaren Seren für Organ-Perfusate und Seren zur Blutgruppen-Bestimmung und -Einordnung.

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Beispiel 1: Herstellung von Plasma zur Verwendung als Organ-Perfusionsflüssigkeit

Plasma, das in einem Antikoagulierungsmittel gesammelt worden war, wurde "bei einem pH-Wert von 6,88 und einer Temperatur von 8° innerhalb von 30 bis 45 Minuten mit Glycin bis zu einer Molarität von 2 bis 3 an Glycin gemischt. Die so gebildete Ausfüllung wurde verworfen und die zurückbleibende überstehende Flüssigkeit in einem Verhältnis 1 : 1 mit normer Kochsalzlösung (0,85 %±ge NaCl-Lösung) verdünnt.

Die Mischung wurde dann bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,0 mit mehr als 20 $> bis etwa 30 # (Gew./Vol.) "PLURONIC" F-38 versetzt lind 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und die zurückbleibende Ausfällung in einer solchen Menge normaler Kochsalzlösung gelöst, bis etwa das ursprüngliche Plasma-Volumen erreicht wurde. Zu dieser Lösung wurden 0,5 ^ (Gew./Vol.) !Dicalciumphosphat bei einem pH-Wert von 7,2 gegeben. Die Suspension wurde 15 bis 60 Minuten bei Zimmertemperatur (25 ) gemischt. Die so erhaltene Ausfällung wurde verworfen und die überstehende Flüssigkeit zurückbehalten. In die überstehende Flüssigkeit wurde Natriumcitrat bis zu einer Konzentration von 0,02 Mol gegeben. Der pH-Wert wurde auf 7,5 eingestellt und die Flüssigkeit dann 24 bis 120 Stunden bei einer Temperatur von 37° wärmebehandelt, bis die Konzentration des Gerinnungsfaktors V (Proaccelerin) auf etwa 0 # gesunken war. Dann wurden 0,15 fi (Gew./Vol.) "CELITE"-Diatomeenerde-Filterhilfe zugegeben und 10 Minuten bei Zimmertemperatur untergemischt. Die so erhaltene Ausfällung wurde verworfen und die zurückbleibende überstehende Flüssigkeit steril durch, ein

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«MILLIPOBE"-Filter (0,3 JU,) filtriert. Die so erhaltene Flüssigkeit war lagerungsbeständig und kristall-klar und eignete sich ausgezeichnet als Organ-Perfusionsflüssigkeit, z.B. als Perfusionsflüssigkeit für !Tieren, Herz oder Lunge,

Bei diesem Beispiel wurden in der Glycin-Ausfällungsstufe praktisch der gesamte Paktor VIII und Fibrinogen, in der "PLUEOUIG"-F-38-Ausfällungsstutfe praktisch das gesamte Lipoprotein und das restliche Fibrinogen und in der Tricalciumphosphat-Absorptionsstufe die Faktoren II, YII, IX und X entfernt, durch Erwärmen auf 37° der Faktor Y inaktiviert und durch die "CELITE"-Absorptionsstufe die Faktoren XI und XII entfernt.

Beispiel 2; Herstellung eines Serums zur Blutgruppen-Bestimmung und -Einordnung

Das zu klärende Serum wurde zuerst mit soviel normaler Kochsalzlösung (0,85 $>ige MaCl-Lösung) verdünnt, dass die Proteinkonzentration etwa 2,5 bis 3,0 g pro 100 ecm betrug. Der pH-VYert wurde auf 6,5 bis 7,0 eingestellt, und dann wurden mehr als 20 $> bis etwa 30 % "PLTJRONIC" F-38 (vorzugsweise etwa 24 g/80 ecm) bei Zimmertemperatur zugegeben und 30 bis 60 Minuten vermischt. Die überstehende Flüssigkeit, die Lipoprotein und faserartige Materialien enthielt, wurde verworfen und die zurückbleibende Ausfällung mit normaler Kochsalzlösung auf etwa, das ursprüngliche Volumen des Serums verdünnt. Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt, und es wurden 0,5 # (Gew./YoI.) [Dicalciumphosphat in die gelöste Ausfällung gegeben. Die Suspension wurde 30 Minuten

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bei Zimmertemperatur gemischt. Dann wurde die Mischung zur Klärung des Serums zentrifugiert, und das so erhaltene überstehende Serum wurde sorgfältig von dem Komplex aus !Dicalciumphosphat und aktivierten Gerinnungsfaktoren abdekantiert; es eignete sich zur Verwendung in einer Blutbank. Dieses Verfahren kann zum Klären von (a) Anti-A- und Anti-B-Blutgruppenseren und (b) Anti-c- und Anti-e"-Bestimmungsseren für den Kochsalzröhrchen-Test verwendet werden

Beispiel 3: Herstellung eines AHF-Konzentrates zur klinischen Verwendung

Durch Fraktionierung mit "PLÜROITIG" F-38 wurde auf folgende Weise ein starkes Konzentrat des antihämophilen Faktors (AHF, Faktor VIII) hergestellt:

Es wurde Blut in einer 4 %igen Citrat-Antikoagulations-Lösung (1 Teil der 4 %igen Antikoagulationslösung plus 9 Teile Blut) gesammelt;Die Blutzellen wurden durch Zentrifugieren von dem Plasma getrennt;das so erhaltene Plasma wurde bei -25° eingefroren und bei 4° bis 5° aufgetaut;die so gewonnene Gefrier-Ausfälr lung wurde durch Zentrifugieren gesammelt.

Die Gefrier-Ausfällung wurde in 0,1 molarer glycincitrat-haltiger Kochsalzlösung (1 Teil 0,1-molares Natriumeitrat in 4 Gew.-Teilen 0,9 %±ger Kochsalzlösung bis zu 0,1 molarem Glycin) bei 22° bis 25° (Zimmertemperatur) gelöst und der pH-Wert mit 1-n-Essigsäure auf 6,5 gebracht.Darauf wurden 3,5% (Gew./Vol.)

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festes "PLURONIC" F-38 zugegeben, und die Suspension wurde 15 Minuten bei 22° bis 25° gemischt. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 5000 U/Min zentrifugiert, und die so erhaltene Ausfällung (Fibrinogen) wurde verworfen.

Die AHF-reiche überstehende flüssigkeit wurde gesammelt und ihr pH-Wert mit 1. UaOH auf 6,88 eingestellt. Es wurde festes "PLUHOIiIC" I*-38 bis zu einer Endkonzentration von 10 $ (Gew./ YoI.) zugegeben und die Suspension 15 Minuten bei 22° bis 25° gemischt. Die Mischung wurde 30 Minuten mit 5000 U/Min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen.

Die durch dieses zweite Zentrifugieren erhaltene AHF-Ausfällung wurde in citrathaltiger Kochsalzlösung (1 Teil 0,1 -Uatriumcitrat in 4 Gew.-Teilen 0,9 $iger Kochsalzlösung) gelöst, bis die endgültige Stärke 20 bis 30 AHF-Einheiten pro ecm betrug. Eine AHF-Einheit entspricht hierbei der AHF-Wirksamkeit in 1 ecm normalem Vorratsblutplasma. Das gelöste Produkt wurde steril durch ein."MILLIPORE"-Membranfilter mit Porengrössen von 0,3 AL*0,45 jU*und 0,2/^ filtriert.Die filtrierte Lösung wurde dann unter aseptischen Bedingungen in kleine Glasgefässe mit einem Fassungsvermögen von 10 ecm bis 30 ecm gefüllt, rasch eingefroren und lyophilisiert.Nach dem Auffüllen mit sterilem Wasser konnte , das Produkt Hämophilie-Patienten verabreicht werden, die unter Blutungen litten.

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Beispiel 4: Herstellung eines Prothrombin-Komplexes zur klinischen Verwendung

Durch Fraktionierung mit "PLUROIiIC" F-38 wurde auf folgende Weise ein wirksamer Prothrombin-Komplex (Faktor II plus andere Gerinnungsfaktoren) hergestellt:

Eine Cohn-Plasmafraktion IV-1 v/urde in normaler Kochsalzlösung (0,9 $ige NaCl-Lösung) bis zu einer Konzeriration von 10 $ (Gew./ YoI.) suspendiert und auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. Dann wurden 500 g tribasisehes Calciumphosphat zu 50 1 dieser Suspension der Fraktion IV-1 gegeben, und die Mischung wurde etwa 30 Minuten gerührt. Darauf v/urde die Suspension zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Die zurückbleibende Ausfällung wurde in 0,1m Trinatriumcitrat bis zu einem Volumen von 5 1 suspendiert. Die Suspension wurde zentrifugiert und die Ausfällung verworfen. Der pH-VTert der überstehenden Flüssigkeit wurde auf 7,2 eingestellt; dann wurde "PLUfiOMC" F-38 bis zu einer Konzentration von 5 ^ zugegeben und die Suspension etwa 15 Minuten gerührt. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren geklärt, wobei die überstehende Flüssigkeit zurückbehalten und die Ausfällung verworfen wurde. Der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit wurde dann auf 5,2 eingestellt, und es wurde "PLTJROIiIC" F-38 bis zu einer abschliessenden Konzentration von 20 $> zugegeben. Die Suspension wurde zentrifugiert und die gewonnene Ausfällung mit citrathaltiger Kochsalzlösung auf ein Volumen von 5 1 verdünnt. Heparin wurde in einer Menge von

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1 Einheit pro ecm zugesetzt, und das gelöste Produkt wurde steril durch ein "MILLIPORE"-Membranfilter mit Porengrössen von 0,3yU<, 0,45 H/ und 0,2 μ, filtriert. Die filtrierte Lösung wurde dann unter aseptischen Bedingungen in kleine Glasgefässe eines Passungsvermögens von 10 ecm bis 30 ecm gefüllt, rasch eingefroren und lyophilisiert. Nach dem Auffüllen mit sterilem Wasser konnte das Endprodukt Patienten verabreicht werden, die unter einem Mangel an Faktor II litten.

Bei den obigen Beispielen 3 und 4 wurde gefunden, dass die Abtrennung der gewünschten Protein-Ausfällung bei Verwendung von "PLURONIC" 1-38 wesentlich rascher eintrat als bei Verwendung von Polyäthylenglykol 4000 und dass die Ausbeute an Endprodukt erheblich höher war.

Beispiel 5t Herstellung einer Thromboplastin-Kontrolle aus Plasma

Frisches menschliches Blut wurde in einer 4 $igen Natriumcitrat-Antikoagulationslösung (1 Teil Antikogulationsmittel und 9 Teile Gesamtblut) gesammelt. Die so erhaltene Mischung wurde bei 5° und 3000 g zentrifugiert.Das so erhaltene überstehende Plasma wurde erneut in gleicher Y/eise zentrifugiert und dann bei -20 eingefroren. Das Plasma wurde bei Zimmertemperatur (etwa 25°) aufgetaut und mit 0,9 $iger physiologischer Kochsalzlösung (1 Teil Plasma und 1 Teil normale Kochsalzlösung) verdünnt. Der pH-Wert der so erhaltenen Lösung wurde mit InHCl auf 6,0 bis 7,0 gebracht. Dann wurde "PLTJRONIC" P-38 bis zu einer endgül-

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tigen Konzsntration von 30 $ zu der Lösung gegeben, und es bildete sich eine Ausfällung. Nach dem Zentrifugieren wurden überschüssiges Citrat und Spuren des thromboplastiseh aktiven Materials mit der überstehenden Flüssigkeit entfernt und verworfen.

Das so erhaltene Plasma wurde nun zur Herstellung verschiedener Thromboplastin-Kontrollen verwendet, mit denen Prothrombin-Zeitbestimmungen durchgeführt wurden, wie z.B. der einstufige Quick-Prothrombin-Zeittest oder der modifizierte Owren-Prοthrombin-Test, die in dem "Hyland Reference Manual of Coagulation Procedures" der Hyland Laboratories, Los Angeles, auf Seiten 10 bis 14 (2. Ausgabe, 1964) beschrieben werden. Diese Kontrollen wurden so hergestellt, dass sie physiologischem Plasma ähnelten, indem als einziges Puffermittel für das Plasma (1) ein Puffer aus Citrat, Imidazol und normaler Kochsalzlösung oder (2) ein Puffer aus Oxalat,Imidazol und normaler Kochsalzlösung der folgenden Zusammensetzung verwendet wurde:

(1) Citrat-Imidazol-Kochsalzlösungs-Puffer 0,9 #ige NaC1-Lösung

0,0135 molares + 0,005 Trinatriumcitrat 0,025 £ bis 0,035 °/> Imidazol

(2) Oxalat-Imidazol-Kochsalzlösungs-Puffer 0,9 #ige NaCl-Lösung

0,0135 molares + 0,005 Natriumoxalat 0,025 #'bis 0,035 $ Imidazol

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Durch Verwendung der obengenannten Mengen der Citrat- oder Oxalat-Antikoagulationsmittel in diesem Puffer wird eine unerwünschte Aktivierung der Gerinnungsfaktoren und die Thromboplastin-Erzeugung wirksam verhindert. Überschüssiges Citrat und Spuren von thromboplastisch aktivem Material werden, wie oben erläutert, durch die vorhergehende Behandlung des Plasmas mit "PLTJ-RONIO" 1-38 entfernt. Durch diese kombinierten Stufen wird eine maximale Stabilisierung der Thromboplastin-Kontrollen erreicht.

Die Oitrat-Kontrollen (100 $ und 20 $> Kontrollen) wurden wie folgt hergestellt:

Pur die 100 $ige Kontrolle wurde die durch die "PLUR01iIC^ll-I¹-38-Behandlung ausgefällte Paste in dem Citrat-Imidazol-Kochsalzlösungs-Puffer bis zu 50 $ bis 70 fo des ursprünglichen Volumens des Plasmas gelöst.

Pur die 20 $ige Kontrolle wurde diese ausgefällte Paste in normaler Kochsalzlösung gelöst, bis ihr Volumen 80 fo bis 120 $> des ursprünglichen Plasma-Volumens betrug. Prothrombin-freies menschliches Plasma wurde dann aus der erneut gelösten, ausgefällten Paste hergestellt, indem der "Prothrombin-Komplex" (Faktoren II, VII, IX und X) aus dieser adsorbiert wurde. Diese Adsorption wird erzielt, indem man !Dicalciumphosphat bis zu einer Konzentration von 1 Gew.-$ zusetzt, den pH-Wert mit 1n HCl auf 7,2 +0,2 einstellt und etwa 30 bis 45 Minuten mischt. Dann wird die

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Suspension zentrifugiert. Die überstehende !Flüssigkeit wird mit 0,0135 m + 0,005 Trinatriumcitrat und 0,025 fi bis 0,035 $> Imidazol gepuffert, und der pH-Wert wird mit 1n NaOH auf 7,8 + 0,2 gebracht. Die Lösung wird dann mit dem entsprechenden Volumen der oben beschriebenen 100 folgen Citrat-Kontrolle gemischt und liefert die gewünschten Gerinnungszeiten für die 20 $ige Kontrolle.

Die 100 ^igen und 20 folgen Oxalat-Kontrollen werden auf die gleiche V/eise hergestellt wie die oben beschriebenen Citrat-Kontrollen, wobei jedoch 0,0135 ro ITatriumoxalat anstelle des 0,0135 m Trinatriumcitrats verwendet wird.

Zahlreiche andere Beispiele und Modifizierungen der obigen Beispiele sind für den Fachmann offensichtlich. So können z.B. auch Albumin, y-Globuline, Fibrinogen und weitere Blutkomponenten mit Hilfe des erfindungsgemässen Trennungsverfahrens gewonnen werden. Alle Blutkomponenten können entweder unmittelbar aus dem Blutserum oder -plasma oder aus Blutfraktionen, die diese Komponenten enthalten, gewonnen werden. So kann Fibrinogen aus der Cohn-Ausfällung I, die Ϋ -Globuline aus der Cohn-Ausfällung II + III und Albumin aus der Cohn-Ausfällung V gewonnen werden. Ähnliche Ergebnisse werden auch erhalten, wenn man "PLTJfiONIC" F-68 anstelle des "PLUHOIiIO" F-38 verwendet.

- Patentansprüche -

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Claims

Patent Ansprüche

fi) Verfahren zum Trennen proteinartiger und lipider bzw. lipoider Materialien von Blutserum und Plasma, dadurch gekennzeichnet, dass man diese Materialien selektiv ausfällt, indem man sie mit einer ausfällenden Menge von etwa 1 bis etwa 35 Gew./Vol.-% eines Blockmischpolymerisates aus Äthylenoxyd und hydrophobem Polyoxypropylen-Anteil mischt, das wenigstens etwa 50 % Äthylenoxyd in dem Blockmischpolymerisat-Molekül enthält und dessen hydrophober Polyoxypropylen-Anteil ein Molekulargewicht von wenigstens etwa 900 aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekannzeichnet, dass die Blutgerinnungsfaktoren von dem Serum und Plasma getrennt werden, indem man das Blockmischpolymerisat in einer Menge von etwa 1 % bis etwa 20 % einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, dass ein Konzentrat des antihämophilen Faktors erhalten wird, indem man durch Gefrieren ausgefälltes Plasma in wässriger Lösung mit etwa 3 bis 5 Gev.-% des Blockmischpolymerisates mischt, die so erhaltene Ausfällung abtrennt, die zurückbleibende überstehende Flüssigkeit mit zusätzlichem Blockmischpolymerisat bis zu einer End-Konzentration von etwa 10 % mischt und die so gebildete Ausfällung als gewünschtes Konzentrat gewinnt.
4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Blockmischpolymerisat verwendet wird, dass etwa 80 % hydrophile Polyoxyäthylen-Einheiten im Molekül aufweist und dessen hydrophober Polyoxypropylen-Anteil ein Molekulargewicht zwischen etwa 950 und 1750

i ·

besitzt.

-2-

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«Ο
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Prothrombin-Komplex erhalten wird, indem man eine Cohn-Fraktion IV-1 in wässriger Lösung mit etwa 0,5 % bis 2 % tribasischem Calciumphosphat mischt, die so erhaltene Ausfällung in einer wässrigen Lösung von etwa 0,1 Mol Trinatriumcitrat suspendiert, die Ausfällung abtrennt, die zurückbleibende überstehende Flüssigkeit mit etwa 5 % des Blockmischpolymerisates mischt, die so erhaltene Ausfällung abtrennt und die zurückbleibende überstehende Flüssigkeit mit zusätzlichem Blockmischpolymerisat bis zu einer End-Konzentration von etwa 20 % mischt und die so gebildete Ausfällung als gewünschten Prothrombin-Komplex sammelt.
6. Blutproteinprodukt aus Blutserum und Plasma, welches bei dem Verfahren nach Anspruch 1-5 erhalten wurde, dadurch gekennzeichnet, dass es eine kleine rückständige Menge von dem Blockmischpolymerisat enthält.

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