DE2636206C3

DE2636206C3 - Trägerfixierte Enzyme sowie ihre Herstellung und Anwendung

Info

Publication number: DE2636206C3
Application number: DE2636206A
Authority: DE
Inventors: Winfried Dr. 6530 Bingen Hartmeier
Original assignee: CH Boehringer Sohn AG and Co KG
Current assignee: CH Boehringer Sohn AG and Co KG
Priority date: 1976-08-12
Filing date: 1976-08-12
Publication date: 1981-06-04
Also published as: BE857718A; CA1088009A; NO772816L; NO149550C; DK357677A; JPS5341489A; SE432779B; FR2361413A1; GB1557645A; JPS6221513B2; DK146446C; AU513438B2; DK146446B; FR2361413B1; US4182655A; IT1079813B; ZA774855B; MX4530E; DE2636206A1; CH632789A5

Description

Die Erfindung betrifft trägerfixierte Enzyme, die mittels Glutardialdehy,'- in Gegenwart einer enzymfällend wirkenden Substanz an einen wasserunlöslichen hochmolekularporösen Kunststoff gebunden sind, der _aus gehärtetem Protein besteht und eine Wasseraufnahmefähigkeit vom zwei- bis achtfachen seines Trockengewichtes aufweist Weiterhin betrifft die Erfindung die Herstellung dieser trägerfixierten Enzyme sowie ihre Anwendung zur Durchführung biotechnischer Reaktionen.

Aus der Fach- und Patentliteratur sind in den letzten Jahren zahlreiche Verfahren zur Fixierung von Enzymen an wasserunlösliche Trägerstoffe bekanntgeworden. Eine zusammenfassenden Übersicht gibt z. B. R. A.

Messing (Herausgeber): Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, Academic Press, New York, 1975. Grundsätzlich kommen nach dem bisherigen Erkenntnisstand für die Unlöslichmachung eines Enzyms vier Bindungsarten in Betracht: 1. die Adsorption, 2. die ionische Bindung, 1 die Verkapselung und 4. die kovalente Bindung an einen Träger oder der Enzyme untereinander. Auch Kombinationen dieser Immobilisiemngs-Grundtypen sind bekannt.

Enzyme, die durch Adsorption an einen enzymfreien

Träger wie z. B. Aktivkohle oder Polysaccharide gebunden sind, haben insbesondere den Nachteil, daß es infolge der relativ schwachen adsorptiven Bindung leicht zur Desorption kommt. Vor allem, wenn Änderungen der lonenkonzentration und derTemperatür eintreten, kann es leicht zu Lösung der Adsorptionsbindung und /um sogenannten »Ausbluten« der Enzyme kommen.

Im Falle einer ionischen Bindung des Enzyms an einen polyanionischen oder polykationiscfien Träger (wie z. B.

Ionenaustauscherharze) besteht ebenfalls der Nachteil der relativ schwachen Bindung zwischen polyionischem Träger und Enzym, da das Enzym in der Regel nur schwach ionische Gruppen aufweist. Ein entscheidender Nachteil ist auch die bei vielen Reaktionen störende lonenaustauscherwirkung der derart fixierten Enzyme, die dazu führt, daß im Verlauf eines Einsatzes z. B. zur Getränkebehandlung unbeabsichtigt gewisse Ionen aus dem Getränk entfernt werden.

Enzyme, die in polymere Stoffe (ζ. B. vernetztes Polyacrylamid) eingeschlossen (verkapselt) sind, haben als Hauptnachteil die relativ schwierige Diffusion durch das Molekularsieb des Einschlußmaterials. Die scheinbare Michaeliskonstante des derart eingeschlossenen Enzyms wird dadurch auch schon gegenüber niedermolekularen Substraten erhöht. Zusätzlich besteht die Gefahr, daß die eingeschlossenen Enzyme infolge ihrer Elastizität durch die Poren des Einschlußmaterials hindurchdringen und so »ausbluten«. ι ο

Bei dem vierten genannten Fixierungstyp ist das Enzym (covalent und damit sehr fest an eine reaktive Gruppe eines wasserunlöslichen Trägers gebunden. Weitaus die meisten Publikationen Ober Enzymfixierung und auch die vorliegende Patentanmeldung betreffen is diese Art Immobilisierung. Eine ganze Reihe derart hergestellter bekannter Präparate sind jedoch schon deshalb wirtschaftlich-technisch nicht anwendbar, weil zu teure Kupplungsreagenzien oder Trägersubstanzen oder zu aufwendige Herstellungsverfahren angewandt werden müssen. Bei der Kupplung nach den bisher bekannten Verfahren muß nämlich zumeist mir einen. erheblichen Enzymüberschuß gearbeitet werden, weil der überwiegende Teil der Enzyme bei der Kupplungsprozedur inaktiviert wird. Die meisten Verfahren lassen 2^r> auch nur einen geringen Anteil Enzyme pro Trägerstoff zu, weil die Trägerstoffe nur an ihrer Oberfläche mit Enzymprotein besetzt werden können. Teilweise Abhilfe kann zwar in Form feinster Vermahlung (Mikronisierung) der Fertigprodukte geschaffen werden, diese Präparate sind jedoch aufgrund ihrer Feinheit bei Anwendung in gepackter Säule (packed bed-Reaktor) nur schwer von einem Flüssigkeitsstrom zu passieren. Ein weiterer Nachteil der meisten Verfahren zur Enzymfixierung ist, daß die Trägerstoffe (z. B. Glas, ^ Diatomeenerde) an gewisse vorgegebene Formen gebunden sind und es nicht möglich ist, sie z. B. sowohl in Kugel-, Splitter-, oder Membranform oder als Überzug über anderen Materialien (z. B. Sieben) herzustellen. Manche Trägerstoffe und Kupplungsrea- -10 genzien sind auch wegen ihrer Toxizität bedenklich.

Einige der vorgenannten Nachteile bekannter fixierter Enzyme werden bei nichtproteolytischen Enzymen nach dem Stand der Technik bereits dadurch überwunden, daß man diese Enzyme z. B. mittels Glutardialdehyd an Kolhgen koppelt Die dera 1 hergestellten Präparate sind jedoch mikrobiell sehr anfällig und ihre spezifische Aktivität ist gering. Ähnlich verhält es sich mit Präparaten, die durch Vernetzung von Enzymen mit gelbildendem Protein errält werden (vgl. DT-OS so 22 46 002). Hierbei entsteht ein homogenes Gemisch, da Enzyme und «elbildendes Protein wahllos miteinander vernetzt werden. Diese Präparate sind zwar mikrobiell stabiler, ihre Wirkung ist jedoch mangelhaft, weil die Enzyme eben gleichmäßig Ober den gesamten Partikelquerschnitt verteilt liegen. Im Hinblick auf einen hohen Aktivitätserhalt kann die Vernetzung nur relativ schwach vorgenommen werden. Das führt zu derart weichen Präparaten, daß es bei Anwendung z. B. in einer Säule zum Verstopfen und zum Ausbluten der Enzyme so kommt. Im Falle stärkerer Vernetzung hingegen kommt es zur Inaktivierung infolge zu starker Bindung und infolge von Einschluß innenliegender Enzymmolekült. Ein erheblicher Nachteil bei den letztgenannten Fixierungsverfahren ist auch, daß sie nicht für proteoly- μ tische Enzyme angewandt werden können.

Aufgabe der vorliegenden. Erfindung war es, wasserunlösliche nichtproteolytische und proteolytische Enzympräparate herzustellen, die möglichst gleichzeitig die folgenden Vorteile Deinhalten:

— billige Herstellungsweise,

— hoher Aktivitätserhalt sowohl bei der Fixierungsprozedur wie auch nach langer oder wiederholter Anwendung,

— große Resistenz gegenüber Mikroorganismen,

— große Formvariabilität des Trägermaterials,

— gute Durchflußeigenschaften bei Anwendung in gepackter Form,

— hohe spezifische Aktivität,

— niedrige scheinbare Michaeliskonstante,

— keine unerwünschten Ionenaustauscher- oder Adsorptionseigenschaften,

— verträgliche, toxisch unbedenkliche Trägerstoffe.

Es wurde gefunden, daß trägerfixierte Enzyme erhalten werden, die alle vorgenannten Kriterien erfüllen, wenn man die Enzyme zunächst in wäßrig gelöster Form von einem quellfähippn, gehärteten (denaturierten) Protein mit der zwei- i.iis achtfachen Wasseraufnahmefähigkeit seines Trockengewichtes aufsaugen läßt und sie anschließend mittels Glutardialdehyd in Gegenwart einer enzymfällend wirkenden Substanz bindet Hierbei entstehen Präparate, bei denen das Enzyrii an bestimmten Stellen auf der Außenseite und im Inneren des hochmolekularporösen Trägerproteins mit vorgegebener Struktur gleichsam »angehängt« wird.

Als Rohstoff zur Herstellung des wasserunlöslichen Trägerstoffes kommen wasserlösliche Proteine verschiedener Art (z. B. Gelatine, Eiklar, Albumin, Sojaprotein u. a.) in Betracht Wesentlich ist daß diese Proteine durch Härtung (z. B. durch Formaldehyd, Glutardialde· hyd oder Diisocyanat) wasserunlöslich gemacht und gegebenenfalls durch sonstige Behandlung (z. B. denaturierende Temperatureinwirkung) so modifiziert werden können, daß s<e im Temperaturbereich zwischen 0 und 100° C eine im wesentlichen gleichbleibende Wasseraufnahmefähigkeit vom zwei- bis achtfachen ihres Trokkengewichts erhalten. Das Quellverhalten der unbehandelten Ausgangsproteine kann hingegen verschieden sein; trockene Gelatine nimmt z. B. in kaltem Wasser nur etwa 10% ( = ein Zehntel seines Trockengewichtes) Wasser auf, während Albumin und Eikbr in kaltem Wasser voll löslich sind. Es ist jedoch möglich, aus diesen beispielhaft genannten sowie anderen ursprünglich sehr unterschiedlichen Proieinen in einfacher Weise einen Kunststoff mit den erfindungsgemäß erwünschten Eigenschaften herzustellen, indem man das Ausgangsprotein in W isser bei geeigneter Temperatur löst, mit einem Härtungs- bzw. Vernetzungsmittel (z. B. Formalin) vernetzt und dann einer trocknenden Wärmebehandlung unterwirft Auf diese Weise ist die Erfindung nicht auf den Einsatz relativ teurer, gelbildender Proteine angewiesen, sondern es können auch minderwertige Proteine, z. B. Gelatine mit niedriger Bloomzahl oder auch überhaupt nicht mehr gelierende Abfall-Mflssiggelatine sowie andere nicht gelierende Eiweißstoffe verwendet werden.

Das Herstellungsverfahren für den Kunststoff, an dem die Enzyme fixiert werden sollen, kann innerhalb weiter Grenzen variieren, je nach dem verwendeten Ausgangsprotein, dem verwendeten Härtungsmittel, der gegebenen appara'iven Einrichtung, der gewünschten Trägerstoff-Form (z. B. Splitter, Kugeln, Membranen, Siebe u. a.) etc. Die Beispiele geben einige grundsätzliche Möglichkeiten an, deren beliebige

Abänderung im Ermessen und handwerklichen Können des Fachmannes liegt.

Als Härtungsmittel kommen übliche Protein-Härtungsmittel (z. B. Formaldehyd, Glutardialdehyd, Diisocyanat) in Frage. Besonders günstig ist die Verwendung von Formaldehyd, weil an einen derart gehärteten Trägerstoff anschließend mehr Enzymaktivität gebunden werden kann als z. B. an ein mittels Glutardialdehyd gehärtetes Protein. Außerdem hat ein z. B. mit Glutardialdehyd vernetzter Trägerstoff eine zusätzliche, oft unerwünschte gerbstoffadsorbierende Wirkung, die formaldehydgehärtete Proteine nicht haben. Auch aus ökonomischen Gründen stellt die Fonnaldehydhärtung der Proteine eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das zur Herstellung des Trägerstoffes vorgesehene wasserlösliche Ausgangsprotein zunächst in die drei- bis zehnfache Wassermenge (bezogen auf Proteinmenge) eingetragen und das Gemisch auf 40 bis 80°C erwärmt. Dieser Proteinlösung wird sodann eine Formaldehydlösung (z. B. Formalin) in solcher Menge zugesetzt, daß ca. 2 bis 5% Formaldehyd, bezogen auf die eingesetzte Protcintrockcnsiibstan/, in die Lösung gelangen. Die gerührte Lösung erstarrt nach einiger Zeit, wobei die Erstarrungszeit im allgemeinen verkürzt werden kann durch möglichst hohe Temperatur, einen möglichst nahe an 8- 10 liegenden pH-Wert und hohe Formaldehyd-Zugabe. Normalerweise ist jedoch eine allzu schnelle Erstarrung gar nicht erwünscht, weil sonst eine homogene Durchmischung des Protein-Formaldehyd-Wasser-Gemisches erschwert wird. Auch bietet eine verzögerte Erstarrung eine gute Möglichkeit, den Trägerstoff zuvor noch in eine gewünchte Form zu bringen. Zum Beispiel kann er durch Eintauchen von Gegenständen (Rührer, Siebe) als Überzug auf diese Gegenstände aufgebracht werden, oder er kann durch Sprühtrocknung in feinste Kugelpratikelform gebracht werden.

Nicht geeignet als Trägerstoff gemäü der Erfindung sind die unter dem Namen Kunsthorn bekannten eehärteten Eiweißstoffe. Es zeigt sich nämlich, daß Kunsthorn, das nur eine Wasseraufnahmefähigkeit von bis zu einem Drittel seines Trockengewichtes hat, nur sehr beschränkt mit Enzymen gekoppelt werden kann, so daß die derart hergestellten fixierten Enzympräparate nur sehr geringe spezifische Aktivitäten erreichen.

Zur Ankopplung der Enzyme werden die gehärteten Trägerstoffe im trockenen Zustand mit den wäßrig gelösten Enzymen bevorzugt in solcher Menge versetzt, daß die gesam?* enzymhaltige Flüssigkeit unter Quellung der wasserunlöslichen Trägerstoffe aufgesogen wird. Dabei werden die äußeren und inneren Oberflächen der Trägerstoffe mit der Enzymlösung benetzt Sodann wird eine übliche enzymfällend wirkende Flüssigkeit in welcher Glutardialdehyd löslich ist beispielsweise Aceton, Äthanol, Isopropanol, zusammen mit dem in ihr gelösten Glutardialdehyd als Kopplungsreagenz zugegeben. Nach erfolgter Bindung der Enzyme wird das Präparat vorzugsweise gut mit Wasser ausgewaschen und entweder in geeigneter Weise (z. B. mit Lösungsmitteln oder durch Sprühtrocknung) getrocknet oder in feuchter Form, gewünschtenfalls unter Zugabe von stabilisierenden Substanzen (z. B. Glycerin, Sorbit Propylenglycol) aufbewahrt bzw. seiner weiteren Verwendung zugeführt

Bevorzugt werden folgende Bedingungen bei der Ankopplungsprozedur der Enzyme eingehalten: Die wäßrige Enzymlösung wird in bis zu achtfacher Menge des Trägerstoff-Trockengewichtes zugesetzt. Enzymfällend wirkende Flüssigkeit wird in solcher Menge zugesetzt, daß im wesentlichen keine Enzyme, deren ■> Fixierung gewünscht würde, von den Trägerstoffen weg mehr in Lösung gehen. Je nach Enzym und je nach Fällungsmittel schwanken diese Mengen bekanntermaßen sehr stark, sie können jedoch vom Fachmann in einfacher Weise durch Ausprobieren für jedes beliebige

in Enzym ermittelt werden. Glutardialdehyd wird bevorzugt in solcher Menge angewandt, daß die Konzentra tion im Reaktionsansatz zwischen 0,5 und 5% liegt. Die ganze Kupplungsreaktion wird bevorzugt bei Raumtemperatur innerhalb von 5 Minuten bis 5 Stunden

i^r> durchgeführt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können im Gegensatz zu bekannten Verfahren auch proteolytisch aktive Enzyme gebunden werden. Durch die Verhärtung des i rägerstoftes gelingt es namiich, die Proteine so

2« weit resilient gegen den proteolytischen Abbau der zu bindenden Protease /κ machen, daß die Fixierung ohne Trägerstoffzerstörung vorgenommen werden kann. Dabei werden bevorzugt auf zwei bis vierfache Wasseraufnahmefähigkeit vorgehärtete Proteine als

y> Träger verwendet. Trägerstoffe mit der vier- bis achtfachen Wasseraufnahmefähigkeit eignen sich jedoch auch für gewisse proteolytische Enzyme, wie z. B. Lab. Dit Ermittlung der im Einzelfall zweckmäßigen Grenzen ist dem Fachmann gegeben. Gewünschtenfalls

i" kann der Trägerstoff auch durch z. B. niedrige Temperaturen bis zur Zugabt der enzymfällend wirkenden Substanzen zusätzlich vor dem proteolytischen Angriff der Proteasen geschützt werden. Nach der Glutaraldehyd-Kopplungsreakton ist die Gefahr des

>> Trägerstoffabbaues dann nicht mehr gegeben.

Die erfindungsgemäßen trägerfixierten Enzyme eignen sich im allgemeinen zur Durchführung der gleichen biotechnischen Reaktionen, zu denen auch die entsprechenden löslichen Enzyme geeignet sind. Darüber hinaus eignen sie sich aber besonders für den wiederholten und kontinuierlichen Einsatz sowie für FSlIp in Hpnpn pinp WipHerentfprnnnp der F.nzyme aus dem Reaktionsgemisch (z. B. aus Getränken) erwünscht bzw. gesetzlich vorgeschrieben ist. Für die wiederholte

*i und Langzeit-Anwendung ist die hohe Resistenz der Präparate gegen Mikroorganismen sowie ihre leichte Desinfizierbarkeit durch gängige Desinfektionsmittel (z. B. quaternäre Ammoniumverbindungen, Lösungsmittel u. ä.) besonders günstig.

5« Nachfolgende Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

1 kg Pulvergelatine (alkalisch aufgeschlossen, 80 Bloom) wurde in 61 kaltes Wasser eingetragen und auf 60° C erwärmt Dabei ging die Gelatine in Lösung. Dann wurden 150 ml Formalin (=35 gew.%ige Formaldehydlösung) unter Rühren zugesetzt Nach 2 Minuten und 30 Sekunden erstarrte die Masse zu einem Gel. Diese &o gelierte Masse wurde durch einen Fleischwolf gedreht so daß grobe feuchte Gelkxümel entstanden. In ca. 5 cm hoher Schicht wurden die Gelkrümel auf Hordenblechen im Trockenschrank mit Umluft bei 115° C 15 Stunden lang getrocknet Die dann trockenen Partikel wurden auf einer Gebläsemühle mit Siebeinsatz gemahlen, so dan eine PartikeigröBe vorwiegend zwischen 50 und 100 um entstand. Die splitterförmigen Partikel waren wasserunlöslich und hatten eine

Wasseraufnahmefähigkeit vom 4,8fachen ihres Trokkengewichtes.

Zu 0,5 kg des Trägerstoffpulvers wurden 1,5 1 einer Lösung zugerühtt, die 0.1 I handelsübliches, flüssiges Glucoseoxidasc-Katalase-Gemisch und 1,4 I dest. Was- -, »er enthielt. Das handelsübliche Glucoseoxidase-Katalasc-Gemisch hatte eine Glucoseoxidaseaktivität von 1780 % <rrett-Einheiten/ml. Dann wurden dem Gemisch 2 I Aceton und 200 ml 25%ige Glutardialdehydlösung fugemischt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 60 in Minuten bei 30⁰C stehen gelassen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde filtriert und die festen Partikel wurden auf dem Filter gründlich mit ca. 501 dest. Wasser ausgewaschen. Der zurückbleibende feuchte Filterkuchen hatte ein Gewicht von 1,95 kg. Unter Zugabe von ιί 1,05 kg Glycerin wurde die Masse fein suspendiert und bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank aufbewahrt.

Viir PriifimcT /lor ALliuitäl c/ituio unr cartel i(T*»n

Untersuchungen wurde die Glycerinlösung jeweils mit

Wasser gut ausgespült. Tabelle I gibt die wichtigsten Analysendaten des Präparates wieder.

Tabelle I

Enzym-Trockensubslanzgchalt [g/100 g] 17.6

Glucoseoxidaseaktivität [SU/g TS] 178

Katalaseaktivität[BU/gTS] 96

Zur Prüfung der Auswaschstabilität des Präparates u> wurt'-in 10 g in einer Säule kontinuierlich mit dest. Wasser gewaschen. In eintägigen Abstanden wurde die Aktivität der F.nzympartikel überprüft. Es ergab sich, daß innerhalb von 14 Tagen kein signifikanter Aktpvitiitsabhill stattfand. Ebenso verhielt es sich, ills t'> anstelle von Wasser Bier als Auswaschflüssigkeit verwendet wurde.

Die Michae'iskonstanten des fixierten Enzympräparates sowie der loslichen Glucoseoxidasc wurden gegenüber Glucose ermittelt. Es zeigte sich kein n· signifikanter Unterschied zwischen der gelösten und der fixierten Enzymform. Siehe dazu die Zeichnung, die die relative Keaktionsgescnwindigkeit des losiicnen und des immobilisierten Enzyms in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration darstellt. j

Beispiel 2

3 g getrocknetes F-iklar wurden in 10 ml Wasser bei 40°C gelöst und mit 0.3 mi Formalin versetzt. Dieses Gemisch wurde im Vakuum-Trockenschrank bei 100⁰C m> und 10—20 Torr getrocknet. Der trockene Kunststoff wurde auf eine Korngröße von 100 bis 200 μπι vermählen und ausgesiebt. Es war wasserunlöslich und hatte eine Wasseraufnahmefähigkeit vom vierfachen seines Trockengewichtes. 5ί

0,1 g einer handelsüblichen Lactase aus Aspergillus flavus, die eine Lactaseaktivität von 520 LU/g aufwies, wurde mit 1,5 ml destilliertem Wasser gelöst In diese Enzymlösung wurden 0,5 g des oben geschriebenen Kunststoffpulvers eingerührt. Dann wurden 3 ml Ace- on ton und 0,25 ml 25%ige Glutardialdehydlösung hinzugerührt Diese Mischung wurde 60 Minuten bei 25° C stehen gelassen und dann filtriert Das als Filterrückstand verbleibende gebundene Enzym wurde gut mit dest Wasser ausgewaschen. Es hatte eine Aktivität von 42 LU/g Trockensubstanz- Die Gesamt-Trockensubstanzmenge des gebundenen Enzympräparates betrug 0,61g.

Beispiel 3

I kg Pulvergelatine (sauer aufgeschlossen, 80 Bloom) wurde in 5 1 kaltem Wasser gerührt und auf 45°C erwärmt. Nach Lösung der Gelatine wurden 100 ml Formalin zugesetzt. Die Lösung wurde weiter bei 45⁰C gehalten und in einem Laborsprühtrockner mit Zweistoffdüse bei 2l0"C Lufteingangstemperatur, 100⁰C Luftausgangstemperatur und einer Luftmenge von 500 NmVh sprühgetrocknet. Es entstand ein wasserunlösliches feines Pulver mit einer Wasseraufnahmefähigkeit vom siebenfachen seines Gewichtes.

0,50 ml einer katalasefreien Glucoseoxidaselösung mit meiner Aktivität von 750 Sarrett-Einheiten/ml wurden mit 1 ml dest. Wasser versetzt. Dann wurden 0.5 g des oben beschriebenen pulvrigen Kunststoffes hinzugeführt. Diese Mischung wurde mit 2 ml Aceton rnd 0,2 ml 25%iger Glutardialdehydlösung verrührt und

FU) Minutpn hpj Raijrntrmnprfitiir ciphpn ppjaccpn Dann

wurde das Präparat über ein Filter gut mit destilliertem Wasser ausgewaschen. Es wurden insgesamt 0,59 g fixierte Enzymtrockensubstanz erhalten mit einer Glucoseoxidaseaktivität von 290 Sarrett-Einheiten pro g Trockensubstanz.

Beispiel 4

20 g Pulvergelatine (sauer aufgeschlossen, 80 Bloom) wurden mit 100 ml dest. Wasser unter Rühren bei 60°C gelöst. Der gelösten Gelatine wurden 2 ml Formalin zugesetzt. Dann wurde ein gut entfetteter Flügelrührer mit einer Oberfläche von 20 cm² in die Gelatine-Formalinmischung eingetaucht und sofort wieder daraus entfernt. Überschüssige Gelatine-Formalinmischung wurde abtropfen gelassen und der Rührer dann 5 Stunden in einen Trockenschrank von 105⁰C zum Trocknen und Vernetzen des Formalin-Gelatinegemisches eingebracht. Danach wurde der nunmehr mit einer feinen Kunststoffschicht überzogene Rührer abkühlen gelassen und in eine Lösung von 20 g Original-Kälberlab (Fa. Hauser) in 100 ml Wasser 1 Minute lang eir<retaucht. Dann wurde der mit Labenzym benetzte Rührer in einer Lösung aus 70 ml Aceton, 30 ml Wasser und tu mi /äTOigem üiutardiaidehyri o0 iviinuien iang stehen gelassen und anschließend 60 Minuten lang im fließenden Wasser gewaschen.

Zur Prüfung auf Labaktivität wurde der Rührer zum langsamen Rühren von 200 ml frischer Vollmilch eingesetzt. Nach ca. 60 Sekunden trat eine starke Caseinausfällung ein, die anzeigte, daß der Rührer noch Labaktivität aufwies. Der Rührer wurde sodann gespült und nochmals zum langsamen Rühren von 200 ml frischer Vollmilch verwendet Es zeigte sich bei lOfacher Wiederholung dieses Vorgangs, daß jeweils nach 50 bis 70 Sekunden starke Caseinfällung eintrat

Beispiel 5

1 kg Pulvergelatine (alkalisch aufgeschlossen, 80 Bloom) wurde in 61 kaltes Wasser eingetragen und auf 60° C erwärmt Dabei ging die Gelatine in Lösung. Dann wurden 250 ml 25%ige Glutardialdehydlösung unter Rühren zugesetzt Nach ca. 2 Minuten erstarrte die Masse zu einem Gel, das durch einen Fleischwolf gedreht und in ca. 5 cm hoher Schicht auf Hordenblechen im Umluft-Trockenschrank bei 120°C getrocknet wurde.

Die trockenen Partikel wurden auf einer GeWäsemühle mit Siebeinsatz gemahlen, so daß eine Partikelgröße vorwiegend zwischen 50 und 100 μπι entstand.

Die splittcrförmigcn Partikel waren wasserunlöslich und hallen eine Wasseraufnahmefähigkeit vom 3.1 fachen ihres Trockengewichtes.

Zu 0,5 kg des Trägerstoffpulvers wurden 1,4 I einer Lösung hinzugeriihrt, die 0,1 I handelsübliches, flüssiges CilucoscoxidiiSL'-Kiiliiliisc-fiomise'h und I.J I destilliertes Wasser enthielt. Das handelsübliche Glucoseoxida- »e-Katalase-Gemi-ch hatte eine Glucoseoxidaseaktivilit von 1780 Sarrjit-Einheiten/ml und eine Katalaseaklivität von 800 Baker-Einheiten/ml. Dann wurden dem Gemisch 2 I Aceton und 200 ml 25%ige Glutardialdehydlösung zugemischt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 60 Minuten bei 30"C stehengelassen. Nach Ablauf dieser Zeil wurde filtriert und die festen Partikel wurden •uf dem f-'ilter gründlich mit ca. 501 dest. Wasser ausgewaschen. Der zurückbleibende feuchie Filterkuchen hatte ein Gewicht von 1,80 kg. Er wurde in 1,20 kg Glycerin fein suspendiert und bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank aufbewahrt.

Vor Prüfung der Aktivität sowie vor sonstigen Untersuchungen wurde die Glycerinlösung jeweils mit Wasser gut ausgespült. Tabelle 2 gibt die wichtigsten Analysendaten des Präparates wieder.

Tabelle 2 Enzym-Trockensubstanzgehalt [g/100 g] 17,8 Clucoseoxidaseaktivität [SU/g TS] 134 Katalaseaktivität[BU/gTS] 58

Hinsichtlich -Auswaschstabilität und Mkhaeliskonttante gegenüber Glucosesubstrat wurden inner halb der «nalytischen Fehlergrenzen die gleichen Werte wie in Beispiel I gefunden.

Beispiel 6

10 kg Pulvergelatine (alkalisch aufgeschlossen, 80 Bloom) wurden in 60 I Wasser von ca. 20⁰C eingetragen ■nd innerhalb von 30 Minuten auf 50°C erwärmt. Dabei ging die Gelatine in Lösung. Dann wurden 3,5 I Formalin unter Rühren zugesetzt. Nach etwa 2 Minuten erstarrte die Masse zu einem Gel, das durch einen Fleischwolf gcuiciii UMU in ca. 5 cm honen Schichten auf Hordenblechen im Umluft-Trockenschrank 24 Stunden lang bei 108⁰C getrocknet wurde. Die trockenen Partikel wurden auf einer Gebläsemühle mit Siebeinsatz gemahlen, so daß ein Trägerstoffpulver mit einer Partikelgröße von 50 bis 100 μπι entstand. Die iplitterförmigen Partikel waren wasserunlöslich und lauen eine Wasseraufnahmefähigkeit vom 3,2fachen ihres Trockengewichtes.

Zu 5 kg des Trägerstoffpulvers wurden bei 0°C 13 I einer auf 0⁰C gekühlten Lösung zugesetzt die 0,5 kg handelsübliches Papain mit einer Aktivität von 45 000 NF-Einheiten pro mg enthielt. Dann wurden 301 Isopropanol und 11 25%iges Glutardialdehyd hinzugemischt Diese Reaktionsmischung wurde innerhalb von 5 Minuten auf 25° C erwärmt und 60 Minuten bei dieser Temperatur stehen gelassen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde filtriert und gründlich mit ca. 2001 entionisiertem Wasser gewaschen. Der zurückbleibende ca. 18 kg schwere Filterkuchen wurde in 201 entionisiertem Wasser resuspendiert und über einem Laborsprühtrockner mit Zweistoffdüse bei 180⁰C Luitemgangstemperatur, 85° C Luftausgangstemperatur und einem Luftdurchsatz von 450 Nm³Zh getrocknet Es resultierten 535 kg trägerfixiertes Trockenpräparat mit einer Aktivität von 520 NF-Einheiten pro mg.

10

Beispiel 7

ίο

I kg hiimldsühlichc Aimlo^liuosidiisc mis Asperillus niger mit 1070 Glin'oamylase-Einheiten pro g wurden mit 14 1 entionisiertem Wasser gelöst. Dann wurden 5 kg Trägerstoffpulver, das wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, hinzugemischt. Nach Aufsaugen der Enzymlösung durch das Trägerstoffpulver wurden 20 I Aceton und I I Glutardialdehyd unter Rühren zugegeben und die Mischung 60 Minuten bei 30°C stehen gelassen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde filtriert und mit ca. 3001 Wasser gewaschen. Der zurückbleibende Filterkuchen wurde in ca. JOl entionisiertem Wasser resuspendiert und über einem l.aborsprühtrockner mit Zweistoffdüse bei 170"C Lufteingangstemperatur, 85"C Luftausgangstemperatur und 400NmVh Luftdurchsatz getrocknet. Es resultierten 5,20 kg trägerfixiertes Trockenpräparat mit einer Aktivität von 162 Glucoamylase-Einheiten prog.

51 gehopfte helle Bierwürze wurden mit 20 ml dickbreiiger Bierhefe (Stamm Rh der Versuchs- und Lehranstalt für Brauerei in Berlin) und I g des oben beschriebenen fixierten Amvloglucosidasepräparates versetzt. Parallel dazu wurde ein zweiter Ansatz in gleicher Weise, jedoch ohne Amyloglucosidasepräparat angestellt; beide Ansätze wurden im temperierten Wasserbad bei 8°C 7 Tage gären gelassen. Danach wurden die Biere geschlaucht und der Vergärungsgrad in üblicher Weise durch Spindeln ermittelt. Die jeweils abgesetzte Bierhefe mit bzw. ohne Amyloglucosidasepräparat wurde auf jeweils 20 ml reduziert und jeweils zum Anstellen einer weiteren Biergärung verwendet. In dieser Weise wurden 4 Führungen der Hefe vorgenommen. Im Falle der mit Amyloglucosidasepartikeln durchsetzten Hefe erwies es sich als relativ einfach, diese Partikeln komplett in die jeweils nächste Gärcharge zu überführen, weil sie sich nach Waschen des Hefesatzes jeweils am Boden von diesem absetzten. Tabelle 3 gibt die bei den 4 Führungen mit und ohne Amyloglucosidasepräparat erzielten Vergärungsgrade wieder.

Tabelle 3

Ohne
Präparat

Mit
Präparat

Vergärungsgrad, 1. Führung 78.2% 89.3% Vergärungsgrad, 2. Führung 78,5% 86,5% Vergärungsgrad, 3. Führung 77,9% 87,6% Vergärungsgrad, 4. Führung 78,0% 84,8% Beispiel 8

25 g Abfall-Flüssiggelatine ohne Gelierfähigkeit mit 70% Trockensubstanzgehalt wurden in 100 ml entionisiertem Wasser bei 50⁰C gelöst Der gelösten Gelatine wurden 3 ml Formalin zugesetzt Dann wurde das Reaktionsgemisch auf einer vorher mit einem fettigen Lappen abgeriebene Glasplatte gegossen und zu einer dünnen Schicht verteilt Die Glasplatten mit dem Reaktionsgemisch wurden im Umluft-Trockenschrank bei 105⁰C getrocknet Nach der Trocknung konnte der vernetzte Trägerstoff in Membranform von den Glasplatten abgelöst werden.

Eine 5 χ 5 cm große Trägerstoffmembran mit einer Dicke von 0,1 mm im Trockenzustand wurde 2 Minuten

in eine Lösung aus IO ml handelsüblicher flüssiger Glucoseoxidase-Katalase (wie in Beispiel I) und 50 ml dest. Wasser jeilaucht. Dann wurde die Membran bei Raumtemperatur 60 Minuten lang in eine Mischung aus 70 ml Aceton, 30 ml Wasser und 12 ml 25%i_ecm Glutardialdehyd gelegt. Nach Ablauf dieser Zeit erfolgt eine gründliche Wässerung der Membran. Sie wurde sodann unter Glycerin bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Die Aktivitätsbestimmung mit einem Teil der Membran ergab eine Glucoseoxidaseaktivität von 112 SU/g Trockensubstanz und eine Katalaseaktivität »on 96 BU/g Trockensubstanz.

Beispiel 9

20 g Pulvergelatine (sauer aufgeschlossen, 80 Bloom) wurden mit 100 ml dest. Wasser unter Rühren bei 60"C gelöst. Der gelösten Gelatine wurden 2 ml Formalin zugesetzt. Dann wurde ein entfettetes Edelstahl-Rund- »ieb von 5 cm Durchmesser, einer Maschenweite von 1 mm und eine, Drahtstärke von 0,1 mm iw diese Reaktionslösung eingetaucht und sofort wieder herausgezogen. Überschüssiges Reaktionsgemisch wurde mit tinem Luftgebläse abgeblasen, so daß die Drähte lediglich von einer dünnen Reaktionsgemisch-Schicht benetzt bleiben. Das Sieb wurde sodann 4 Stunden bei 105⁰C im Umluft-Trockenschrank getrocknet. Danach wurde das nunmehr mit einer feinen Trägerstoffschicht überzogene Sieb 2 Minuten lang in eine Lösung aus 10 ml handelsüblicher flüssiger Glucoseoxidase-Katalaie und 50 ml d^st. Wasser getaucht. Dann wurde das Sieb bei Raumtemperatur 60 Minuten lang in eine Mischung aus 70 ml Aceton, 30 ml Wasser und 15 ml 25%igem Glutardialdehyd gelegt. Nach Ablauf dieser Zeit erfolgte eine gründliche Wässerung des Siebes.

Zur Prüfung auf enzymatische Wirkung wurde das Sieb in 100 ml 3,5%ige Glucoselösung gelegt, die durch tine Fritte kräftig von unten belüftet wurde. Der pH-Wert dieser Lösung wurde automatisch durch einen Titrator konstant gehalten. Es wurden die in Tabelle 4 wiedergegebenen Verbrauche an 0,01 n-NaOH gemesien.

rabelle 4

Zeit [min] Verbrauch

0,01 n-NaOH[ml]

0	0,00
15	0,35
30	0,85
45	1,41
60	1.85
75	2.41
90	2.96
105	3,58
120	4,19

Enzymaktivitätsbestimtnungen
Die Bestimmung der Enzymaktivitäten erfolgt nach den nachfolgend angegebenen Methoden, im Falle von ΠγΐΡΓίρη Ep.2^vrp.^pn "".!rdcn di^p !nkiibiUionsRn??.*?? 2Ii gerührt oder geschüttelt, auch wenn das in der Originalvorschrift nicht angegeben war.

Katalaseaktivität:

nach First Suppl. Food Chem. Codex, 2nd. Ed., S. :", 67-63, Verlag National Academy of Sciences,

Washington, 1974.
Glucoseoxidaseaktivität:

nach First Suppl. Food Chem. Codex, 2nd. Ed., S.

78-79, Verlag National Academy of Sciences, ίο Washington, 1374.

Lactaseaktivität:

nach First Suppl. Food Chem. Codex, 2nd, Ed., S.

81-83, Verlag National Academy of Sciences,

Washington, 1974.
r, Amyloglucosidaseaktivität:

nach H. J. P ι e ρ e r, Mikrobielle Amylasen bei der

Alkoholgewinnung, S 48-49, Verlag l'imer,

Stuttgart.
Papainaktivität:
in nach First Suppl. Food. Chem. Codex, 2nd. Ed., S.

86 — 87, Verlag National Academy of Sciences,

Washington, 1974. Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Wasserunlösliches Enzympräparat auf der Basis von mittels Glutardialdehyd kovalent an ein Trägerprotein fixierter Enzyme, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym oder ein Enzymgemisch an einen hochmolekularporösen, aus gehärtetem Protein bestehenden Kunststoff, der eine Wasseraufnahmefähigkeit vom zwei- bis achtfachem seines Trockengewichts aufweist, gebunden is L

2. Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gehärtete Protein durch Behandlung mit üblichen Härtungsmitteln und ggf. anschließende Temperaturbehandlung erhalten worden ist

3. Enzympräparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein mii Formaldehyd gehärtetes Protein, vorzugsweise formaldehvdeehärtete Gelatine handelt

4. Enzympräparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß der Trägerstoff in bestimmte Anwendungsformen gebracht worden ist

5. Enzympräparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß es sich um eine an ein gehärtetes Protein mit einer Wasseraufnahmefähigkeit vom zwei- bis vierfachen seines Trockengewichts gebundene Protease handelt

6. Enzympräparat nach eine:»i der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein an ein gehärtetes Protein mit der (au dieses Trockengewicht bezogenen) zwei- bis achtfachen Wasseraufnahmefähigkeit gebundene Glucoseoxidase und Katalase handelt

7. Enzympräparat nach einem der Ansprüche 1 -4, dadurch gekennzeichnet daß es sich um an ein gehärtetes Protein mit der (auf dessen Trockengewicht bezogenen) zwei- bis achtfachen Wasseraufnahmefähigkeit gebundenes Lab-Enzym handelt.

8. Enzympräparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich noch stabilisierend wirkende Polyalkohole enthält.

9. Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß ein aus einem wasserlöslichen Protein mittels eines Härtungsmittels und gewünschtenfalls durch anschließende trocknende Wärmebehandlung erhaltener hochmolekularporöser Kunststoff, welcher eine Wasseraufnahmefähigkeit vom zwei- bis achtfachen, bezogen auf sein Trockengewicht, aufweist mit einer solchen Menge an enzymhaltiger Flüssigkeit versetzt wird, daß die Flüssigkeit vom Kunststoff unter Quellung voll aufgesaugt werden kann, und daß anschließend eine Lösung von Glutardialdehyd in einer enzymfallenden Flüssigkeit zugesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Kunststoff ein mittels Formaldehyd gehärtetes wasserlösliches Protein ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Kunststoff aus mittels Formaldehyd gehärteter Gelatine besteht.

12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der hochmolekularooröse Kunststoff

mit einer wäßrigen Enzymlösung in geeigneter Menge versetzt und eine Lösung von Glutardialdehyd in einem niederen aliphatischen Alkohol und/oder Keton zugegeben wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet daß der hochmolekularporöse Kunststoff mit wäßriger Enzymlösung in bis zu achtfacher Menge, bezogen auf das Trockengewicht des Trägerstoffs, versetzt, dann die enzymfät-;nde Flüssigkeit in solcher Menge hinzugefügt wird, daß keine wesentlichen Enzymmengen mehr in Lösung gehen können und die zur Fixierung verwendete Glutardialdehydmenge auf 0,5 bis 5%, bezogen auf den Reaktionsansatz, bemessen wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet daß die Kupplungsreaktion in einem Zeitraum von 5 Minuten bis 5 Stunden durchgeführt wird.

15. Verwendung von Enzympräparaten nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Durchführung biotechnischer Verfahren.