DE69220939T2

DE69220939T2 - Gegengift immunsera

Info

Publication number: DE69220939T2
Application number: DE69220939T
Authority: DE
Inventors: Damon Smith
Original assignee: Therapeutic Antibodies Inc
Current assignee: BTG International Inc
Priority date: 1991-05-02
Filing date: 1992-04-24
Publication date: 1997-11-20
Anticipated expiration: 2012-04-25
Also published as: ES2106183T3; EP0583281A1; JPH06506928A; WO1992019280A1; AU1677492A; GB9322377D0; GB2271509B; GB2271509A8; ATE155345T1; DE69220939D1; AU672172B2; GB9109478D0; JP3666872B2; GB2271509A; DK0583281T3; US6833131B1; EP0583281B1; RU2114636C1; GR3024907T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Gegengifte und Verfahren zu ihrer Herstellung. Die Erfindung betrifif insbesondere Schlangengegengift und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Zahlreiche Tiere wie Schlangen, Gilatiere, Spinnen und Bienen produzieren Gifte, die für Menschen gefährlich sind. Jedes Jahr werden zum Beispiel weltweit etwa eine Million Menschen von Giftschlangen gebissen. Von diesen sterben schätzungsweise einige 100.000 und weitere 300.000 behalten für ihr restliches Leben in irgendeiner Form eine Schädigung zurück. Dabei handelt es sich wahrscheinlich um eine grobe Unterschätzung aufgrund fehlender genauer Aufzeichnungen aus einigen Teilen der Welt.
Schlangengifte, die in erster Linie für die Beschaffung von Beute oder zur Verteidigung produziert werden, sind komplexe biologische Gemische aus bis zu 50 Komponenten. Der Tod eines Beutetiers infolge eines Schlangenbisses ist auf Atemlähmung oder Kreislaufversagen zurückzuführen, verursacht durch verschiedene Neurotoxine, Kardiotoxine (auch als Zytotoxine bezeichnet), Gerinnungsfaktoren und andere Substanzen, welche einzeln oder synergistisch wirken. Schlangengifte enthalten auch eine Anzahl von Enzymen, die, wenn sie der Beute eingespritzt werden, das Gewebe zu verdauen beginnen. Die Gifte enthalten folglich Substanzen, welche die Lebensvorgänge wie Nerven- und Muskelfunktion, Herztätigkeit, Blutkreislauf und die Permeabilität von Membranen angreifen. Die meisten Bestandteile von Schlangengiften sind Proteine, es sind jedoch auch niedermolekulare Verbindungen wie Peptide, Nudeotide und Metallionen vorhanden (1).
Giftschlangen lassen sich in 4 Hauptfamilien einteilen: die Colubridae, die Viperidae, die Hydrophidae und die Elapidae (2). Die Systematik dieser Schlangen ist in Tabelle 1.1 und 1.2 beschrieben. Tabelle 1.1 Klassifikation von Giftschlangen Tabelle 1.2 Klassifikation und geographische Verbreitung der Unterfamilie der Crotalinae
Klapperschlangen, die nur auf dem amerikanischen Kontinent vorkommen, sind Mitglieder einer Unterfamilie von Giftschlangen aus der Familie der Viperidae, bekannt als Crotalinae, Gattungen Crotalus oder Sistrurus (Klapperschlangen), Bothrops, Agkistrodon und Trimerisurus. Die beiden Klapperschlangengattungen können noch weiter in Spezies und Subspezies unterteilt werden. Diese Schlangen werden aufgrund des Vorhandenseins von fazialen wärmesensorischen Gruben auch als "Grubenottern" bezeichnet, ihr hervorstechenstes Merkmal ist jedoch die Klapper, die - sofern vorhanden - sie von allen anderen Schlangen unterscheidet.
Jede Spezies oder Subspezies besetzt ein gesondertes geographisches Gebiet in Nord- oder Südamerika. Das Gift jeder Klapperschlangenart enthält Komponenten, die allen Klapperschlangen gemeinsam, nur einigen kleineren Gruppen gemeinsam oder für eine einzige Spezies oder Subspezies spezifisch sein können (3).
Ein Gegengift ist das Serum oder die teilgereinigte Antikörperfraktion aus dem Serum von Tieren, welche durch die nach einem bestimmten Schema erfolgende Verabreichung von Injektionen mit steigender Dosis an Schlangengift gegen Gift-Toxizität immun gemacht wurden.
Die wissenschaftliche Erforschung von Gegengift begann 1887 mit der Arbeit von Henry Sewell (5) und hat in diesem Jahrhundert laufend Fortschritte gemacht. Gegenwärtig werden weltweit eine große Zahl und Vielfalt monospezifischer und polyspezifischer Gegengifte produziert.
Der Begriff "monospezifisches Gegengift", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Gegengift, das gegen das Gift einer einzigen Spezies oder Subspezies eines giftigen Tieres gebildet worden ist. Der Begriff "polyspezifisches Gegengift" bezieht sich auf ein Gegengift, das gegen eine Mischung aus zwei oder mehr Giften von verschiedenen Spezies oder Subspezies giftiger Tiere gebildet worden ist.
Die Begriffe "monospezifische" und "polyspezifische" Antiseren werden hier verwendet, um eine Verwechslung infolge der Verwendung der üblichen alternativen Ausdrücke "monovalente" und "polyvalente" Antiseren zu vermeiden. Diese Terminologie wird verwendet, weil der Begriff "Valenz" von Immunologen dazu benutzt wird, die Zahl der Bindungsstellen auszudrücken, die ein Antikörper oder ein Antikörperverdauungsprodukt besitzt; ein IgG-Molekül ist somit bivalent, während ein F(ab)-Fragment, das nur eine Bindungsstelle aufweist, monovalent ist. Die Verwendung des Begriffes "Spezifität" bei der Beschreibung eines Antiserums vermeidet jegliche Verwechslung.
In der bahnbrechenden Arbeit von Sewell wurden Tauben mit subletalen Dosen an Klapperschlangengift geimpft, gefolgt von Injektionen steigender Dosen bis zu Mengen, die über jenen lagen, welche, wenn sie zu Beginn injiziert worden wären, den Tod verursacht hätten. Es war somit bewiesen, daß die Vögel eine Resistenz gegen das Gift entwickelt hatten. 1889 erzielte Kaufmann (6) mit der europäischen Schlange Vipera berus ähnliche Resultate, und 1892 berichtete Calmette (7), der in Saigon mit Kobragift arbeitete, daß es möglich war, durch ein Protokoll von Giftinjektionen Resistenz zu verleihen. Es war jedoch Kanthack (8), der als erster einem anderen Tier Resistenz verlieh, als er durch Mischen von Gift mit Blut von einem immunisierten Tier Resistenz gegen letale Dosen des Schlangengiftes nachwies.
Calmettes Grundkonzept war, das Tier an häufige, wiederholte, allmählich steigende Giftdosen (gewöhnlich Kobragift) zu gewöhnen. Er stellte fest, daß Pferde, die über einen Zeitraum von 16 Monaten immunisiert worden waren, das 80fache der letalen Giftdosis tolerierten. Er zeigte außerdem, daß das aus dem Blut dieser Pferde gewonnene Gegengift eine neutralisierende Wirkung von 20.000 Einheiten besaß, wenn es auf Kaninchen angewendet wurde, das heißt, daß 1 ml Serum die geringste tödliche Dosis Gift für 20.000 g Kaninchen neutralisieren konnte.
Die meisten bekannten Gegengifte sind gereinigte Konzentrate von Pferdeserumglobulinen, die in flüssiger oder getrockneter Form hergestellt sind. Die Gegengifte werden aus Pferden gewonnen, die gegen ein einziges Gift immunisiert worden sind, um ein monospezifisches Gegengift zu produzieren, oder gegen eine Mischung mehrerer Gifte, um ein polyspezifisches Gegengift zu produzieren. Gegengifte sind für die Behandlung der meisten Arten von Schlangengift-Vergiftungen hergestellt worden. Die Herstellungsmethoden haben sich seit den Pionierzeiten des letzten Jahrhunderts wenig geändert. Das Serum immuner Pferde kann einem groben Reinigungsschritt unterzogen werden, wobei gewöhnlich Ammoniumsulfat verwendet wird, um die Globulinfraktion auszufällen, und in einigen Fällen stellt dies die Form des Endprodukts dar. Da Gegengifte in dieser Form schwere Serumrekktionen auslösen können, wird bekannterweise eine Pepsinverdauung angewendet, um den Fc-Teil des Immunglobulins zu entfernen, der vornehmlich für derartige immunogene Rekktionen verantwortlich ist.
Die Wirksamkeit der bekannten Gegengifte in Bezug auf die Neutralisierung sowohl der schädlichen als auch der scheinbar unschädlichen Wirkungen eines spezifischen Giftes kann beträchtlich schwanken und hängt von mehreren Faktoren ab. Die wichtigsten dieser Faktoren sind die Spezifität des Gegengiftes, der Titer der erzeugten Antikörper und der Grad der Konzentration oder Reinheit des Endprodukts.
Je spezifischer ein Gegengift ist, desto größer ist im allgemeinen die Wahrscheinlichkeit, daß es das Gift, dem es ausgesetzt ist, neutralisiert. Monospezifische Gegengifte, die gegen einzelne Gifte gerichtet sind, sind daher gegen ihr homologes Gift am wirksamsten. Solche Gegengifte sind jedoch bei der Behandlung eines Schlangenbisses nur dann von Nutzen, wenn die Spezies oder Subspezies der angreifenden Schlange identifiziert worden ist. Wenn die angreifende Schlange nicht identifiziert worden ist, wie das gewöhnlich bei einer "Feld"-Situation der Fall ist, ist ein polyspezifisches Gegengift, das gegen ein Spektrum verschiedener Gifte gebildet worden ist, vorzuziehen, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, daß das Gegengift gegen das Gift der nicht identifizierten Schlange wirkt. Herkömmlichen polyspezifischen Gegengiften fehlt jedoch die Spezifität von monospezifischen Gegengiften, und sie sind daher weniger wirksam hinsichtlich der Neutralisierung der pharmakologischen Aktivität eines Giftes.
Delori et al. (Anim. Plant Microb. Toxins, Proc. Int. Symp. 4th, 1974 (veröffentlicht 1976), 2, 407-20) beschreibt die Herstellung eines Gegengiftes, das eine Mischung aus Antiseren umfaßt, die gegen verschiedene Komponenten eines Giftes gebildet worden sind.
Die Internationale Patentanmeldung WO91/06306 beschreibt die Herstellung von Gegengiften in Nicht-Säugern.
Die Anmelderin hat die unerwartete und überraschende Entdeckung gemacht, daß ein Gegengift (hier als "gemischtes monospezifisches Gegengift" bezeichnet), das eine Mischung aus verschiedenen Antiseren aufweist, die gesondert gegen verschiedene Gifte gebildet worden sind, in Bezug auf die Neutralisierung der pharmakologischen Aktivität eines Giftes wirksamer ist als ein herkömmliches polyspezifisches Gegengift, das durch die Bildung eines einzigen Antiserums gegen ein Spektrum von Giften hergestellt wurde, jedoch die breite Spezifität eines polyspezifischen Gegengiftes beibehält.
Gemäß einer ersten Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein Gegengift bereitgestellt, das eine Mischung aus mindestens zwei verschiedenen Schaf-Antiseren umfaßt, die gegen verschiedene Gifte gerichtet sind, wobei jedes Gift ein Vollgift ist.
Es wird postuliert, daß Gegengifte, die eine Mischung aus verschiedenen Antiseren umfassen, wirksamer als herkömmliche polyspezifische Gegengifte sind, da erstere einen höheren Anteil an Antikörpern enthalten mögen, die gegen die niedermolekularen und/oder wenig immunogenen Komponenten von Giften gerichtet sind.
Schlangengifte sind komplexe mehrkomponentige Gemische aus Protein, Nucleotiden und Metallionen. Diese Komponenten unterscheiden sich im Molekulargewicht, in ihrem Antigenitätsgrad und in ihrer Konzentration in dem Gift.
Wenn in ein Tier Gift eingespritzt wird, um ein Antiserum zu bilden, können mehrere Antikörperpopulationen erzeugt werden. Die Konzentration und Affinität der gebildeten Antikörper werden entsprechend verschiedenen Kriterien, zum Beispiel der Anzahl an Epitopen auf der Oberfläche einer Komponente, der Immunogenität jedes Epitops oder der Konzentration jeder Komponente, variieren. Die letalen, neurotoxischen Komponenten von Giften (einschließlich zum Beispiel Klapperschlangengiften) weisen oft niedermolekulare, wenig immunogene Komponenten auf, die nur in geringen Konzentrationen vorhanden sind. Es ist unwahrscheinlich, daß solche Komponenten einen hohen Antikörpertiter auslösen.
Es wird postuliert, daß sich dieses Problem bei der Produktion eines polyspezifischen Gegengiftes unter Verwendung einer Immunisierungsmischung, die eine Mischung von Giften umfaßt, in der die in geringer Konzentration vorliegenden, niedermolekularen und wenig immunogenen Komponenten durch hochimmunogene Komponenten noch weiter verdünnt sind, verschärft. Die Produktion eines polyspezifischen Gegengiftes führt daher zu einem Gegengift, in dem Antikörper gegen einige Komponenten fehlen oder in einer solch geringen Konzentration vorliegen, daß deren Wirkung unwesentlich ist.
Im Gegensatz hierzu umfaßt das gemischte monospezifische Gegengift der vorliegenden Erfindung eine Mischung aus Antiseren, die gegen verschiedene Gifte in getrennten Gruppen von Tieren gebildet worden sind. Durch getrennte Bildung der Antiseren bleibt zwar die für jedes Antiserum verfügbare Zahl an möglichen Antikörperpopulationen gleich, jedoch ist die Zahl der Epitope in dem Immunogen deutlich geringer. Somit wird postuliert, daß die Teilantiseren einen höheren Anteil an schützenden Antikörpern gegen niedermolekulare, wenig immunogene Komponenten enthalten als polyspezifische Gegengifte. Die Kombination der monospezifischen Antiseren zur Herstellung eines gemischten monospezifischen Antiserums führt zu einem Gegengift, das sämtliche Populationen des monospezifischen Serums aufweist und daher einen besseren Schutz vermittelt, jedoch außerdem die Vorteile eines polyspezifischen Gegengiftes besitzt, insofern als die Kreuzreaktivität des Gegengiftes maximiert worden ist.
Es versteht sich, daß jedes Teilgegengift des gemischten monospezifischen Gegengiftes der vorliegenden Erfindung selbst ein monospezifisches Gegengift oder ein polyspezifisches Gegengift sein kann. Zum Beispiel kann das gemischte monospezifische Gegengift eine Mischung aus einem polyspezifischen Gegengift, das gegen die Gifte A + B gebildet wurde, und einem monospezifischen Gegengift, das gegen das Gift C gebildet wurde, umfassen.
Vorzugsweise ist jedes Teilgegengift ein monospezifisches Gegengift. Das gemischte monospezifische Gegengift kann zum Beispiel eine Mischung aus monospezifischen Gegengiften umfassen, die jeweils gegen die Gifte A, B und C gerichtet sind.
Die Antiseren, welche das gemischte monospezifische Gegengift umfassen, können in jedem geeigneten Verhältnis gemischt sein. Vorzugsweise enthält das gemischte monospezifische Gegengift Antiseren, die in einem Verhältnis gemischt sind, das für das geographische Gebiet passend ist, in dem das gemischte monospezifische Gegengift zur Anwendung kommen soll. Faktoren, die bei der Herstellung eines solchen "maßgeschneiderten" gemischten monospezifischen Gegengiftes in Betracht gezogen werden können, sind die Population, die Verbreitung, das Verhalten und die Toxizität eines speziellen giftigen Tieres in einem speziellen Gebiet.
Die Zusammensetzung des gemischten monospezifischen Gegengiftes kann durch eine statistische Analyse der Bisse an Menschen in einem speziellen geographischen Gebiet durch eine spezielle Spezies oder Subspezies eines giftigen Tieres bestimmt werden. Vorzugsweise ist jedes Teilantiserum des gemischten monospezifischen Gegengiftes in direktem Verhältnis zur relativen Häufigkeit vorhanden, mit welcher Menschen in einem speziellen geographischen Gebiet durch die spezielle Spezies oder Subspezies eines giftigen Tiers, gegen dessen Gift das jeweilige Antiserum gerichtet ist, gebissen werden.
So spaltet sich zum Beispiel die Diamantklapperschlange in zwei geographische Typen auf, die als die Östliche (C. adamanteus) und die Westliche (C. atrox) Diamantklapperschlange bekannt sind. Es kann daher ein gemischtes monospezifisches Gegengift hergestellt werden, das den Schlangen eines speziellen geographischen Gebiets entspricht. Die Einbeziehung von Antiseren gegen Schlangen, die in diesem Gebiet nicht anzutreffen sind, welche die Wirksamkeit eines jeden Produkts abschwächen kann, ist daher nicht erforderlich. Diese Fähigkeit zur Herstellung maßgeschneiderter Gegengifte ermöglicht, daß die gemischten monospezifischen Gegengifte der vorliegenden Erfindung auch ohne Kenntnis der angreifenden Schlange der Wirksamkeit eines homologen monospezifischen Gegengiftes nahekommen oder diese sogar noch verbessern, indem der Typ des Schlangenbisses in einem geographischen Gebiet statistisch kompensiert wird.
Die Antiseren, welche das Gegengift umfassen, werden in Schafen gebildet. Die Bildung von Antiseren in Schafen ist von besonderem Vorteil gegenüber dem herkömmlichen Verfahren der Bildung von Antiseren in Pferden, da in Schafen gebildete Antiseren keine der besonders immunogenen IgG- und IgG(T)-Komponenten von Pferdeantiseren enthalten, die bei Menschen oder Tieren, denen das Gegengift verabreicht wird, unerwünschte immunogene Serumreaktionen auslösen.
Die Antiseren, welche das Gegengift umfassen, können Vollantiseren sein. Vorzugsweise können die Antiseren zu F(ab')2 oder F(ab)-Fragmenten teilverdaut sein. Eine Entfernung der Fc-Fragmente ist vorteilhaft in Bezug auf die Verminderung der immunogenen Reaktion des Patienten auf das Gegengift. Die Erzeugung von Antikörperfragmenten kann durch herkömmliche Verfahren erfolgen, zum Beispiel durch Pepsin- oder Papainverdauung (15).
Die Antiseren, welche das Gegengift umfassen, können gegen das Gift jedes giftigen Tieres gerichtet sein, einschließlich Schlangen, Gilatieren, Spinnen und Bienen. Das Gegengift kann Antiseren enthalten, die gegen das Gift eines einzigen Tiertypus gerichtet sind, zum Beispiel Antiseren, die gegen das Gift verschiedener Schlangenarten oder -unterarten gebildet wurden. Alternativ kann das Gegengift Antiseren enthalten, die gegen das Gift von mehr als einem Tiertypus gerichtet sind. Vorzugsweise ist das Gift Schlangengift. Insbesondere ist das Gift Klapperschlangengift.
Das Gift, gegen das jedes Antiserum gerichtet ist, kann ein Vollgift oder ein teilgereinigtes Gift umfassen. Vorzugsweise umfaßt das Gift ein Vollgift.
Gemäß einer zweiten Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Gegengiftes gemäß der ersten Ausführung der Erfindung bereitgestellt, welches das Mischen von mindestens zwei verschiedenen Antiseren umfaßt.
Gemäß einer dritten Ausführung der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die eine wirksame Menge eines Gegengiftes gemäß der ersten Ausführung der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff umfaßt.
Vorzugsweise ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung an einen Patienten geeignet. Insbesondere ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen Injektion geeignet.
Gemäß einer vierten Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein Klt zur Verabreichung eines Gegengiftes an einen menschlichen oder tierischen Körper bereitgestellt, welches umfaßt:
(a) ein Gegengift gemäß der ersten Ausführung der Erfindung und
(b) Mittel zum Injizieren des Gegengiftes in den Körper.
Die Erfindung wird nun mittels eines Beispiels unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben, wobei:
Figur 1 die Phospholipase-A2-Aktivität in 1 µg von vier Crotalidengiften darstellt; und
Figur 2 die Menge an Gegengift veranschaulicht, welche erforderlich ist, um 50% der Phospholipase-A2-Aktivität in 1 µg Crotalidengift zu neutralisieren.

EXPERIMENTELLER TEIL

1. Herstellung von Gegengiften

Durch Immunisierung einer Gruppe von 10 Waliser Halbblutschafen mit einem Gift entsprechend dem herkömmlichen Immunisierungsschema von Sidki et al. (11) wurde ein Gegengift hergestellt. Das Gift für die Immunisierung wurde von Prof. F. Russel von der Arizona University zur Verfügung gestellt. Das Gift wurde von einer großen Anzahl Schlangen derselben Spezies gesammelt. Es wurden Einzeltiere verschiedenen Alters und von unterschiedlichen geographischen Standorten einbezogen, und das Gift wurde das ganze Jahr hindurch gesammelt. Diese Faktoren beeinflussen bekannterweise die Giftzusammensetzung und sind daher wichtig für die erfolgreiche Produktion eines Gegengiftes. Der Gruppe wurde monatlich Blut (300 ml) entnommen, und nach 18stündiger Gerinnung bei 4ºC wurde das Serum abgesaugt.
Aus dem Antiserum-Pool wird durch Natriumsulfat-Ausfällung ein IgG-Konzentrat hergestellt. Dann wird die Immunglobulinfraktion durch Natriumsulfat-Ausfallung des Antiserum-Pools teilgereinigt. Volumen der Antiseren werden mit gleichen Volumen einer 36%igen Natriumsulfatlösung gemischt, und das resultierende Gemisch wird 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, um eine Ausfallung der Immunglobuline zu gestatten. Nach 60minütiger Zentrifugation bei 3500 UpM wird das Pellet zweimal mit 18%igem Natriumsulfat gewaschen, und das letzte Pellet wird dann mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einem Volumen verdünnt, das dem des ursprünglichen Antiserum-Pools entspricht. Die Lösung wird dann gegen 20 Volumen PBS dialysiert, und das Produkt wird bei 4º aufbewahrt, bis es benötigt wird.
Das Produkt kann einer Analyse durch die Mikro-Kjeldahl-Methode (14) unterzogen werden, um die genaue Proteinkonzentration in der Probe zu bestimmen. Erforderlichenfalls kann zur Bildung von F(ab')2 und F(ab) eine Verdauung dieses IgGs mittels Pepsin beziehungsweise Papain durchgeführt werden. Diese Produkte können außerdem durch SDS-PAGE (13), Mikro-Kjeldahl und ELISA (12) analysiert werden, um sicherzustellen, daß sie ihre Wirksamkeit bewahrt haben.

5 2. In-vitro-Vergleich von Gegengiften

2.1. Einführung

Schlangengift ist ein mehrkomponentiges Gemisch aus Proteinen, Metallionen und Nucleotiden. Obwohl die genaue Beschaffenheit jedes einzelnen Giftes eine Eigentümlichkeit des Genotyps der Schlange ist, gibt es einige gemeinsame Proteine.
Ein solches gemeinsames Protein ist das Enzym Phospholipase A&sub2; (PLA2). Dieses Enzym ist in erster Linie für den Abbau von Körperfett verantwortlich, kann aber auch mehrere andere Aktivitäten wie zum Beispiel die Zerstörungen von Zellen (über Lysoprodukte aus der Fetthydrolyse) und Neurotoxizität (vermittelt durch ein pharmakologisch aktives Zentrum des Enzyms) aufweisen.
Die Aktivität von PLA2 in Crotaliden- oder Klapperschlangengiften kann durch einen einfachen kolorimetrischen Test abgeschätzt werden. PLA2 hydrolysiert Fette zu Fettsäure und Glycerol, was zu einem Absinken des pH-Werts des Systems führt.
PLA2 + FETT T Fettsäure + Glycerol
Dieses Absinken des pH-Werts kann durch Beimischung eines farbigen pH-Indikators zum System beobachtet werden.

2.2 Abschätzung der PLA2-Aktivität

Der folgende Test kann verwendet werden, um die Phospholipase-A2-Aktivität (PLA2, EC 3.1.1.4) einzelner Gifte zu beobachten. Die Aktivität wird durch Messung der Freisetzung freier Fettsäuren aus einem Phospholipidsubstrat (Phosphatidylcholin, Sigma Chemical Company, Produktnummer P-9671) unter Verwendung eines pH-Indikators (Cresolrot, Sigma Chemical Company, Produktnummer C-9877) abgeschätzt.

Testpuffer:

1. 100 mM NaCl
2. 100 mM KCl Alles GPR-analysenrein
3. 10 mM CaCl2
Für einen Routinetest werden 500 ml dieser Lösung vorbereitet und mittels einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,6 gebracht.

Herstellung des Indikators:

10 mg Cresolrot (Natriumsalz, Sigma Nr. C-9877) werden in Testpuffer (10 ml) gelöst, und das Gefaß wird in Stanniol gehüllt.

Herstellung des Substrats:

Phosphatidylcholin (1,2 g aus Eigelb, Type XV-E, 60%, L-Alpha-Form, Sigma Nr. P-9671) wird in Methanol (1 ml) gelöst, und die Lösung wird mit Testpuffer auf 10 ml aufgefüllt (Endkonzentration 120 mg/ml). Das Substrat sollte für jede Serie von Experimenten frisch angesetzt werden.

Verfahren:

Rohes gefriergetrocknetes monovalentes Gift wird in destilliertem Wasser bis zu einer Endkonzentration von 10 µg/ml gelöst. 10 ml Giftlösung werden routinemäßig für jede Serie von Experimenten vorbereitet. Dann wird Substratlösung auf die folgende Weise hergestellt:
Zu 1 ml der frisch vorbereiteten Lipidsuspension werden 25 ml Testpuffer gegeben, gefolgt von 0,3 ml Triton-X-100 (BDH Nr. 30632). Triton ist eine Schutzmarke. Die Lösung wird gründlich gemischt, bis sie klar ist. Mit verdünntem Natriumhydroxid wird auf pH 8,6 eingestellt. Es wird 1 ml der vorbereiteten Indikatorlösung zugesetzt und die Substratlösung bis zu einem Endvolumen von 30 ml mit Testpuffer aufgefüllt. (Die Substratlösung sollte eine rote Farbe aufweisen; falls nicht, so sollte der pH-Wert des Testpuffers überprüft werden). Diese Lösung sollte ebenfalls in Silberfohe gehüllt werden.
Zu 2,8 ml Substratlösung in einer 3-ml-Kunststoffküvette werden 100 µl Testpuffer gegeben, und es wird die OD573nm gemessen. Es werden 100 µl Giftlösung zugesetzt, und eine Stoppuhr wird gestartet. Einer zweiten Küvette, die 2,8 ml Substratlösung und 100 µl Testpuffer enthält, werden weitere 100 µl Testpuffer zugesetzt, um jeglichen Hintergrund-pH-Abfall zu beobachten. Dieser Ansatz wird gleichzeitig mit der Testküvette gemessen. Ablesungen erfolgen jede Minute über einen Zeitraum von 30 Minuten. Es wird dann die OD graphisch gegen die Zeit aufgetragen, wobei der Hintergrund-pH-Abfall der Kontrolle berücksichtigt wird und dieser Wert von dem durch die Zugabe des Giftes verursachten subtrahiert wird. Diese Ablesungen werden dann als Prozent der normalisierten Kontrollablesung ausgedrückt.

2.3 Neutralisierungsuntersuchungen

Neutralisierungsexperimente werden unter Verwendung von IgG-Fraktionen der relevanten Antiseren durchgeführt. Diese Präparationen wurden durch Salzfallung des Vollantiserums (18% Natriumsulfat, 25ºC für 1,5 h) erhalten.
Die für diese Untersuchungen verwendeten Test- und Substratpuffer sind die gleichen wie bei den obigen Experimenten.
Eine 1:10-Verdünnung des Gegengiftes in dem Testpuffer (Stammlösung) wird dann durch Verdopplung der Verdünnung weiter verdünnt, und es werden aliquote Teile von 100 µl zu 100 µl der spezifischen Giftlösung (10 µl/ml) gegeben. Es werden zwei zusätzliche Probenserien vorbereitet, um den Hintergrund-pH-Abfall (200 µl Testpuffer) und die Gesamthydrolyse (100 µl Testpuffer und 100 µl Giftlösung) zu beobachten. Die Proben werden dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Zeit wird die Substratlösung vorbereitet und ihr pH-Wert überprüft.
Es wird dann die zum Zeitpunkt Null bestehende OD von durch 2,8 ml gebildeten aliquoten Teilen Substratpuffer gemessen. Dies geschieht unmittelbar vor Zugabe von 200 µl Gift/ Gegengift-I-ösung (nach der 30minütigen Inkubationsdauer). Es erfolgt eine weitere 15minütige Inkubation bei Raumtemperatur, und es wird dann die OD abgelesen. Die Ergebnisse werden dann wie oben beschrieben ausgewertet und als Prozent Neutralisierung der giftinduzierten Hydrolyse ausgedrückt.

ERGEBNISSE

Die obigen Tests wurden mit vier Klapperschlangengiften durchgeführt, wobei es sich bei diesen um A. piscivorus, C. adamanteus, C. atrox und C. scutulatus handelte.
Figur 1 zeigt, daß jedes der Gifte hochwirksame PLA2-Enzyme enthält und daß die Reihenfolge nach der Aktivität geordnet A. piscivorus > C.adamanteus = C.scutulatus > C.atrox ist. Es wurde dann das oben beschriebene PLA2-Neutralisierungsvermögen der Gegengifte ermittelt.
Die Neutralisierungsuntersuchungen wurden unter Verwendung eines gemischten monospezifischen Gegengiftes durchgeführt, das durch Mischen gleicher Volumen mit gleicher Konzentration der monospezifischen IgGs hergestellt wurde, welche durch die Immunisierung von vier Schafgruppen gegen das Gift von A. piscivorus, C. adamanteus, C. atrox und C. scutulatus erhalten worden waren. Die Konzentrationen wurden durch die Kjeldahl-Methode der Stickstoffanalyse bestimmt und durch die Zugabe geeigneter Mengen an PBS auf einen gleichen Wert eingestellt.
Es wurden ebenfalls Kontroll-Neutralisierungsuntersuchungen durchgeführt, und zwar unter Verwendung gegen jedes der Gifte gebildeter monospezifischer Gegengifte und eines gegen eine 1:1:1:1-Mischung der Gifte gebildeten polyspezifischen Gegengiftes. Die Kontrollexperimente erfolgten nach genau den gleichen Protokollen - einschließlich Giftquellen, Immunisierung, Reinigung und Testprotokollen - wie das Experiment mit dem gemischten monospezifischen Gegengift.
Die Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt, welche zeigt, daß das gemischte monospezifische Gegengift in Bezug auf die Neutralisierung der Gift-PLA2-Aktivität von größerer oder gleicher Wirksamkeit ist als bzw. wie die entsprechenden polyspezifischen Antiseren. Tatsächlich war bei dreien der getesteten Gifte deutlich weniger Gegengift erforderlich, um eine 50%ige Neutralisierung zu erzielen.
Überdies war das gemischte monospezifische Gegengift auch von gleicher oder größerer Wirksamkeit wie bzw. als das homologe monospezifische Gegengift, was zeigt, daß das gemischte monospezifische Gegengift einen größeren Grad an Kreuzreaktivität aufwies.
Diese Ergebnisse führen zu dem überraschenden Schluß, daß im Falle der PLA2-Neutralisierung das gemischte monospezifische Antiserum wirksamer ist als sein polyspezifisches Gegenstück.

Literaturstellen

1. Karlsson, E. (1979), Chemistry of protein toxins in snake venoms. In: "Snake Venoms", Kapitel 5, Handbook of Experimental Pharmacology Nr. 5, herausgegeben von C.Y. Lee, Springer-Verlag, New York.
2. Tu, A.T. (1982), "Rattlesnake Venoms, Their Action and Treatment", Kapitel 1, Marcel Dekker Inc., New York.
3. Russel F.E. (1983), Snake Venom Poisoning, 2. Auflage, Great Neck, New York.
5. Sewall, H. (1887), Experiments on the Preventive Inoculation of Snake Venom, J. Physiol. 8, 203.
6. Kaufman, M. (1986), Du Venom Vipere, Masson Paris.
7. Calmette, A. (1992), Etude Experimentale du Venin de Naja tripuians, Ann. Institut Pasteur 6, 160.
8. Kanthack, A.A. (1987), Report on Snake Venom in its Prophylactic Relation with Poison of the Same and Other Sorts, Rep. Med. Local Govt. Bd., 1895-6, London.
9. Calmette, J. (1907) Les Venins Animaux et la Serotherapie Antivenimeuse, Masson, Paris.
11. Sidki, A.M., Al Abdullah, I.H. und Rowell, F.J. (1987), Quinine Directly Determined in Serum or Urine by Separation Fluoroimmunoassay, Clin. Chem. 33, 463.
12. Theakston, R.D.G. (1983), The Application of Immunoassay Techniques Induding Elisa, to Snake Venom Research, Toxicon. 21, Nr.3, 352.
13. Laemmli, U. (1970), Nature 227, 680.
14. Grimble, G.K. (1990), Clin. Lab. Practice 39, Nr.4, 71.
15. Lamoyi, E. und Nisonoff, A. (1983), J. Immunol. Meth. 56, 235. Porter, R.R. (1959), Biochem. J. 73, 119.

Claims

1. Gegengift, das eine Mischung aus mindestens zwei Schaf-Antiseren umfaßt, die gegen verschiedene Gifte gerichtet sind, wobei jedes Gift ein Vollgift ist.

2. Gegengift nach Anspruch 1, wobei jedes Teilantiserum ein monospezifisches Gegengift ist.

3. Gegengift nach Anspruch 1 oder 2, wobei jedes Antiserum F(ab')&sub2;- oder F(ab)-Fragmente enthält, die sich durch teilweise Verdauung von IgG eines Vollserums gewinnen lassen.

4. Gegengift nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jedes Antiserum in einem Anteil vorhanden ist, der mit der Toxizität und Häufigkeit in Verhältnis steht, mit welcher Menschen in einem speziellen geographischen Gebiet durch das spezielle giftige Tier, gegen dessen Gift das jeweilige Antiserum gerichtet ist, gebissen werden.

5. Gegengift nach Anspruch 4, wobei jedes Teilantiserum in direktem Verhältnis zur relativen Häufigkeit vorhanden ist, mit welcher Menschen in einem speziellen geographischen Gebiet durch die spezielle Spezies oder Subspezies eines giftigen Tiers, gegen dessen Gift das jeweilige Antiserum gerichtet ist, gebissen werden.

6. Gegengift nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jedes Antiserum gegen Schlangengift gerichtet ist.

7. Gegengift nach Anspruch 6, wobei jedes Antiserum gegen Klapperschlangengift gerichtet ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines Gegengifts nach einem der Ansprüche 1 bis 7, welches das Mischen von mindestens zwei verschiedenen Antiseren umfaßt.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Gegengifts nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff umfaßt.

10. Kit zur Verabreichung eines Gegengifts an einem menschlichen oder tierischen Körper, welches umfaßt:

(a) ein Gegengift nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und

(b) Mittel zum Injizieren des Gegengifts in den Körper.