DE2222092A1

DE2222092A1 - Antigene Substanz zur Pruefung auf Tuberkulose und Verfahren zur Herstellung derselben

Info

Publication number: DE2222092A1
Application number: DE19722222092
Authority: DE
Inventors: Dr Kniker William T
Original assignee: LINCOLN LAB Inc; LINCOLN LABORATORIES INC
Current assignee: Lincoln Laboratories Inc (eine Gesellschaft Nd
Priority date: 1971-05-05
Filing date: 1972-05-05
Publication date: 1972-11-16
Also published as: CA991992A; FR2135284B1; US3969497A; GB1385087A; FR2135284A1

Description

Lincoln Laboratories, Inc.

3 HANNOVER. BURCKHARDTSTR. 1

TELEFON CO5I» 6a 84 73 Unser Zeichen 279/9

Datum 3. Mai 1972

Antigene Substanz zur Prüfung auf Tuberkulose und Verfahren zur Herstellung derselben

Die Erfindung bezieht sich auf eine antigene Substanz zur Prüfung auf Tuberkulose und auf ein Verfahren zur Herstellung einer solchen antigenen Substanz.

Es ist seit vielen Jahren bekannt, daß eine Infektion eines Menschen mit der Krankheit, die man als Tuberkulose bezeichnet und durch Mycobacterium tuberculosis (M. tb.) hervorgerufen ist, durch eine Injektion mit einem antigenen Material in die Haut geprüft werden kann, wobei sich dieses Material von Tuberkelbazillen oder ihren Stoffwechselprodukten ableitet. Das antigene Material, Tuberkulin, veranlaßt sensitisierte Lymphozyten, eine verzögerte Hypersensitivität an der Injektionsstelle hervorzurufen. Die sich daraufhin ergebende

WR/Si

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Schwellung bezeichnet man als Edema oder Induration und die Rötung in diesem Gebiet als Erythema. Nach einer bestimmten Zeit, im allgemeinen nach 48 bis 72 Stunden, wird die Größe der Schwellung gemessen und mit einem Standard, welcher vor-, her festgelegt ist, verglichen, wobei der Standard die jeweilige Reaktionsgröße nach einer bestimmten Dosis an Antigenen mit Bezug auf die Möglichkeit und auf eine rezente frühere Infektion mit M. tb. erkennen läßt. Auf diese Weise wird eine Bewertung vorgenommen, ob der Patient "positiv" oder "negativ" reagiert.

Es gibt eine Anzahl von antigenen Materialien oder Tuberkulinen, und es gibt auch eine Anzahl von Einrichtungen, um diese in die Haut zu übertragen. Das klassische Mittel zur Injektion ist eine Nadel und eine Spritze, die in der medizinischen Literatur als "Mantoux test" bezeichnet werden, ein Verfah^ren, das außerordentlich viel Geschicklichkeit erfordert sowohl bei der Ausführung der Injektion -. als auch bei der Auswertung der Ergebnisse. Andere Verfahren verwenden einen einfachen Kratztest, den man auch als "Vollmer"-Test bezeichnet oder mehrfache Einstiche vermittels eines Instruments, das als "Heaf gun" bezeichnet wird, aber auch unter dem Warenzeichen "Sterneedle" bekannt ist oder einfach durch Punktieren der Haut und einer Injektion mit einem Instrument, das als "Mono-Vacc" der Lincoln Laboratories bekannt geworden ist und als "Tine Test¹¹ der

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Lederle Laboratories. Aus Gründen, die hier nicht weiter interessieren, ist der Mantoux-Test als Standarddiagnosetest allgemein akzeptiert, während die Verwendung anderer Instrumente im allgemeinen als Sichtungstest nützlich.ist, d. h. um in einem ersten Test eine Gruppe von Menschen, die untersucht werden sollen, zu überprüfen auf jene, die klar positive Reaktion geben. Einige der oben aufgeführten Tests, beispielsweise der Vollmer-Test, sind als unzulässig abgelehnt worden.

Auch bei dem Mantoux-Test ist das Problem der Zuverlässigkeit nach wie vor vorhanden. Ein Hauptgrund für die unzuverlässigen Faktoren in dem Test ist auf die Natur des antigenen Materials, welches von dem Testinstrument und dem Testverfahren verwendet wird, zurückzuführen. Bis jetzt werden zwei Tuberkuline verwendet, die in der medizinischen Literatur als "Old Tuberculin" (OT) und "Purified Protein Derivative" (PPD), ein Derivat von OT, bezeichnet werden.

Die medizinische Literatur hat schon vor Jahren auf die Existenz dieses Unzuverlässigkeitsfaktors unter dem Begriff "falsche Positive" mit Bezug auf die Verwendung von OT und PPD hingewiesen. Diese unerwünschten Reaktionen stammen prinzipiell von der Stimulierung der Lymphozyten, die vorher durch eine Infektion durch arx.dere Bakterien "sensitiviert waren, beispielsweise durch eine atypische "mycobacteria",

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die eng mit der M. tb. verwandt ist. Gewisse Antigene verteilen sich aber gemeinsam auf M. tb. und andere Mykobakterien. Falls diese geteilten oder diese Antigene mit Querreaktionen in dem Tuberkulin, welches in die Haut injiziert wird, zugegen sind, kann ein Patient, der früher durch Mycobacteria anderer Art als M. tb. infiziert war, eine positive Reaktion zeigen.

Die Existenz der falschen Positiven geht daher auf die Verwendung von OT oder PPD bei allen Arten von Injektionen oder Stich- oder Kratzinstrumenten zurück und hat ein wirkliches Problem erzeugt, mit dem sich die Medizin seit langer Zeit befaßt. Es ist durchaus bekannt, daß ein spezifisches antigenes Material, das in einer zuverlässigen und wirksamen Weise in einem Diagnosetest für M. tb. verwandt werden kann, notwendig ist.

Von manchen Forschern ist postuliert worden, daß die Isolierung eines einzigen spezifischen Antigens für M. tb. ein ideales antigenes Material zur Diagnostizierung von M. tb. im Hauttest wäre und für Diagnosetests für M. tb.-Sensitisierungen oder Infektionen in vitro.

Es wurden viele Studien über das antigene Gemisch von M. tb.-Kulturfiltraten angefertigt mit demZiel, wie man solche für die Diagnose zuverlässige und äußerst spezifische Antigene auswählen und isolieren kann. Es sind viele Verfahren für solche Mycobacteria-Antigenisolationen vorgeschlagen

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worden, beispielsweise in American Review of Respiratory Disease, Ausgabe 89, Nr. 1, Januar 1964, Seite 29 et seq. und Ausgabe 92, Dezember, Teil 2, 1965, Seite 19 et seq. Es scheint jedoch, daß der Schlüssel zur Bereitung eines antigenen Materials, das sowohl eine hohe Spezifizität und hohe Empfindlichkeit aufweist, bis jetzt noch nicht gefunden wurde trotz der Tatsache, daß solche für M. tb. spezifischen Antigene zu existieren scheinen und die Literatur präparative und analytische Verfahren für ihre Trennung und Isolierung beschreibt und das seit vielen Jahren.

Ein einziges isoliertes Antigen für M. tb., selbst wenn es hoch spezifisch für M. tb. ist, dürfte kaum ein befriedigendes Tuberkulin für weit verbreitete Verwendung zur Diagnose aus einer Vielzahl von Gründen abgeben. Für M. tb.-empfindliche Menschen und Tiere sind unvertretbar große Dosen eines einzigen Gens erforderlich, um auch nur eine schwach positiv verzögerte hypersensitive Reaktion in einem geringen Prozentsatz von Patienten zu erzeugen. Es läßt sich theoretisch zeigen, daß einzelne Antigene nicht in der Lage sind, eine Reaktion von einer ausreichenden Anzahl von Lymphozyten hervorzurufen, um eine ausreichende Entzündung einzuleiten. Aus diesem Grund können unerwünschte sofortige hypersensitive Reaktionen in der Haut auftreten, die durch Antikörper oder durch Immunisierung der getesteten Personen mit großen Dosen von Antigenen herrühren. Außerdem ist es

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möglich, daß einige Patienten oder Tiere keine Immunität oder immune Reaktion für bestimmte Antigene zeigen. Das kann angeboren oder erworben sein. Ein besonderer, einzelner Gen braucht sich nicht in allen M. tb.-Stämmen zu finden, die in der Lage sind, einen Menschen oder ein Tier zu infizieren und wenn dieses Antigen in dem Organismus nicht zugegen war, der selbst eine kleine Anzahl von Menschen und Tieren infizierte, dann ist die diagnostische Brauchbarkeit und die Zuverlässigkeit eines solchen einzigen Gens stark beeinträchtigt.

Der physiochemische Charakter eines einzigen Gens kann bei manchen Menschen die gewünschte positive Verzögerung der Hypersensitivitätsreaktion in vivo oder in vitro nicht hervorrufen. Ein solches M. tb.-Antigen kann ein solches sein, das vorwiegend ein Kohlenwasserstoff ist. Es ist auch gezeigt worden, daßfrühere Infektionen oder Sensitisierungen durch gewisse atypische Mykobakterien die hypersensitive Reaktion auf einzelne Antigene zum Verschwinden bringen, selbst dann, wenn die getestete Person oder das Tier erst kürzlich mit M. tb.-Organismen infiziert und sensitisiert worden ist. Stattdessen wurde gefunden, daß ein Gemisch von mehrfachen Antigenen, die für M. tb. spezifisch sind und die getrennte und besondere physische und chemische Eigenschaften aufweisen, wie man sie durch die Chromatographie und andere

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Verfahren feststellt, die verzögerte hypersensitivität synergistisch verstärken, ohne daß eine Verringerung der spezifischen Wirksamkeit eintritt. Die Verwendung eines solchen Gemisches von speziellen Antigenen führt zu einer Reaktion, die die gewünschte spezifische Wirksamkeit besitzt bei einer wesentlich niedrigeren Dosis als sie sonst nötig wäre, wenn nur ein einziges M. tb.-Antigen verwendet werden würde.

Mithin wird erfindungsgemäß eine antigene Substanz vorgeschlagen, die im wesentlichen frei von querreagierenden Antigenen ist und die daher eine positive verzögerte hypersensitive Reaktion auf eine in die Haut gemachte Injektion einer ausreichenden Menge von Antigen hervorruft, so daß zuverlässig erkennbar ist, ob der Patient nur auf eine Sensitisierung durch M. tb.-Antigen reagiert.

Die beigefügte Zeichnung zeigt eine graphische Darstellung von Ergebnissen von spektrofotometrischen und Immunodiffusionstests und läßt den Charakter verschiedener Antigene erkennen, die in einem Filtrat einer repräsentativen M. tb.-KuItür enthalten sind."

Ehe mit der spezifischen Diskussion der Erfindung begonnen werden soll, wird eine kurze Zusammenfassung angebracht sein. Die wesentlichsten Schritte des Verfahrens sind:

I. Herstellung eines Filtrats oder eines Bakterienextrakts aus einer M. tb.-Kultur;

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II. Fraktionieren dieses Filtrats oder des Extrakts und Identifizierung der Antigene in den Fraktionen und

III. Herstellung einer Testsubstanz durch Kombiniereh einer Mehrzahl von Fraktionen, die M. tb.-spezifische Antigene enthalten und im wesentlichen frei von querreagierenden Antigenen sind.

Zu I., nämlich der Herstellung des Filtrats, werden mehrere verschiedene M. tb.-Organismen verwendet. Diese Organismen sind leicht von Laboratorien in den Vereinigten Staaten zu erhalten und werden wie folgt identifiziert:

C-3; C-27; H37 Rv und TMC-107

Die H37 Rv (und TMC-1.07)-Kulturen wurden als virulent charakterisiert, und von Dr. William-Steencken, Saranac Lake, New York zur Verfügung gestellt. Die C-27 und C-3-Kulturen wurden von Dr. J: Bates,Veteranf Administration Hospital, Little Rock, Arkansas zur Verfügung gestellt. Eine Serie von atypischen mykobakterischen Kulturen wurde von Dr. Ernest Runyon, Salt Lake City, Utah oder dem Veterans' Administation Hospital in Little Rock, Arkansas, bezogen und fand Verwendung bei der Bestimmung der Querreak-

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tionen und bei der Herstellung von Antisera. Die Originalkulturen und Subkulturen wurden auf einem Löwenstein-Jensen-Gestell bei 4° gelagert. Für die Herstellung der rohen Antigene wurde eine Proskauer-Beck-Plüssigkeit verwendet. Weitere Einzelheiten über dieses Medium können dem Journal of Bacteriology, 1946/ Ausgabe 51, Seite 703 entnommen werden. Nach der entsprechenden Behandlung wurden die Medien mit je einem der zu studierenden Organismen geimpft. Nach der Inkubation wurde der Inhalt der Kolben gleichmäßig auf 8 bis IO sterilisierte Roux-Flaschen zur Impfung verteilt, von denen jede 250 ml des Proskauer-Beck-Mediums enthielt. Diese wurden dann einer Inkubationszeit von 8 bis 12 Wochen unterworfen.

Nachdem ein starkes Wachstum stattgefunden hatte,wurden die Kulturen geerntet und durch Filtration durch eine Seitz-Filterplatte sterilisiert. Das meiste des sterilen Kulturfiltrats wurde dann auf das 50-fache durch Vakuumdialyse konzentriert, Thiomerosal im Verhältnis von 1 : 10 zugesetzt und das Gemisch dann bei -20°C bis zum Gebrauch gelagert.

II. Die Abtrennung der Antigene und ihre Identifi7 zierung.

Der nächste Schritt besteht in der Fraktionierung des Filtrats, so daß man die Antigene trennen kann. Das kann auf verschiedene Weise geschehen. Eine Separierung kann vermit-

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tels Ionenaustauschchromatographie vorgenommen werden. Dabei kann man eine Anzahl von Fraktionen aus dem Filtrat herstellen. Es wurde gefunden, daß einige von ihnen sowohl spezifisches M. tb.-Antigen enthalten als auch solches, welches Querreaktionen ergibt. Die Fraktionen müssen dann weiter aufgetrennt oder Unterfraktionen erzeugt werden.

Als Alternative zur chromatographischen Separation bietet sich die elektrophoretische Separation an. Es wurde von anderen gefunden, daß die langsamste elektrophoretische Fraktion, die sogenannte Α-Fraktion, eine große Anzahl von M. tb.-spe2ifischen Antigenen erihält. Eine schneller durchgeführte Fraktion, die B-Fraktion, enthielt weitere spezifische Antigene, während die sich am schnellsten bewegende

Fraktion, die C-Fraktion, vielmehr querreagierende Antigene enthielt als spezifische. Diese genannten elektrophoretischen Fraktionen stimmen in ihrem Antigengehalt grob mit den chromatographischen Fraktionen überein, die mit denselben Buchstaben nachfolgend bezeichnet sind.

In jedem Falle enthält jede der Hauptfraktionen, ganz gleich, ob durch Ionenaustauschchromatographie oder elektrophoresisch getrennt, immer noch ein Gemisch von M. tb.-spezifischen und querreagierenden Antigenen, die weiter fraktioniert oder getrennt werden müssen. Diese weitere Trennung kann nun entweder durch Molekularausschlußchromatographie,

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isoelektrische Fokussierung oder Scheiben- oder Polyakrylamidgel-Elektrophoresis, insbesondere die diskontinuierliche Gelmodifikation erfolgen. Unter Verwendung dieser Verfahren können die verschiedenen Antigene getrennt werden.

Immunodiffusxonsverfahren können verwandt werden, um festzustellen, welche Antigene in irgendeiner Fraktion oder Unterfraktion Querreaktionen eingehen und welche spezifisch für M. tb. sind. Dieses Immunodiffusionsverfahren verwendet hyperimmune Antisera für jeden der vielen Stämme von M. tb. als auch für repräsentative Stämme von atypischen Gruppen von mycobacteria. Wenn man einmal die querreagierenden Antigene erkannt hat, dann werden nur jene Fraktionen oder Unterfraktionen, die für M. tb. spezifische Antigene enthalten, für die neue Testsubstanz vereinigt.

Zur weiteren Erläuterung der hier verwendeten Verfahren werden die besonderen Trennverfahren und Vergleichsverfahren, die nachfolgend aufgeführt sind, mit Bezug auf die verschiedenen Ionenaustauschchromatographiefraktionen diskutiert. Die bei einer Fraktion brauchbaren Verfahren können auch für andere Fraktionen angewandt werden. Es wird angenommen, daß die vereinigte Verwendung von Ionenaustauschchromatographie und eine bestimmte Form der Polyakrylamidgel-Elektrophorese das wirksamste Verfahren ist.

Ein Filtrat einer Kultur, z. B. das von einem Stamm von M. tb. erhalten worden ist, wird über eine DEAE-Zellulose-

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anionaustauscherkolonne fraktioniert. Das Grundverfahren, welches angewandt wird und welches im einzelnen in den oben erwähnten Zeitschriften ausführlich beschrieben ist, ist seitdem wenig verändert worden. Nachdem die Kolonne vorbereitet ist, wird .sie mit dem konzentrierten Konzentrat beschickt. Dann wird die Kolonne mit dem ersten Puffer gewaschen, um die lose gebundenen Antigene zu eluieren. Bei einer neueren Modifikation verwendet man wenigstens 500 ml eines ersten Puffers, um die lose gebundenen Antigene vollständig zu eluieren, und die erhaltene Fraktion nennt man Waschfraktion und sie wird auch so in der repräsentativen Darstellung bezeichnet. Der erste Puffer ist eine 0,01-Molare-Lösung von Na₂HPO₄, die auf pH 8,0 eingestellt ist. Die weitere Eluierung setzt man dann fort unter Verwendung einer polystaltischen Pumpe und eines Varigrad-Systems von Pufferkammern, damit die Molarität des Puffers bis auf 0,5 M gesteigert werden kann in einem flachen linearen Gradienten. Wenn das Eluat aus der Kolonne herausfließt, wird es in einer Anzahl von Rohren aufgefangen.

Jedes Rohr wird spektrophotometrisch bei 280 mu analysiert, um die Anwesenheit von Proteinen festzustellen. In der Zeichnung ist die Absorption gegen die Gesamtmenge an Effluents in mm aufgetragen. Die Hauptfraktionen, die sich ergeben, sind durch die besonderen Spitzen als "Wash", ¹¹A" und "BC" oder als "B" und "C"-Fraktionen bezeichnet.

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Indem man spezifische Antisera für jede Fraktion der studierten Mykobakterienorganismen verwendet und diese in Immunodiffusion gegen jede Chromatographisehe Fraktion testet, ist es möglich, die Anzahl der Antigene in jeder Fraktion zu bestimmen und jedes Antigen hinsichtlich seiner spezifischen Wirkung für die M. tb.-Gruppe oder für Querreaktionen mit atypischen Mykobakterien zu kennzeichnen.

Wie z. B. aus der Zeichnung hervorgeht, ist zu erkennen, daß Antigene in dem FiItrat der RIRV-Kultur in dem betreffenden Experiment identifiziert wurden. Die durch die mit senkrechten weißen Strichen unterbrochene Linie angedeuteten Antigene sind jene, die gleichartig mit einem oder mehreren Mykobakterien außerhalb der M. tb.-Gruppe sind. Sie tragen die Nummern 1, 3, 4, 6, 9, 10, 13, 14, 15 und 20. Betrachtet man die "Wash"-Fraktion, dann sieht man, daß die Antigene 1 bis 4 anwesend sind. Von diesen Antigenen wurde nur Nr. 2 als spezifisch für die M. tb.-Gruppe identifiziert. Einfach ausgedrückt, besteht nun der nächste Schritt darin, eine Unterfraktion herzustellen oder die querreagierenden Antigene von den für M. tb. spezifischen Antigenen in einer Fraktion zu trennen und zu entfernen und dann die neue Testsubstanz aus diesen Unterfraktionen herzustellen, die nur Antigene enthalten, welche für M. tb. spezifisch sind. Es sei darauf hingewiesen, daß Filtrate und chromatographische Fraktionen sich verändern, wenn man die Untersuchungen wieder-

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holt mit irgendwelchen Organismen. So enthält z. B. RIRV-Piltrat nicht immer genau 20 Antigene, und die Waschfraktion kann mehr als 4 Antigene enthalten, von denen wenigstens einer für M. tb. spezifisch ist.

In Übereinstimmung mit der gegenwärtigen Entwicklung wurde bei neuen Experimenten, die im wesentlichen wie die früheren Beispiele ausgeführt wurden, die Waschfraktion von mehreren M. tb.-Organismen einer diskontinuierlichen Scheibenelektrophorese unterworfen, um die darin enthaltenen Antigene abzutrennen. Die Scheibenelektrophorese, wie sie hier angewandt wird, besteht im wesentlichen darin, daß man das Filtrat einer Kultur oder wie in diesem Falle eine Fraktion desselben durch eine Kolonne schickt, die drei übereinanderliegende Polyakrylamidgel-Zonen enthält, die jeweils verschiedene Gelkonzentrationen aufweisen. Bei diesen Versuchen bestand die obere Zone aus 5,0 % Polyakrylamid, die mittlere aus 7,0 % und die untere aus 10,5 %. Um das Material, welches durch Elektrophorese zu trennen ist, zu isolieren und zu kennzeichnen, werden die Gelsäulen in eine Vielzahl von dünnen Scheiben geschnitten, und jede wird in eine geeignete Lösung getaucht, damit die Antigene aus dem Gel eluiert werden können. Nach dem Zentrifugieren werden die Gele verworfen, und die oben schwimmende Flüssigkeit, die die löslichen Antigene enthält, wird untersucht. Bei einem Experiment, bei welchem eine H37Rv-Waschfraktion verwandt wurde, wurde

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ein für M. tb. spezifisches Antigen als 10-10 identifiziert
und in der 10,5 %-Säule gefunden. Bei einer anderen Gelegenheit, bei der eine C-3-Waschfraktion verwandt wurde, wurde
ein mit 8-10 identifiziertes Antigen an derselben Stelle
in der 10,5 %-Säule lokalisiert. So war es auch mit dem
10-10-Antigen von H37Rv. Diese beiden Antigene erwiesen
sich als identisch als sie später mittels Immunodiffusion
getestet wurden.

Die chromatographische Α-Fraktion von M. tb. (human) Organismen ist ebenfalls separiert worden. Dies wurde vermittels der Scheibenelektrophorese, wie oben beschrieben,
durchgeführt. Um jedoch ein anderes Verfahren hier zu erläutern, wurde eine Unterfraktion durch die Anwendung der isoelektrischen Fokussierung erhalten, was jetzt beschrieben
wird. Kurz gesagt, die isoelektrische Fokussierung wird in
einer Kolonne durchgeführt, die eine Mehrzahl von horizontal zueinander ausgerichteten Zuckerlösungen verschiedener Zuckerkonzentration enthalten. Die Kolonne ist an ihrem oberen
Ende mit Einrichtungen versehen, um einen niedrigen pH-Wert aufrechtzuerhalten oda: einen hohen pH-Wert und mit Einrichtungen am unteren Ende, um einen gegenteiligen Wert aufrechtzuerhalten. An beiden Enden der Kolonne sind auch elektrische Anschlüsse angeordnet. Die zu untersuchende Fraktion wird mit einem Träger vermischt, der als "Ampholine" bezeichnet wird, ein Reagenz, das von LKB Industries, Inc. verkauft

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wird. Das Ampholine und die Probe werden dann in die Mitte der Kolonne gebracht. Wird nun elektrischer Strom angelegt, dann bewegen sich die in dem Ampholine enthaltenen Komponenten nach oben oder nach unten und stabilisieren sich an einem Pegel, wo. ein entsprechender pH-Wert vorhanden ist. Individuelle Komponenten der Probe werden zu einer bestimmten Zone transportiert, wo sie sich ebenfalls stabilisieren, d. h. fokussieren. Ein zweiter Fokus über einem schmalen pH-Bereich kann so herbeigeführt werden, was eine weitere Trennung ermöglicht.

Eine Α-Fraktion eines konzentrierten Kulturfiltrats von C-3-Tuberkelbazillen (wie oben erwähnt) erhält man durch DEAE-Zellulosechromatographie, analysierte und fand, daß sie 7 Antigene nach der Immunodiffusion enthielt. Diese Fraktion wurde konzentriert und der isoelektrischen Fokussierung über einen pH-Wert von 3 bis 5 unterworfen unter Verwendung einer Ampholinekonzentration von 4 %. Nach 48 Stunden und bei einer Spannung von 600 V wurde die Säule eluiert und das Eluat in einer Serie von Rohren nacheinander aufgefangen. Die Rohre, die mit 11 bis 20 bezeichnet sind, wurden zusammengegossen und das darin enthaltene Material zwischen den pH-Werten 3,70 und 4,12 fokussiert.

Diese zusammengegossenen 10 Rohre wurden einer zweiten isoelektrischen Fokussierung unterworfen, und das

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•Ampholat, welches darin enthalten war, erzeugte einen linearen Gradienten über einen pH-Bereich von3,10 bis 4,15, Durch immunologische Tests wurden Antigene in zwei getrenn- ' ten Bereichen gefunden. Im ersten Bereich mit einem isoelektrischen pH-Wert zwischen 3,2 bis 3,7 waren zwei Antigene vorhanden, die beide für alle Stämme humaner und bo— ' viner Tuberkulosebazillen spezifisch wirkten. (Die Antigene reagierten nicht mit Antisera auf irgendeins der A-typischen Mycobacteria). Diese beiden spezifischen Antigene wurden in einer Fraktion erhalten, die als 11-22B bezeichnet wurde. Die beiden anderen Antigene hatten isoelektrische Punkte oberhalb 4,0 und gingen Querreaktionen mit ein oder mehreren der Α-typischen Organismen ein. Wenn weitere 10 kontinuierliche Rohre aus der 4 %-igen Ampholine-Behandlung in ähnlicher Weise fokussiert wurden, wurde ein weiteres für M. tb. spezifisches Antigen ermittelt und zwei guerreagierende Antigene.

Die B- und C-Spitzen sind Unterfraktionen, die durch Scheibenelektrophorese, wie oben beschrieben, erhalten wurden, um Trennung der Antigene vorzunehmen.

Antigene aus verschiedenen nitraten von Kulturen wurden durch Kombination der oben erwähnten Verfahren getrennt und an Meerschweinchen, wie weiter unten beschrieben, getestet.

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Für eine erste Reihe von Versuchen wurden Meerschweinchen, die durch ein oder mehrere Mykobakterien infiziert waren, verwendet, um die verzögerte hypersensitive Reaktion der Haut auf gewisse Fraktionen hin zu bestimmen. Es wurden jeweils 6 Meerschweinchen infiziert, entweder einzeln oder zusammen durch· die nachfolgend -aufgeführten Mykobakterien: -

(1) H37 RV - oben identifiziert

(2) Gruppe I - atypisch, M. Kansasii

(3) Gruppe II - atypisches mycobacterium

Gause-Stamm

(4) Gruppe III - atypische mycobacteria der

Avin- und Battery-Typen

(5) Gruppe IV - atypisch, M. Fortuitum

Einige Meerschweinchen zeigten mehrfache Infektionen, und diese sind in der Reihenfolge ihrer Infektion in Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I Infizierende Mykobakterien

Meerschw.- H37RV Gruppe I Gruppe II Gruppe Gruppe IV Gruppe III

Gruppe I nur

Gruppe II zweite u. erste

letzte

Gruppe III dritte u. zweite erste letzte

Gruppe IV dritte u. erste u.

letzte zweite

Gruppe V dritte u. erste zweite

letzte

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Gewisse isoelektrisch fokussierte Unterfraktionen, die aus der Α-Fraktion der Ionenaustauschchromatographie bereitet wurden, wurden ausgewählt, um damit den Hauttest auf verzögerte Hypersensitivitat an den nachfolgenden Meerschweinchen durchzuführen.

	Tabelle II	Antigene (durch Immunodiffusion)
Tuberkel-Bacilli	Unterfraktion	2 M.tb. spezifisch
C-27	4-7A	2 M.tb. spezifisch
C-3	11-22B	3 querreagierend mit atypischen Mykobakte rien
H-37RV	1-3B	3 querreagierend mit atypischen Mykobakte rien
C-3	2-4B

Es wurden Untersuchungen durchgeführt, bei denen ein jedes Meerschweinchen aus jeder Gruppe gemäß Tabelle I mit jeder der Unterfraktionen der Tabelle II geimpft wurde. Zur Kontrolle wurden die Meerschweinchen auch mit PPD, einem rohen Tuberkulin, geimpft. Alle Dosen betrugen 0,0001 mg, was die Standardintermediate-PPD-Dosis ist. Die Meerschweinchen wurden nach 48 und 78 Stunden untersucht, ob irgendeine Hautreaktion stattgefunden hatte. Wenn das der Fall war,wurde die Größe oder der Durchmesser der Verhärtung gemessen und in Millimeter festgehalten.

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Tabelle	III	11-22B	1-3B	den	14 mm
	N.R.		2-4B	12 mm
Mittlere Hautverhärtung bei Impfstoffen	N.R.	11-14 mm 8-17 mm	N.R.
4-7A	N.R.	N.R.	N.R.
N.R.	N.R.	5 mm
N.R.	N.R.	N.R.
N.R.	N.R.
N.R.
N.R.

Meerschweinchen

PPD

Gruppe I 7-15 mm Gruppe II 14 mm Gruppe III 13 mm Gruppe IV 14 mm Gruppe V 10 mm

N.R. = keine Reaktion

Aus diesen Tests ist zu ersehen, daß die Fraktionen 4-7A und 11-22B, die spezifische Antigene enthielten, keine Reaktion bei den infizierten Meerschweinchen hervorriefen, obgleich sie mit den Antisera in vitro (siehe Tabelle II) reagierten, und die Versuche zeigen, daß querreagierende Antigene offensichtlich ähnliche Reaktionen geben wie bei der Verwendung von PPD. Diese bestimmten querreagierenden Antigene können potenter sein als jene , die keine Reaktion hervorriefen, oder es können mehr Antigene zugegen gewesen sein als die Reaktion erfolgte als wenn keine Reaktion stattfand. Es ist wesentlich, darauf hinzuweisen, daß frühere Infektionen mit atypischen Mykobakterien, wie beispielsweise die Organismen der Gruppe III das Ansprechen der Meerschweinchen, die anschließend mit M. tb. infiziert wurden, für die gereinigten querreagierenden Fraktionen und nicht für das rohe PPD (siehe Gruppen II, IV und V) aufheben.

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Zusätzliche Versuche wurden unter Verwendung der in Tabelle IV identifizierten Unterfraktionen durchgeführt, um zu bestimmen, was für einen Effekt, wenn überhaupt, eine größere Dosis haben würde.

	Ta ll)	Tabelle IV	2	Antigen	spezifisch
		Fraktion	1	M.	spezifisch
Tuberkel-Bacilli		11-22B	4	' M.	spezifisch
C-3 (siehe belle		14-31B		M.
TMC-107	11-20Z
C-3	11-20A		,tb.
		,tb.
	,tb.

Alle Fraktionen in Tabelle IV wurden durch chromatographische Trennung des Kulturfiltrats und isoelektrische Fokussierung der chromatographischen Α-Fraktion hergestellt.

Versuche mit diesen Fraktionen wurden an Meerschweinchen durchgeführt, die mit M. tb.-human H37RV, Rinder-M. tb. .und drei atypischen Mykobakterienstammen infiziert waren. Die injizierte Dosis eines jeden Antigens betrug 0,001 mg, eine zehnmal größere Dosis als die übliche PPD-Dosis. Bei den Meerschweinchen, die mit atypischen Mykobakterien infiziert waren, erfolgte keine Reaktion. Bei diesen Dosen reagierten 3 von 5 Tieren (mit dem Humanstamm infiziert) und auf die 14-31B-Fraktion positiv und 4 von 5 Tieren (human) und 2 von 5 (Bovinstamm) auf die ll-20Z-Fraktion positiv. Auf die 11-22B- und die ll-20A-Fraktionen erfolgte überhaupt keine Reaktion.

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Es sei daran erinnert, daß in den vorangegangenen Tests mit den 0,0001 mg-Dosen die ll-22B-Fraktion bei den mit H37RV behandelten Tieren überhaupt keine Reaktion hervorrief.

Obgleich einige Versuche mit den M. tb.-spezifischen Antigenen positiv waren, ergab die größere Dosis keine merkliche Vergrößerung der Verzögerung der hypersensitiven Reaktion.

Bei weiteren Versuchen ntt dieser und anderen Fraktionen, die M. tb.-spezifische Antigene enthielten, um festzustellen, ob noch größere Dosen befriedigende Hautreaktionen hervorriefen, wurdei die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten zusätzlichen Fraktionen benutzt.

	Tabelle V	Antigen
Tuberkel-Bacilli	Fraktion	2-3 M.tb. spezifisch 1 M.tb. spezifisch 1 M.tb. spezifisch
H37RV C-3 H37RV	1-3A 8-10 10-10

Die 8-10-Antigenfraktion wird durch diskontinuierliche Gelelektrophorese aus der Waschfraktion getrennt, in der man spezifische Antigene in der 10,5 %igen Gelsäule fand. Die 10-10-Fraktion wurde wie die 8-10-Fraktion hergestellt.

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Meerschweinchen, die nur mit dem RIRV-Stamm von M. tb. infiziert worden waren, wurden für diese zusätzlichen Tests verwendet, um den Effekt der Dosis für einzelne Antigene oder Fraktionen zu bestimmen. Die Tabelle VI, die sich anschließt, enthält die Ergebnisse dieser Tests, und wie bei früheren Tabellen wird der Vergleich der Antigenentests bezogen auf eine Dosis von PPD. Mit Ausnahme der PPD-Dosis waren die anderen Dosen 0,01, 0,001 und/oder 0,0001 mg.Die Größe der Hautverhärter in Millimeter wurde der Länge, der Breite und der Höhe nach gemessen.

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Tabelle VI
Dosen in mg (Protein)

Meer- PPD 11- 4-7a 11-20Z 14-31B 1-3A 8-10 10-10

schw. 22B

0,GDOl 0,01 0,01 0,01 0,001 0,0001 0,01 0,001 0,01 0,001 0,0001 .01 .001 .0OQ .01 001 .0001

I4x 4x

15x NR NR NR NR ' NR NR NR 4x NR NR NR NR ^- MR NR NR NR
· 0,5

16x 5x 9x

I8x NR 5x NR NR NR — NR - NR NR 8x NR NR NR NR NR
3,5 0,5 1

- - NR NR - NR NR NR - NR NR - NR NR

	3	I3x
CN		I3x -
I		1
ro	4	Hx
ο		I2x -
co		1
OO
	5	I6x
-«j		I3x -
V		2

- - NR NR - NR

15x14

x2 NR - NR

NR - keine Reaktion

P - positive Reaktion angenommen, da bereits die 10-fach kleinere Dosis positiv war
- - nicht getestet N)

	NR	NR	P	NR	NR	NR	NR
	13x	8x		8x
P	Hx	8x	8x	NR	NR	NR
	0,5	Ix	Ix

Die Konzentration von 0,01 mg (Protein) ist hundertmal größer als die normale PPD-Dosis. Selbst bei diesen hohen Dosen erfolgten nur 5 positive Reaktionen auf gereinigte Antigene in 14 Versuchen bei einer Dosis von 0,01 mg. Es ist jedoch auch zu erkennen, daß stark vergrößerte Dosen tatsächlich einen positiven Effekt hervorrufen, wenn kleinere Dosen das nicht tun.

Um den Effekt von gemischten Unterfraktionen oder einer Mehrzahl von Antigenen zu bestimmen, wurden drei Gemische hergestellt, die jeweils gleiche Mengen der drei nachfolgend aufgeführten Unterfraktxonen enthalten.

Gemisch I 11-22B + 10-10 + 8-10 Gemisch II 11-22B + 10-10 + · 11-20Z Gemisch III 4-7A + 10-10 + 11-20Z

Diese drei Gemische wurden so hergestellt, daß jede Dosis 0,002 mg Protein enthielt, was etwa zwanzigmal mehr ist als das der PPD-Standarddosis. Jede Komponente eines jeden Gemisches hatte mithin eine Konzentration von unge¹-fähr 0,0007 mg. Das Volumen einer jeden Dosis betrug etwa 0,1 ml und wurde den Meerschweinchen infiziert, die vorher mit dem RIRV-Stamm von M. tb* infiziert worden waren. Wie bei den anderen Tests erfolgten zusätzlich zu den Injektionen der Gemische PPD Kontrollimpfungen. Die Testergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt, und die Hautverhärtung ist wie vorher auch in Millimeter angegeben.

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	PPD	Tabelle VII	8-10	Gemisch II	10x7x1	11-22B	Gemisch III	4-7A	—"
Meer- schw.	.OOOlmg	Gemisch I	.002mg .002mg	12xl2x 0,5	.002mg	.002mg	.002mg	—
	12x15x2	.OO2mg	NR	12x10x 0,5	10x8x1	13x11x1	6x6x0,5	-
1	15x15x2	NR	NR	12xl3x 1/5	5x5x0	13x13x1	NR
2	7x5x1	NR	NR	22x21x 3	NR	—
3	17x16x2	NR	5x5x 0,5		1OxIOx 10	—
4	10x11x2	5x4x 0,5	5x5x 0,5	16xl4x 2	-
5	8x8x1

Die sich beim Gemisch II ergebenden Reaktionen, das insgesamt wenigstens 5 verschiedene M. tb. -spezifische Antigene enthält, sind deutlich ähnlich den Ergebnissen, die man durch PPD erhält. Vergleicht man die Reaktion, die man durch 11-22B allein erhält - siehe Tabelle VI - ist erkennbar, daß das Gemisch einen synergistischen Effekt hervorbrachte. Das beruht auf der Beobachtung, daß in den tabulierten Tests der Tabelle VI die Fraktion 10-10 überhaupt nicht reagierte und 11-20Z nur bei einem von 5 Tieren eine Reaktion zeigte bei einer Dosis von 0,001 mg. Mithin sind die Reaktionen, die das Gemisch 11 hervorbrachte, größer, d. h. synergistisch gesteigert. Über die Ergebnisse hinaus, die man von 11-22B oder irgendeiner anderen einzigen Komponente allein erwarten konnte. Ähnliche synergistische Ergebnisse sind bei dem Gemisch III

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festzustellen, wenn man es mit einem seiner 5 Komponenten der Fraktion 4-7A vergleicht.

Diese Versuche zeigen deutlich, daß Tuberkuline, die frei von querreagierenden Antigenen sind und eine Mehrzahl von M. tb.-spezifischen Antigenen enthalten, Reaktionen hervorbringen können, die gleich jenen sind, die man mit PPD erhält.

Wenn man einmal Unterfraktionen erhalten hat, die M. tb.-spezifische Antigene enthalten und frei von querreagierenden Antigenen sind, lassen sich andere Kombinationen, als Hauttestmaterial ableiten. Es wurde z. B. gefunden, daß ein einziges M. tb.-spezifisches Antigen in der 10,5 %-Gelzone isoliert werden kann, wenn man eine diskontinuierliche Gelelektrophorese für jede Wasch-, A- und BC-chromatographische Fraktion von H37RV oder C3-Kulturfiltrate verwendet. Ein Gemisch dreier solcher M. tb.-spezifischer Antigene, von denen ein jedes klar verschiedene physiochemische Eigenschaften aufweist, dürfte zeigen, daß es ein häufiger reagierendes Gemisch sein wird als die Kombination von 3 M. tb.-spezifischen Antigenen,. die man aus derselben chromatographischen Fraktion gewinnt, die alle chemisch eng miteinander verwandt sind. Es ist möglich, daß das ideale Tuberkulin, das fraglos positiv verzögerte hypersensitive Reaktionen hervorbringt, nur in M. tb.-sensitiven Tieren reagiert, und zwar bei einer Proteindösis in einer Größe, die vergleichbar ist

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mit der des derzeitigen rohen Tuberkulins und ein Gemisch von 3 oder mehr M. tb.-spezifischen Antigenen ist, die man aus 2 oder mehr chromatographischen Fraktionen und möglicherweise von mehr als einem M. tb.-Organismus gewinnt.

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Claims

Patentansprüche

1. Antigene Substanz, hergestellt aus einer Mehrzahl von Filtraten von M. tb.-Kulturen oder Fraktionen von Extrakten von Bakterien zur Bestimmung der.immunologischen Sensitisierung von M. tb. in Menschen und Tieren mit hoher spezifischer Wirkung und hoher Empfindlichkeit, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz im wesentlichen frei von querreagierenden Antigenen ist und im wesentlichen aus einer Mehrzahl von M. tb.-spezifischen Antigenen besteht, wobei wenigstens 2 dieser spezifischen Antigene jeweils aus einer anderen Fraktion stammen.

2. Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fraktionen durch DEAE-Austauschionenchromatographie gewinnt und eine Waschfraktion, eine Α-Fraktion und eine BC-Fraktion erhält.

3. Verfahren zur Gewinnung einer Substanz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die nachfolgenden Verfahrensschritte:

a) Herstellung eines Filtrats von wenigstens einer M. tb.-Kultur oder Herstellung eines Bakterienextrakts ;

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b) Fraktionierung dieses Filtrats oder Extrakts vermittels der Ionenaustauschchromatographie, um eine Mehrzahl von ehromatographisehen Fraktionen zu erhalten;

c) Herstellung von Unterfraktionen von einer Vielzahl solcher chromatographischer Fraktionen,

so daß man Unterfraktionen enthält, die jeweils wenigstens ein M. tb.-spezifisches Antigen enthalten und die im wesentlichen frei von querreagierenden Antigenen sind und

•d) Mischen einer Mehrzahl solcher Unterfraktionen, um eine Testsubstanz zu erhalten, die im wesentlichen frei von querreagierenden Antigenen ist und eine Mehrzahl von M. tb.-spezifischen Antigenen enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine chromatographische Fraktion in Unterfraktionen vermittels der Polyakrylamid-Gelelektrophorese aufgeteilt wird,

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Chromatographisehe Fraktion vermittels der isoelektrischen Fokussierung in Unterfraktionen aufgeteilt wird.

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6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine chromatographische Fraktion vermittels der isoelektrischen Fokussierung und der Polyakrylamid-Gelelektrophorese in Unterfraktionen aufgeteilt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens eine Unterfraktion aus den vielen chromatographischen Fraktionen herstellt und diese Unterfraktionen miteinander vermischt.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Gelelektrophorese drei- übereinandergestapelte Säulen aus einem Polyakrylamid-Gel verwandt werden, die jeweils 5%, 7% und 10,5% Gel enthalten und wobei wenigstens eine Unterfraktion aus der 10,5%-Gelsäule entnommen wird für jede der chromatographischen Fraktionen.

9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens zwei Unterfraktionen aus der gleichen chromatographischen Fraktion hergestellt werden.

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