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DE2247163A1 - Traegermatrix zur fixierung biologisch wirksamer stoffe und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Traegermatrix zur fixierung biologisch wirksamer stoffe und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number
DE2247163A1
DE2247163A1 DE19722247163 DE2247163A DE2247163A1 DE 2247163 A1 DE2247163 A1 DE 2247163A1 DE 19722247163 DE19722247163 DE 19722247163 DE 2247163 A DE2247163 A DE 2247163A DE 2247163 A1 DE2247163 A1 DE 2247163A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
groups
biologically active
acid
solution
active substances
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE19722247163
Other languages
English (en)
Inventor
Wolfgang Dr Bruemmer
Dr Orth Hans Dieter
Norbert Dr Hennrich
Michael Dr Klockow
Hans Dieter Dr Orth
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Priority to DE19722247163 priority Critical patent/DE2247163A1/de
Priority to GB3977073A priority patent/GB1394530A/en
Priority to FR7333566A priority patent/FR2200281B1/fr
Priority to BE135905A priority patent/BE805157A/xx
Priority to CH1373373A priority patent/CH589680A5/xx
Priority to IT29360/73A priority patent/IT998648B/it
Priority to US05/400,898 priority patent/US3959080A/en
Priority to JP48108335A priority patent/JPS4972334A/ja
Priority to NL7313258A priority patent/NL7313258A/xx
Publication of DE2247163A1 publication Critical patent/DE2247163A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Description

Merck Patent Uesellscliaft 2üo September 1,072
mit beschränkter Haftung 2247 I O3
Darmstadt
Trüge rma tr ix zur Fixierung biologisch wirksamer Stoffe und Verfahren zu ihrer .Herstellung
Die Erfindung betrifft eine Trägerinatrix zur Fixierung biologisch aktiver Stoffe, insbesondere Enzyme, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung«,
Tr&gergebundene biologisch aktive Substanzen sind an eich bekannt (vgl, z„B. Angewandte Che-iaie, Band 84, Seiten 31.9 ~> 330 (1972))« Bei der Fixierung an den Träger reagieren die biologisch wirksamen. Stoffe in der Regel an in ihnen enthaltenen Aminogruppen, auch an OH— oder SH-Gruppen oder an aromatischen Kernen, jeweils unter Ausbildung neuer covalenter Bindungen zum Träger. Als Trägerstoffe wurden beispielsweise Polysaccharide und deren Derivate wie Carboxymethylcellulose (CMC), Cellulose und insbesondere Agarose, oder bestimmte Vinylpolymerisate, z.B. Copolymerisate aus Aethylen und Maleinsäureanhydrid, vorgeschlagen. Diese Substanzen werden teilweise als solche, teilweise in vorvernetzter Form verwendet, wobei in manchen Fällen zur kovalenten Bindung von biologisch aktiven Substanzen noch raktive Gruppen eingeführt werden ("Aktivierung"). Agaroao hat sich als Grundsubstanz besonders bewährt, da sie von vornherein eine so hohe Porosität besitzt, daß sie trotz teilweiser Schrumpfung während der Aktivierung (z.B. mit BrCN)
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als Trägermatrix für Enzyme noch brauchbar ist. Der Hauptnachteil der Agarose ist ihr hoher Preis, der die Anwendung agarose-gebundcner Enzyme für präpurutive StoffUmwandlungen (z.B. Stärkeverzuckerung, Invertzuokergcwinnung) in Frage stellt.
Es besteht daher der Wunsch nach einer billigeren Trägermatrix, die ähnlich gute Eigenschaften wie vernetzte Agarose besitzen, darüber hinaus aber noch folgende Vorteile haben sollte:
1. Es sollten nicht nur eine, sondern wahlweise verschiedeuc reaktive Gruppen in die Matrix eingeführt werden konuen. Damit könnten die gewünschten Windungen zwischen der Matrix und dem biologisch aktiven Stoff über verschiedene (basische, saure, aromatische) funktioneile Gruppen geknüpft und z.U. so die für jedes einzelne Enzym unterschiedlichen Bedingungen für eine weitgehende Erhaltung der Aktivität leichter erfüllt werden.
2. Die Bindung des biologisch wirksanen Stoffes sollte nicht immer unmittelbar an der Oberfläche der Matrix erfolgen müssen, sondern es sollte auch die Zwischenschaltung einer Seitenkette ("Spacer") ermöglicht werden» Dadurch würde die räumliche Orientierung des aktiven Zentrums eines Enzyms zu seinem Substrat oder Effektor erleichtert, insbesondere, wenn diese Substanz ebenfalls hochmolekular ist. Ist diese Möglichkeit nicht gewährleistet, so kann sich z.B. die Aktivität eines gebundenen Enzyms infolge sterischer Hinderung nicht immer voll entfalten.
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Es wurde nun gefunden, daß man billige wasserlösliche Polymere als Grundlage für Enzymträger verwenden kann, die die gewünschten Eigenschaften besitzen. Man geht dabei von wasserlöslichen Polymeren aus, die Säurehydrazidgruppen oder Säureazidgruppen, vorzugsweise Carbonsäurehydrazid- oder -azidgruppen, enthalten. Diese Ausgangsstoffe werden durch Umsetzung der Säurehydraζid- oder -azidgruppen mit einem bifunktionellen Reagenz teilweise vernetzt ("Vernetzung"). Gegebenenfalls verbleibende, nicht vernetzte funktionelle Gruppen, insbesondere Säurehydrazid« gruppen, können mindestens teilweise in die erforderlichen reaktiven Gruppen, die mit den biologisch wirksamen Stoffen reagieren können, umgewandelt werden ("Aktivierung").
Unter biologisch wirksamen Stoffen versteht man hier Enzyme, Hormone, Antigene, Antikörper und andere Plasmaproteine, Blutgruppensubstanzen und biologisch aktive Derivate aller diese.r Stoffe; ferner Enzymeffektoren, d.h. Enzymsubstrate, -inhibitoren, -aktivatoren, -stabilisatoren, allosterische Effektoren, Antibiotika, Coenzyme und biologisch aktive Derivate aller dieser Stoffe. Darüber hinaus können natürlich auch weitere Naturstoffe, Viren und Bakterien fixiert werden, wena sie die für die Reaktion mit den reaktiven Gruppen des Polymers geeigneten reaktionsfähigen Gruppen enthalten.
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung einer Trägermatrix zur Fixierung biologisch wirksamer Stoffe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Polymei das Säurehydrazidgruppen oder Säureuzidgx-uppen enthält, durch Umsetzung dieser Gruppen mit einem bifunktionellen Reagenz
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teilweise vernetzt und gegebenenfalls in dem erhaltenen Produkt vorhandene nicht vernetzte funktionelle Gruppen mindestens teilweise in reaktive Gruppen, die mit den biologisch wirksamen Stoffen reagieren können, überführt.
Als Polymere werden vorzugsweise wasserlösliche Hydrazide der CMC oder der Polyacrylsäure und ihrer Copolymerisate (z.B. mit Acrylamid) verwendet, üie Verwendung von CMC als Enzymträger ist an sich aus der Literatur bekannt. In der Hegel wird CMC dabei aus der Carboxylform über den Methylester und das entsprechende Ilydrazid in die reaktive Azidform übergeführt. Insgesamt wurden dabei jedoch bisher unbefriedigende Ergebnisse erhalten, bei Verwendung einer nicht wasserlöslichen, niedersubstituierten CMC (0,5'bis 0,8 mAeq/g), wie sie üblicherweise als Ionenaustauscher für die chromatographische Reinigung vieler Enzyme verwendet wird, wurden nach der Aktivierung nur kleine Proteinmengen (10 bis 20 mg/g Träger) mit niedrigen ( < 50 £>) Restaktivitäten gebunden. Andererseits wurden bei Verwendung von wasserlöslicher, hochsubstituierter CMC als Ausgangsmaterial bei der Umsetzung mit Proteinen, die in schwach alkalischem wässerigem Milieu durchgeführt wird, ganz oder teilweise lösliche Produkte erhalten. Dabei wird ein Teil der Azid-Uruppen zu wasserlöslichen COOII-tiruppen hydrolysiert. Dadurch wird ein Teil des Protein-CMC-Konjugflts wasserlöslich und geht verloren. Hei dem verbleibenden unlöslichen Anteil ist das Protein stark vernetzt und dadurch in hohem Maße sterisch gehindert.
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Erfindungsgemäß geht man vorzugsifeise von einem wasserlös-« ' liehen, hochsubstituierten CMC-Hydrazid aus, das etwa 3 bis 3,5 mVal Säurehydrazidgruppen pro g enthält. Der durchschnittliche Substitutionsgrad, d.h. die durchschnittliche Anzahl der an einer Glucoseeinheit befindlichen Säurehydrazidgruppen, liegt dabei zwischen etwa 0,65 und 1,0. Der durchschnittliche Polyraerisationsgrad liegt bei etwa 150 bis 2000, vorzugsweise bei etwa 1500 Glücoseeinheiten pro Cellulosemolekul,
Ebenso wie die genannten CMC-Hydrazide können auch die unvernetzten, wasserlöslichen Hydrazide der Polyacrylsäure, vorzugs weise als Copolymerisat mit Acrylamid, verwendet werden. Dabei kann das Verhältnis Acrylsäurehydrazid : Acrylsäurearaid etwa 1 : 1 bis 1 : 40 betragen. Der Gehalt dieser Copolymeren an Säurehydrazidgruppen reicht dann von etwa 6,3 bis 0,34 mVal/g. Das Verhältnis 1 : 1 bis 1 : 5 wird bevorzugt.
Die partielle Vernetzung wird vorzugsweise mit einem bifunktio nellen Reagenz der allgemeinen Formel I
worin
X1 und X2 -CHO, "CH2HaI, -CH-CH2,
0 -COHaI, -NCO odor -SCN,
Hal Cl, Br oder J und
Y eine Valenz oder eine gegebenenfalls durch bis zu 4 O-Atome unterbrochene Kohlenwasserstoifkette mit bis zu 18 C—Atomen
bedeuten,
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vorgenommen. Hierin sind die Gruppen X und X" vorzugsweise gleich; sie können über auch voneinander versehiodon «ein. Y ist vorzugsweise eine unverzweißte gesättigte Kette vom Typ -C H0 — (n = i bis 18, vorzugsweise. 1 bis 8, insbesondere 3 bis 6). Insbesondere eignen sich als Vernetzungsmittel üialdehyde, Dicarbonsüurehulogenide, Diepoxide, Diaraine, Diisocyanate, Dirhodanide, ferner z.U. Halogencarbonsäurehalogenide wie Chloracetylchlorid, Uromacetylchlorid oder Jodacotylehlorid, halogenierte Epoxide wie Kpichlorhydrin oder Kpibromhydrin, Halogenide von Aldehydsäuren wie Glutaraldehydsuureehlorid. Hesonders bevorzugte Vernetzungsmittel sind ülutardiuldehyd und Hexamethylendiamin.
Durch die Vernetzungsreaktion werden jeweils zwei Stränge des Polymeren durch Gruppen verknüpft, die der allgemeinen Formel -CO-NH-Z-Y-Z-NH-CO- entsprechen (worin Y die oben angegebene Uedeutung hat und Z eine Valenz, -N=CH-, -NlICHy-, -NUCU2CHOH-, -NHCO-, -NH-CO-NH- oder -NH-CS-NH- bedeutet, wobei die beiden Gruppen Z vorzugsweise gleich sind, aber auch voneinander verschieden sein können).
Die partielle Vernetzung des polymeren Säurehydrazida wird in der Regel in wässeriger Lösung vorgenommen und zwar bei pH-Werten, die vom Vernetzungsreagenz abhängig sind. Ueispielsweise erfolgt die Umsetzung mit Dialdehyden zweckmäßig in schwach saurer Lösung (pH etwa 4,5). Die Heaktionstemperaturen liegen etwa zwischen 0 und 50 , vorzugsweise zwischen 15 und 30 · Zur völligen Ueberführung in ein wasserunlösliches, hochgequollenes UcI reicht eine 15- bis 2O$4ige Vernetzung der vorhandenen Ilydrazid— gruppen aus. Die Quellbarkeit bzw, Porosität des erhaltenen Gels kann über die Heaktionsbedingungen gesteuert wurden, und
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zwar durch die Konzentration des vorgcgebeuou wasserlöslichen Polymeren, sowie; durch df.ti pH, bei dem die Yernetzung.sreuktion. durciiporührt wird, Die Quellbarkeifc des GoIb, gemessen tsis Wastseraufnahrue pro g Gel-Trockensubstanz, kanu von 10 Ijis 80 ml IL.0 /& variiert worden. Eine solche Aveiträuinige Gelstruktur ist aus sterilsehen Gründen von besonderem Vorteil ziir vollen Entfaltung dor Aktivität eines an eine solche Matrix !covalent biologisch aktiven Stofi's.
Eine vollständige Vcrn.o1.KUMg aller llyJrazidgruppen läßt sich axicli durch Verwundung eines Uoberschusses an Veruetzungsroagejiz nicht erzielen und ist auch nicht erwünscht; in dem erhaltenen vernetzten Produkt sind entweder noch Säurehydrazidgruppeu oder andere, aus den Säurehydrazidgruppen lait dem Mfunktio— iiellcn Reagenz durch- "einseitige" Reaktion ontstandene reak^,iΛ'e G-rupptm vorhanden» Die Umsetzung des wasserunlöslichen Polymers mit weit or em υ i funkt i one Hem Reagenz führt näslich infolge einer Phasengrenzreaktion überwiegend zu "einseitiger" Substitution.
In dein erhaltenen Produkt noch enthaltene, nicht vernetzte funkt ioneile Gruppen, insbesondere Säure liydru zidgruppen, können eriindungsgeiaäß mindestens teilweise in andere reaktive Gruppen, die mit den biologisch wirksamen Stoffen reagieren können, übergeführt werden ("Aktivierung").
Eine bevorzugte Form der Aktivierung ist die Umwandlung der Hydrazid- in Azidgruppen mit salpetriger Säure, zweckmäßig/mit. Natriumnitrat in 0,01 N Salzsäure bei niedrigen Temperaturen zwischen etwa -10 und +10°.
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BAD
ο ^
Die restliche» Sliureliydrazidgruppon können auch durch Umso ta« f.« ^ rait eine?« bi.fiinktioneJJen Reap/in/, dor oben angegebenen Fürmol 1 aktiviert werden. Dabei reagiert, wie erwähnt, uur die eine der reaktiven Gruppen X1 bzw· X2 nit der Säureijyd.ra/.idgiuppe, wahrend die andere reaktive Gruppe erhalten bleibt und für die Koalition rait dew biologisch wirksamen Stoff, z.U. mit der Aminogruppe eines Enzyms, zur Vorfügung steht. So erhält ra*n beispielsweise mit Dialdehyden die Mono-acylhytira zone, eiere» freie Aldchydgrunpen i'iit den Aminogruppen von Enxynicn unges-etzt werden können. Gewünschtenfalls können die C-N-Iiintlungen der erhaltenen Schiffschen Hasen zu CJI-NlI-liindungcn reduziert vrei~den, z.B. mit Naüll.. Die Umsetzung mit den bifunktionellen ftofigentien der Formel I erfolgt zweckmäßig unter den oben angegebenen Dedingungen.
Die Aktivierung kann auch nit bifunktionellen Iteageiitien erfolgen, die zur Vernetzung nicht oder weniger gut ßueignet :;Jnd. beispielsweise können Säurehydrazide mit Nitrobenzaldehyden, z.D. p-Nitrobenzaldehyd umgesetzt werden, wobei die entsprechenden Acylhydrazone der Nitrobenzaldehyde entstehen. Die Nitrogruppen können dann zu Aminogruppen reduziert, diese diazotiert und mit in ilon biologisch wirksamen Stoffen gegebenenfalls vorhandenen aromatischen Gruppen, z.U. dem Tyrosinanteil von Eiweißstoffen, gekuppelt worden.
Falls die Zwischenschaltung einer Seitenkette ("Spacer1*) erwünscht ist, kann man die partiell vernetzten polymeren Säurehydrazide bzw. -azide auch nacheinander mit mehreren Keugcntien umsetzen. Dabei kann die Länge der zwischengeschalteten Stitanketten nach Wunsch variiert werden; sie ist z.U. abhängig von, der Art der ltcagcntien und der Zahl der aufeinanderfolgenden, kettenverlängernden Umsetzungen,
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BAD ORIGINAL
Beispielsweise ist es möglich. Aside mit einem Uebersehuß an Uiaminen, z.H.. Hexamethylendiamin, in die entsprechenden N-(Aminoalkyl)-amide zu überführen, deren freie Aiainogrnp_ny anschließend ciit Dialdohyden, z.B. Crlutardialaehyd., oder Mit Nitrobenzaldehyden, z.B. p-Nitrobenzaldenyd, in der angegebenen V/eise zu den entsprechenden Schiffsehen Basen umgesetzt werden. So .erhalten« SuLstanzen haben z.B. die sehen Teil formel η 1^0-CH0GONH-(CH0K-N=CH-(CIi0) .-CKO oder R-O-CII0CONn- ( CH0 ) rN=CH-/
(worin It für einen partiell vernetzten Strang des Polymeren, z.B. eine Cellulosekette oder die Kette eines VinylpoJymeren steht). Die erhaltenen Produkte können dann entweder Kit dor endständigen funktioneilen Gruppe, z.B. der Aldehydgruppe, direkt mit den biologisch aktiven. Substanzen umgesetzt werden., oder die endständige funktioneile Gruppe kanu wie angegeben weiter umgewandelt, z.B. reduziert, diazotiert und dann mit der biologisch aktiven Substanz gekuppelt werden.
Es ist auch möglich, die partielle Vernetzung und die Aktivierung gleichzeitig auszuführen. Zu diesem Zweck setzt man das polymere Säurehydrazid mit einem 2- bis 5-fachen Ueberschuß an bifunktionellein Reagenz unter den oben angegebenen Bedingungen um. Bevorzugte Reagentien sind auch hier wieder die IJialdehyde, insbesondere Glutarddaldehyd.
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- ίο —
Die Umsetzung der vernetzten und aktivierten Trägermatrix mit den zu fixierenden Verbindungen erfolgt in der Hegel in einem Lösungemittel, vorzugsweise Wasser, bei pll-\ferten zwischen 4 und 14. Bei der Fixierung von Enzymen arbeitet man zweckmäßig in gepufferter wässeriger Lösung, ζ. U. in 0,005 - 0,5 M, vorzugsweise 0,05 M Acetatpuffer im pH-Bereich von 4-5, oder in Phosphatpuffer derselben Konzentration im pH-Bereich von 5-8. Im pH-Bereich von 7-9 kommen Triethanolamin-, Trishydroxyraethylaminomethan-' oder Borsäure/ßorax-Puffer derselben Konzentration in Frage, im pll Bereich von 9 - Ii Carbonat/Bicarbonat-Puffer. Auch andere in den angegebenen Bereichen wirksamo Puffer können verwendet werden. Nähere Angaben über solche Puffersysterne finden sich in der Literatur. Die Temperaturen sollen bei der Umsetzung von empfindlichen Enzymen vorzugsweise bei etwa 0 bis 25° liegen.
Das Mengenverhältnis von aktivierter Trägerinatrix zu der zu fixierenden Verbindung beträgt etwa 5 ; 1 bis 1 : 5, vorzugsweise etwa 2:1. Hierbei handelt es sich bei hochmolekularen Substanzen um Gewichteteile, bezogen auf Trockengewicht. Bei der Fixierung niedermolekularer Substanzen bezieht man sich dagegen auf die Anzahl Mole (bzw. Millimole) reaktiver Gruppen
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*** χ. χ 1^-
Zur Fixierung Kann die reaktionsfähige Gruppen enthaltende Verbindung in der Gepufferten wässerigen Lösung vorgelegt und der Träger in diese Lösung eingerührt werden. Man kann jedoch auch die zu fixierende Verbindung in wässeriger, ge« pufferter Lösung in die Trägersuspension einrühren. Gegebenen falls enthält das Reaktionsgemisch beiin Umsatz mit Proteinen in an sieh üblicher V/eise noch Stabilisatoren, z.B. SII- Reagentien wie Cystein oder Mercaptoäthanol oder auch Ca.-Ionen« Anschließend wird das Reaktionsgemisch für eine Reaktionszeit von etwa 5 Minuten bis zu 48 Stunden, in der Hegel etwa 1 Stunde, bei einem pH-Wert zwischen 4 und 14, bei Enzymen vorzugsweise um etwa 0, gehalten* Danach wird das Reaktionsprodukt in an sich üblicher Weise aus der Suspension isoliert. Es wird in der Regel abfiltriert und zur Entfernung adsorbierter Reste der fixierten Verbindung in an sieh bekannter Weise gewaschen. Bei Enzymen verwendet man dazu vorzugsweise Salzlösungen unterschiedlicher Molari— tat (bis etwa 3) und unterschiedlicher pH-Werte zwischen 4 und 14. Als Salze kommen insbesondere leicht lösliche und stark dissoziierende Alkalimetallsalze, z. B. NaCl oder Na0SQ.. in Frage. Es können jedoch auch Pufferlösungen, gegebenenfalls im Gemisch mit diesen Alkalimetallsalzlösungen, eingesetzt werden. In vielen Fällen ist es auch von Vorteil, die Fixierung in Gegenwart basischer Katalysatoren, insbesondere Pyridin, vorzunehmen.
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Von den zu fixierenden biologisch aktiven Verbindungen selen aus der Gruppe der Proteine beispielsweise folgende Enzyme genannt:
Proteasen und Peptidasen, z.B. Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin. Papain, Ficin, Bromelin, Bakterienproteinasen (Thermolysin, Subtilisin), Pilz-proteinasen, Aminopeptidase, Carboxypeptidase; Enzyme des Nucleinsäurestoffwechsele, z.B. Endonucleasen (Desoxyribonucleasen, Ribonucleasen) oder Exonucleasen (Phosphodiesterasen I und IIj DNS-polymerase, RNS-polymerase); ferner weitere Hydrolasen, z.B. α-Amy läse, ß-Amy läse, Amylo»- glucosidase, Saccharase (-> Invertase), Lactase (■« ß-Galactosidase), ß-Glucuronidase, Penicillinase, Urease, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase; Transferasen, z.B. Glyceratkinase, Glutamat-Pyruvat-Transaminase, Glutamat-Oxalacetat-Transaminase; Oxidoreduktasen, z.B. Lactatdehydrogenase, Malatdehydrogcnase, Steroiddehydrogenasen, Steroidhydroxylasen, Glucosedehydrogenase, Glucoseoxidase, L- und D-Aminosäureoxidase, Phenoloxidase, Katalase, Peroxidase, Uricase; Lyasen,.z.B. Amlnosäuredecarboxylasen und Ketocarbonsäuredecarbpxylasen; Carboxylesteraseη und Oeacylasen; Isomerasen, z.B. Glucoseisomcrase; Synthetasen, z.B. Aminosäure-tRNS-ligasen, Peptidsynthetasen, Carboxylason.
Zur Gruppe der Enzymeffektoren gehören z.B. Coenzyme wie NAD(P), NAD(P)H, Pyridoxaminphosphat, Pyridoxa!phosphat, Thiaminpyrophosphat, Coenzym A, Biotin, Ferner selen genannt Flavine, Folsäure und ihre Derivate, Aminosäuren, Nucleoside und Nucleotide, Steroide, sowie Enzyminhibitoren. Diese können entweder natürlicher (Proteaseinhibitoren aus tierischem oder pflanzlichem Material) oder synthetischer (Mercaptoverbindungen, Benzamidine, m-Aminophenylboronsäure) Herkunft sein.
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Die Enzymgehalte der !Conjugate, die die erfindungsgemaß
fixierten Enzyme enthalten, liegen hoch. Es werden z.B.
Enzyragehalte bis 20 % erzielt. Auch die Aktivitäten dieser
fixierten Enzyme sind hervorragend (70 - 100 %) ,
Di« Aktivitäten der nach der vorliegenden Erfindung fixierten Enzyme können in an sich üblicheν Weise bestimmt werden, und zwar so wie die der nativen Enzyme selbst. Für das polymer gebundene Trypsin kann als Substrat N-Benzoyl-L-argin.in-äthylester verwendet werden. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird durch kontinuierliche Titration (mit z.B. HaOH) der aus dem Substrat freigesetzten Carboxylgruppen bei konstantem pH-Wert gemessen. Als pH-Wert wird dex* für das zu untersuchende Enzym optimale Wert gewählt. Die Reakt ionsteniper aturen liegen in der Regel bei etwa 20 - 60 , vorzugsweise bei etwa 25 , die ReaktionsVolumina bei etwa 1 - 10 ml. Die gemessene enzymatisch^ Aktivität wird in internationalen Einheiten (U-) angegeben, 1 Enzymeinheit (1 U) ist diejenige Enzymmenge, die 10 Mol Substrat (z,B. N-Bensoyl-Ir-arginin-äthy!ester) pro Minute umsetzt.
Neben dieser Aktivitätsbestimmung an niedermolekularem Substrat kann auch eine Messung an hochmolekularen Substraten in an sich bekannter Weise vorgenommen werden. Zur Messung der proteolytischen Aktivität verwendet man z.B. häufig Hämoglobin nach in der Literatur angegebenen Methoden.
Die erfindungsgemäß fixierten Verbindungen können aufgrund ihrer vorteilhaften Eigenschaften mannigfache Anwendung finden. Hervorragend geeignet sind sie zu Reaktionen in Säulenpackungen, da sie gute mechanische Eigenschaften aufweisen, so. daß hohe Durchlaufgeschwindigkeiten erzielt werden können.
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So sind z.H. als S;tule gepackte, nach der Erfindung fixierte niedermolekulare Substanzen von großem Vor teil bei der Env:yr.4-aufreinigung n.xt Hilfe der AfJ3 i u.L t ät sehr c ■..:..<.tographic? bzw. biospezifischcn Adsorption. Gibt man z.B. ein Enirynige,äsch in einer Lü.juus !.,äßi:ver lonenstärhe über eine solche Kiiule, so wird das sun unlöslichen Effektor affine Enzym selektiv adsorbiert, Duvch Variation der Elutionsbedingungen, τ,Ti, höhere Ionei:stiuke und pH, oder Zusatz von Effektor Kum Blutionspuffer kann dann das Enzym in an sich bekannter Υίοΐκο wieder desorMert werden.
Darüber hinaus können abor auch die erfindungsgemäß fixierten Enzyme selbst mit Vorteil in Säulenpackungon eingesetzt «erderi. Das umzusetzende Eeaktionsgemisch wird dann durch diese Säule geschickt, wo es mit dem ensymatischen Katalysator in Berührung kommt. Die Reaktionsprodukte verlassen die Säule frei von Verunreinigung mit Enzym. Die Sau.lenpackung kann in dieser Weise längere Zeit hindurch benutzt werden.
Der Einsatz fixierter und unlöslich gemachter Enzyme gewinnt bei industriellen Prozessen zuaehwend an Bedeutung» z.B, in der Gärungsindustrie, bei der Herstellung von Antibiotica und bei chemischen bzw. biologischen Synthesen. Weitere Anwendungsgebiete sind beispielsweise Stoffvvechseluntersuchungen, insbesondere zu diagnostischen Zwecken, und die Verwendung als Arzneimittel, speziell bei topischer, aber auch bei oraler und parenteraler Applikation, wo die fixierten Enzyme vorzugsweise in Form von Mikrokapseln verabreicht worden.
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BAD
Beispiel 1
2 g CMC-Hydrazid (mit 3,2 mAeq/g Säurehydrazidgruppen) werden in 100 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit HCl auf pH 4,5 eingestellt und mit 0,6 ml einer 25 %igen, wässerigen Lösung von Glutardialdehyd versetzt. Die Mischung wird sofort hochviskos, und nach 2-3 Minuten fällt ein gelartiges Polymerisat aus. Durch Rühren stellt man eine homogene Suspension her, kühlt auf 0 -.2° ab und senkt den pH durch Zugabe von 5 N HCl auf 1,2 ab. 10,4 ml einer 5 %igen wässerigen NaNO3-Lösung werden zugegeben. Nach 15 Minuten wird das säureazidgruppenhaltige Polymere abgesaugt, mit Wasser gewaschen und sofort in einer auf 2° vorgekühlten Lösung von 1 g kristallinem Trypsin in 100 ml 0,2 M Triäthanolamin/HCl-Puffer (2 mM CaCl3; pH 8,5) homogen suspendiert. Nach 2 Stunden wird das nicht kovalent gebundene Protein durch wiederholtes Auswaschen mit 0,3 M Phosphatpuffer (pH 8,0) sowie 1 M NaCl-Lösung entfernt. Man erhält trägergebundenes Trypsin der schematischen Teilforniel R-O-CH2CONH-Trypsin (R =■ partiell vernetzter Cellulosestrang). 52 % des vorgelegten Enzyms sind kovalent an den Träger gebunden. Das gebundene Trypsin ist noch zu 80 - 90 % gegen N-Benzoylarginin-äthylester-HCl (BAEE) enzymatisch aktiv.
Beispiel 2
Nach Beispiel 1 werden 2 g CMC-Hydrazid mit Glutardialdehyd vernetzt und mit 2,8 g p-Nitrobenzaldehyd in 40 ml Essigsäure 1 Stunde bei 25 umgesetzt. Danach wird das gebildete polymere Hydrazon abgesaugt, intensiv mit Methanol und Wasser gewaschen und in 400 ml Wasser suspendiert. Nach Alkalisieren mit verdünntem Ammoniak (pH etwa IO1-II) werden die Nitrogruppen mit 10 g Na2S2°4 2 stunden bei 25° reduziert. Das gebildete Amin wird abgesaugt, mit Wasser und Methanol gewaschen und in 400 ml auf 5° vorgekühlter 0,1 N HCl suspendiert. Zur Diazotierung werden 5 ml 5%igo NaNO2-Lösung zugetropft. Man läßt 30 Minuten
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reagieren, saugt das diazoniumgruppenhaltige Polymere ab und wäscht mehrfach mit 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,8). Der feuchte Filterkuchen wird anschließend sofort in 150 ml einer vorgekühlten Lösung von 500 mg Papain homogen suspendiert und 18 Stunden unter Eiskühlung umgesetzt. Danaoh wird das nicht kovalent gebundene Protein wie im Beispiel 1 ausgewaschen. Man erhält trägergebundenes Papain der Teilformel R-O-CH2CONHN-CH-^^- N=N-Papain. 66 % dos eingesetzten Enzyms sind kovalent an den Träger gebunden. Das gebundene Papain ist gegen BAEE als Substrat zu 90 % enzymatisch aktiv.
Beispiel 3
Nach Beispiel 1 werden 2 g CMC-Hydrazid mit Glutardialdehyd vernetzt. Nach Umsetzung mit NaNO2 wird das säureazidgruppenhaltige Polymere in einer auf 5° gekühlten Lösung von 4 g Hexamethylendiamin in 100 ml Wasser homogen suspendiert. Nach 2 Stunden wird der pH auf 4 abgesenkt, das aminogruppenhaltige Polymere abgesaugt, gewaschen und in 100 ml 0,2 H Triethanolamin/ HCl-Puffer (pH 8,5) suspendiert. Unter Rühren gibt man 100 ml einer 2,5 %igen wässerigen Lösung von Glutardialdehyd hinzu und läßt 2 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Danach wird das aldehydgruppenhaltige "aktivierte" Polymere abgesaugt, gewaschen und in 200 ml einer auf 5° gekühlten Lösung von 1 g kristallinem Trypsin in 0,2 M Triäthanolarain/HCl-Puffer (2 mM CaGl0 ;
pH 8,5) homogen suspendiert. Nach 18 Stunden wird das nicht kovalent gebundene Protein wie in Beispiel 1 ausgewaschen. Man erhält trägergebundenes Trypsin der Teilformel R-O-CH2CONH(CH2)6N-CH(CH2)3CH«N-Trypsin. 26 % des eingesetzten Enzyms sind kovalent an den polymeren Träger gebunden. Das gebundene Trypsin ist zu 90 - 100 %, gemessen gegen BAKE als Substrat, enzymatisch aktiv.
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Beispiel 4
Nach Beispiel 3 werden 2 g CMC-Hydrazid in das "aktivierte" aldehydgruppenhaltige Polymere überführt und in 200 ml einer auf 5° vorgekühlten Lösung von 0,6 g kristallinem ct-Chymotrypsin in 0,2 M Triäthanolamin/HCl-Puffer (2 mM CaCl2; pH 8,5) homogen suspendiert. Nach 18 Stunden wird das nicht kovalent gebundene Protein wie in Beispiel 1 ausgewaschen. Man erhält trägergebundenes a-Chymotrypsin der Teilformel R-O-CH2CONH(CH2)6N-CH(CH2)3CH—N-a-Chymotrypsin. 80 % des eingesetzten Enzyms sind kovalent an ,den Träger gebunden. Das gebundene e-Chymotrypsin ist zu 90 - 100 % gegen N-Glutaryl-L-phenylalanin-4-nitroanilid als Substrat enzymatisch aktiv.
Beispiel 5
Nach Beispiel 3 werden 2 g CMC-Hydrazid in das "aktivierte" aldehydgruppenhaltige Polymere überführt und in 150 ral einer auf 5° vorgekühlten Lösung von 0,6 g kristalliner Ribonuclease (aus Rinderpankreas) in 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,8) homogen suspendiert. Nach 18 Stunden wird das nicht kovalent gebundene Protein wie in Beispiel 1 ausgewaschen. Man erhält trägergebundene Ribonuclease der Teilformel
R-O-CH2CONH(CH2)6N=CH(CH2)CH-N-Ribonuclease. 28 % des eingesetzten Enzyms sind kovalent an den Träger gebunden. Die gebundene Ribonuclease ist zu 76 % gegen Cytidln-2',3'-cyclophosphat als Substrat enzymatisch aktiv.
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Beispiel 6
2 g CMC-Hydrazid werden in 200 ml Wasser gelöst und mit wenigen Tropfen HCl auf pH 4,5 eingestellt. 50 ml 5 %iger wässeriger Glutardialdchydlösung werden unter Rühren zugegeben. Es bildet sich sofort ein wasserunlösliches Gel. Nach 2 Stunden bei 25° wird das aldehydgruppenhaltige Polymere abgesaugt und durch intensives Waschen mit Wasser von überschüssigem Aldehyd befreit. Der ausgewaschene Filterkuchen wird sofort in eine auf 5° vorgekühlte Lösung von 400 mg kristalliner Ribonuclease in 200 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 8,0) homogen suspendiert. Nach 13 Stunden wird das nicht kovalent gebundene Protein wie in Beispiel 1 ausgewaschen. 23 % des eingesetzten Enzyms sind kovalent an den Träger gebunden. Die gebundene Ribonuclease ist zu 82 % gegen Cytidin-2',3*-cyel©phosphat als Substrat enzymatisch alctiv. Das so erhaltene trägergebundeiie Enzym (ca. 30 g Feuchtmaterial) wird zur Eliminierung nicht umgesetzter Aldehydgruppen in 250 ml 0,1 M NaBII.-Lösung homogen suspendiert.und 20 Minuten bei 0° reduziert. Danach gibt »an 2 N HCl bis pH 4,0 zu und wäscht das trägergebundene Ensyn der Teilformel R-O-CH3CONH-NH-(CH3) g-NII-RibonucleaSe mit Wasser und 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,8) gut aus. Die gebundene Ribonuclease ist noch zu 70 % enzymatisch aktiv,
Beispiel 7
Aus 2 g CMC-Hydrazid wird nach Beispiel 6 das "aktivierte" aldehydgruppenhaltige Polymere hergestellt und in einer Lösung von 500 mg kristallisiertem Trypsin in 200 ml 0,2 M Triäthanolamin/HCl-Puffer, (2 mM CaCl3; pH 8,5) bei 5° homogen suspendiert.
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Nach 18 Stunden wird das nicht kovalent gebundene Protein wie in Beispiel 1 ausgewaschen, 30 % des eingesetzten Enzyms sind kovalent an den Träger gebunden. Das gebundene Trypsin ist gegen Bsnzoyl-L-argininäthylester als Substrat zu 90 % enzymatisch aktiv. Nach Behandeln rait NaBK4 analog Beispiel 6 erhält man trägergebundenes Trypsin der Teilformel R-O-CH0CONH-NH-: (CEL>--NH-Trypsin, dessen Aktivität noch 86 %
dt di Ό
beträgt,
Beispiel 8
2 g eines wassei-löslichen Copolymers aus Acrylsäurehydrazid und Acrylamid (2,7 raVal/g Säurehydrazidgruppen) werden in 100 ml 0,2 M Triäthanolamin/HCl-Puffer (pH 8,0) suspendiert und mit 1Ö0 ml 5 %iger wässeriger Glutardialdehydlosung 3 Stunden bei 25 umgesetzt. Der überschüssige Dialdehyd wird mit Wasser ausgewaschen und das aktivierte Copolymer sofort in eine auf 5 vorgekühlte Lösung von 1 g,kristallisiertem Trypsin in 160 ml 0,2 M Triäthanolamin/HCl-Puffer (0,01 M CaCl0; pH 8,5) homogen suspendiert. Nach 18 Stunden wird das nicht kovalent gebundene Protein wie in Beispiel 1 ausgewaschen. Man erhält trägergebundenes Trypsin der Teilformel R-CONIIN= CH(CH0)oCH=N-Trypsin (R =* partiell vernetzter -CH~CKO-Strang). 10 % des eingesetzten Enzyms sind kovalent an den Träger gebunden. Das gebundene Trypsin ist zu 80 % gegen BAEE enzymatisch aktiv.
Beispiel 9
10 g CMC-Hydrazid werden in 200 ml Dimethylformamid (DMF) suspendiert. Die Suspension wird mit 105 ml 25 %iger Glutardialdehydlosung versetzt und 18 Stunden bei 25° gerührt.
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Danach wird der aktivierte Träger abgesaugt, mit DMF gewaschen, wieder in 100 ml DMF suspendiert und mit einer Lösung von 17,6 g p-Arainophenyl-inercuriacetat in 150 ml DMF versetzt. Man rührt 4 Stunden bei 25°. Danach wird der beladene Träger abgesaugt, wit DMF und mit Methanol gewaschen und bei 40° getrocknet. Man erhält 11,2 g trägergebundenes p-Aminophenlymercuriacetat der Teilformel
R-O-CH0COKHN=CH(CH0)-CH-N-f^V-HgOCOCH9. Hg-Geha11; 3,2 % entsprechend 0,16 mMol p-Aminophenyl-mercuriacetat pro g Trockensubstanz.
Beispiel 10
a) 100 g CMC-Hydrazid werden bei 0-4° in 5 1 0,5 N HCl gelöst. Zu der Lösung werden langsam 330 ml 1,5 N NaNO,.-Lösung zugetropft. Das gebildete CMC-Azid wird abzentrifugiert und mehrmals mit kalter 0,001 N HCl gewaschen. Danach wird das CMC-Azid in 4 1 kalter 0,3 M Hexamethylendiaminlösung suspendiert und über Nacht unter Biskühlung gerührt. Das partiell vernetzte Reaktionsprodukt wird abzentrifugiert, mehrmals mit Wasser, verdünnter Salzsäure (pH 4), verdünnter NaOH (pH 8), und schließlich wieder mit Wasser gewaschen. Die so erhaltene N-(6-Aminohexyl)-carbamoylmethylcellulose ("Aminoalkyl-(Cp)-CeIIuIoSe", AAC) wird lyophilisiert. Die Ausbeute beträgt 70 g und der Gehalt an NHg-Gruppen 115 mVal/g Trockensubstanz.
In analoger Weise werden partiell vernetzte Aminoalkyl-(C0)~
und Aminoalkyl-(Oxycellulose durch Umsatz von CMC-Azid mit Octamethylendiamin und Dodecamethylendiamin erhalten.
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-ti -
b) 5 g partiell vernetzte AAC werden in 500 ml 0,1 M Triäthanolarainpuffer (Trampuffer, pH 8,5) suspendiert und zur Aktivierung mit 38 ml 25 %iger Glutardialdehydlösung versetzt. Man rührt über Nacht bei 25°, saugt ab und wäscht den aktivierten Träger mit 0,1 M Trampuffer. Danach wird der aktivierte Träger in 500 ml einer 0,04 M Alanin-p-nitranilid-(Alapa)-Lösung in 0,1 M Trampuffer suspendiert. Man rührt 2 Stunden bei 25°, saugt ab und wäscht das polymer gebundene. Alapa solange bis das Waschwasser nach Zugabe von Natronlauge nicht mehr gelb wird. Das erhaltene polymer gebundene Älapa der Teilformel R-OCH2CONH ( CH2 ) 6N=CH ( CH2 ) 3CH-NCH ( CH3 ) CONH-^-NO2 wird gefriergetrocknet. Ausbeute: 4,6 g, Gehalt: 0,42 Alapa/g Trockensubstanz,
Beispiel 11
100 g partiell vernetzte AAC (ca, 100 mVal NEL-Gruppen) werden be,i 0 - 4° in 1,5 1 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8) suspendiert und mit 200 g Bernsteinsäureanhydrid versetzt. Während der Umsetzung wird der pH-Wert durch Zugabe von NaOH auf 7,8 - 8,2 gehalten. Man rührt über Nacht, saugt dann ab und wäscht mit NaHCO3-Lösung, Wasser, Phosphatpuffer (pH 5,5) und wieder mit Wasser. Die gebildete succinylierte Aminoalkylcellulose (SAAC) wird lyophilisiert, Ausbeute: 104,3 g; COOH-Gruppen: 0,89 mVal/g.
5 g SAAC werden in 500 ml einer 0,04 H Alapalösung in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 5) suspendiert. Dazu tropft man innerhalb von 5 Minuten 80 ml einer 0,1 M Lösung von N-Cyclohexyl-N1-[2-(N-raethyl-morpholinium)-äthyl]-carbodiimid-p-toluolsulfonat (CDI). Man rührt anschließend Über Nacht bei pH 4,7 - 5 und 25°.
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Danach wird das Reaktionsprodukt der schematischen .Fonaol R-OCII2CONII(Ch2)gKHCOCCH2)2COKIICn(CH3)COlIH-^-NO2 abj-es mit 0,05 M Na-Aethylendiamintetraacetat (EDTA)-Lösung (pH 7) und mit Wasser gewaschen. Das Reaktionsprodukt wird lyophilisiert Ausbeute: 6,3 g. Beladung: 0,89 m?.Iol Alapa/g Trockensubstanz.
Beispiel 12
30 g SAAC v/erden in 1 1 einer Lösung von 30 g Pyridoxarainphosphat (PAMP) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 5) suspendiert. Dazu tropft man unter Rühren innerhalb von 5 - 10 Minuten 250 ml 0,2 M CDI-Lösung. Man rührt anschließend über Nacht bei pH 4,7 - 5 und 25°. Das polymer gebundene PAMP wird abgesaugt und mit Phosphatpuffer (pH 5,5), Yiasser, NaHCO3-Lösung, Wasser, NaCl-Lösung und wieder mit Wasser gewaschen. Das Produkt wird feucht aufbewahrt. Man erhält 212 g feuchtes trägergebundenes Pyridoxaminphosphat. Zur Analyse werden 2 g des feuchten Materials unter vermindertem Druck bei 40° getrocknet. Man erhält 0,32 g Trockensubstanz. Die Trockensubstanz hat einen !«-Gehalt von 3,8 % und einen P-Gehalt von 0,95 % entsprechend 0,29 mllol PAMP pro g Trockensubstanz.
Beispiel 13
Man arbeitet analog Beispiel 12, verwendet aber 0,1 Hol (- 13,7 g) m-Aminophenyl-boronsäure als Substrat und erhält 33,4 g trockene trägergebundene m-Aminophenylboronsäure. B-Gehalt: 0,45 % entsprechend 0,41 mMol/g Trockensubstanz.
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Beispiel 14
10 g SAAC werden in 120 ml 0,1 M CDI-Lösung in 0,1 M 2-Morpholinoäthaiisulfonsäure-Puffer (pH 5) suspendiert und 30 Minuten bei 25° gerührt. Dann gibt man 4 g p-Aminobenzamidin-dihydrochlorid zu und rührt 1,5 Stunden bei pH 4,7 - 5. Dann werden nochEials 5 g festes CDI zugegeben und 3 Stunden weiter gerührt. Das Reaktionsprodukt v/ird mit Pufferlösung, 1 M HaCl-Lösung, 0,05 M EDTA-Lösung (pH 7,3) und Wasser gewaschen und lyophilisiert. Ausbeute: 9,8 g trägergebundenes p-Ainincbenzamidin. N-Zunahrae: 2 % entsprechend 0,475 mMol p-Aminobenzamidin/g Trockensubstanz.
Beispiel 15
10 g SAAC werden in einer Lösung von 5,3 g p-Aminophenylmercuriacetat in 200 ml DMF suspendiert. Die Suspension '.yird mit verdünnter HCl auf pH 5 eingestellt. Dann gibt man 200 ml 0,08 M CDI-Lösung, wobei der pH Wert auf 4,7-5 gehalten wird. Man rührt 1 Stunde tropft dann weitere 100 ml CDI-Lösung zu und rührt über Nacht weiter. Danach wird das erhaltene trägergebundene p-Aminophenyl-mercuriacetat abgesaugt, mit DMF, DMF/Wasser (1:1) und Wasser gewaschen und lyophilisiert. Ausbeute: 11 g; Hg-Gehalt: 5,35 %, entsprechend 0,265 mMol/g Trockensubstanz,
Beispiel 16
26 g SAAC werden in 400 ml einer b,15 M L-Lysin-p-nitranilid-Lösung in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 5) suspendiert. Dazu gibt man unter pH-Kontrolle 250 ml 0,15 M CDI-Lösung (in Wasser) rührt 1 Stunde unter pH-Kontrolle und dann über Nacht weiter.
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Das polymer gebundene L-Lysin-p-nitranilid wird abgesaugt, zweimal mit 1 M NaCl-Lösung und einmal ra.lt Wasser gewaschen, dann zur Abspaltung vorn p-Nitroanilin in 1 N NaOH supendiert und 30 Minuten bei 60° inkubiert. Das polymer gebundene L·-Lysin wird ir.it 1 M KaCl-Lösung, 0,2 M Ka2HPO4-Lösung (pH 9), 0,2 M NaH3PO4-Lösung (pil 4,5), 0,05 M EDTA-Lösung (pH 7), IM NaCl-Lösung und V/asser gewaschen und lyophilisiert. Ausbeute: 15,2 g. Beladung: 0,7 r*?.lol L-Lysin/g Trockensubstanz (errechnet aus der Menge des abgespaltenen p-Nitroanilins>.
Beispiel 17
10 g SAAC werden in 300 ml einer Lösung von 6,75 g Oestron in DMF suspendiert und der pH-Wert auf 5,5 gestellt. Dann gibt man unter pH-Kontrolle 50 ml wässerige 0,2 M CDI-Lösung dazu und rührt 1 Stunde. Danach gibt man weitere 50 ml CDI-Lösung zu und rührt weitere 3 Stunden. Das erhaltene trägergebundene Östron wird abgesaugt, mit DMF und Wasser gewaschen und lyophilisiert. Ausbeute: 10,8 g; Beladung: 0,167 mMol Oestron/g Trockensubstanz.
Beispiel 18
a) 100 g CMC-Hydrazid werden wie im Beispiel 1 beschrieben, mit Glutardialdehyd partiell vernetzt, dann diazotiert und mit kalter 0,001 M HCl gewaschen. Das so erhaltene Azid wird in 1,5 1 kalte 1 M 6-Aminocapronsäure (pH 5,5) eingerührt und homogenisiert. Man rührt 1 Stunde unter Eiskühlung und pH-Kontrolle und danach über Nacht bei 5°.
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_ 25 - *
Die erhaltene "Carboxyallcy !-cellulose" der schematischon Formel -0-CH0-CQ-NH-(CH0)a~COOH v/ird abgesaugt, mit Wasser, NaIICO15-LOSUHg, EDTÄ-Lösung und erneut mit Wasser gewaschen und lyophilisiert. Ausbeute: 69 g. COOH-Gruppengehalt: 0,445 mVal/g Trockensubstanz.
b) 1Ό g der erhaltenen "Carboxyalkyl-cellulose" werden in 300 ml einer Lösung von 6,8 g Oestradiol in BMF suspendiert Dann gibt man SO ml wässerige 0,2 M CDI-Lösung dazu und fährt fort wie unter a) beschrieben, wobei auch bei dei* zweiten Carbodiimidzugabe nur 30 ml zugetropft werden,vAusbeute: 10,45 g; Beladung: 98 mMol Oestradiol/g Trockensubstanz.
Beispiel 19 .
10 g eines wasserlöslichen Copolymerisate aus Acrylsäurehydrazid und Acrylamid mit 2,7. mVal Säurehydrazidgruppen/g werden analog Beispiel 10a mit HNO2 diazotiert und anschliessend sofort mit 500 ml 0,5 M Teträmethylendiaminlösung umgesetzt, Nach Auswaschen mit Wasser wird das partiell vernetzte Copolymerisat von Acrylamid und N-(4-Aminobutyl)-acrylamid analog Beispiel 10b mit Glutardialdehyd "aktiviert" und mit Alapa umgesetzt. Nach Gefriertrocknung erhält man 8,2 g eines Produkts der scheraatischen Formel R-CONH(CH2)4N-CH(CHg)3CH= NCH(CH3)CONH-^-NO2 (R *> partiell vernetzter CH-CHg-Strang), das 0,55 mMol Alapa/g Trockensubstanz enthält.
Beispiel 20
10 g CMC-Hydrazid werden in 500 ml Ο,ΟΟΙΝ NaOH gelöst,
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mit 4 g l,3-Bis-(2,3-epoxypropoxy)-butan versetzt und 2 Stunden bei 50° gehalten. Das partiell vernetzte.CKC-ν Hydrazid wird mit Wasser ausgewaschen, amilug Beispiel 9 mit Glutardialdehyd "aktiviert" und mit p-Arainoplienylmercuri-benzoat umgesetzt. Man erhält 9,5 g Realttiomsprodukt, das 0,2 mMol p-AminopIienyliaercuribenzoct/g Trockensubstanz enthält.
Beispiel 21
'2 g CMC-Hydrazid werden in 100 ral 0,1 N NaOH gelöst, mit 0,3 g Epichlorhydrin versetzt und 2 Stunden bei 5Q° gehalten. Das partiell vernetzte CMC-Hydrazid wird mit Wasser gewaschen. Analog Beispiel 1 werden die freien Säurehydrazidgruppon mit HNOn diazotiert und mit Trypsin umgesetzt. 40 % des Enzyms v/erden an den Träger gebunden. Das gebundene Trypsin ist noch zu 85 % gegen BAEE enzymatisch aktiv.
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Claims (7)

Patentansprüche ι————-
1. Verfahren zur Herstellung einer Trägermatrix zur Fixierung biologisch wirksamer Stoffe, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Polymer, das Säurehydrazidgruppen oder Säureazidgruppon enthält, durch Umsetzung dieser Grppen mit einem bifunktionellen Reagenz teilweise vernetzt und gegebenenfalls in dem erhaltenen Produkt vorhandene, nicht vernetzte funktioneile Gruppen mindestens teilweise in reaktive Gruppen, die mit den biologisch wirksamen Stoffen reagieren können, überführt,
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Polymer auf Basis Carboxymethylcellulose oder Polyacrylsäure verwendet,
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet^ daß man als bifunktionelles Reagenz eine Verbindung der allgemeinen Formel I
1 o worin
X —Y—X
X1 und X2 -CHO, -CII0HaI, -CH-CH0,
1 V ~
-NH2, -COHaI, -NCO oder -SCN,
Hal Cl, Br oder J und Y eine Valenz oder eine gegebenenfalls durch bis zu. 0-Atome unterbrochene Kohlenwasserstoffkette mit bis zu 18 C-Atomenbedeuten,
verwendet.
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a?
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die nicht vernetzten Säurehydrazidgruppen mit salpetriger Säure und/oder mindestens einem bifunktionellen Reagenz umsetzt,
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß nan als bifunktionelles Reagenz eine Verbindung der in Anspruch angegebenen Formel I verwendet.
6. Trägermatrix zur Fixierung biologisch wirksamer Stoffe, bestehend aus einem teilweise durch -CO-IiH-Z-Y-Z-NH-CO-Gruppen (worin Y die in Anspruch 3 angegebene Bedeutung hat und
Z eine Valenz, -N=CH-, -NHCH2-, -NHCK2CHOH-, -NHCO-, -NH-CO-NH- oder -NH-CS-NH- bedeutet) vernetzten Polymeren, das ferner reaktive Gruppen enthält, die mit den biologisch wirksamen Stoffen reagieren können,
7. Verwendung von teilweise durch -CO-NH-Z-Y-Z-NH-CO-Gruppen (worin Y die in Anspruch 3 und Z die in Anspruch 6 angegebene Bedeutung hat) vernetzten Polymeren, die ferner reaktive Gruppen enthalten, zur Fixierung biologisch wirksamer Stoffe.
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DE19722247163 1972-09-26 1972-09-26 Traegermatrix zur fixierung biologisch wirksamer stoffe und verfahren zu ihrer herstellung Pending DE2247163A1 (de)

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