DE2519909A1

DE2519909A1 - Verfahren zum fraktionieren fluessiger loesungen von proteingemischen

Info

Publication number: DE2519909A1
Application number: DE19752519909
Authority: DE
Inventors: Harold Stern
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1974-05-06
Filing date: 1975-05-05
Publication date: 1975-11-20
Also published as: JPS50153696A; CH622436A5; ZA752829B; CA1043703A; BR7502739A; FR2270267B1; NL7505304A; FR2270267A1; BE828752A; ES437483A1; US3972791A; IT1032822B; GB1496726A

Description

Patentanwälte

Dipl.-Chem. I. SCHULZE Dipl.-Ing. E. GUTSCHER

HeIUeLBERO

Gaisbergstraße 3 Telephon 23269

Abs. Dipl.-Chem. I. Schulze, Dipl.-Ing. E. Gutscher, Patentanwälte 6900 Heidelberg, GalsbergstraBe 3

UNSER ZEICHEN: IHRZEICHEN:

2839

Anmelder: Harold Stern, Llewellyn Park, West Orange, New Jersey 07052, V.St.A.

Verfahren zum Fraktionieren flüssiger Lösungen von Proteingemischen

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Trennen komplexer Proteingemische, insbesondere Fraktionieren und teilweisem Wiederlösen solcher Gemische durch Kombinationen von Elektrodialysen und mindestens einem der folgenden Schritte: Zwangslauf-Elektrophorese, Elektrodekantation und Alkoholfällung.

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Biologische Medien bzw. Flüssigkeiten enthalten gewöhnlich ein Gemisch aus mehreren Proteinen und es ist ein Verdienst der modernen Biochemie, dass Methoden zu deren Trennung entwickelt worden sind. Das beste Beispiel ist Blutplasma oder Serum, wo Verfahren und Methoden zur Bestimmung und Trennung von mindestens 25 Hauptproteinkomponenten verfügbar sind (Schultze und Heremans: Molecular Biology of Human Proteins, Elsevier, 1966). Andere Beispiele natürlich vorkommender komplexer Proteingemische ist Milch oder Molke, Urin, Rückenmarksflüssigkeit, Eiweiss usw..

Im Rahmen der vorliegenden Offenbarung ist es zweckmässig, die folgende Protein-Nomenklatur zu definieren, wobei die Klassifizierung aufgrund ihrer Löslichkeit in einer Vielzahl von Lösungsmitteln vorgenommen wurde:(1) Albumin ist die Haupt-Proteinkomponente von Plasma, Serum und Eiweiss und es ist dadurch gekennzeichnet, dass es sowohl in halbgesättigtem Ammoniumsulfat sowie in destilliertem Wasser löslich ist; (2) globuline sind jene Proteine von Plasma oder anderen biologischen Flüssigkeiten, die in halbgesättigtem Ammoniumsulfat ausfallen; (3) Euglobuline sind solche Glufouline, die nicht nur in halbgesättigtem Ammoniumsulfat, sondern auch in de-ionisiertem Wasser aus-fallen, da sie offensichtlich einige Salze benötigen, um löslich zu sein. Diese Klassifizierung ist willkürlich wird aber in der Proteinchemie weitverbreitet verwendet. Tatsächlich hängt die Löslichkeit aller Proteine auch vom pH-Wert der Lösung, der Temperatur und anderen gelösten Stoffen, wie Alkohol* abj (4) euglooulinartige Stoffe; Der Begriff "Euglobulinartig" wird hierin für solche Proteine verwendet, die in de-ionisierten wässrigen Lösungen nur in Gegenwart verschiedener Mengen Alkohol ausfallen. Diese Proteine sind keine echten Euglobuline, die in de-ionisiertem Wasser ohne Vorhandensein von Alkohol löslich sind. Die euglobulinartigen Stoffe besitzen aber einige Eigenschaften der Euglobuline, wobei sie auch bei niedrigen Salzkonzentrationen löslieh gemacht werden können»

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Es ist hier ferner zweckmässig, die folgenden elektrischen Membranverfahren zu definieren:

(1) Elektrodialyse wird vornehmlich für die Entsalzung wässriger Lösungen verwendet. Üblicherweise wird dies durch Ionenselektive Membrane durchgeführt. Diese Membrane gestatten den bevorzugten Durchgang von entweder positiv oder negativ geladenen Ionen - wie es in mehreren US-Patentsehriften, beispielsweise 2 694 68O; 2 848 402; 2 86O 09I und 2 777 811 besehrieben ist. Die Zweckmässigkeit dieser Technik zur Trennung von Proteinen ist früher nicht erkannt worden. Die Ionen-selektiven Membrane können auch durch im wesentlichen elektrisch neutrale Membrane ersetzt werden, wobei Polyelektrolyte in bestimmte Abteilungen eingesetzt werden. Diese Polyelektrolyte werden entlang der Membrane unter Einfluss eines elektrischen Feldes polarisiert, wobei zu den neutralen Membranen ein Element von Ionen-Selektivität geführt wird (vgl. US-PS 3 677 923 und 3 725 235). Bei anderen elektrischen Membranverfahren, die in den folgenden beiden Abschnitten behandelt werden, ist eine gewisse Elektrodialyse unvermeidbar, die anderen gesuchten Effekten überlagert ist, die ein direktes Ergebnis des elektrischen Stromflusses sind. Pur die erfindungsgemässen Zwecke wird der Begriff Elektrodialyse diesen elektrischen Verfahren vorbehalten, deren Hauptzweck das Entsalzen ist, das vorzugsweise entweder mit Ionen-selektiven Membranen oder unter Verwendung von Polyelektrolyten durchgeführt wird.

(2) Elektrodekantieren ist ein elektrisches Verfahren zum Konzentrieren und Trennen einer Vielzahl von Kolloiden, einschliesslich von Proteinen, wie es in den US-PSen 2 057 156; 2 292 608; 2 762 770; 2 800 448 und 2 801 962 beschrieben ist. Es handelt sich um Vorrichtungen oder Apparate, die eine Vielzahl von im wesent-

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liehen elektrisch neutraler Membrane in paralleler Anordnung enthalten. Die Kolloide oder Proteine akkumulieren unter dem Einfluss des elektrischen Stromes oder elektrischer Felder in unmittelbarer Nachbarschaft der Membrane und sind entlang dieser Membrane als Ergebnis von Diehtigkeitsgradienten dekantierbar. Ein analoges Verfahren wird manchmal als "Elektrophorese-Konvektion" bezeichnet (US-PS 2 758 966), bei der gewöhnlieh nur ein einziges Paar elektrisch neutraler Membrane zur Erzeugung von Elektrodekantierung in der Proteinlösung verwendet wird. Diese Techniken wurden weitgehend zur Proteinfraktionierung verwendet, hauptsächlich zur Herstellung von Gamma-Globulinen. Diese Proteine von Plasma sind iso-elektriseh und nicht dekantierend. Diese Arbeitsweise ist für die Herstellung von Serum-Albumin, das beweglichste der Plasma-Proteine (ausgedrückt in Begriffen der Elektrophorese) nicht vorgeschlagen worden. Es gehört zu den Aufgaben der Erfindung, einen Weg zur Verwendung solcher Fraktionierverfahren zur Herstellung von Serum-Albumin aufzuzeigen.

(3) Zwangslauf-Elektrophorese umfasst Apparate, die denen für die Elektro-Dekantierung ähnlieh sind. Es werden ebenfalls elektrisch neutrale Membrane in paralleler Anordnung verwendet, aber die Trennwände sind zwischen benachbarten Membranpaaren eingesetzt. Solehe Trennwände gestatten eine bessere Steuerung der Strömungsbilder innerhalb der Apparatur und dienen auch als Diffusionswände. Zwei solcher Elektrophorese-Apparate sind in den US-PSen 2 878 178 und 3 079 3¹^ beschrieben und die Arbeitsweise ist ebenfalls als "Zwangslauf-Elektrophorese" von M. Bier "Electrophoresis", Academic Press, 1959, Seite 295 erläutert.

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Die Verfahren der Elektrodekantierung und Zwangslauf-Elektrophorese sind im Prinzip und in den Ergebnissen ähnlieh und bequemlichkeitshalber wird hierin häufig von Elektrofeld-Trennungen gesprochen. Wie weiter unten ausgeführt ist, können sie im Austausch verwendet werden.

Die wichtigsten handelsüblichen Proteinprodukte sind diejenigen, die vom menschlichen oder tierischen Plasma oder Serum gewonnen werden. Zwei solcher Proteine, Serum-Albumin und Gamma-Globulin, entweder menschlichen oder tierischen Ursprungs, werden als Hauptbeispiele verwendet. Aber das erfindungsgemässe Verfahren kann auch ohne abgeändert zu werden, mit anderen biologischen Medien bzw. Flüssigkeiten oder anderen

Proteinen angewandt werden. Die bekannten handelÜbliehen Verfahren zur Gewinnung dieser Fraktionen basieren auf Alkoholfraktionierung, ein Verfahren, das von Cohn u. a. entwickelt wurde und in den US-PSen 2 390 074 und 2 770 6l6 beschrieben ist. Diese Arbeitsweise basiert im wesentlichen auf aufeinanderfolgender Fällung verschiedener Proteinfraktionen durch Alkohol und zwar unter gesteuerten und kontrollierten Bedingungen der Temperatur, des Alkoholgehalts, des pH-Wertes und Salzgehaltes, wie es von C. A. Janeway, Adv. in Internal Med. 3* 295, 19^9 zusammengefasst ist. Eine solche Arbeitsweise erfordert eine grosse Anlage, die Ausbeute bestimmter Fraktionen ist gering, die Proteine müssen längere Zeit einem hohen Alkoholgehalt ausgesetzt werden, was auf gewisse Proteinfraktionen denaturierend wirkt. Das Verfahren ist ferner auf die Herstellung nur bestimmter Plasmafraktionen beschränkt. Andere Proteinfraktionen können nicht in ausreichend reinem Zustand gewonnen werden.

Die Erfindung betrifft die Fraktionierung und teilweise Wiederlösung von Proteingemischen, hauptsächlich Gemischen wie - Jedoch nicht ausschliesslich - Plasma, Serum oder deren Fraktionsderivate, wobei eines oder mehrere der obengenannten elektrischen Verfahren verwendet werden, und zwar entweder allein oder in Kombination sowie in Kombination mit Alkoholfraktionierung. Der Fraktionierungsverlauf gemäss dem erfindungsge-

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massen Verfahren gestattet eine weit grössere Flexibilität der zu gewinnenden Fraktionen, da die elektrischen Verfahren einige oder alle Stufen herkömmlicher Alkoholfraktionierung ersetzen können. Das bedeutet eine wesentlich bessere Wirtschaftlichkeit und Kostenersparnis, Zeitersparnis, geringere Installationskosten und grössere Ausbeuten der gewünschten Produkte.

Genauer gesagt umfasst das erfindungsgemässe Verfahren:

(1) Das Fraktionieren von Proteinen einschliesslich Plasma oder Plasmafraktionen, wobei durch elektrodialytische Entsalzung und kontrollierten Bedingungen der Temperatur des pH-Wertes und der Leitfähigkeit eine Euglobulin-Fraktion gefällt und das Dialysat gewonnen wird.

(2) Das Fraktionieren von Proteinen einschliesslich Plasma oder Plasmafraktionen, wobei durch elektrodialytisches Entsalzen unter kontrollierten Bedingungen der Temperatur, des pH-Wertes, der Leitfähigkeit sowie des Alkoholgehalts eine euglobulin-ähnliche Fraktion gefällt wird.

(j5) Fraktionieren von Proteinen einschliesslich Plasma

oder Plasmafraktionen, bei der durch elektrodialytisches Entsalzen unter kontrollierten Bedingungen der Temperatur, des pH-Wertes der Leitfähigkeit und des Alkoholgehalts ein euglobulin-ähnliches Präzipitat hergestellt wird, anschliessend eine mit Albumin angereicherte Fraktion unter Wiedereinstellung der Temperatur, des pH-Wertes, der Leitfähigkeit oder des Alkoholgehalts selektiv gelöst wird.

(4) Plasma-Fraktionierung, bei der zunächst durch Alkohol gefällt und anschliessend die über der Ausfällung schwimmende Flüssigkeit elektrodialytisch entsalj^ wird, wobei bei dem zweiten Verfahrenesehritt eine euglobulinartige Fraktion erhalten wird. Sine gewählte dritte Verfahrensstufe besteht in selektiver Lösung

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einer an Albumin reichen Fraktion aus dem euglobulinartigen Präzipitat und eine letzte Verfahrensstufe der Alkoholausfällung einer an Albumine reichen Fraktion aus den zusammengesehütteten über den Ausfällungen schwimmenden Flüssigkeiten der elektrodialytisehen Entsalzungsstufe oder wahlweise der zusammengesehütteten oben schwimmenden Flüssigkeiten der zweiten Verfahrensstufe und der gewählten dritten Fraktionierungsstufe.

(5) Verfahren zum Verbessern der Fraktionierung von Proteingemischen durch Elektrodekantieren oder Zwangslauf-Elektrophorese, bei dem durch vorheriges elektrolytisches Entsalzen der Salzgehalt verringert, wobei dieses Entsalzen auch eine Ausfällung von Euglobulin oder euglobulinartigen Stoffen bewirkt.

(6) Verfahren zum Verbessern der Fraktionierung von Proteingemischen durch Elektrodekantieren oder Zwangslauf-Elektrophorese, bei dem durch vorheriges Entsalzen der Salzgehalt der Gemische verringert und anschliessend ein Puffersal#z zugegeben wird. Das Puffersalz ist ein Ampholyt, wie Glycin. Das Entsalzen bewirkt auch die Ausfällung von Euglobulinen.

(7) Plasma-Fraktionierung, bei der eine erste Ausfällung durch Alkohol erfolgt, anschliessend die oben schwimmende Flüssigkeit elektrodialytisch entsalzt wird, wobei diese zweite Verfahrensstufe ein Ausfällen einer euglobulinartigen Fraktion von dem euglobulinartigen Präzipitat bewirkt. Eine letzte Verfahrensstufe ist die selektive Konzentration einer an Albumin reichen Fraktion, wobei die oben schwimmende Flüssigkeit der Entsalzungsstufe oder andererseits die kombinierten obenschwimmenden Flüssigkeiten vom Entsalzen und der gewählten dritten Verfahrensstufe der Fraktionierung durch Elektrodekantieren oder Zwangslauf-Elektrophorese behandelt werden.

(8) Herstellungsprodukte, brauchbar zur Verwendung als Plasmastrecker, die mindestens 90 % Albumin enthalten

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die durch die obengenannten Verfahren, insbesondere durch das Verfahren 4 oder 7 erhalten wurden.

A - Elektrodialyse wird weitverbreitet zum Entsalzen wässriger Lösungen verwendet. Auf dem Gebiet der Proteine hat sie Eingang gefunden bei dem Entsalzen von Milch und Molke (US-PSen 3 433 726; 3 447 930; 3 595 766; 3 757 005; 3 754 650). Die bekannten Verfahren haben jedoch keine Beziehung zum erfindungsgemässen Verfahren, da sie lediglich die Verringerung des Salzgehaltes der Molke betreffen und nicht mit dem Einfügen des Entsalzungsverfahrens in ein komplexes Arbeitsschema der Fraktionierung.

Es ist auch bekannt, dass das Entsalzen die Ausfällung von

Euglobulinen bewirkt. Die US-PSen 2 669 5595 2 76I 809; 2 76I 811; 3 234 199 und 3 429 867 offenbaren die Anwendung des Entsalzens durch Ionenaustauseherharzbetten zur Plasmafraktionierung. Aber dieses Verfahren ist zu wenig flexibel bei der Gewinnung von Produkten, so dass es keinen praktischen Wert besitzt. Ausserdem ist es schwierig, die lonenaustauschersäulen in einem ausreichend sauberen und genügend sterilem Zustand - wie es für die Protein-Fraktionierung erforderlich ist - zu halten.

Es ist ein Verdienst der Erfindung, dass gefunden wurde, dass das elektrodialytische Entsalzen ein wertvolles Werkzeug in einem Gesamtarbeitsschema der Plasma-Fraktionierung sein kann, wenn es zusammen mit anderen Techniken verwendet wird, da die Ergebnisse beim Kombinieren verschiedener Techniken die Brauchbarkeit einer jeden Arbeitsweise in unerwarteter Weise verbessert. ^

Die Zugabe verschiedener Alkoholmengen zu entsalzenen Proteinen bewirkt eine zusätzliche Auffällung instabiler oder euglobulinärtiger Proteine. Das Verfahren ist nicht ganz identisch mit der Alkoholfraktionierung von Proteinen, da die Qualität und Zusammensetzung der gefällten Fraktion un-

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gleichmässig empfindlich ist gegenüber Temperatur, pH-Wert und geringste-n _{Mengen eines} Elektrolyten, die für alle Globulin-Praktionierungen charakteristisch sind. Der Wert dieser Peststellung :; t ist insbesondere deswegen bedeutend, da das Ablaufschema der Alkohol-Fraktionierung in der ersten Stufe eine sogenannte Cohn-Fraktion II und III abtrennt, wobei das Präzipitat die grösste Menge der Gamma-Globuline enthält. Die über dem Präzipitat schwimmende Masse oder Flüssigkeit enthält bereits etwa 20$ Alkohol und wenn nun entsalzt wird, wird ein Präzipitat einer euglobulinartigen Fraktion erhalten, die die grösste Menge der verbleibenden ft Plasma-Globuline (genannt alpha- und beta-Globuline) enthält, die bei der Herstellung von Serum-Albumin unerwünscht sind. Ausserdem ist es we;gen der Gefahr von Hepatitis-Infektion sehr erwünscht, die Gamma-Globuline in zeitgerechter Weise durch Alkohol-Fraktionierung herzustellen, da; (.=■:. das hierbei gewonnene Produkt nicht infektiös ist. So passt das ■■..' elektrodialytische Entsalzen in das vorliegende Schema der Fraktionierung, indem ein Gamma-Globulinprodukt durch zur Zeit akzeptierbare Methoden erhalten wird. Ausserdem wird eine Durchschnittsmenge bei der Albuminherstellung gewährleistet. Hepatitis ist bei den Albuminpräparaten kein Problem, da diese durch Hitzebehandlung pasteurisiert werden können, wie es in den US-PSen 2 705 und 2 958 628 beschrieben ist.

Ferner kann die Euglobulin-Fraktion wegen der unregelmässigen Empfindlichkeit gegenüber Temperatur, pH-Wert und Ionenstärke leicht zur Bildung einer Vielzahl von Unterfraktionen verwendet werden, Produkte die zur Herstellung anderer Plasmafraktionen brauchbar sind.

Die euglobulinartige Fraktion, die bei 20# Alkoholgehalt erhalten wurde, enthält auch eine beachtliche Menge Albumin, das durch selektive Lösung gewonnen werden kann, wie es in den Beispielen gezeigt ist. Aus einer solchen Quelle kann wiederum eine Vielzahl von weiteren Fraktionen erhalten werden. Es ist

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nicht erforderlich, aus den obenschwimmenden Massen zuerst die . : euglobulinartige Fraktion abzutrennen, um eine selektive Lösung zu bewirken. Aber der pH-Wert, die Temperatur, die Leitfähigkeit oder der Alkoholgehalt des entsalzenen Proteingemisehes kann durch zahlreiche verschiedene Arbeitsweisen eingestellt werden. Hierüber geben die Beispiele auch nähere Erläuterungen. Es wird deutlich, dass ein neues und wand lungs fähiges Werkzeug für die Fraktionierung gegeben ist, wenn die obengenannten Faktoren, nämlich Alkoholgehalt, pH-Wert, Leitfähigkeit und Temperatur kombiniert werden.

Es ist auch nicht nötig, dass die erste Verfahrensstufe bei der Fraktionierung die Alkoholausfällung ist, d. h. die Cohn-Fraktion II und II Trennung. Diese Arbeitsweise passt nur am besten in das vorliegende Schema der Gamma-Globulinherstellung. Es ist aber auch möglich, zuerst das Plasma zu entsalzen, die gebildeten Euglobuline abzutrennen oder nicht abzutrennen und dann zum entsalzenen Plasma Alkohol zuzugeben, um eine weitere Ausfällung von euglobulinartiger Fraktion zu erreichen. Diese euglobulinartige Fraktion fällt bereits bei 10$ Alkoholgehalt aus, während die Cohn-Fraktionierung 20$ Alkohol für die erste Verfahrensstufe erfordert. Auf diese Weise kann eine wesentliche Menge an Alkohol eingespart werden. Diese Fraktionierungsweise ist besonders attraktiv, wenn nur Albumin erwünscht ist, und nicht Gamma-Globuline. Dies ist der Fall bei vielen tierischen Seren, wo Albumin das bedeutendste handelsübliche Produkt ist. Es ist auch brauchbar, wenn die Trennung der sogenannten Makro-Globuline oder IgM Immuno-Globuline gewünscht wird. Diese gehen zur Zeit bei der Cohn-Alkoholfraktionierung verloren, können aber leicht in der ersten Euglobulin-Fraktion gewonnen werden, da sie auch in Abwesenheit von Alkohol unlöslich sind.

Eine optimale Ausfällung von Euglobulinen oder euglobulinartigen Proteinen erfolgt bei ihren isoelektrischen Punkten, also dem Punkt ihrer geringsten Löslichkeit. Es ist charakteristisch

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für genau durchgeführte elektrolytisehe Entsalzungsverfahren, dass das Endgemisch automatisch auf einen pH-Wert kommt, der dem mittleren isoelektrischen Punkt der Proteine im Gemisch entspricht, da alle freien Ionen entfernt und nur Proteine zurückbehalten werden. Im Falle von Plasma entspricht dies einem pH-Wert von 5,3 - 0,2 pH-Einheiten. Wegen Protein-Protein Wechselwirkungen tritt keine Mischfällung verschiedener Proteine auf, aber die Zusammensetzung des Präzipltats kann geändert und modifiziert werden, indem der pH-Wert auf einen Bereich von 6 bis 4,8 eingestellt wird, wobei die Zusammensetzung des PKäzipitats wesentlich geändert und eine selektive Ausfällung bestimmter Proteine ermöglicht wird, einschliesslich der obengeannten Makro-Globuline.

Die Ausfällung von Euglobulinen im Plasma beginnt bei einem spezifischen Widerstand über 1000 0hm-cm, steigt aber allmählich bis zur maximalen Entsalzungan. Für die beste Fraktionierung von Euglobulinen oder euglobulinartigen Fraktionen ist ein Widerstand von mehr als 50 000 0Hm-cm erforderlich. Die meisten Fraktionierungen wurden im Bereich zwischen 50 000 bis 200000 Ohm-cm durchgeführt.

Die Temperatur spielt eine wesentliche Rolle bei der Ausfällung der euglobulinartigen Fraktion. Der grösste Teil der Fraktionierung wurde in einem Temperaturbereich unter 5° C durchgeführt. Aber die Unterfraktionierung der euglobulinartigen Fraktion kann bei Temperaturen von etwa 15° C oder darunter erfolgen.

Zusammengefasst wird festgestellt, dass die optimale Fraktionierung von Proteinen durch elektrodialytisches Entsalzen innerhalb der folgenden recht engen Bereiche der Arbeitsbedingungen erhalten wird: Temperatur unter 15° C, pH-Wert 5,3 plus minus 0,2, Widerstand über 100 000 Ohm-em. Der Einfluss dieser Parameter wird deutlich aus den Beispielen, in denen die Erfindung näher erläutert wird.

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Die Vorrichtung zum Durchführen der elektrodialytischen Fraktionierung ist nicht kritisch und es können viele Randelsübliehe Einrichtungen und Geräte dafür verwendet werden. Die meisten der hier beschriebenen Experimente wurden mit Geräten und Apparaten von "ionics Corp., B. Watertown, Mass." durchgeführt. Es ist wichtig, dass die paarweise zu verwendenden lonenaustausehermembrane richtig ausgewählt werden, die ein proportioniertes Entfernen von positiv und negativ geladenen Ionen aus der Lösung bewirken. Damit werden übermässige Änderungen der pH-Werte vermieden. Die Ionics Membrane haben sich als ausserordentlich gut erwiesen. Andere Ausführungen von Membranen geben jedoch ohne Zweifel gleich gute Ergebnisse und bei einigen Arbeiten wurden selbstgemachte Apparaturen verwendet., die ähnlich denen waren, die in der US-PSen 3 079 318 und 3 677 923 beschrieben sind. Das Entsalzen kann auch so durchgeführt werden, wie es in der letztgenannten US-PS erläutert ist, wodurch Ionenaustauschermembrane nicht unbedingt erforderlich sind.

Die Proteinlösung wird kontinuierlich durch die Elektroä.ialyseapparatur in Umlauf gebracht, durch Wärmeaustauscher gekühlt und ein Gleichstromfeld über die Membrane gelegt, um die Elektrodialyse zu bewirken. Das Elektrolytsalz benetzt die Seiten der Membrane und die Salzkonzentration steigt allmählich an, sowie Salze vom Plasma in den Elektrolyten gelangen. Dieses Salzbad kann irgendeine der üblichen Zusammensetzungen aufweisen. Die Zusammensetzung sowie ihre Leitfähigkeit sind für das erfindungsgemässe Verfahren nicht kritisch.

Bei den meisten Fraktionierungen, bei denen lonenaustauschermembrane verwendet wurden, enthielt die Lösung etwa 0,5 g/l Natriumchlorid. Andere Elektrolytlösungen sind jedoch ebenso gut und brauchbar.

Bei den Versuchen mit elektrisch neutralen Membranen wap die "Salzlauge" eine 0,2,^-ige Lösung von Polyacrylsäure, die mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert 6 eingestellt war. Die beste

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Temperatursteuerung erfolgte durch Kühlung der Salzlaugen, beispielsweise durch Wärmeaustauscher.

Bei einm richtig ausbalancierten System sank der pH-Wert des Plasmas allmählich gegen seinen mittleren isoelektrischen Punkt auf 5,2 ί 0,2. Das Ausfällen beginnt bei einem spezifischen Widerstand von etwa 1000 Ohm-cm und einem pH-Wert von etwa 5,6. Wenn das Ausgangsprodukt nicht Plasma aber eine durch die Alkoholfällung erhaltene Fraktion des Plasmas ist, tritt Fällung auf, wenn der Widerstand etwa 6000 0hm-cm erreicht hat, da einige der Euglobuline bereits entfernt worden sind. In jedem Fall ist die Fällung bei höchst möglicher Entsalzung weitgehend vollständig, wenn der Widerstand etwa 100 000 0hm-cm beträgt.

Das Protein soll durch entsprechende Kammern der Elektrodialyse-Apparatur heftig zirkulieren, um eine maximale Wirbelung in der Vorrichtung zu schaffen. Ein solches Vorgehen 1st bei der Elektrodialyse bekannt. Bei den meisten Versuchen wurde ein Umlaufdruck von 25 lbs/sq.in. verwendet. Diese Turbulenz ist auch erforderlich, um ein Ablagern der ausfallenden Proteine innerhalb der Apparatur und damit ein Verstopfen der Strömungskanäle zu vermeiden.

Um das Problem des Verstopfens so gering wie möglich zu halten, kann eine kontinuierlich arbeitende Zentrifuge in den Kreislauf der Proteinlösung eingesetzt werden.

Das Ausfällen von Euglobulinen erfolgt schnell und ihr vollständiges Zentrifugieren wird bei einer verhältnismässig niedrigen Zentrifugiergeschwindigkeit erreicht, wobei etwa 2000 U/M ausreichen. Dieses Hilfsmittel hat gewisse Vorteile, da es eine Fraktionierung der Euglobuline ermöglicht so wie sie gebildet werden, indem die Niederschläge getrennt bei den verschiedenen pH- oder Widerstandswerten gesammelt und abgesondert werden. Es ist auch vorteilhaft, in den Weg des Proteinumlaufs entsprechende Anzeigeinstnumente zur automatischen oder mechanischen Betätigung der Steuerung des pH-Wertes, des Widerstände und der Temperatur während des Entsalzens einzusetzen.

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Wenn an irgendeinem Teil der Apparatur eine Verstopfung auftreten sollte, was durch einen plötzlichen Druckanstieg angezeigt wird, kann dies leicht abgestellt werden, indem ein entsprechendes alkalisch wirkendes Mittel zugegeben wird. Es kann beispielsweise eine Natriumhydroxydlösung sein, die in solchen Mengen zugegeben wird, die den pH-Wert der Proteinlösung auf über 6 anheben. Dabei werden alle Niederschläge schnell gelöst. Ein solches "Entstopfen" verursacht keine grosse Verzögerung beim gesamten Entsalzungsverfahren. Die Elektrodialyse von Natrium-Ionen verläuft sehr viel schneller als diejenige anderer Ionen in der Proteinlösung. Die zum vollständigen Entsalzen erforderliche Gesamtzeit wird hauptsächlich durch diese langsamer elektrodialysierenden Ionen begrenzt und nicht durch die Natrium-Ionen. So ist es möglich, das Proteingemisch vollständig zu entsalzen, dann ausreichend Alkali zuzugeben, um die gesamten Niederschläge zu lösen (die natürlich den Widerstand senken) und anschliessend in einem weiteren Enddurchgang durch den Elektrodialysator ein Endprodukt zu erhalten, wobei das zugesetzte Natriumhydroxyd entfernt wird. Auf diese Weise wird eine Anhäufung des Niederschlags in der Apparatur vermieden. Der grösste Teil der Fällung ist ausreichend verzögert und erfolgt erst nach dem Verlassen des Dialysators.

Ein anderes verfahren, um Ausfällen und Verstopfen der Apparatur zu vermeiden, ist eine periodische Umkehr der Strompolarität.

Da bis zum vollständigen Entsalzen das Plasma mehrfach durch die Apparatur in Umlauf gebracht werden muss, ist das Verfahren im wesentlichen ein Chargenbetrieb. Es kann aber auch halb-kontinuierlich in aufeinanderfolgenden Arbeitsgängen durchgeführt werden, wobei ein zwischengeschalteter Kessel einen Anteil der gesamten Proteinlösung aufnimmt. Dieser Anteil wird dann vollständig entsalzt, indem er wiederholt durch den Elektrodialysator zirkuliert und dann durch eine neue Charge ersetzt wird. Ein solches Vorgehen ist bei der Verfahrenaautomatik sehr wohl bekannt. Durch aufeinanderfolgendes Durchleiten der Proteinlösung

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durch hintereinander angeordnete Dialysekammern wird der Salzgehalt in jeder nachfolgenden Kammer bis zur Endkammer verringert, wobei in dieser letzten der Salzgehalt ein Minimum erreicht hat.

Die für die Elektrodialyse erforderliche Kraft ist nie ht kritisch. Die meisten Versuche wurden mit einer Stromdichte von etwa 0,03 * Amp/cm gestartet, wobei weniger als 25 V/cm erforderlich waren. Da der Widerstand des Elektrodialysators allmählich ansteigt, und zwar aufgrund des Widerstandes der Proteinlösung, steigt auch die Spannung allmählich bis zu 100 V/cm an. Die End-Stromdichte

ist niedrig, üblicherweise weniger als etwa 0,03 Amp/cm. Die Kraft wird hauptsächlich dadurch begrenzt, dass sie die Lösung erwärmt. Die Steuerung und Kontrolle der gesamten zugeführten Leistung beruht auf der Überwachung der Temperatur der abfliessenden Ströme. Die Temperatur kann unterhalb irgendeines gewünschten Wertes gehalten werden, der mit der Stabilität und der sanitären Handhabung der Proteinlösungen vereinbar ist, d. h. die Temperatur kann während des ganzen Versuches unter etwa 5° oder 10° C gehalten werden.

Die sanitären Massnahmen bei der Proteinfraktionierung sind von grösster Bedeutung. Die gesamte Apparatur der Elektrodialyse, alle Verbindungen, Rohre, Pumpen usw. werden in situ durch herkömmliche Verfahren sanitär behandelt, beispielsweise durch Spülen mit verdünnter' Natriumhydroxydlösung, Salzsäure, Hypochlorit oder anderen entsprechenden Verbindungen. Das Spülen mit Natriumhydroxyd wird bevorzugt, da diese Verbindung auch ein wirksames Mittel zum Entfernen gefällter Proteine ist.

B - Sowohl die Zangslauf-Elektrophorese als auch die Elektrodekantierung wurden zum Fraktionieren von Plasmaproteinen verwendet, wie es in den US-PSen 2 801 9β2; 2 878 I78 und 3 079 318 beschrieben ist. Die übliche Aufgabe war die Isolierung von Gamma-Globulin. Der Grund für diese Festlegung auf Gamma-Globulin ist, dass diese Methoden leicht und direkt anwendbar sind, da Gamma-Globulin über einen relativ grossen pH-Bereich an der

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Neutralitätsgrenze isoelektrisch oder nahezu isoelektrisch ist. Die beiden obengenannten Verfahren differieren im wesentlichen lediglich zwischen isoelektrischen und beweglichen Komponenten. Bei beiden Verfahren werden die beweglichen Bestandteile zum Elektrodekanten gebracht und die obenschwimmende Masse besteht hauptsächlich aus isoelektrischen oder nahezu isoelektrischen Komponenten, die durch das angelegte elektrische Feld nicht beeinflusst werden (wobei der Begriff "isoelektrisch" wie folgt definiert wird: mit gleicher positiver und negativer Ladung, d. h. mit null Nettoladung). Die Dekantierfraktion enthält das meiste Albumin, das die elektrophoretisch am meisten bewegliche Hauptkomponente des Plasmas ist. So fraktioniertes Albumin ist jedoch durch Globuline mittlerer Beweglichkeit, die allgemein als alpha- und beta-Globuline bezeichnet werden, stark verunreinigt.

Diese Verfahren der Zwangslauf-Elektrophorese oder Elektrodekantierung haben bis jetzt keine Verwendung zur wirtschaftlichen Herstellung von Gamma-Globulinen oder irgendwelchen anderen Plasmafraktionen gefunden. Die Gründe hierfür sind zahlreich und u. a. folgende:

1. Gamma-Globulin ist nicht kurzzeitig lieferbar. Es wird mehr Albumin benötigt als Gamma-Globulin.

2. Die Cohn-Alkoholfraktionierung ergibt ein Produkt, das frei ist von infektiösen Hepatitismitteln. Es ist zur Zeit nicht sieher, ob andere Verfahren, wie beispielsweise die obengenannten elektrischen Methoden konsequent ein gleiches sicheres Produkt liefern. Das Ergebnis ist, dass viele legale Bestimmungen das Alkoholfraktionierungsverfahren verlangen. Im Hinblick auf die Fülle dieses Produktes besteht wenig Anreiz, das Verfahren zu ändern.

Gleichmassen wichtig sind aber einige rein technische Nachteile der beiden elektrischen Verfahren, die durch das erfindungsgemässe Verfahren ausgeschaltet sind:

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1. Plasma enthält eine Anzahl vernaltnismässig instabiler Proteine, die leicht ausfallen, entweder wegen der ihnen anhaftenden Löslichkeit oder aufgrund von Denaturierung. Ferner ist bei Verwendung von Plasma die Lebensdauer der in den beiden elektrischen Verfahren verwendeten Mehrfach-Membransätze begrenzt, da durch die Fällung eine Membranverschmutzung auftritt. Da aber die Anordnung solcher Mehrfachmembrane ein wesentlicher Kostenfaktor ist, werden die Verfahren teuer. Durch das erfindungsgemässe Verfahren ist dieses Problem vollständig ausgeschaltet, und zwar durch jede der weiter oben beschriebenen Behandlungen: (a) Alkohol-Vorfraktionierung, die zur obenschwimmenden Masse der sogenannten Cohn-Fraktion II und III führt; oder (b) elektrodialytisches Entsalzen. Jede dieser beiden Anfangsstufen der Fraktionierung entfernt die instabilen Proteine und es werden keine Spuren von Membranverschmutzung festgestellt.

2. Obwohl die bei diesen beiden Verfahren der Elektrophorese und des Elektrodekantierens verwendeten Membrane im wesentlichen elektrisch neutral sind, wird ihr Charakter geändert, und zwar aufgrund von Proteinpolarisation entlang der Membrane, die durch das elektrische Feld hervorgerufen wird, wie es beobachtet und in der US-PS 3 677 92j5 beschrieben worden ist. Das Fraktionierverfahren wird so von einem Element der Elektrodialyse überlagert und es tritt eine teilweise Entsalzung der "isoelektrischen " Fraktion auf, die eine frühzeitige Ausfällung bewirkt. Euglobuline neigen daher auszufallen und tragen zu dem obengenannten Problem der MembranVerschmutzung bei. Es ist offensichtlich, dass dieses Problem beim erfindungsgemässen Verfahren vermieden wird, da alle Euglobuline beim elektrodialytischen Entsalzen entfernt worden sind.

3. Plasma weist einen hohen Salzgehalt auf, der etwa 0,9$ Natriumchlorid entspricht. Dies begrenzt sehr ernsthaft das elektrische Feld, das angelegt werden kann, da die durch das elektrische Feld hervorgerufene Joulesehe Wärme proportional ist zu der Leitfähigkeit, d. h. dem Salzgehalt der behandelten Flüssigkeit. Das Ergebnis sind niedrige Arbeitsgeschwindigkeiten (die wiederum pro-

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portlonal sind dem angelegten Feld) und vom wirtschaftlichen Standpunkt aus bestenfalls toleriert werden können. Verdünnung wurde vorgeschlagen, um dem hohen Salzgehalt abzuhelfen (US-PS 2 878 178, Beispiel 3), aber dies ist höchstens ein lindernder Effekt .und vergrössert zudem die zu behandelnden Volummengen.

Beim erfindungsgemässen Verfahren ist dies Problem vollkommen ausgeschaltet. Der Abfluss der elektrodialytischen Entsalzung weist keine Restsalze auf, wodurch übermässiges Erwärmen aufgrund des elektrischen Feldes vermieden wird. Erwärmen ist natürlich schädlich, und zwar wegen der rein sanitären Überlegungen sowie der dabei auftretenden chemischen Zersetzung. Bei dem erfindungsgmässen Verfahren können stärkere elektrische Felder angelegt werden, wodunch grössere Produktionsgeschwindigkeiten erzielt werden und das Verfahren wirtschaftlich interessanter wird.

4. Der Salzgehalt des Plasmas besteht in der Hauptsache aus Natriumchlorid, das in dem pH-Bereich, in dem die Proteinfraktionierung durchgeführt wird, keine Pufferwirkung hat. Daher wird der pH-Wert der behandelten Flüssigkeit schlecht überwacht, wodurch eine Unsicherheit hinsichtlich der tatsächlichen Schärfe der Fraktionierung auftritt, da die elektrophoretische Beweglichkeit der Proteine stark pH-Wert abhängig ist. Die Zugabe wirksamer Puffer zu unbehandeltem Plasma kann die Situatinn verbessern, trägt aber auch zur allgemeinen Leitfähigkeit der Lösung bei, was - wie oben ausgeführt - sehr unerwünscht ist. Vorheriges Entsalzen der zu behandelnden Flüssigkeit gestattet jedoch eine entsprechende Zugabe jeder Art von Puffern, wie beispielsweise Phosphat, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Glycin und dergleichen, die ihre maximale Pufferwirkung im gewünschten pH-Bereich ausüben, während die Leitfähigkeit des Mediums in einer Grössenordnung gehalten wird, die niedriger ist als diejenige des unbehandelten Plasmas. Aus diesem Grunde sind besonders amphotere Puffersalze geeignet und bevorzugt, beispielsweise die den pH-Wert stabilisieren aber die Leitfähigkeit des

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Mediums nicht wesentlich beeinflussen. Andere amphotere Substanzen sind verschiedene andere Aminosäuren, einschliesslich Alanin, oder Di- oder Tripeptide, einschliesslich Glycyl-Glycin und Glyeyl-Glycyl-Glycin. Solche Produkte sind im Handel leicht erhältlich und schaffen einen entsprechenden Bereich isoelektrischer Punkte.

5. Frühere Forscher waren nicht in der Lage, Techniken, wie Zwangslauf-Elektrophorese oder Elektrodekantieren zur Herstellung irgendwelcher anderer Plasmafraktionen - mit Ausnahme von Gamma-Globulin - anzuwenden. Insbesondere Albumin konnte nicht mit ausreichender Reinheit zur Verwendung als Plasmastrecker gewonnen werden. Dies kann aber nun durch das erfindungsgemässe Verfahren geschehen, und zwar als Ergebnis folgender Schritte:

(a) Ausschalten des Niederschlags der Cohn II und III Fraktionierungsstufenj

(b) Ausfällen von Euglobulinen oder euglobulinartigen Stoffen durch elektrodialytisches Entsalzen;

(c) Verbesserte Bedingungen während des Fraktionierens als Ergebnis niedrigeren Salzgehalts und Einführen entsprechender Puffer in die zu behandelnde Flüssigkeit, wie es untere und 4 weiter oben erläutert ist; und

(d) schliesslich die mögliche Anwendung spezieller Bedingungen während der Fraktionierung selbst.

Diese speziellen Bedingungen (d) sind es wert, näher betrachtet zu werden:

Sowohl beim Elektrodekantieren als auch bei der Zwangslauf-Elektrophorese wird der einfliessende Strom des Ausgangsmaterials in zwei Fraktionen geteilt. Die beweglichsten Komponenten werden in die dekantierte Fraktion am Boden der durch die Membran eingeschlossenen Kammern abgesondert. Diese- umfassen die gewünschten Albuminfraktionen. Die weniger beweglichen oder isoelektrischen Komponenten werden im oberen Teil dieser Kammern abgesondert. Die relative Verteil-ung der Komponenten in den beiden Ausflüssen, die einfachheitshalber hierin als der obere bzw. der untere Aus-

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fluss bezeichnet werden, ist ejLne Punktion vieler Faktoren, einschliesslich des elektrischen Feldes, der Leitfähigkeit, der Temperatur, der relativen Konzentrationen und der Beweglichkeit jeder Komponente des Gemisches.

Als Regel gilt bei konstantem oberen Fluss, je langsamer der untere Fluss umso höher ist sein gesamter Proteingehalt. Es wurde nun gefunden, dass bei Parallelisierung dieser erhöhten Proteinkonzentration auch eine erhöhte Reinheit der Albuminfraktion erzielt wird, die im unteren Ausfluss gewonnen wird. Für eine optimale Proteinkonzentration ist es erforderlich, die Konzentration des unteren Ausflusses zwischen 15 bis 25$ Gesamtproteingehalt zu halten. Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, dass das Verhältnis der oberen und unteren Flussgeschwindigkeiten zwischen 8 : 1 und 15 : 1 gehalten wird, und zwar abhängig von der Konzentration des Ausgangsmaterials.

Die Zwangslauf-Elektrophorese und die Elektrodekantierung wurde unter Verwendung von Bauteilen der in der US-PS > 079 318 beschriebenen Anlage durchgeführt. Es wurden drei verschiedene Arbeitsgänge erfolgreich erprobt. Diese sind schematisch in den Figuren dargestellt, die schaubildlißh Seitenansichten der Membrane und Filter zeigen, welche in der verwendeten Apparatur eingesetzt waren. Die Figuren zeigen nicht die Abstandhalter, die die Bauteile in ihrer richtigen Lage halten, die Ein- und Auslässe aufweisen können. Die durchgezogenen Linien stellen Membrane dar, die üblicherweise bei der passiven Dialyse eingebe.·-.; setzt werden, d. h. elektrisch neutrale Membrane, wie beispielsweise regenerierte Cellulose (erhältlich unter dem Warenzeichen "Visking" von Union Carbide). Die gestrichelten Linien bedeuten Filter, die in verschiedenen Ausführungen brauchbar sind, beispielsweise Filterpapier (wie Whatman Nr. 54), mikroporöse Filter, wie sie von Millipore oder der Gelma Corp. angeboten werden, ober bestimmte Arten von Batterie-Trennelementen, wie sie von der Mallory Corp. verwendet werden.

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Der wesentliche Unterschied zwischen Filter und Membran, wie sie oben besehrieben sind, besteht darin, dass die Filter für Proteine durchlässig sind und einen Gesaratdurchfluss der Flüssigkeit gestatten. Membrane dagegen halten Proteine zurück und erlauben keinen allgemeinen Durchfluss der Flüssigkeit, sondern nur eine langsame Ultrafiltration. Die Pfeile in den Figuren zeigen die Richtung der Strömung der Flüssigkeitsn durch die Apparatur an.

Fig. 1 veranschaulicht das Elektrodekantieren, während die Fig. 2 und 3 zwei Modalitä-ten der Zwangslauf-Elektrophorese zeigen, die sich durch die Lage des Einlasses unterscheiden. Diese beiden I Modalitäten^weisen etwas verschiedene Ergebnisse auf und können ausgetauscht werden.

Die Figuren verdeutlichen auch den wesentlichen Unterschied zwischen dem Elektrodekantieren und der Zwangslauf-Elektrophorese. Bei der letztgenannten trennen die Filter jede elektrophoretische Kammer in zwei Unterabteilungen, Die Filter wirken im wesentlichen als Reibungsgrenze zwischen nach unten und nach oben fliessenden Teilen der Flüssigkeit und tragen so wesentlich zu der Wirksamkeit des Verfahrens bei. Die Zwangslauf-Elektrophorese ist eine bevorzugte Arbeitsweise. Mit dem Elektrodekantieren werden aber im allgemeinen ähnliche Ergebnisse erzielt.

Ein erwünschtes, jedoch nicht wesentliches Merkmal des Verfahrens ist die Trennung einzelner elektrophoretischer Kammern voneinander durch Kanäle, durch die entsprechende Elektrolyse fliessen. Der Elektrolyt trägt vornehmlich zur maximalen inneren Kühlung der Apparatur bei und aus diesem Grund wird der Elektrolyt durch einen ausserhalb der Anlage vorgesehenen kühlenden Wärmeaustauscher geführt.

Dieser Elektrolyt ist vorzugsweise ein Puffer, wobei die gleichen Überlegungen gelten, wie sie weiter oben im Zusammenhang mit dem Puffer der behandelten Proteinlösung beschrieben ist. So können als Puffer Phosphat, Glycin, Natrium-octanoat und

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dergleichen verwendet werden. Die elektrische Leitfähigkeit des Puffers muss die gleiche sein wie die Leitfähigkeit der behandelten Proteinlösung, um ein relativ einheitliches elektrisches Feld in der gesamten Apparatur zu sichern. Dieser Puffer spielt auch eine weitere wichtige Rolle beim Fraktionieren von Alkohol enthaltenden Proteinlösungen. Durch Diffusion durch die Membrane kann ein wesentlicher Teil des Alkohols, da wo es erwünscht ist, aus den abfliessenden Proteinlösungen entfernt werden.

Beispiel 1

Dieses Beispiel veranschaulicht defl Unterschied zwischen Euglobulinen und euglobulinartigen Stoffen, d. h. den Unterschied zwischen dem Fällen entsälzener Proteine in Abwesenheit oder in Gegenwart von 10$ Alkohol. In einer Elektrodialysezelle bestehend aus zwei Paar kationischen und anionischen Membranen 9 χ 10" wurden zwei Liter Rinderplasma entsalzt bis der spezifische elektrische Widerstand von 200 000 Ohm-cm bei einem pH-Wert 5,2 erreicht war. Es wurde ein voluminöser Niederschlag erhalten, der bei 0° C zentrifugiert wurde. Die Analyse der obenschwimmenden Masse zeigte einen Gehalt von 84$ Albumin mit noch etwa 4$ Gamma-Globulin. Die Zugabe von 10 Vol.-$ Alkohol bei 0° C zu der obenschwimmenden Masse ergab eine zweite Fällung, die wieder bei der gleichen Temperatur zentrifugiert wurde. Die Analyäe der obenschwimmenden Masse ergab 95$ Albumin und weniger als 0,5$ Gamma-Globulin.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigte die Gewinnung durch Entsalzen einer mit Albumin angereicherten Fraktion von der sogenannten Conn II + III obenschwimmenden Fraktion, die durch Fällen von Plasma mit 18$ Alkohol erhalten worden war. Es veranschaulicht auch den Vorteil der selektiven Wiederauflösung eines Teiles des Albumins, das mit der euglobulinartigen Fraktion gefällt wurde, sowie die Wirkungen des elektrischen Widerstandes und des pH-Wertes auf die Reinheit der so erhaltenen Fraktionen. Zwei Liter der Cohn II -f III obenschwimmenden Fraktion wurden wie in Beispiel 1 ent-

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salzen und in 100 ml Proben getrennt. Jede Probe wurde getrennt behandelt, wobei alle Flüssigkeiten während der Behandlung, auch während des Zentrifugierens bei 0° C gehalten wurden.

Nach sorgfältigem Entsalzen betrug der Widerstand der Proteinlösung 240 000 Ohm-cm, der pH-Wert 5,2. In einigen Proben wurde der Widerstand durch Zugabe konzentrierter Natriumehloridlösung gesenkt, was nur einen vernachlässigbaren Einfluss auf den pH-wert hatte. In zwei Proben wurde der pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxyd erhöht. Dabei wurde ein wesentliches Absinken des Widerstandes beobachtet. Nach diesen Einstellungen wurden alle Proben zentrifugiert, dekantiert und der Niederschlag gewaschen, und zwar in der Hälfte des ursprünglichen Volumens von entweder destilliertem Wasser oder eine Alkohollösung der angegebenen Konzentration. Der Niederschlag wurde sorgfältig wieder in der Waschlösung suspendiert und die Suspension erneut zentrifugiert. Die obenschwimmende Masse ist das "wiedergewinnbare Albumin", während der Rest der Niederschlag ist. Die Daten in Tabelle 1 zeigen den Albumingehalt in allen Fraktionen:

Tabelle 1

Es ist deutlich erkennbar, dass die Reinheit des gewonnenen Albumins durch den Alkoholgehalt des Suspensionsmediums stark beeinflusst wird. Während die Niederschläge noch einen relativ hohen Albumingehalt haben können, ist der Verlust an Albumin, wenn das geringe Gewicht des Niederschlages in Betracht gezogen wird, weniger als Q% des Gesamtalbumins. Die Ausbeute beträgt mehr als 90,^ in allen Fällen.

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Beispiel

cn

co. .

cc

Tabelle 1

Wirkung des pH-Wertes, Widerstand und Alkoholgehalt auf die Reinheit von Proteinfraktionen

Spez. Wider stand (Ohm-cm)	pH- Wert	Obenschwim- mende Pl. Alb. %	Waschen % Alkohol	Gewinnung % Alb.	Fällung % Alb.
240,000	5.2	95.5	15	93.1	70.5
240,000	5.2	95.3	10	95.9	62.5
240,000	5.2	95.8	5	9I.O	35.0
240,000	5.2	97.0	0	85.2	37.4
100,000	5.3	94.6	0	81.4	35.4
45,000	5.3	96.Ο	0	83.5	33.4
21,000	5.3	92.8	0	79.5	27.5

(V)

4=·

ro cn

co co ο co

Tabelle 1
(Fortsetzung)

Beispiel Spez. Wider- pH- Obenschwim- Waschen Gewinnung Fällung stand Wert mende Fl. % Alkohol % Alb. % Alb. (Ohm-cm) Alb. %

	8	10,000	5.3	92.I
cn σ to OO	9 10 11	6,300 58,000 30,000	-5.3 5.4 5.7	96,2 9^.9 9I.2
tr

0 0 0 0

71.2 2.5

62.4 9.2

74.6 3.1

60.2 3.2

CD CD CD CD

Beispiel 3

Dies Beispiel zeigt die Wirkung der Temperatur während der Trennung des euglobulinartigen Niederschlags von dem Alkohol enthaltenden Plasma. Das Ausgangsmaterial war das gleiche wie in Beispiel 2, d. h. sorgfältig entsalzene Cohn II + III oben-

wurde
schwimmende Fraktion. Diese / · in 100 ml Proben geteilt und bei den in Tabelle 2 angegebenen Temperaturen zentrifugiert. Alle Niederschläge wurde wieder in einem gleichen Volumen von 10^ Alkohol in destilliertem Wasser suspendiert und ein zweites Mal zentrifugiert. Dieses Waschen wurde ein zweites Mal wiederholt, wobei eine zweite wiedergewinnbare Albuminfraktion und der Endniederschlag erhalten wurden. Alle Verfahrensschritte wurden unter genauer Kontrolle der Temperatur durchgeführt, wie sie zusammen mit den anderen Daten in Tabelle 2 angeführt ist.

Tabelle 2

Prozent Albumin bei der angegebenen Temperatur Probe (0⁰C) (5° C) (10° C) (15° C)

91,8 85,5

90,1 85,5 .

78,1 78,0

5,5 5,0

1. obenschwimmende	97,7	9^,0
Masse	9M	91,2
1. Gewinnung	89,2	82,3
2, Gewinnung	17,5	10,2
Niederschlag
Beispiel 4-

Dieses Beispiel veranschaulicht die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens bei der Herstellung eines Albuminkonzentrats, wobei eine Alkohol enthaltende Plasma-Protein-Praktion entsalzen, das Albumin durch Waschen in 10^-igem Alkohol teilweise gefällt und gewonnen und schliesslich konzentreirt wurde. Weiter wurden die kombinierten obenschwimmende Anteile der ersten euglobulinartigen Fraktion und des gewonnenen Proteins durch Zwangslauf-Elektrophorese gereinigt.

Das Ausgangsmaterial waren 10 Liter obenschwimmende Masse der

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sogenannten Conn Fraktion IV-I, die ein späterer Zwischenverfah:- rensschritt bei der Alkoholfraktionierung ist. Das Ausgangsmaterial wurde zuerst wie in Beispiel 1 entsalzen, wobei eine fünf Membranpaare fassende Zelle verwendet wurde. Die gefällte euglobulinartige Fraktion wurde zentrifugiert und zweimal mit 1 Liter Anteilen einer 10^-igen Lösung von Alkohol in destilliertem Wasser gewaschen. Die obenschwimmenden Massen dieser Albumingewinnung wurden mit der obenschwimmenden Masse der ersten Zentrifugierung zusammengegeben. Dieses Gemisch wurde durch Zugabe von Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert 7,5 eingestellt und durch die Zwangslauf-Elektrophorese konzentriert. Dies geschah in einer Anordnung von fünf Zellen, wie sie in Fig. 2 gezeigt ist, wobei ein unteres Konzentrat aus Albumin und eine obere Abflussfraktion erhalten wurde. Die Ergebnisse der Fraktionierung sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3

Das Albuminkonzentrat hatte nur 5# Alkoholgehalt, während die ursprüngliche Eingabe, nämlich die Cohn-Fraktion IV-I einen Alkoholgehalt von 4o# aufwies. Daraus folgt, dass die Zwangslauf-Konzentration aufgrund der Dialyse den Alkoholgehalt wesentlich gesenkt hat.

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Tabelle 3

Herstellung eines Albuminkonzentrats von der Cohn-Fraktion

IV-I

	Beispiel	Volum (L)	Proteine- konz. (gms/L)	Albumin	Gesamt- Protein (gms)	Gesamt Albumin (gms)	Ausbeute Albumin
οι ο CD	Vorrat Albumin	10 1.25	23.2 167.5	90.6 96.5	232 209.4	210 200.8	95.7
cn	Präzipitat	0.4	54.6	40.3	21.9	8.8	4.2
-j	Ablauf	12	.3	40.0	3.6	1.4	0.7

cn

CO

ro cn

CD CD CD CD

Beispiel 5

Diese Beispiel zeigt die neue Methodik zur Gewinnung wertvoller Fraktionen aus bisher verworfenen Substanzen. Ausgangsmaterial waren 2,000 g feuchter Niederschlag von der sogenannten Stufe Iv-4 der Cohn Alkoholfraktionierung. Dieses Material enthielt hauptsächlich alpha- und beta-Globuline, aber auch zwischen 40 und 50$ Albumin, das bisher weggeworfen wurde. Dieser Niederschlag wurde in 10 Liter Wasser suspendiert und sorgfältig wie in Beispiel 1 entsalzen. Dann wurde 1 Liter Alkohol zugegeben, während die Lösung bei 0° C gehalten wurde. Es bildete sich ein reichlicher Niederschlag. Die obenschwimmende Masse wurde durch Zentrifugieren geklärt und es wurde gefunden, dass sie etwa 1,6% Albumin einer Reinheit von 90,5$ enthielt. Aus den 2,000 g

der Paste wurden insgesamt I8o g Albumin gewonnen. Die Paste enthielt etwa 320 g Albumin, so dass über 50% des bisher weggeworfenen Albumins wiedergewonnen wurden.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zum Fraktionieren flüssiger Lösungen von Proteingeniischen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasma, Serum und deren Fraktionen,

dadurch gekennzeichnet, dass a) die Lösung· igexi im pH-Bereich 4,8 bis β einer Elektrodialyse unterworfen wird; b) diese Elektrodialyse bei Temperaturen unter 15° C durchgeführt wird; c) die Elektrodialyse so lange fortgesetzt wird, bis der spezifische Widerstand des erhaltenen Gemisches 1000 0hm-cm übersteigt und eine Fraktion des Proteingemisches ausfällt; d) der Niederschlag von der obenschwimmenden löslichen Proteinlösung getrennt und e) diese Lösung gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der spezifische Widerstand des erhaltenen Gemisches .nach Beendigung der Elektrodialyse im Bereich von 50 000 bis 200 000 Ohm-cm und

die Temperatur unter etwa 5° C gehalten werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die entsalzende Elektrodialyse so lange fortgesetzt wird, bis ein End-pH-Wert von 5,j5 - 0,2 erreicht ist, wobei dies der isoelektrische Punkt von Euglobulin und/oder euglobulinartigen Proteinen ist.

4. Verfahren nach Anspruch J5* dadurch gekennzeichnet, dass die gefällte und unter d) abgetrennte Fraktion das Euglobulin oder die euglobulinartigen Proteine im Plasma sind.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das vom Plasma herrührende Proteingemisch eine Albumin enthaltende Fraktion ist, die durch die Cohn Alkohol-Plasmafraktionierung gewonnen wird, wie die Cohn II + III obenschwimmende Fraktion, die mindestens 20$ Alkohol enthält, wobei die bei der Elektrodialyse ausgefällte und anschliessend abgetrennte Euglobulin- nnd euglobulinartige Fraktion hauptsächlich alpha- und beta-Globuline enthält, wodurch ein reineres Albumin in der gewonnenen löslichen Proteinfraktion erhalten

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6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet , dass die von e) gewonnene entsalzne obenschwimmende lösliche Proteinlösung mit Alkohol behandelt und dabei ein Niederschlag aus Proteinen gefällt wird, der im wesentlichen aus Albumin besteht'.

7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5* dadurch gekennzeichnet, dass die elektrodialysierte Lösung oder Suspension auf einen Alkoholgehalt von 10 bis 20$ eingestellt wird, wobei dieser Alkoholgehalt im elektrodialysierten Plasma oder der vom Plasma herrührenden Lösungen oder Suspensionen eine optimale Fraktionierung von Euglobulin oder euglobulinartigen Proteinen aus den obenschwimmenden löslichen Proteinen bewirkt, wodurch in der obenschwimmenden Fraktion ein reineres Albumin erhalten wird, die abgetrennt und gewonnen wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 j 6 oder 7* dadurch gekennzeichnet, dass das gewonnene Euglobulin oder das euglobulinartige Material teilweise in einer 5 bis 15$ Alkohol enthaltenden Lösung wieder gelöst wird, und die erhaltene obenschwimmende Proteinlösung mit der gewonnenen Albumin enthaltenden löslichen Proteinfraktion zusammengegeben wird.

9- Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die von e) gewonnene obenschwimmende lösliche Proteinlösung mit einem Puffermittel behandelt wird, um den pH-Bereich für optimale elektrophoretische Proteinbeweglichkeit zu schaffen, und dann die Lösung durch eine Elektrofeld-Trennung behandelt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung durch Elektrofeld ein Elektrodekantieren ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung durch Elektrofeld eine Zwangslauf-Elektrophorese ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die bei d) abgetrennte gefällte Fraktion durch Zugabe einer alkalischen Lösung wiedergelöst und dabei der pH-

b Π 9 Η 4 7 / 1 1 δ

Wert auf etwa 6 eingestellt und anschliessend die wiedergelöste Fraktion erneut elektrodialysiert wird.

IJ. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die gewonnene obenschwimmende" lösliches Protein enthaltende Lösung von e) amphoter ist und mit amphoteren Puffermitteln behandelt wird, die eine starke Pufferwirkung haben aber die spezifische elektrische Leitfähigkeit der Lösung nicht oder nur wenig beeinflussen.

14. Verfahren nach Anspruch 9 oder IJ, dadurch gekennzeichnet, dass als amphoterer Puffer Trid-(hydroxymethyl)-aminomethan, Glycin, Alanin, Glycyl-Glycin oder Diglycyl-Glycin verwendet wird.

15. Verfahren nach Anspruch 9* dadurch gekennzeichnet, dass das gepufferte Produkt der Dialyse während der Elektrofeld-Trennung in obere und untere Ausflussströme getrennt wird, wobei die Strömungsgeschwindigkeiten der oberen und unteren Ströme in einem Verhältnis von 8 : 1 bis I5 : 1 gehalten werden.

16. Verfahren nach Anspruch 1, zur Herstellung eines Aiuminkonzentrats, das als Plasmastrecker brauchbar ist, dadurch gekenn_T zeichnet, d>ass das Plasma mit Alkohol behandelt wird, um die Cohn II und III Fraktionen zu fällen und auszuscheiden, die obenschwimmende Masse bei Temperaturen unter etwa 5° C einer Elektrodialyse unterworfen wird, bisr die gesamten Euglobuline und euglobulinartigen Fraktionen ausgefallen sind, diese Fraktionen abgetrennt undgewonnen und die obenschwimmende, lösliches Protein enthaltende Lösung abgetrennt wird, die ausgefällten Fraktionen in einer 5 bis 15$ Alkohol enthaltenden Lösung gemischt werden, der Rückstand von der obenschwimmenden Masse abgetrennt wird, die reich an Albumin ist und mit der obenschwimmenden, das lösliche Protein enthaltenden Lösung zusammengegeben wird, dieses Gemisch gepuffert und auf einen pH-Wert eingestellt wird, bei dem die optimale elektrophoretische Proteinbeweglichkeit gegeben ist, diese gepufferte Lösung bzw. Flüssigkeit in eine Vorrichtung zur Elektrofeld-Trennung eingeführt wird, eine elektrische Spannung zur Trennung der Proteinfraktionen angelegt

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angelegt und die in der gepufferten Flüssigkeit zwischen den c . .^ oberen und unteren Ausflüssen enthaltenen Proteinfraktionen getrennt werden und schliesslich das Alüuminkonzentrat aus dem unteren Ausfluss gesammelt wird.

17. Albuminkonzentrat hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 16.

18. Albuminkonzentrat aus dem Plasma zur Verwendung bei der Herstellung von Plasmastreckern, bestehend aus mindestens 90$ Albumin, wobei dieses Konzentrat im wesentlichen frei ist von ionischen Salzen, Euglobulinen und euglobulinartigen Stoffen.

19. Verfahren zum Fraktionieren von Gemischen aus wässrigen Proteinlösungen aus natürlich vorkommenden biologischen Medien, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Lösungsgemische einer entionisierenden Elektrodialyse bei einem pH-Wert von - 0,2 des isoelektrischen Punktes der Gemische und bei Temperaturen unter 15° C unterworfen werden; b) die entionisierende Dialyse so lange fortgesetzt wird, bis im wesentliche alle ionisierbaren Salze aus dem Gemisch entfernt sind, was durch den spezifischen Wiederstand des Dialisats angezeigt wird, der über 50 000 Ohm-cm ansteigt; c) die ausgefällte Proteinfraktion, die in der erhaltenen entionisierten obenschwimmenden, lösliches Protein enthaltenden Lösung unlöslich ist, abgetrennt wird.

20. Verfahren nach Anspruch I9, dadurch gekennzeichnet, dass die Gemisch aus Proteinlösungen aus natürlich vorkommenden biologischen Stoffen herrührt, wie Milch, Molke, Urin, Rückenmarksflüssigkeit, Hühnereiweiss, Blutplasma, Serum und deren Gemische.

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