DE2219063B2 - Verfahren zur Herstellung einer enzymatisch aktiven Membran, nach diesem Verfahren hergestellte Membran und deren Verwendung für enzym-katalysierte Substratumwandlungen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung einer enzymatisch aktiven Membran, nach diesem Verfahren hergestellte Membran und deren Verwendung für enzym-katalysierte SubstratumwandlungenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer enzymatisch aktiven Membran durch Inberührungbringen
einer Proteinmembran mit der wäßrigen Lösung eines Enzyms sowie eine nach diesem Verfahren
hergestellte enzymatisch aktive Membran.
Enzyme sind Proteinkatalysatoren, welche sich für eine Vielfalt von industriellen und wissenschaftlichen
Anwendungen eignen und insbesondere in der pharmazeutischen Industrie, der Papierindustrie und der
Textilindustrie oder dergleichen. Ihre Wirksamkeit ist hoch spezifisch und sie führen im allgemeinen nicht zu
wesentlichen Mengen von unerwünschten Nebenprodukten. Enzymreaktionen sind industriell vorteilhaft, da
sie keine großen Investitionen hinsichtlich Wärmeübertragungseinrichtungen erfordern und leicht mehrstufig
durchführbar sind. Daher werden die mit der Abtren- 4r>
nung von Zwischenprodukten verbundenen Probleme auf ein Minimum reduziert.
Bei enzymatischen Reaktionen bereitet jedoch die Abtrennung und die Wiedergewinnung des Enzymmaterials
große Schwierigkeiten.
Bei den meisten industriell verwendeten Verfahren wird die enzymatische Reaktion durch einfaches
Vermischen des Enzyms mit dem Substrat durchgeführt, worauf das Enzym inaktiviert und/oder zurückgewonnen
wird. Eine solche Verfahrensweise ist jedoch oft für das Produkt schädlich und führt zu einem unumgänglichen
Verlust großer Mengen des Enzyms, da das Enzym gewöhnlich nicht zurückgewonnen wird oder bei einer
Zurückgewinnung nur in geringen Ausbeuten anfällt.
Ein weiteres Problem besteht darin, daß die Enzyme <>o
gewöhnlich in wäßriger dispergierter Form vorliegen. Demzufolge haben Enzyme, welche in dieser Form
aufbewahrt werden, eine begrenzte Lebensdauer oder Lagerfähigkeit. Dies ist insbesondere der Fall, wenn sie
in verdünnter Form gelagert werden. Sie verlieren rasch ihre Aktivität.
Zur Überwindung dieses Problems wurde ein ■ Verfahren entwickelt, um die Enzyme zu immobilisieren,
d. h. an einen inerten unlöslichen Träger zu binden. Nach
Beendigung der enzymatischen Reaktion kann das unlösliche Enzym-Material von dem nicht umgesetzten
Substrat und von dem Produkt durch herkömmliche Techniken, wie z. B. durch Ultrafiltration oder dergleichen
abgetrennt werden.
Die Auswahl eines geeigneten inerten Trägers bereitete jedoch Schwierigkeiten. Der Träger muß nicht
nur inert gegenüber dem Enzym sein, er muß vielmehr auch auf die katalytische Aktivität des Enzyms keinen
hemmenden Einfluß haben, noch zu unerwünschter unspezifischer Adsorption führen. Darüber hinaus sollte
das Trägermaterial zu einem Minimum an sterircher
Hinderung in bezug auf die Enzym-Substratreaktion führen. Es wurde bereits eine große Vielfalt von
Trägermaterialien vorgeschlagen, je nach der speziellen Enzymreaktion und je nach dem speziellen Enzym.
Solche herkömmlich verwendeten Trägermaterialien umfassen z. B. synthetische Polymere, wie Polyamide,
Cellulose-Derivate, verschiedene Tone und Ionen-Austausch-Harz,
insbesondere DEAE-Cellulose und DEAE-Dextrane, siehe Suzuki et al, Agr. Biol. Chem, Band 30,
Nr.8, Seiten 807-812 (1966). Bekannte Arten der Immobilisierung von Enzymen umfassen z. B. die
direkte kovalente Bindung, die indirekte Bindung durch eine Brücken-Verbindung, die Vernetzung des Enzyms
oder das Einschließen des Enzyms im Polymergitter.
Die DE-OS 19 15 970 beschreibt z. B. die chemische Bindung eines Enzyms an ein Trägersubstrat, z. B. an
Kollagen durch Brücken-Verbindungen. Bei dem dabei angewandten Verfahren kommt es zu Beginn zu einer
adsorptiven Bindung des Enzyms an die Kollagenmembran. Diese adsorptive Bindung ist jedoch äußerst lose,
so daß das Enzym leicht ausgewaschen werden kann. Aus diesem Grunde ist es bei dem bekannten Verfahren
erforderlich, eine kovalente Bindung des Enzyms durch Brück*en-Verbindungen herbeizuführen. Durch diese
Maßnahme wird jedoch die Aktivität des Enzyms erheblich beeinträchtigt.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer enzymatisch aktiven
Membran zu schaffen, welches einerseits zu einer festen Bindung zwischen Membran und Enzym führt und
andererseits die enzymatische Aktivität des Enzyms im wesentlichen nicht beeinträchtigt, sowie eine nach
diesem Verfahren hergestellte enzymatisch aktive Membran.
Ferner sollen die erstrebten Membranen zum Einsatz bei enzym-katalysierten Substratumwandlungen geeignet
sein.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemßß dadurch gelöst, daß man eine Kollagen-, Zein-, Casein-, Ovalbumin-,
Weizengluten-, Fibrinogen-, Myosin-, Mucoprotein-, Polyglutamat-, Polyaspargat-, Polyphenyalanin-, Polytyrosin-
oder Leucin-p-Aminophenylalanin-Copolymer-Membran
mit einem pH von 2—12 bis zur maximalen Quellungskapazität quillt und daß man die gequollene
Membran in eine wäßrige Lösung des Enzyms mit einem pH zwischen dem isoelektrischen Punkt der
Membran und dem isoelektrischen Punkt des Enzyms eintaucht
Das erfindungsgemäße Verfahren führt überraschenderweise zu einer äußerst stabilen Bindung des Enzyms
an die Kollagen-Membran und selbst bei längerem Auswaschen mit einer Salzlösung wird das Enzym nicht
von der Membran getrennt.
Der Komplexierungsmechanismus zwischen den Enzymen einerseits und den Proteinmembranen an-
dererseits umfaßt die Ausbildung von mehrfachen Wasserstoff bindungen, von Salzbindungen und von van
der Waals-Weehselwirkungen. Die Komplexbildung
verläuft besonders leicht bei einem pH-Wert zwischen
dem isoelektrischen Punkt des Enzyms und dem isoelektrischen Punkt der Proteinmembran.
Die Auswahl eines speziellen synthetischen Polypeptids oder eines speziellen Naturproteins aus den im
Anspruch 1 genannten in modifizierter oder unmodifizierter Form hängt unter anderem von der Natur des zu
komplexierenden Enzyms ab, sowie von der Natur des umzusetzenden Substrats und von den Reaktionsbedingungen.
Kollagen und Zein sind bevorzugte Naturproteine, da sie gegenüber einer großen Zahl von Enzymen
inert sind. Die folgende Beschreibung bezieht sich in der ι >
Hauptsache auf Kollagen und Zein.
Ein Kollagenfilm kann in herkömmlicher Weise durch Gießen einer Kollagendispersion hergestellt werden.
Sodann wird dieser Film bis zur maximalen Quellungskapazität gequollen, mit Wasser gewaschen und in eine
Enzymlösung eingetaucht Es wird gekühlt1 gelagert, um dem Enzym Gelegenheit zu geben, in die Kollagenmembran
einzudiffundieren. Der Film kann sodann auf eine Basis aufgebracht werden, wie z. B. auf einen Celluloseacetatfilm.
Schließlich wird der Film getrocknet. Kollagen ist ein Hydroxyprolin-Glycin-Protein. Es bildet den
organischen Hauptbestandteil von tierischem Bindegewebe und von Knochen. Chemisch unterscheidet sich
Kollagen von anderen Proteinen durch einen ungewöhnlich hohen Glycin-Gehalt. Etwa '/3 der Amino- j)
säurereste im Kollagen besteht aus Glycin. Ferner hat Kollagen einen hohen Gehalt an Prelin und Hydroxyprolin.
Hinsichtlich seines Gehaltes an Hydroxyglycin nimmt das Kollagen unter den Proteinen eine
Sonderstellung ein. Der Gehalt des Kollagens an aromatischen und schwefelhaltigen Aminosäuren ist
bemerkenswert gering. Das Kollagen kann in guten Ausbeuten aus Körperteilen von einer großen Vielzahl
von Säugetieren und Fischen gewonnen werden. Häufig wird Kollagen aus Schweinesehnen, Schafsehnen und +0
Rindersehnen gewonnen, sowie aus Schweinehaut, aus Gerbereiabfällen, wie z. B. aus nicht für die Ledergewinnung
verwendbaren Kalbsfellen, sowie aus Ossein, welches aus Rinderknochen durch Säurebehandlung
unter Entfernung des Kalziumpliosphats und anschließende
Trocknung erhalten wird.
Eine andere brauchbare Methode zur Herstellung einer Kollagen-Membran besteht aus folgenden Schritten:
Die Kollagenquelle wird zunächst mit einer Enzymlösung behandelt um das Elastin aufzulösen,.
welches die Kollagenfasern umgibt und verbindet. Für diesen Zweck kommen z. B. proteolytische Enzyme aus
pflanzlichen oder tierischen Quellen in Frage. Daneben eignen sich jedoch auch andere Enzyme. Sodann wird
die Kollagenquelle mit Wasser gewaschen und die löslichen Proteine und Lipoide werden durch Behandlung
mit einer verdünnten wäßrigen Lösung eines Chelatisierungsmittels, wie z. B. des Tetranatriumsalzes
der Äthylendiamin-tetraessigsäure entfernt. Sodann ; werden die Kollagenfasern iii einer geeigneten Säure, 6D
wie z. B. in Cyanessigsäure, gequollen, wobei sich eine Kollagenfaserdispersion ausbildet (Hochstadt, et al.,
US-PS 29 20 000). Diese Dispersion kann sodann in eine geeignete Membranform gegossen oder extrudiert
werden. Die getrocknete Kollagenmembran wird fe> sodann während 48 h bei 6O0C und 95% relativer
Feuchtigkeit nachbehandelt oder fixiert oder gehärtet.
Ferner können geeignete Membranen gemäß GB-PS 11 53 551 durch elektrische Abscheidung des Kollagens
aus der Kollagenfaserdispersion gewonnen werden. Neben den genannten Methoden der Herstellung von
Kollagenmembranen eignen sich natürlich auch alle anderen bekannten Techniken zur Herstellung solcher
Membranen. Vorzugsweise haben die erfindungsgemäß verwendeten Kollagenmembranen eine Dicke von
0,005 mm bis 0,1 mm und insbesondere von 0,01 mm bis 0,05 mm. Wenn die Membrandicke geringer als
0,005 mm ist, so hat die Membran keine genügende Festigkeit Ferner ist es möglich, daß sich bei diesen
geringen Dicken kein vollständiger zusammenhängender Film ohne Poren, Löcher oder andere strukturelle
Defekte ausbildet. Wenn die Dicke 0,1 mm übersteigt, so
steigen die Kosten unnötig an, ohne daß die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Membran
noch erheblich ansteigt Natürlich ist die erfindungsgemäße Membran auch noch bei größeren Dicken voll
funktionsfähig.
Für spezielle Zwecke können die Membranen noch andere Stoffe enthalten. Weichmacher können verwendet
werden, um die molekulare Struktur der Membran zu modifizieren. Hierdurch wird eine Kettenverschiebung
und damit eine größere Elastizität bewirkt. Durch Zusetzung von Anfeuchtungsmitteln oder Befeuchtungsmitteln
kann die Wasseraufnahmekapazität günstig beeinflußt werden. Durch Zugabe von Vernetzungs- ·
mitteln, durch Wärmefixierung oder durch Gerbung, z. B. durch Chromgerbung oder durch Formaldehydgerbung
nach herkömmlichen Verfahren kann eine Hydrolyse vermieden werden. Ferner können auf diese
Weise zusätzliche Bindungsstellen für das Enzym gebildet werden, so daß auf diese Weise die Enzymabsorption
verbessert wird.
Sodann wird die Kollagenmembran für die Komplexierung mit dem Enzym vorbereitet. Dies geschieht im
allgemeinen durch Quellen mit einer organischen Säure, welche ein niedriges Molekulargewicht hat oder in
einigen Fällen durch Quellen mit einer geeigneten Base, so daß der pH-Wert im Bereich von etwa 2 bis 12 liegt.
Geeignete Säuren umfassen z. B. Milchsäure und Cyanessigsäure. Falls erwünscht, können Weichmacher
oder andere oben genannte Zusätze während der Quellstufe zugesetzt werden. Die Quellung wird
durchgeführt, indem die Membran während '/2 bis 1 h, je nach den speziellen Badbedingungen, im allgemeinen
bei Zimmertemperatur in das Quellungsbad eingetaucht wird. Wenn zu lange gequollen wird, so besteht die
Gefahr, daß das Kollagen in lösliche Gelatine umgewandelt wird. Die Membran wird auf Grund der
Acidität der organischen Säure und auf Grund der Weichmacherwirkung der organischen Säure gequollen.
Weitere Zusätze sind nicht erforderlich. Auf Grund der Säurebehandlung kommt eine Veränderung der Wasseraufnahmefähigkeit
zustande. Nach der Quellungsbehandlung wird die gequollene Kollagenmembran sorgfältig mit Wasser gewaschen bis der pH-Wert der
Membran innerhalb eines Bereiches liegt, in dem das jeweilige Enzym gemäß den kennzeichengemäßen
Maßnahmen an die Membran komplex gebunden werden kann.
Sodann wird die gequollene und gespülte Membran in eine wäßrige Enzymlösung eingetaucht bis die Komplexierung
der Membran mit dem Enzym gemäß den kennzeichengemäßen Maßnahmen beendet ist. Gewöhnlich
nimmt diese Stufe etwa 10 h bis 2 Tage in Anspruch. Während dieser Zeitdauer sollte die Temperatur
bei 4°C bis 20° C, je nach dem speziellen
angewandten Enzym, gehalten werden. Nach dem Waschen wird die maximale Enzymaufnahme durch
Aktivitätsmessung bestimmt Diese Messung zeigt an, ob die Komplexierung beendet ist. Der Enzym-Kollagen-Komplex
sollte sorgfältig getrocknet werden, vorzugsweise etwa bei Zimmenemperatur oder bei
einer niedrigeren Temperatur, so daß das komplex gebundene Enzym nicht zerstört oder beschädigt wird.
Im folgenden sei ein zweites Beispiel für die Herstellung eines Enzym-Komplexes mit einem natürlichen
Protein beschrieben. Ein Zeinfilm wird hergestellt, indem man eine Zeinlösung in herkömmlicher Weise zu
einem Film gießt Es wird das gleiche Verfahren wie bei der Herstellung des Kollagenfilms angewandt, außer
daß bei der Quellung des Zeinfilms Weichmacher als Quellungshilfen zugesetzt werden, wie z. B. 1,5-Pentandiel.
Zein ist das Prolamin (alkohol-lösliches Protein) der Maiskörner. Es ist das einzige im Handel erhältliche
Prolamin und eines der wenigen leicht zugänglichen Pflanzenproteine. Zein findet sich in erster Linie im
Endosperm des Maiskorns. Die Menge an alkohol-löslichem
Protein steht in direkter Beziehung zum Gesamtproteingehalt im Endosperm. Der Zeingehalt
liegt bei 2,2 bis 10,4%, bezogen auf die Trockensubstanz
von verschiedenen Maisproben.
Zein zeichnet sich im Vergleich zu den meisten anderen Proteinen durch einen relativ geringen Gehalt
an hxdrophilen Gruppen aus. Der hohe Anteil an nicht-polaren Seitenketten (Kohlenwasserstoffgruppen)
und Säureamid-Seitenketten bewirkt die Löslichkeit des Zeins in organischen Lösungsmitteln, weshalb das Zein
als Prolamin klassifiziert wird.
Ein im Handel erhältliches Zein ist Argo-Zein G-200,
hergestellt durch Com Products Refining Company, Argo, Illinois. Die Filmgießlösungen können auf der
Basis von reinen Komponenten hergestellt werden, wobei man den Wassergehalt des Rohzeins und der
anderen Komponenten berücksichtigen muß. Die Gießlösungen werden durch Auflösung des Proteins in
dem ausgewählten organischen Lösungsmittel unter leichter Rührung bei Zimmertemperatur während 1 bis
2 h hergestellt. Während dieser Zeitdauer findet eine vollständige Auflösung statt. Im folgenden werden
einige Beispiele geeigneter Lösungsmittel genannt: 81 %
(Gewicht/Gewicht) Isopropylalkohol und 4% Äthylenglycol-monoäthyl-äther.
Die Klaren Lösungen, welche 20 bis 30 Gewichtsprozent trockenes Zein enthalten, haben eine Bernsteinfärbung. Härtungsmittel, wie z. B.
Formaldehyd und Weichmacher können kurz vor dem Gießen des Films zugesetzt werden. Natürlich kann jede
beliebige herkömmliche Methode zur Herstellung von Zeinmembranen angewandt werden.
Erfindungsgemäß eignen sich insbesondere Zeinmembranen mit einer Dicke von 0,005 mm bis 0,1 mm.
Sodann wird die Zeinmembran für die Komplexierung mit dem Enzym vorbereitet. Dies geschieht durch
Quellung mit einem Weichmacher, falls beim Filmgießen kein Weichmacher zugesetzt wurde. Geeignete
Weichmacher sind 1,5-Pentan-diel, Glycerin und Sorbit.
Dies geschieht durch Eintauchen der Membran in ein Bad von 2% (Gewicht/Gewicht) des Weichmachers in
Wasser während 10 h bei Zimmertemperatgur. Sodann wird die gequollene Membran mit Seidenpapier
getrocknet und in eine wäßrige Enzymlösung eingetaucht, bis die Komplexierung gemäß den kennzeichnengemäßen
Maßnahmen beendet ist. Gewöhnlich bedarf es hierzu einer Zeitdauer von 10 h bis 2 Tagen.
Dabei sollte die Temperatur in einem Sereich von 4CC
bis 2O°C, je nach dem eingesetzten Enzym gehalten werden. Der Enzym-Zein-Komplex sollte sorgfältig
getrocknet werden, vorzugsweise etwa bei Zimmertemperatur
oder bei einer niedrigen Temperatur, so daß das komplex gebundene Enzym nicht zerstört wird.
Für die Komplexierung mit Naturproteinen, wie z. 8.
mit Kollagen, oder Zein oder dergleichen, eignen sich
viele verschiedene Proteine je nach der speziellen
ίο Anwendung. Im folgenden sei eine Auswahl der
geeigneten Enzyme aufgezählt:
Amylasen, Lysozyn, Invertase, Urease, Cellulasen,
Brenzkatechin-methyltransferase,
Saccharose-6-glucosyl-transferase,
Carboxyl-Esterase, Aryl-Esterase, Lipase,
Pektinesterase, Glucoamylase,
Amylopektin-1,6-glucosidase,
Oligo-1,6-glucosidase, Polygalacturonase,
a-Glucosidase, 0-Glucosidase, 0-Galactosidase,
Glucose-Oxydase, Galactose-Oxydase,
Brenzkatechin-methyltransferase,
Saccharose-6-glucosyl-transferase,
Carboxyl-Esterase, Aryl-Esterase, Lipase,
Pektinesterase, Glucoamylase,
Amylopektin-1,6-glucosidase,
Oligo-1,6-glucosidase, Polygalacturonase,
a-Glucosidase, 0-Glucosidase, 0-Galactosidase,
Glucose-Oxydase, Galactose-Oxydase,
Brenzkatechin-Oxydase, Katalase, Poroxydase,
Lipoxydase, Glucose-Isomerase, Pontasoyasen,
Cellobiase, Xylose-isomerase, Sulfit-oxydase,
Äthanolamin-oxydase, Penicillinase,
Carbonanhydraise, Gluconolactonase,
3-Ketosteroid-iü'-dehydrogenase,
11 -j3-Hydroxylase und Aminsosäureacylasen.
Es können auch verträgliche Kombinationen von Enzymen und Multienzymsysteme an das Kollagen komplex gebunden werden.
Lipoxydase, Glucose-Isomerase, Pontasoyasen,
Cellobiase, Xylose-isomerase, Sulfit-oxydase,
Äthanolamin-oxydase, Penicillinase,
Carbonanhydraise, Gluconolactonase,
3-Ketosteroid-iü'-dehydrogenase,
11 -j3-Hydroxylase und Aminsosäureacylasen.
Es können auch verträgliche Kombinationen von Enzymen und Multienzymsysteme an das Kollagen komplex gebunden werden.
Insbesonders geeignet sind Lysozym, Invertase,
Urease und Amylasen. Lysozym hat verbreitete Anwendung zur Hydrolyse von Mikroorganismen in der
pharmazeutischen Forschung gefunden, sowie bei der Abwasserbehandlung. Es wird entweder allein oder in
Kombination mit anderen Enzymen angewandt Eine besonders wichtige Anwendung des Lysozym-Proteinmembrankomplexes
ist die Lysis von Zellen.
Invertase oder /J-D-Fructofuranosidase findet in der
Nahrungsmittel- und Getränkeindustrie sowie in der Analyse Anwendung. Invertase kann dazu verwendet
werden, die Hydrolyse von Saccharose zu Glucose und Fructose oder die Inversion von Zucker zu katalysieren.
Invertase ist bei der Hydrolyse von ji-D-Fructofuranesylbindungen
in Saccharose, Raffinose, Gentianose und Methyl- und /Ϊ-Fructofructose wirksam. Eine besonders
wichtige Anwendung des Invertase-Proteinmembrankomplexes ist dis: kontinuierliche Hydrolyse von
Saccharose.
Urease ist ein hoch spezifisches Enzym, welches die Umwandlung von Harnstoff in Ammoniumcarbonat
katalysiert. Urease wird oft dazu verwendet, den Harnstoffgehalt in Urinproben zu bestimmen. Wegen
dieser hoch spezifischen Wirksamkeit kann man die erfindungsgemäße Urease-Proteinkomplexmembran in
künstlichen Nieren anwenden. Darüber hinaus können Urease-Proteinkoniiplexmembranen für die wiederholte
Hydrolyse von Harnstoff verwendet werden, wie z. B. für die Behandlung von menschlichem Urin oder
fco dergleichen.
Λ-Amylase wird als »verflüssigendes Enzym« bezeichnet.
Es hydrolysiert allgemein Stärke, Glykogen und Dextrane. ^-Analyse dient zur Erzeugung von
Maltose aus Zucker, Glykogen und Dextran. Andere b5 geeignete Amylasen sind Λ-Glucosidase, Amyloglucosidase,
Amylo-l,6-a-|»lucosidase (Enzym zur Entfernung
von Verzweigungen), Oligo-1,6-glucosidase (Limit-Dextrinase),
Isomaltase und Isotriase. Der Ausdruck
»Amylase« bezieht sich somit auf eines oder mehrere dieser und anderer Amylasen. Eine besonders wichtige
Anwendung des Amylase-Proteinkomplexes gemäß vorliegender Erfindung ist die kontinuierliche Hydrolyse
von Stärke durch kontinuierliches Oberleiten eines Stärkesubstrats über die enzymatisch aktive Membran.
Mehrere Enzyme können gleichzeitig komplex an die Proteinmembran gebunden werden. Es ist z. B. erwünscht,
«-Amylase zusammen mit anderen Enzymen komplex zu binden, da a-Amylase das Stärkemolekül in
unspezifischer Weise spaltet, so daß reaktive Stellen für andere spezifischere Enzyme gebildet werden.
Die auf diese Weise gebildeten immobilisierten Komplexe haben eine hohe enzymatische Aktivität.
Wenn ein enzymatisch aktives Substrat mit diesen Komplexen in Berührung gebracht wird, so verbleibt
während der gesamten Reaktionsdauer eine konstante Menge des Enzyms am Trägermaterial, so daß eine
besondere Abtrennung wie bei herkömmlichen Verfahren nicht erforderlich ist. Ferner wurde gefunden, daß
die erfindungsgemäßen Enzym-Proteinkomplexe auch bei langen Lagerungszeiten stabil sind und daß sie
wiederholt ausgewaschen werden können, ohne daß es zu einem wesentlichen Verlust der enzymatischen
Aktivität kommt.
Die Art der komplexen Bindung des Enzyms an die Proteinmembran ist nicht bekannt. Es wird jedoch
angenommen, daß der Komplexierungsmechanismus zwischen der Proteinmembran oder dem filmähnlichen
Proteinträger einerseits und dem Enzym andererseits die Bildung einer Vielzahl von Wasserstoffbindungen,
sowie von Salzbindungen und von van der Waals-Wechselwirkungen
umfaßt. Die Komplexbildung geht besonders leicht bei einem pH-Wert zwischen dem isoelektrischen
Punkt des Enzyms und der Proteinmembran vonstatten. Es muß betont werden, daß die Herstellungen
von Membranen, z. B. aus Kollagenfilmen oder dergleichen, dem Fachmann wohl bekannt sind. So ist
das US-Patent 29 20 000, welches oben erwähnt wurde, eine unter vielen Veröffentlichungen, welche die
Herstellung von Kollagenfilmen und -Membranen betreffen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
In allen Beispielen wurden die Membranen bis zur maximalen Quellungskapazität gequollen.
Beispiel 1 (Lysozym)
zeigt die Herstellung und die Lysozym-Kollagen-Membrankom-
Dieses Beispiel
Verwendung eines
plexes.
Verwendung eines
plexes.
1 cm3 eines 0,025 mm dicken Kollagen-Films (während 48 h bei 55° C und bei 90% relativer Feuchtigkeit
nacherhitzt) wurde in einer Milchsäurelösung (pH = 3) gequollen und sodann 5 min in fließendem Leitungswasser
gewaschen. Sodann wurde der gewaschene Film in eine Enzym-Lösung von 250 mg Lysozym in 15 cm3
-Wasser eingetaucht und bei 2°C während 14 h so belassen. Sodann wurde der behandelte Film auf
Celluloseacetat aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet Auf diese Weise erhielt man eine Lysozym-Kollagen-Komplexmembran.
Eine Lösung von Mikroceccus-lysodeictikus (300 mg
getrockneter Zellen pro Liter) wurde dazu verwendet,
die enzymatische Aktivität des Komplexes zu bestimmen. Dabei wurde die Abnahme der optischen Dichte
der Bakterienlösung bei 450 ΐημ gemessen. Der
getrocknete Membrankomplex wurde zunächst mit 101 fließendem Wasser gewaschen und seine anfängliche
enzymatische Aktivität wurde gemessen. Diese Bestimmung erfolgte auf der Basis der Abnahme der optischen
Dichte nach einer Reaktionsdauer von 30 min, dividiert durch die anfängliche optische Dichte. Der Komplex
wurde zwischen den einzelnen Experimenten mit 2 I Wasser gewaschen. Die anfängliche Aktivität betrug
0,538, entsprechend einer Auflösung von 53,8% der
ίο Zellen. Die zweite Wiederholung ergab eine Aktivität
von 0,420, entsprechend einer Auflösung von 42%; die dritte Wiederholung ergab eine Aktivität von 0,489,
entsprechend einer Auflösung von 48,9% und das vierte Experiment ergab eine Aktivität von 0,533, entsprechend
einer Auflösung von 53,3%.
Beispiel 2 (Invertase)
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Verwendung eines Invertase-Kollagen-Komplexes.
1,5 cm3 eines 0,025 mm dicken Kollagen-Films (ungegerbt und mindestens 2 Monate bei Zimmertemperatur
gelagert) wurden in einer Milchsäurelösung (pH = 3) gequollen. Der Film wurde sodann während '/2 h in
Wasser gewaschen und der gewaschene Film wurde in eine Lösung von 140 mg Invertase in 10 cm3 Wasser
eingetaucht und in einem Kühlschrank über Nacht stehengelassen. Sodann wurde der behandelte Film auf
ein Celluloseacetat-Substrat aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet. Der getrocknete Film stellt
eine Kollagen-Invertase-Komplexmembran dar, welche bei dem nachfolgenden Versuch einer Saccharosehydrolyse
verwendet wurde.
J5 400 cm3 einer 6%-Saccharoselösung wurden als
Substrat bei dem Enzym-Versuch verwendet. Die enzymatische Aktivität wurde in einem Umlaufreaktorsystem
polarimetrisch verfolgt. Nach Bestimmung der Aktivität des Films wurde dieser in 21 Wasser
gewaschen und die Aktivität wurde wiederum gemessen. Dieses Verfahren wurde mehr als 20ma! wiederholt,
wobei insgesamt mit mehr als 401 Wasser gewaschen wurde. Die enzymatische Aktivität des Invertase-Kollagen-Komplexes
nahm allmählich nach dem Waschen ab, um schließlich einen stabilen Grenzwert zu erreichen,
welcher beim Waschen mit mehr als 101 Wasser
konstant blieb. Die gesamte bis zu diesem Zeitpunkt abgelaufene Zeit betrug 13 Tage.
Zahl der | % invertierte Saccharose |
Waschungen | nach 30 min Reaktions |
dauer | |
25°C pH 5-6 | |
1 | 50 |
5 | 40 |
10 | 38 |
15 | 30 |
20 | 28 |
25 | 26 |
30 | 25 |
35 | 25 |
40 | 24 |
Die enzymatische Aktivität des Invertase-Komplexes
bei der stabilen unteren Grenze entspricht einer
ίο
Reaktionsgeschwindigkeit von 1,73 χ ΙΟ-3 mol/1/min.
Wenn man dem Komplex den gleichen Umsatz zuschreibt wie dem freien Enzym (370 Mol Saccharose
pro Mol Enzym pro Sekunde) so entspricht die obige Reaktionsgeschwindigkeit einer Aktivität von 21,4 mg
Invertase in 1 1 einer 6%igen Saccharose-Lösung. Da nur 1,5 cm3 eines Invertase-Komplexes für die Hydrolyse
von 400 cm3 Substrat verwendet wurden, so wird die an 1,5 cm3 Membran gebundene Menge Invertase zu
8,56 mg berechnet oder zu 5,7 mg Invertase pro 1 cm3 des Komplexes.
Diese Serie von Experimenten wurde über eine Zeitdauer von 13 Tagen durchgeführt. Der Komplex
wurde bei 2° C in 5 cm3 destilliertem Wasser aufbewahrt, wenn er nicht gebraucht wurde.
Beispiel 3 (Urease)
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Verwendung von Urease-Kollagen-Membranen. 1 cm3
eines 0,025 mm dicken Kollagen-Films (während 48 h bei 600C und 95% relativer Feuchtigkeit nacherhitzt)
wurde in einer Milchsäurelösung (pH = 3) gequollen und sodann xh h lang in Wasser gewaschen. Der
gewaschene Film wurde in eine Enzymlösung von 200 mg Urease in 15 cm3 Wasser während 16 h
eingetaucht. Sodann wurde der Film auf eine Celluloseacetat-Substrat aufgebracht und bei Zimmertemperatur
getrocknet.
Vor der Verwendung wurde der Membran-Urease-Komplex mit 5 1 Wasser gewaschen und 5 Tage bei 20C
gelagert, ehe die Urease-Aktivität gemessen wurde.
Hydrolyse von Harnstoff mit dem Urease-Kollagen-Membrankomplex
Tag Konzentration d. % hydrolysierter Harnstoff während angegebener
Harnstofflösung Reaktionsdauer
3,3 X 10"3
Potentiometrische Messung
(anfänglich) | |
1 | 100 |
2 | 100 |
3 | 10 |
4 | 1 |
5 | 1 |
8 | 1 |
8 | 1 |
8 | 1 |
Verwendung von
Nessler's Reagenz
Nessler's Reagenz
pH der Harnstofflösung
anfänglich endgültig
anfänglich endgültig
0,21% (30 min) - -
0,3% (20 h) - -
0,20% (160 min) - -
7,6% (200 min) - -
14% (20 min) - -
7,6% (20 min) 8% (20 min)
3,8% (20 min) 5% (20 min) 7,30 7,40
99% (20 h) 99% (20 h) 7,30 7,90
a. Bei allen Experimenten zur Hydrolyse von 50 cm3 Harnstofflösung wurde 1 cm3 des Membrankomplexes verwendet
b. Der am 4. Tag verwendete Membrankomplex wurde vor der Verwendung am 5. Tag in 50 cm3 einer Enzymlösung (100 mg
Urease/50 cnr) während 14 h eingetaucht und sodann mit 21 Wasser gewaschen.
c. Durchschnitt von zwei Experimenten.
Die Urease-Aktivität wurde durch direkte potentiometrische Messung der Ammoniumionenkonzentration
unter Verwendung einer kationenempfindlichen Elektrode, Beckman 39137, verfolgt Ferner wurde eine
colorimetrische Messung mit Hilfe von Nessler's Reagenz durchgeführt Ammoniumsulfat wurde verwendet,
um in beiden Fällen eine Standardkurve zu erhalten. Ein Tropfen eines frisch hergestellten Nessler's
Reagenz wurde zu 2 ml Substratlösung gegeben und die Farbintensität wurde spektral fotometrisch bei
einer Wellenlänge von 430 πιμ gemessen. Drei Konzentrationen
von Harnstoff, nämlich 33 χ 10-',33 χ ΙΟ-2
und 33 x 10~3 Mol in destilliertem Wasser wurden
verwendet Die Aktivität des Membrankomplexes wurde während 1 Woche getestet Die Membran wurde
in 50 cm3 destilliertes Wasser eingetaucht, bei Zimmertemperatur
gelagert, wenn sie nicht verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß bei Verwendung von 1 cm3
Membrankomplex, welcher zuvor schon 1 Woche lang verwendet wurde, während 20 h bei 50 ml einer
33 χ 10~3 molaren Lösung eine 99%ige Hydrolyse
stattfand.
Beispiel 4 (Amylase)
Dieses Beispiel zeigt die Bildung und Verwendung einer Amylase-Kollagen-Komplexmembran. 2 cm3 eines
Kollagen-Films mit einer Dicke von 0,038 mm (während 48 h bei 600C und 95% relativer Feuchtigkeit nacherhitzt)
wurde in einer Milchsäurelöasung (pH = 3) während '/2 h gequollen. Sodann wurde der Film
während 5 min unter fließendem Leitungswasser gewaschen und der gewaschene Film wurde in eine Lösung
von 200 mg Malzamylase in 15 cm3 Wasser eingetaucht
und 15 h bei 20C so belassen. Es bestand keine Notwendigkeit, die überschüssige Enzymlösung zu
entfernen und der so behandelte Film wurde unmittelbar auf einen Celluloseacetatfilm mit einer Dicke von
0,025 bis 0,05 mm aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet Die getrocknete Kollagen-Amylase-Komplexmembran
wurde für die Hydrolyse von Stärke verwendet 50 cm3 einer 1 %igen Stärkelösung wurde als
Substrat bei dem Enzymversuch verwendet Die enzymatische Aktivität wurde anhand der Abnahme der
Intensität der Blaufärbung des Stärke-Jodkomplexes gemessen (Veränderung der optischen Dichte bei
400 πιμ). Ein Standard-Jod-Reagenz wurde durch
Auflösen von 30 g Kaliumjodid und 3 g J2 in Il
destilliertem Wasser hergestellt 1 Tropfen von diesem Reagenz wurde zu 20cm3 des umgesetzten Substrats
gegeben, welches während 15 min bei 400C mit 2 cm3
der Amylase-Kollagen-Komplexmembran behandelt worden war. Die Absorption bei 400 πιμ wurde
gemessen.
Die folgenden Ergebnisse der Stärke-Hydrolyse mit der Kollagen-Amylase-Komplexmembran, welche vor
Durchführung des Experimentes mit 101 Wasser
gewaschen wurde, wurden gemessen. Nach 15 min wechselte die Färbung der Jod-Stärke-Lösung von Blau
nach Violett, entsprechend dem Abbau der Stärke-Moleküle von einem anfänglichen durchschnittlichen
Polymerisationsgrad von mehr als 30 bis zu einem endgültigen durchschnittlichen Polymerisationsgrad
von 10 bis 15. Beim ersten Experiment bei einer Umsetzung von 50cm3 einer l°/oigen Stärke-Lösung
während 15 min bei 400C in Gegenwart von 2 cm3 des
Films ergab sich eine Amylase-Aktivität von 0,700, gemessen als Quotient der Abnahme der optischen
Dichte bei 400 ιπμ, dividiert durch die anfängliche
optische Dichte bei 400 mu. Der Komplex wurde mit 2 1 Wasser gewaschen. Beim zweiten Experiment ergab
sich eine Amylase-Aktivität von 0,325. Sodann wurde wiederum gewaschen und es wurde eine Amylse-Aktivität
von 0,500 beim dritten Experiment festgestellt.
Beispiel 5 (Cellulase)
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung und Verwendung eines Cellulase-Kollagen-Komplexes. 1 cm3 eines
0,038 mm dicken Kollagen-Films (während 30 h bei 55° C und 95% relativer Feuchtigkeit nacherhitzt und
sodann 2 Monate bei Zimmertemperatur gelagert) wurde in einer Milschsäurelösung (pH = 3) gequollen.
Der gequollene Film wurde sodann '/2 h lang in Wasser gewaschen und der gewaschene Film wurde in eine
Lösung von 200 mg Cellulase in 10 cm3 Wasser eingetaucht und 14 h bei 40C belassen. Sodann wurde
der so behandelte Film auf ein Cellulose-acetat-Substrat aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet. Der
getrocknete Film wurde in 11 Wasser während 2 Wochen bei 4° C gewaschen, bevor er bei den
nachstehenden Experimenten der Hydrolyse von Carboxyl-methyl-ceilulose (CMC) verwendet wurde.
50 cm3 1,5% CMC wurden als Substrat für den Enzymversuch verwendet Die enzymatische Aktivität
wurde durch Verfolgung der Abnahme der relativen Viskosität des Substrats mit einem Ostwald-Viskosimeter
festgestellt Zwischen den einzelnen Experimenten wurde der Film mit 21 Wasser gewaschen. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.
Versuch Abnahme der relativen
Viskosität während
30 min bei 20' C
30 min bei 20' C
Vergleich | 12,90 |
1 | 10,75 |
2 | 7,74 |
3 | 5,60 |
4 | 5,43 |
5 | 5,27 |
Aus diesen Ergebnissen ersieht man, daß nach fünf Experimenten der Cellulase-Kollagen-Komplex noch
befähigt war, die Viskosität des Substrats auf weniger als die Hälfte des ursprünglichen Wertes zu senken.
Während des fünften Versuchs wurde die relative Viskosität des Substrats nach 18 h Reaktionsdauer auf
1,43 gesenkt
Beispiel 6 (Invertase-Zein)
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Verwendung eines Invertase-Zein-Komplexes. 2 cm3
eines 0,038 mm dicken Zein-Films (mit Formaldehyd gegerbt) wurden in 2% (Gewicht/Gewicht) 1,5-Pentandiol
gequollen. Der Film wurde sodann mit Seidenpapier getrocknet und in eine Enzymlösung von 200 mg
Invertase in 15 cm3 Wasser eingetaucht und über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Der so behandelte Film
wurde sodann auf ein Celluloseacetat-Substrat aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet. Die
getrocknete Zein-Invertase-Komplexmembran wurde bei den nachstehenden Experimenten zur Hydrolyse
von Saccharose verwendet.
400 cm3 einer 6%igen Saccharose-Lösung wurden als
Substrat bei der Feststellung der Enzym-Aktivität verwendet. Wie in Beispiel 2 wurde die Enzym-Aktivität
in einem Umlaufreaktorsystem polarimetrisch verfolgt.
Nach Messung der Aktivität des Komplexes wurde dieser mit 2 1 Wasser gewaschen und wieder verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt.
Zahl der In 2 h invertierte
Waschungen Saccharose (%) bei
25"Cund pH = 6
25"Cund pH = 6
1 | 40 |
2 | 16 |
4 | 8 |
6 | 8 |
10 | 6 |
15 | 7 |
Die enzymatische Aktivität des Invertase-Zein-Komplexes wurde allmählich bei den Waschungen verringert
und erreichte schließlich einen stabilen Grenzwert ähnlich dem Kollagen-lnvertase-Komplex gemäß
Beispiel 2.
Beispiel 7 (Glucose-Isomerase)
Dieses Beispiel zeigt die Bildung und Verwendung eines Glucose-Isomerase-Kollagen-Membrankomplexes.
1 cm3 eines 0,025 mm dicken Kollagen-Films (während 28 h bei 60°C und 90% relativer Feuchtigkeit
nacherhitzt) wurde in einer Milchsäurelösung (pH = 3) gequollen und sodann 5 min in fließendem Wasser
gewaschen. Der gewaschene Film wurde sodann während 16 h bei 2°C in 55 cm3 Enzymlösung eingetaucht
Die verwendete Enzymlösung hatte eine enzymatische Gesamtaktivität von 5,4 χ 10~5 Einheiten
(1 Einheit = 1 Mol gebildetes Produkt/min). Der so behandelte Film wurde auf Celluloseacetat aufgebracht
und bei Zimmertemperatur getrocknet Man erhielt so einen GIucose-Isomerase-Kollagen-Membrankomplex.
Dieser Membrankomplex wurde dazu verwendet, die
Isomerisierung von D-Glucose zu katalysieren. Es
wurde bei 6O0C und pH 7,2 mit 50 ml einer 3%igen
gepufferten Lösung gearbeitet Nach 2 h Reaktionsdauer
wurde ImI Reaktionslösung entnommen und die
gebildete D-Fructose wurde nach der GysteniTCarbazol-Methode
(Z. Dische und E. Berenfreund, J. BioL ChenL,
192,583, (1951)) bestimmt Die anfängliche Aktivität des
13 14
Membrankomplexes betrug 8,3 χ ΙΟ-6 Einheiten. Der 9,8 χ 10~6 Einheiten. Sodann wurde der Membrankom-
Membrankomplex wurde sodann mit 1,51 Wasser plex mit weiteren 1,5 I Wasser gewaschen und in einem
gewaschen und vor dem zweiten Versuch während 17 h dritten Versuch bei 600C verwendet. Die Enzym-Aktivi-
bei 4°C in 100 cm3 Wasser gelagert. Bei dem zweiten tat betrug sodann ii,7 χ 10-6 Einheiten. Beim dritten
Versuch zeigte sich eine geringe Zunahme der Aktivität, 5 Versuch wurde der Membrankomplex während mehr
welche wahrscheinlich auf eine Zunahme der Reaktions- als 6 h bei 60° C gehalten. Diese Ergebnisse zeigen die
temperatur von 60 auf 65°C während des Versuchs Stabilität und wiederholte Verwendbarkeit des Mem-
zurückzuführen war. Die enzymatische Aktivität betrug brankomplexes.
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung einer enzymatisch aktiven Membran durch Inberührungbringen einer
Proteinmembran mit der wäßrigen Lösung eines Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß
man eine Kollagen-, Zein-, Casein-, Ovalbumin-, Weizengluten-, Fibrinogen-, Myosin-, Mucoprotein-,
Polyglutamat-, Polyaspargat-, Polyphenylalanin-, Polytyrosin- oder Leucin-p-Amir.ophenylalanin-Copolymer-Membran
bei einem pH von 2—12 bis zur maximalen Quellungskapazität quillt und daß man
die gequollene Membran in eine wäßrige Lösung des Enzyms mit einem pH zwischen dem isoelektrischen
Punkt der Membran und dem isoelektrischen Punkt des Enzyms eintaucht
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Membran einsetzt, die auf
einen Träger aufgebracht ist
3. Verwendung der nach Anspruch 1 oder 2 hergestellten enzymatisch aktiven Membran zu
enzym-katalysierten Substratumwandlungen.
4. Enzymatisch aktive Membran, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 oder 2.
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