HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft offenporiges, geschäumtes
Cellulosematerial, das als Träger für Ionenaustauscher zur
Züchtung von tierischen Zellen verwendet wird, das leicht zu
handhaben ist und eine große Oberfläche pro Gewichtseinheit
aufweist.
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Insbesondere betrifft die Erfindung einen
Cellulose-Ionenaustauscher, der durch die Einführung einer funktionellen
Ionenaustauschergruppe in ein offenporiges, geschäumtes
Cellulosematerial erhalten wird, der leichter zu handhaben und
größer hinsichtlich der Oberfläche pro Gewichtseinheit ist
als herkömmliche, gelähnliche Ionaustauscher. Diese Erfindung
richtet sich auch auf einen Träger für tierische
Zellkulturen, der leichter zu handhaben ist als herkömmliche
Mikroträger für tierische Zellkulturen und wo tierische Zellen
gezüchtet werden können, während die Zellen darauf mit hohen
Dichten immobilisiert sind ohne Nachteil für eine Umgebung,
die sich gut für das Zellwachstum eignet.
Angaben zum Stand der Technik
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Die bis jetzt auf diesem Gebiet benutzten industriellen
Ionenaustauscher haben ihren Ursprung in einer Entdeckung von
Adam et al. in England im Jahre 1935, daß Kondensate von
Phenolverbindungen mit Formalin Alkalien absorbieren,
während Kondensate von Verbindungen auf Anilinbasis mit Formal in
Säuren absorbieren. Die Kommerzialisierung begann mit Erfolg
zum ersten Mal in Deutschland 1938. Seitdem erfuhren sie
steigende Zuwächse und sind für industrielle Zwecke
unerlässlich, u.a. für die Wasserentsorgung.
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Die meisten dieser Ionenaustauscher auf der Basis von Harzen
sind auf ihrer Oberfläche hydrophob. Je nachdem, was
ionengetauscht wird, oder in deutlicheren Ausdrücken, wenn
Polymermaterialien, z.B. hydrophile Biopolymere wie Proteine
ionengetauscht werden, können sie oft nachteilige Wirkungen
aufgrund ihrer hydrophoben Wechselwirkung mit solchen Polymeren
hervorrufen. Dies ist einerseits der Schwierigkeit
zuzuschreiben, die beim Elutionsbetrieb auftritt, teilweise weil
Ionenbindungen an der Adsorption nicht teilnehmen und
andererseits erfolgt eine Abstoßung durch elektrostatische oder
van der Waals'sche Kräfte, was zu einem schwerwiegenden
Abfall in der Adsorptionsfähigkeit führt.
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Ionenaustauscher auf Zellulosebasis, die von Sober et al.
1954 entwickelt wurden, haben andererseits so starke
hydrophile Oberflächen, daß bei Verwendung in wässrigen Medien die
Oberflächen ihrer Träger so betrachtet werden können, als
verhielten sie sich wie eine wässrige Lösung. Um es anders
auszudrücken, es erfolgt weder Adsorption noch Abstoßung
durch andere elektrostatische Kraft als ihrer ionischen
Wechselwirkung mit dem was ionengetauscht wird. Daher haben
solche Ionenaustauscher einen großen Vorteil, da man in einem
leichten Betrieb die Adsorption und Elution von Material
kontrollieren kann, selbst wenn es sich um sterisch
komplizierte Biopolymere wie ein Protein oder ein Lipid handelt, in
dem ein Molekül hydrophile und hydrophobe Anteile aufweist,
wobei die elektrostatische Kraft zwischen ihnen in einem
wässrigen System gut ausbalanciert ist. Dies ist so, weil
keine Wechselwirkung erfolgt, jedoch drei Arten von
elektrostatischer Kraft zwischen diesen drei Sätzen von Polymer und
Wasser auftreten; Polymer- und funktionelle Gruppen, welche
die Ionenaustauscher haben und funktionelle Gruppen, welche
die Ionenaustauscher haben und Wasser.
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Solche Ionenaustauscher auf der Basis von Celluloseträgern
sind nun in Bahnform (ebene und Filterbahnen) in Pulverform,
in Granulatform und in gelähnlicher Form im Handel
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Bei der Durchführung von Zellzüchtung können die meisten der
tierischen Zellen sich nicht vermehren, wenn sie nicht auf
der Oberfläche von Festmaterial abgeschieden sind. Aus diesem
Grund sollte irgendeine feste Oberfläche vorhanden sein,
gleichgültig, wie groß der Maßstab der Züchtung ist.
Insbesondere bei einem Versuch, die Massenkultur von Zellen zu
erzielen, wird nun jede mögliche Maßnahme benutzt um die
Oberfläche pro Züchtungsvolumen zu erhöhen und dadurch die
Produktivität zu erhöhen. Von diesen Maßnahmen ist die
üblichste von allen eine Mikroträgerkulturtechnik gemäß welcher
Mikroträger, die jeweils eine verhältnismäßig große
Oberfläche haben, in einem Züchtungsmedium suspendiert werden, um
die verfügbare Züchtungsfläche pro Züchtungsvolumen auf ein
Maximum zu vergrößern. Die Mikroträger, die zur Züchtung von
tierischen Zellen bestimmt sind, werden erhalten indem man
Polymere, wie Polysaccharid oder Polystyrol zu Perlen mit
einer Teilchengröße von 100 bis 300 µm formt, auf denen die
Zellen immobilisiert werden sollen. Zur Begünstigung der
Abscheidung der Zellen auf die Mikroträger können sie
entweder mit Collagen beschichtet oder durch chemische Synthese
positiv geladen werden. Der erstere Träger vom Collagentyp
hat den Vorteil, daß er eine höhere Bioaffinität zeigt als
das natürliche vorkommende Collagen, während der letztere
Träger vom Ladungstyp mehrere Vorteile hat, indem er dazu
fähig ist, schwimmende Zellen zu immobilisieren, die sonst
nicht an Ort und Stelle fixiert werden können und auch in der
Lage ist, wiederholt nach der Entfernung von Zellen unter
Verwendung von solchen Enzymen wie Protease usw.,
wiederverwendet werden zu können. Somit können beide Arten von Trägern
selektiv benutzt werden, je nachdem, wofür sie benutzt.
werden. Der Ladungstyp von Träger wird hergestellt indem man
ternäre Aminogruppen einführt, wie sie durch die
Diethylaminoethylgruppe dargestellt sind, oder quarternäre Aminogruppen
als Kationen, wie sie im typischen Fall unter den
Handelsbezeichnungen Cytotex 1 und Cytotex 2 erhältlich sind, die
von Pharmacia Co., Ltd. hergestellt werden.
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Obwohl sie im Hinblick auf die Morphologie nur begrenzt
nutzbar sind, können derzeit erhältliche
Cellulose-Ionenaustauscher im Laboratoriumsmaßstab benutzt werden, haben jedoch
den Nachteil, daß sie oft zur Verwendung in industriell
ausgedehntem Maßstab ungeeignet sind.
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Kurz gesagt, werden Ionenaustauscher in Bahn- oder Blattform
in solcher Weise benutzt, daß Papierfilter benutzt werden.
Zum Beispiel wurden sie vor allem als
Immobilisierungsschichten für die Papierchromatographie benutzt. Sie können
möglicherweise auch auf andere Weise benutzt werden; sie können in
Säulen gepackt werden, durch welche Flüssigkeiten für den
Ionenaustausch fließen, wobei eine Ultrafiltrationsmembran
spiralförmig als Immobilisierungsfolie für die sogenannte
Säulenchromatographie gewickelt würde. Die Erfahrung zeigt
jedoch, daß sie nicht für diesen Zweck benutzt werden können,
da die Möglichkeit auftritt, daß die Folie wegen mangelnder
Festigkeit und durch die Kraft, die durch das Fließen der
Flüssigkeit erzeugt wird, brechen kann.
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Selbst wenn sie für die Filtration gemäß dem üblichen
Verfahren für die Verwendung von Papierfiltern angewandt werden,
ist es unmöglich, die Filtrationsfläche größer zu machen als
den erforderlichen Raum wenn sie in ebener Form benutzt
werden, so daß man keine Zunahme der Ionaustauscherkapazltät
erhält. Aus diesem Grund können sie nicht benutzt werden ohne
sie speziellen morphologischen Behandlungen zu unterziehen.
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Pulverförmige Ionenaustauscher können möglicherweise als
Festschicht für die Dünnschicht-Chromatographie benutzt.
werden. Eine solche Verwendung wurde jedoch selten für die
Festschicht für Säulen-Chromatographie angewandt, worin sie für
den Ionenaustausch einer flüssigen Probe gepackt werden, da
die Größe der Teilchen es unmöglich macht, die
Fließgeschwindigkeit der Probenflüssigkeit zu erhöhen und die
Ionenaustauschwirksamkeit zu verbessern.
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Die pulverförmigen Ionenaustauscher eignen sich auch schlecht
zur Verwendung bei den sogenannten ansatzweisen Systemen,
wobei sie direkt in eine Probenflüssigkeit, die
ionengetauscht werden soll, eingebracht werden und dadurch selektiv
die erforderliche Substanz aus der Probenflüssigkeit
adsorbieren. Dies ist so, weil nicht nur die Rückgewinnung der
notwendigen Substanzen zeitraubend ist, sondern auch das
Waschen zuviel Zeit kostet.
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So haben diese zwei Arten von Ionenaustauscher nur Verwendung
für analytische Zwecke allein gefunden, da es klare Anzeichen
dafür gibt, daß sie nicht gut für die Verwendung in
ausgedehntem Maßstab geeignet sind.
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Andererseite wurden körnige oder gelförmige Ionenaustauscher
vor allem als chromatographische Festschichten benutzt, wobei
sie gepackt werden und für die selektive Adsorption der
erforderlichen Substanzen aus einer Probenflüssigkeit in diese
hineingegeben werden. Ihre Verwendung ist jedoch auf enge
Bedingungen begrenzt (wie so niedere Fließgeschwindigkeiten,
daß man keinen Druck in einem Zustand niederer ionischer
Stärke erzeugt) wegen der folgenden Nachteile: Einerseits
werden sie aufgrund ihrer geringen physikalischen Festigkeit
flachgequetscht wenn sie den Druck oder die Scherungskraft
erhalten, die durch erhöhte Fließgeschwindigkeit oder durch
Rühren erzeugt ist und andererseits ziehen sie sich leicht
zusammen oder erfahren eine Änderung im Durchmesser wenn
Probenflüssigkeiten von hoher Ionenstärke bei ihnen benutzt
werden, was Anlaß zu Veränderungen in der Packung in Säulen
und zur Kanalbildung gibt.
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Vom praktischen Standpunkt aus ist eine begrenzte Verwendung
nicht wünschenswert, da sie wenig zum Fortschritt der
Technologie
beiträgt. Insbesondere wenn eine gewisse Art von
Technologie Beschränkungen hinsichtlich der Maßstabsvergrößerung
hat, gibt es nur beschränkte Verwendung, z.B. die analytische
Verwendung, was für die künftigen industriellen Aussichten
schlecht ist.
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Bei Trägern für Tierzellenzüchtung sind die üblichsten ein
Mikroträger, der eine so große Oberfläche hat, daß man Zellen
in Masse züchten kann. Jedoch ist auch dieser Mikroträger
noch weniger zufriedenstellend hinsichtlich der Oberfläche.
Es gibt daher einen starken Bedarf bei den verschiedenen, an
Tierzellen interessierten Industrien für die Entwicklung
eines Trägers, der die Durchführung der Zellzüchtung bei
einer viel größeren Dichte ermöglicht. Überdies gibt es bei
Benutzung von Mikroträgern bei turbulent fließenden
Züchtungslösungen oder übermäßiger Packung in Züchtungslösungen
eine erhöhte Wahrscheinlichkeit, daß sie miteinander mit
großer Wucht zusammenstoßen, so daß die immobilisierten
Zellen in solchem Ausmaß Schaden nehmen, daß sie nicht überleben
können. Im Falle von Mikroträgern sind diese Probleme der
Tatsache zuzuschreiben, daß es nur ihre Oberfläche ist, wo
die Zellimmobilisierung erfolgt und nicht an irgendeiner
Stelle in ihnen.
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Aus der US-A-4332916 sind Ionenaustauscher-Polymere bekannt,
die sich zur Gewinnung, Konzentration und den Nachweis von
Schwermetallionen aus verdünnter, wässriger Lösung eignen.
Ihre Herstellung wird bewirkt durch Vernetzen von
Polyvinylphosphat oder Polyethylenimin an Stücken von
Regenerat-Celluloseschwamm irgendeiner zweckmäßigen Größe, z.B. gehackten
Stücken von Schwamm.
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Die FR-A-1297504 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von
ähnlichem Celluloseschwamm-Ionenaustauschmaterialien,
vorzugsweise in Form von Bahnen, Diaphragmen oder Blockstücken.
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EP 0420171 A1 bezieht sich auf einen Träger zur Züchtung von
tierischen Zellen, wobei der Träger eine gemahlene Matrix mit
einer dreidimensionalen Netzwerkstruktur aufweist und mit
einem faserigen Protein, wie Collagen oder Gelatine,
beschichtet ist. Diese Matrix kann aus Celluloseschaum
bestehen, jedoch ist kein vernetzbares Polymeres, das
Ionenaustauscherstellen aufweist, damit verknüpft..
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Insgesamt betrachtet, wurde nun der Schluß gezogen, daß die
grundlegenden Nachteile von Cellulose-Ionenaustauschern und
Trägern für die Züchtung tierischer Zellen alle von ihrer
morphologischen Konstruktion stammen können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Hauptziel dieser Erfindung ist die Überwindung der Probleme
der Cellulose-Ionenaustauscher und der Träger für die
Züchtung tierischer Zellen gemäß dem Stand der Technik, soweit
sie für die Praxis eingesetzt und kommerzialisiert sind,
nämlich daß sie umständlich und nur in sehr kleinem Maßstab
benutzt werden können, indem eine neue Art von Material
bereitgestellt wird, das für industrielle Zwecke in großem
Maßstab benutzt werden kann.
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Um dieses Ziel zu erreichen, wurde ein Celluloseträger
untersucht, der die folgenden Merkmale hat:
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1. leicht zu handhaben,
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2. ausgezeichnete Durchlässigkeit für Wasser,
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3. eine größere Oberfläche pro Gewichtseinheit und
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4. eine erhöhte physikalische Festigkeit.
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Als Ergebnis von Forschung und Untersuchung wurde nun
gefunden, daß ein offenporiges, geschäumtes Cellulosematerial
wirksam als solcher Celluloseträger ist.
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Das Material gemäß der Erfindung kann hergestellt werden,
indem man kleine Mengen von Verstärkungen und
cellulosebildenden, kristallinen Substanzen mit Viscose mischt, die durch
chemische Behandlungen von hochreinem Zellstoff erhalten
wird, der aus Holz hergestellt ist, und das Gemisch in eine
Form gibt, worin es erhitzt und dann für die Verfestigung
abgekühlt wird, wobei man alternativ die Mischung
tropfenweise in eine Verfestigungsflüssigkeit gibt, um dadurch Perlen
zu erhalten.
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Mit diesem so erhaltenen, offenporigen, geschäumten
Cellulosematerial können die folgenden Merkmale erhalten werden:
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Durch Verwendung dieses Materials als Ionenaustauscherträger
ist es möglich, die Trennung von Flüssigkeit vom
Ionenaustauscher zu erleichtern. Überdies ist es möglich, den
Ionaustauscher ansatzweise zu verwenden, da er Druckerhöhungen bei
einer Erhöhung der Fließgeschwindigkeiten und Scherkräften,
die durch Rühren entstehen, widersteht, und so eine
vergrößerte Ionenaustauschkapazität durch seine vergrößerte
Oberfläche zu realisieren, gestattet.
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Durch Verwendung dieses Materials als Trägerunterlage bei der
Züchtung tierischer Zellen ist es möglich, eine rasche Zufuhr
von Nährstoffen und Sauerstoff aus einer Kulturlösung zu den
Zellen zu erzielen. Dies ist so, weil die Züchtungslösung
leicht durch den Träger durch eine Anzahl von
kontinuierlichen kreuz und quer laufenden feinen Poren dringt. In diesem
Fall sollte jedoch der Porendurchmesser auf 0,1 bis 1,7mm
eingestellt werden. Andererseits kann durch Schlacken
bedingtes Material, das durch Zellen erzeugt wird, so rasch
entfernt werden, daß die Zellen nicht mehr auf dem Träger,
sondern auch durch den gesamten Träger wachsen können. Ein
derartiges Aufbaumerkmal gestattet es, daß die spezifische
Oberfläche etwa zehnmal größer ist als die der herkömmlichen
Mikroträger, bei denen nur die Oberfläche für die
Zellabscheidung zur Verfügung steht und macht es somit möglich,
Zellen mit viel höheren Dichten zu immobilisieren. Dieser
schwammartige, of fenporige, geschäumte Aufbau schützt auch
die Zellen darin und absorbiert Stöße, die durch die
Zusammenstöße zwischen den Trägerperlen erzeugt werden. Somit ist
es sehr unwahrscheinlich, daß Zellen durch Zusammenstöße
zwischen den Trägerperlen, die durch das Strömen einer
Züchtungslösung hervorgerufen sein können, Schaden nehmen können.
In entsprechender Weise schützt dieser Aufbau die Zellen
gegen große Scherkräfte, die in einem Inkubator wie einem
Drehkolben auftreten, so daß dessen Umdrehungen pro Minute
erhöht werden können bis eine ausreichende
Fließgeschwindigkeit erzielt ist. Solche Effekte machen es möglich, die
vorliegenden Träger mit höherer Dichte zu packen als dies bei
herkömmlichen Trägern möglich war.
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Der cellulosebildende Teil des offenporigen, geschäumten
Cellulosematerials hat eine so stark hydrophile Oberfläche,
daß sich seine Oberfläche wie eine wässrige Lösung verhalten
kann, wenn es in einem wässrigen System verwendet wird und
zeigt eine günstige Affinität für Biopolymere, wie Proteine
und Zellen. Da außerdem die Cellulose eine Vielzahl von
Hydroxylgruppen im Molekül enthält und eine Struktur zeigt, die
sich gut für die Einführung verschiedener funktioneller
Gruppen eignet, können Cellulose-Ionenaustauscher und Träger für
die Züchtung tierischer Zellen leicht aus Cellulose erhalten
werden, indem man funktionelle Ionenaustauschergruppen darin
einführt. Zu den funktionellen Ionenaustauschergruppen
gehören z.B. Gruppen, welche ein Stickstoffatom aufweisen, wie
primäre, sekundäre, tertiäre Aminogruppen und quarternäre
Ammoniumgruppen wie sie durch Aminoethyl-, Diethylamino- und
Triethylaminogruppen dargestellt werden, sowie Cyano-,
Thiocyanato- und Hydroxyaminogruppen; Gruppen, die zwei oder mehr
Stickstoffatome enthalten, wie diejenigen, die durch Ureido-,
Amidino-, Guanidino-, und Polyethylenimingruppen dargestellt
werden; heterocyclische Gruppen, wie sie durch Pyrrolyl-,
Pyridyl-, Piperidyl-, Chinolyl- und Morpholinylgruppen
dargestellt werden und stickstoffatomenthaltende
Kronenverbindungen, wie sie durch Azakron und Kryptand dargestellt werden;
sauerstoffatomhaltige Gruppen, wie Carboxylgruppen, wie sie
durch Carboxymethyl- und Iminodiessigsäuregruppen dargestellt
werden, heterocyclische Gruppen, wie sie durch eine
Furylgruppe dargestellt werden, cyclische Ether, wie sie durch 18-
Kron-6 dargestellt werden und Carbonylgruppen, wie sie durch
eine Hydroxaminsäuregruppe dargestellt werden;
phosphoratomenthaltende Gruppen, wie sie durch eine Phosphogruppe
dargestellt werden, Gruppen, die ein Schwefelatom enthalten, wie
diejenigen, die durch Mercapto- und Sulfogruppen dargestellt
werden und Gruppen, die zwei Schwefelatome enthalten, wie
diejenigen, die durch eine Dithiocarboxygruppe dargestellt
werden und heterocyclische Gruppen, wie diejenigen, die durch
eine Thienylgruppe dargestellt werden.
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Von diesen funktionellen Ionenaustauschergruppen ist eine
Polyethyleniminogruppe, wie sie unten formelmäßig angegeben
ist, die, die sich am besten für den Träger für die Züchtung
von tierischen Zellen gemäß der Erfindung eignet.
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{ -C&sub2;H&sub4;-N(-C&sub2;H&sub4;-NH&sub2;)-C&sub2;H&sub4;-NH-} n (1)
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Polyethylenimin ist ein transparentes, viskoses,
wasserlösliches Polymer, das durch Polymerisation in Gegenwart eines
sauren Katalysators erhalten wird und eine hochgradig
verzweigte Baumstruktur aufweist. Es sei hier auf die Gründe
Bezug genommen, warum die Polyethylenimingruppe die am besten
geeignete funktionelle Gruppe zur Einführung in den Träger
für die Züchtung von tierischen Zellen gemäß der Erfindung
ist. Einerseits kann sie die Zellabscheidung durch das
Merkmal verbessern, das später beschrieben wird, andererseits
kann sie einen nachteiligen Einfluß minimieren, den
synthetische funktionelle Ionenaustauschergruppen auf Zellen haben.
Mit anderen Worten ist es erwünscht, daß die Menge an nicht
natürlichen oder synthetischen funktionellen Gruppen, die
eingeführt werden sollen, soweit wie möglich vermindert wird.
Polyethylenimin, das die höchste Ionisierungsdichte unter den
existierenden Polymermaterialien hat, kann Zellen in der
geringsten Menge aufnehmen und man sagt, daß es ein stärker
zellrezeptiver, jedoch weniger cytotoxischer Träger für die
Aufnahme tierischer Zellen ist. Geradkettige funktionelle
Gruppen lösen sich leicht in einer Kulturlösung, wenn ihre
Molekularketten beschädigt und abgeschnitten werden, da sie
an einem Ende, das nicht an Träger gebunden ist, eluiert
werden. Aufgrund ihrer verzweigten Struktur, in welcher die
Endgruppen alle an Träger gebunden sind, wird jedoch die
Polyethylenimingruppe kaum freigesetzt. Bezugnehmend
einerseits auf die in gewöhnliche Mikroträger eingeführten
funktionellen Gruppen sind Monomere oder Dimere von ternären oder
quarternären Aminogruppen so aneinander gebunden, daß sich
niedermolekulare, gerade Ketten von den Trägern erstrecken
können. Wenn die gebundenen Bereiche einmal beschädigt oder
aus irgendwelchen unbekannten Gründen abgebrochen sind, kann
die funktionelle Gruppe freigesetzt werden, was eine
nachteilige Wirkung auf das Wachstum der Zellen hervorruft.
Bezugnehmend andererseits auf die niedermolekularen funktionellen
Gruppen, die in gewöhnliche Mikroträger eingeführt werden,
sind ihre Molekülketten, die sich von den Trägern erstrecken,
so kurz, daß Ladungen nur auf den Oberflächen des Trägers
selbst verteilt werden. Somit ist der Adsorptionsraum, der
für die Immobilisierung von Zellen auf den Trägern
erforderlich ist, auf die Trägeroberfläche selbst begrenzt. im
Gegensatz dazu kann Polyethylenimin nicht nur auf der Oberfläche
des Trägermaterials vorliegen, sondern auch in einem Raum,
der mehr oder weniger getrennt von den Trägern ist, was zu
einer Verbesserung in der Adsorptionswirksamkeit und so zu
einer Zunahme in der Fähigkeit, Zellen aufzunehmen, führt.
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Wenn man von ihrer Adsorptionsfähigkeit Verwendung macht,
werden die Ionenaustaustauscher zur Gewinnung von wertvollem
Material, zur Entfernung von Verunreinigungen, Verfärbung und
anderen Zwecken benutzt. Der offenporige, geschäumte
Cellulose-Ionenaustauscher der vorliegenden Erfindung zeichnet sich
dadurch aus, daß er industriellen Zwecken genügt. Zusätzlich
kann er möglicherweise nicht nur in der allgemeinen
chemischen Industrie, sondern auch in der Nahrungsmittelindustrie
Verwendung finden, da natürlich vorkommende Materialien, die
als Ausgangsmaterialien benutzt werden, ausgezeichnet
hinsichtlich Bioaffinität und toxisch harmlos sind. Ein Beispiel
des offenporigen, geschäumten Cellulose-Ionenaustauschers
dieser Erfindung ist ECTEOLA Cellulose, in die
Triethanolaminogruppen eingeführt sind. Allgemein erhältliche ECTEOLA
Cellulose hat eine Gesamtaustauscherkapazität von 0,2 bis 0,4
mequ./g, jedoch zeigt die ECTEOLA Cellulose gemäß der
vorliegenden Erfindung eine Gesamtaustauschkapazität bis zu 1,0
mequ./g.
BEISPIELE
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Die vorliegende Erfindung wird nun im speziellen, jedoch
nicht ausschließlich unter Bezugnahme auf einige Beispiele
beschrieben, in welcher die Kombination ECTEOLA/offenporige,
geschäumte Cellulose benutzt wird.
Beispiel 1
Protein-Adsorptionstest
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Vor dem Versuch wird eine Probe
ECTEOLA/Celluloseionenaustauscher in der OH-Form hergestellt.
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Genau gewogene 1 g der ungetrockneten Probe von
ECTEOLA/offenporigem Celluloseschaum wird in eine offene Säule
eingebracht, die dann mit einer Gesamtmenge von 1l 2N-NaOH zwei
Stunden lang behandelt wird. Nach Beendigung dieser
Behandlung werden die NaOH Rückstände in der Säule weggespült und
das Waschen mit deionisiertem Wasser wird wiederholt, bis die
Waschwässer kein Anzeichen von Alkali mehr zeigen. Die so
behandelte Probe wird für die anschließende Prüfung
verwendet, wobei sie ungetrocknet bleibt.
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Getrennt davon wird eine genau gemessene, konstante Menge der
Probe bei 105ºC 6 Stunden getrocknet, um das Gewicht an
Trokkenmaterial festzustellen. Der Wassergehalt wird dann durch
folgende Gleichung gefunden:
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Wassergehalt = (Gewicht vor Trocknen - Gewicht nach
Trocknen)/(Gewicht vor Trocknen)
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Humanes Serumalbumin (hergestellt von Wako Junyaku K. K.)
wird in deionisiertem Wasser gelöst und auf eine
Konzentration von 0,1% (Gew./Vol.) bei etwa pH 6,0 eingestellt.
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Vierzig (40) ml der 0,1%igen Albuminlösung werden in jeden
von zwei Kolben von 100ml Volumen eingegossen, von denen
einer als Blindwert benutzt wird. In den anderen Kolben wird
die Probe in der OH-Form gegeben.
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Nach gelindem Rühren läßt man die Kolben über Nacht stehen.
Die Träger werden auf einem Glasfilter abfiltriert und mit
mehreren Portionen von deionisiertem Wasser gewaschen. Danach
wird das Filtrat mit den vereinigten Waschwässern mit 0,1 N
HCl auf PH 6,0 eingestellt, um dessen gesamtes flüssiges
Gewicht zu messen.
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Die Absorptionen der Blindprobe und der Testlösung werden
kolorimetrisch bei 280nm gemessen. Die Adsorptionsfähigkeit
wird dann durch folgende Gleichungen gefunden:
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Menge an nicht adsorbiertem Protein (mg) = (Absorption von
Prüfflüssigkeit/Absorption von Blindprobe) x gesamtes
Flüssigkeitsgewicht (ml) x 1 mg/ml.
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Adsorption (mg) = (Menge an Protein vor Adsorption in 1 mg/ml
x 40 ml) - (Menge an nicht adsorbiertem Protein).
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Protein-Adsorptionsfähigkeit (mg Protein/g Trockengewicht)
= (Adsorption in mg)/(Gewicht der Probe (g) x (1 -
Wassergehalt)
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Die Ergebnisse der Versuche sind nachstehend wiedergegeben:
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Gewicht der verwendeten Proben 0,7233g
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Absorption der Blindprobe 0,4838 (Abs280nm)
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Absorption der Prüfflüssigkeit 0,1693
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Gesamtgewicht der Prüfflüssigkeit 85,5ml
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Probe zur Messung des Wassergehaltes
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Gewicht vor Trocknen 0,3124g
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Gewicht nach Trocknen 0,2808g
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Wassergehalt 0,101
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Adsorption 10,7mg
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Albumin-Absorptionsfähigkeit 16,4mg Albumin/g
Probe (Trockengew.)
Beispiel 2
Polypeptid-Adsorptionstest
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Polypepton (hergestellt von Nippon Seiyaku K. K.) wird in
deionisiertem Wasser gelöst und auf eine Konzentration von
0,25% (Gew./Vol.) bei pH 6,9 eingestellt.
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Achtzig (80) ml der 0,25%igen Polypeptonlösung werden in
jeden von zwei Kolben von 100ml Volumen gegossen, von denen
einer als Blindwert benutzt wird. In den anderen Kolben wird
die Probe in der OH-Form gegeben.
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Nach gelindem Rühren läßt man die Kolben über Nacht stehen.
Die Träger werden auf einem Glasfilter abfiltriert und mit
mehreren Portionen deionisiertem Wasser gewaschen. Danach
wird das Filtrat mit den vereinigten Waschwässern mit 0,1 N
HCl auf PH 7,0 eingestellt um ihr Gesamtgewicht zu messen.
Durch Kolorimetrie werden Absorptionen der Blindprobe und der
Prüfflüssigkeit bei 280nm gemessen, um ihre
Adsorptionsfähigkeit gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 zu berechnen.
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Die Ergebnisse sind anschließend angegeben:
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Gewicht der verwendeten Probe 0,2004g
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Absorption der Blindprobe 1,3342 (Abs280nm)
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Absorption der Prüfflüssigkeit 0,7493
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Gesamtgewicht der Prüfflüssigkeit 132ml
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Probe zur Messung des Wassergehaltes
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Gewicht vor Trocknen 0,2550g
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Gewicht nach Trocknen 0,2327g
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Wassergehalt 0,087
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Adsorption 14,7mg
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Polypepton-Adsorptionsfähigkeit 80,3 mg Polypepton/g
Probe (Trockengew.)
Beispiel 3
Aminosäure-Adsorptionstest
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Eine Aminosäure mit dem Handelsnamen L-Tylosine (hergestellt
von Wako Junyaku K. K.) wird in einer kleinen Menge von 0,1N
Natriumhydroxid gelöst und dann in deionisiertem Wasser auf
eine Konzentration von 0,0625% Gew./Vol. gelöst. Das pH der
Lösung, das mehr oder weniger, je nach der Menge an
Natriumhydroxid schwankt, liegt im Bereich von 11,5 bis 12.
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Achtzig (80) ml der 0,0625%igen Tylosine-Lösung werden in
jeden von zwei Kolben von jeweils 100ml Volumen gegossen, von
den einer als Blindprobe verwendet wird. In den anderen
Kolben wird die Probe in der OH-Form gegeben.
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Nach gelindem Rühren läßt man die Kolben über Nacht stehen.
Die Träger werden auf einem Glasfilter abfiltriert und mit
mehreren Portionen deionisiertem Wasser gewaschen.
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Danach wird das Filtrat mit den vereinigten Waschwässern auf
pH 11,5 bis 12 eingestellt um dessen Gesamtgewicht zu messen.
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Kolorimetrisch werden die Absorption der Blindprobe und der
Prüfflüssigkeit bei 293nm gemessen, um ihre
Adsorptionsfähigkeiten gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 zu berechnen.
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Die Ergebnisse sind nachfolgend angegeben:
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Gewicht der verwendeten Probe 0,3988g
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Absorption der Blindprobe 0,7751 (Abs293nm)
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Absorption der Prüfflüssigkeit 0,4526
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Gesamtgewicht der Prüfflüssigkeit 130ml
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Probe zur Messung des Wassergehaltes
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Gewicht vor Trocknen 0,2550g
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Gewicht nach Trocknen 0,2327g
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Wassergehalt 0,087g
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Adsorption 2,6mg
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Aminosäure-Adsorptionsfähigkeit 7,0mg Tylosine/g
Probe (Trockengew.)
Beispiel 4
Pigment Adsorptionstest
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Prüfungen wurden mit im Handel erhältlichen
Nahrungsmittelpigmenten (Esculentblau und -rot) und mit den folgenden
Komponenten durchgeführt.
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Esculentblau (hergestellt von Ogura Shokuhin Kako K. K.)
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Esculentblau Nr. 1 5%
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Esculentgelb Nr. 4 3%
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Dextrin 92%
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Esculentrot (hergestellt von Ogura Shokuhin Kako K. K.)
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Esculentrot Nr. 3 7%
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Dextrin 93%
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Die Esculentblau- und -rotpigmente werden beide in
deionisiertem Wasser auf eine Konzentration von 0,25% Gew./Vol.
gelöst.
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Zweihundert (200) ml der 0,25%igen Pigmentlösung werden in
jeden von zwei Kolben von jeweils 300ml Volumen gegossen, von
denen einer als Blindprobe benutzt wird und in den anderen
Kolben wird die Probe in der OH-Form gegeben.
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Nach gelindem Rühren läßt man die Kolben zwei oder drei Tage
stehen. Die Träger werden auf einem Glasfilter abfiltriert
und mit mehreren Portionen deionisiertem Wasser gewaschen, um
die Anteile der nicht adsorbierten Pigmente zu entfernen. Das
Filtrat wird mit den Waschwässern vereinigt, um eine
Prüfflüssigkeit herzustellen, deren Gesamtgewicht dann gemessen
wird.
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Kolorimetrisch werden die Absorptionen der Blindprobe und der
Prüfflüsssigkeit gemessen um ihre Adsorptionsfähigkeit gemäß
dem Verfahren von Beispiel 1 zu berechnen.
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Die Absorptionsbestimmung wird bei 630nm bei Esculentblau Nr.
1 und bei 410nm bei Esculentgelb Nr. 4 für das blaue
Nahrungsmittelpigment und bei 526nm mit Esculentrot Nr. 3 für
das rote Nahrungsmittelpigment gemessen.
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Die Ergebnisse sind nachfolgend angegeben:
Esculentblau
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Gewicht der verwendeten Probe 0,0415g
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Gesamtgewicht der Prüfflüssigkeit 180ml
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Blau Nr. 1
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Blindprobenabsorption 15,07 (Abs630nm)
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Absorption der Prüfflüssigkeit 13,34
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Gelb Nr. 4
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Blindprobenabsorption 4,03 (Abs410nm)
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Absorption der Prüfflüssigkeit 2,577
Esculentrot
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Gewicht der verwendeten Probe 0,0415g
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Gesamtgewicht der Prüfflüssigkeit 180ml
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Rot Nr. 3
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Blindprobenabsorption 14,87 (Abs526nm)
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Absorption der Prüfflüssigkeit 6,24
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Probe zur Messung des Wassergehaltes
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Gewicht vor Trocknen 0,2099g
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Gewicht nach Trocknen 0,1928g
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Wassergehalt 0,081
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Adsorption von Blau Nr. 1 3,4mg
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Adsorption von Geld Nr. 4 6,5mg
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Adsorption von Esculentblau
(Adsorptionen von Blau Nr. 1
+ Gelb Nr. 4) 9,9mg
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Adsorptionfähigkeit von Esculentrot 25,5mg
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Adsorptionsfähigkeit von
Esculentblaupigment 259,6mg Pigment/g
Probe (Trockengew.)
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Adsorptionsfähigkeit von
Esculentrotpigment 673,1mg Pigment/g
Probe (Trockengew.)
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Die Beispiele 5 bis 9 werden angegeben, um einige
Ausführungsformen des Trägers für die Züchtung tierischer Zellen
gemäß der Erfindung zu zeigen. Es sei jedoch darauf
hingewiesen, daß die vorliegende Erfindung keineswegs darauf
beschränkt ist.
Beipiel 5
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Polyethylenimin wurd kovalent an ein mercerisiertes,
offenporiges, geschäumtes Cellulosematerial mittels Epichlorhydrin
gebunden um ein Trägermaterial für die Züchtung tierischer
Zellen herzustellen. Das verwendete Polyethylenimin hatte ein
Molekulargewicht von 10.000 und das verwendete geschäumte
Cellulosematerial wurde in ein kubisches Stück mit einer 1mm
Seite geschnitten, wobei sich die Größe für die Zellzüchtung
eignete (hergestellt von Sakai Engineering Co., Ltd.).
Beispiel 6
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Zur Erzielung eines Trägermaterials für die Züchtung
tierischer Zellen oder eine Kombination ECTEOLA/Cellulose wurde
Triethanolamin kovalent an ein mercerisiertes, offenzellig
geschäumtes Cellulosematerial über Epichlorhydrin gebunden.
Das verwendete geschäumte Cellulosematerial wurde in die
gleiche Größe geschnitten wie in Beispiel 5.
Beispiel 7
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Ein mercerisiertes, offenporig geschäumtes Cellulosematerial
ließ man mit Monochloressigsäure reagieren um ein
Trägermaterial für die Züchtung tierischer Zellen herzugstellen, das
Carboxymethylgruppen eingeführt enthielt. Das geschäumte
Cellulosematerial wurde in die gleiche Größe wie in Beispiel
5 geschnitten.
Beispiel 8
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Ein mercerisiertes, offenporig geschäumtes Cellulosematerial
ließ man mit Monochloressigsäure zu Carboxymethylzellulose
reagieren, worin dann Polyethylenimin durch elektrostatische
Anziehung eingeführt und so ein Trägermaterial für die
Züchtung tierischer Zellen hergestellt wurde. Das verwendete
Polyethylenimin hatte ein Molekulargewicht von 70.000 und das
verwendete offenporige Cellulosematerial wurde in die gleiche
Größe geschnitten wie in Beispiel 5.
Beispiel 9
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Ein offenporiges, geschäumtes Cellulosematerial wurde in ein
kubisches Stück mit einer 3mm Seite geschnitten und dann zu
einem Trägermaterial für die Züchtung tierischer Zellen
geformt, indem man der Arbeitsweise von Beispiel 5 folgte.
Vergleichsbeispiel 1
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Als Trägermaterial für die Züchtung tierischer Zellen wurde
Cytotex 2 verwendet, hergestellt von Pharmacia Co., Ltd., in
welches N,N,N-trimethyl-2-hydroxy-aminopropylgruppen auf die
Oberflächen von vernetzten Dextrankörnern eingeführt wurden.
Vergleichsbeispiel 2
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Als Trägermaterial für die Züchtung tierischer Zellen wurde
Dormacel 1 benutzt, hergestellt von Pfeifer & Langen Co.,
Ltd., in welches Dimere von Diethylaminogruppen auf die
Oberflächen von vernetzten Dextrankörnern eingeführt wurden.
Illustrative Ausführungsformen
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Die Zellzüchtung wurde mit den Trägermaterialien der
Beispiele 5 bis 9 und der Vergleichsbeispiele 1 und 2 durchgeführt.
Die Anzahl der immobilisierten Zellen und die Konzentration
an wertvollem Material, das durch sie erzeugt wurde, wurde
bestimmt nachdem die Vervielfältigung einen stationären
Zustand erreicht hatte.
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Die Anzahl der Zellen wurde mit einem Erythrocytometer nach
Behandlung der Träger mit Trypsin gefunden. Die verwendeten
Medien waren E-RDFs, die von Kyokuto Seiyaku K. K.
hergestellt werden, die auch noch zusätzliche
Zellvervielfachungspromotoren erhielten, wie Insulin, Ethanolamin, Transferrin
und Selen. Die Immobilisierung zielte auf die Einstellung von
Fibroblasten und schwimmenden Zellen auf Null. Die
verwendeten Fibroblasten waren Mäusezell-Linien L929, in welche
humane Erythropoietin-Gene (im folgenden kurz EPO genannt)
eingebaut waren und die benutzten schwimmenden Zellen waren
antikörpererzeugende Mäuse-Hybridoma 16-3F Zell-Linien.
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Die Versuchsdurchführung beruhte auf einer stationären
Züchtung auf Petri-Schalen mit einer kontinuierlichen Züchtung in
einem Bioreaktor von schrägem Innenzylinderdrehtyp
(hergestellt von Sakai Engineering Co., Ltd.). Für die Züchtung im
Bioreaktor wurde der Träger mit 15% pro Volumen der
Züchtungslösung gepackt.
Versuchsergebnisse
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Wie aus den Tabellen 1 und 2 ersichtlich ist, erzielen die
Träger gemäß der Erfindung eine viel höhere Zelldichte der
Immobilisierung und eine viel höhere Produktivität als die
herkömmlichen Träger.
Tabelle 1
Dichte der Fibroblasten und Konzentration der dadurch
gebildeten EPO
(Zelldichte Zellen/ml)
(Konzentration an EPO U/ml)
Zelldichte auf Petri-Schalen
Bioreaktor Zelldichte
Bioreaktor Konzentration von EPO
Beispiel
Vergleichsbeispiel
Tabelle 2
Dichte der schwimmenden Zellen und Konzentration der dadurch
gebildeten Antikörper
(Zelldichte Zellen/ml)
(Konzentration an Antikörper mg/ml)
Zelldichte auf Petri-Schalen
Bioreaktor Zelldichte
Bioreaktor Konzentration von Antikörper
Beispiel
Vergleichsbeispiel
WIRKUNG DER ERFINDUNG
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Wie oben berichtet, wurde in erfolgreicher Weise ein
Ionenaustauscher erzielt, der leicht zu handhaben ist, eine viel
höhere Ionenaustauschkapazität pro Gewichtseinheit, eine viel
größere Oberfläche und eine viel größere physikalische
Festigkeit hat, indem ein offenporiges, geschäumtes
Cellulosematerial verwendet wurde, in das funktionellen
Ionenaustauschergruppen eingeführt wurden.
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Es wurden auch bei der Züchtung von tierischen Zellen ein
Trägermaterial erzielt, das die Zellimmobilisierung bei viel
höheren Dichten auszuführen ermöglicht. Dies ist so, weil es
funktionelle Gruppen enthält, die eine
Ionenaustauscherfähigkeit haben, wie sie sich am besten für tierische Zellen
eignet. Aufgrund seines spezifischen Aufbaus ermöglicht es
das vorliegende Trägermaterial, die Zellen gegen
physikalische Stöße zu schützen und die Medien um die Zellen rasch zu
metabolisieren, was es somit ermöglicht; eine Massenzüchtung
unter schweren Bedingungen dafür durchzuführen. Somit kann
das vorliegende Trägermaterial bei verschiedenen
Zellzüchtungsverfahren benutzt werden, je nachdem, wofür sie
industriell eingesetzt werden sollen.