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DE2541308A1 - Spezifisch, insbesondere protein- reaktive membran, verfahren zur herstellung derselben und deren verwendung - Google Patents

Spezifisch, insbesondere protein- reaktive membran, verfahren zur herstellung derselben und deren verwendung

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Publication number
DE2541308A1
DE2541308A1 DE19752541308 DE2541308A DE2541308A1 DE 2541308 A1 DE2541308 A1 DE 2541308A1 DE 19752541308 DE19752541308 DE 19752541308 DE 2541308 A DE2541308 A DE 2541308A DE 2541308 A1 DE2541308 A1 DE 2541308A1
Authority
DE
Germany
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protein
reactive
membrane
compound
reactive group
Prior art date
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Application number
DE19752541308
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Inventor
Jarmila Janata
Jiri Janata
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Utah
Original Assignee
University of Utah
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Filing date
Publication date
Application filed by University of Utah filed Critical University of Utah
Publication of DE2541308A1 publication Critical patent/DE2541308A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2541308C2 publication Critical patent/DE2541308C2/de
Expired legal-status Critical Current

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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D67/00—Processes specially adapted for manufacturing semi-permeable membranes for separation processes or apparatus
    • B01D67/0081—After-treatment of organic or inorganic membranes
    • B01D67/0093—Chemical modification
    • B01D67/00931—Chemical modification by introduction of specific groups after membrane formation, e.g. by grafting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
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    • B01D71/82—Macromolecular material not specifically provided for in a single one of groups B01D71/08 - B01D71/74 characterised by the presence of specified groups, e.g. introduced by chemical after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

TlEDTKE -' BüHLING " KlNNE Patentanwälte:
Dipl.-Ing. Tiedtke Dipl.-Chem. Bühling Dipl.-Ing. Kinne
8 München 2, Postfach 202403 Bavariaring 4
Tel.: (0 89) 53 96 53 - 56 Telex: 5 24845 tipat cable: Germaniapatent München
16. September 1975
B 6847/ICI case Q.27273Z
UNIVERSITY OF UTAH Salt Lake City, USA
Spezifisch, insbesondere proteih-reaktive Membran, Verfahren zur Herstellung derselben und deren Verwendung
Die Erfindung bezieht sich auf organische Membranen sowie deren Herstellung und Verwendung.
Die spezifische Reaktion eines speziellen Proteins mit einem anderen ist allgemein bekannt und eine solche tritt beispielsweise bei der Entwicklung spezifischer Antikörper zur Bekämpfung eines speziellen Antigens im Tierkörper auf. Dieses spezifische Ansprechen eines Proteins auf ein anderes wird in der Affinitätschromatographie zur Abtrennung eines spezifischen Proteins, ausgenutzt, das in einer speziellen Lö-
Nö/12
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sung anwesend ist.
Eine solche selektive Reaktion zwischen zwei Verbindungen existiert bei zahlreichen Substanzen;so reagieren Proteine einschließlich Hormone und Enzyme sowie Poly-und Monosaccharide selektiv mit spezifischen Verbindungen,und alle diese Reaktionen werden im Rahmen der vorliegenden-Beschreibung als immunochemiche Reaktionen bezeichnet. Obgleich sich der nachfolgende Text aus Zweckmäßigkeitsgründen vornehmlich auf Proteine und protein-reaktive Gruppen bezieht, können selbstverständlich andere geeignete Kombinationen von spezifisch coreaktiven Verbindungen oder Gruppierungen anstelle der Proteine und protein-reaktiven Gruppen vorgesehen werden. .
Affinitätschromatographische Materialien wie z.B. Säulenpackungen werden ausgehend von hydrophilen polymeren Oberflächen hergestellt, die in Anbetracht ihres polaren Charakters reaktive Stellen besitzen, an die eine proteinreaktive Verbindung angefügt werden kann. Der hydrophile Charakter des Substrats wird durch die Proteinanlagerung nicht beeinträchtigt. .
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Ein Proteinmolekül wie ein Antikörper oder Antigen ' in einer Pufferlösung hat eine deutliche elektrische Ladung, deren Höhe und Polarität vom isoelektrischen Punkt des Proteins und der Zusammensetzung des Puffers abhängt. Diese Ladung wird durch Antikörper-Antigen-Reaktionen verändert. Obgleich nun die resultierende Änderung der elektrischen Ladung von einer nachzuweisenden Größe ist, ist die Proteinimmobilisierung auf einer hydrophilen Membran unbefriedigend, da die ionische Wir-« kung von Wasser auf die polaren Gruppen des hydrophilen Substrats so stark ist, daß sie die durch die immunochemische Reaktion induzierte geringe Änderung des elektrischen Potentials überdeckt bzw. maskiert.
Es würde nun gefunden, daß die Oberflächenladung der Polymer/Lösungsgrenzfläche von der reinen Ladung des immobilisierten Antikörpers abhängt, wenn aller Antikörper kovalent an die Oberfläche eines hydrophoben Polymeren gebunden ist, das wiederum auf einem Leiter sitzt bzw.. abgelagert ist. Wenn in der Lösung entsprechendes Antigen anwesend ist und die Bindungsstelle des Antikörpers während der Immobilisierung (Bindung an das Polymere) nicht zerstört wurde, findet die immunochemische Reaktion an der Grenzfläche mit daraus resultierender Änderung der Oberflächenladung statt. Diese Änderung kann potentiometrisch gegenüber einer Bezugselektrode gemessen werden/die in die gleiche Lösung eintaucht.
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Gegenstand der Erfindung ist mit_hin eine hydrophobe Membran mit der Fähigkeit der Immobilisierung eines Proteins. Die Membran umfaßt ein Substrat aus einem hydrophoben Polymeren, das durch Lösungsmittelwirkung quellbar ist und in dem eine - üblicherweise aliphatische - Kohlenwasserstoff-Verbindung mit einer geeignet reaktiven Gruppe aus einem Lösungsmittelsystem absorbiert bzw. aufgenommen werden kann. Die resultierende hydrophobe Membran besitzt eine anhängende (im wesentlichen) Kohlenwasserstoffkette, die eine protein-reaktive Gruppe wie eine Oxyrangruppe (Epoxyd) oder eine andere proteinreaktive Gruppe enthält. Die Kette kann von Kohlenstoff-Kohlenstoff bindungen verschiedene Verknüpfungen öder Kettenglieder wie Ätherbindurtg aufweisen und wird daher als "im wesentlichen Kohlenwasserstoffkette" für die Zwecke der Erfindung bezeichnet. ' ■ .>.;'.)i.·
Gemäß eines Aspekts der Erfindung wird somit eine spezifisch reaktive Membran vorgesehen, die ein hydrophobes Polymeres mit anhängenden im wesentlichen Kohlenwasserstoffketten umfaßt/ die mit einer chemischen Verbindung spezifisch reaktive Gruppen tragen. Vorzugsweise, umfaßt die Membran Kohlenwasserstoffketten, die in einer mit einem Polypeptid spezifisch reaktiven Gruppe enden» Zweckmäßigerweise ist die Membran mit Kohlenwasserstoffketten versehen, die jeweils eine reaktive Gruppe aufweisen, die zur Bindung einer spezifisch protein-reaktiven Gruppierung durch Kontakt der reak-
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• . . · 2547308
tiven Gruppe mit der protein-reaktiven Gruppierung befähigt ist, wodurch diese Gruppierung über die Kette an die Membran gebunden wird. Geeignete protein-reaktive Gruppierungen sind Antigene oder Antikörper. ..
Die mit einer Proteinimmobilisierungsfähigkeit ausge-. stattete hydrophobe Membran wird als Hülle einer hochleitfähigen Elektrode wie beispielsweise Platin verwendet. Ein Protein,z.B. ein Antikörper/mit einer Selekt-ivität für die Reaktion mit einem speziellen Protein (Antigen) wird an der protein-reaktiven Stelle zur Reaktion veranlaßt. Durch Eintauchen einer solchen beschichteten Elektrode zusammen mit einer Bezugselektrode in eine das Antigen enthaltende wässrige Lösung erhält man ein elektrisch empfindliches System,das in der Lage ist, die durch Einfang eines speziellen Proteins (Antigens) durch die mit einem immunoreaktiven Antikörper versehene Elektrode verursachte Änderung der elektrischen Ladung an der Lösung/Polymer-Grenzfläche zu messen. Alternativ kann das Antigen für einen selektiven Einfang des Antikörpers an der Membran immobilisiert werden.
Gemäß eines zweiten Aspekts der Erfindung wird somit eine Elektrode vorgesehen, die eine Hülle bzw. Hüllschicht von spezifisch reaktiver Membran aufweist.
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Ferner wird gemäß der Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit und optimal der Konzentration einer Verbindung in einer Mischung vorgesehen, welche die Verbindung zusammen mit anderen Molekülen, z.B. Lösungsmitteimolekülen, enthält, indem die Mischung mit einer Elektrode in Kontakt gebracht wird, die von einer mit der Verbindung spezifisch reaktiven Membran umschlossen wird und irgendeine resultierende Änderung der elektrischen Ladung an der Membran nachgewiesen wird . Zweckmäßigerweise kann dies durch Vergleich mit einer geeigneten Bezugselektrode erfolgen.
Für die Erzeugung einer hydrophoben Polymermembran mit selektiver iinmunochemischef Wirksamkeit (d.h. einer spezifisch reaktiven Membran) wird eine Membran aus einem hydrophoben Polymeren erzeugt. Das Polymere ist vorzugsweise mit einem organischen Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung/ insbesondere mit aliphatischen Lösungsmitteln/ quellbar. Für die praktische Durchführung der Erfindung besonders brauchbare Polymere sind solche hydrophoben Polymeren, die keine anhängenden polaren Gruppen enthalten. Zu typischen Polymeren für diesen Zweck gehören thermoplastische Polymere wie Polyvinylchlorid, Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen* Siliconkautschuk, Polyurethan, Polycarbonat, Polytetrafluor* äthylen und dgl.. Warmhärtende Polymere wie Epoxyharze und
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vernetzte Polyester können auch angewandt werden. Bevorzugt werden Polymere, die durch Tauchbeschichtung oder Aufgießen oder Aufschrumpfen auf eine Elektrode aufgebracht werden können. . · ·
Die polymere Membran wird dann mit einem zur Anquellung der Membran betätigten Lösungsmittelsystem so lange behandelt, daß die Membran zumindest soweit angequollen wird, daß die Kohlenwasserstoffkette in genügender Konzentration, wie nachfolgend beschrieben,in die Membran eingebaut'werden kann. Das Lösungsmittelsystem enthält neben einem geeigneten Lösungsmittel eine Kohlenwasserstoffverbindung mit einer reaktiven Stelle, die sich vorzugsweise am Ende der Kohlenwasserstoff kette oder in dessen Nähe befindet. Als Lösungsmittel zum Anquellen der polymeren Membran dienen vorzugsweise solche, die durch Trocknen des Polymeren ohne weiteres entfernt werden können. So werden Lösungsmittel mit geringeren Molekulargewichten im allgemeinen gegenüber solchen mit höheren Molekulargewichten bevorzugt. Wie im nachfolgenden angegeben ist, wird bevorzugt, daß das Lösungsmittel einen niedrigeren Siedepunkt hat und leichter abgedampft wird als die Kohlenwasserstoff verbindung mit einer reaktiven Stelle. Eine typische Lösungsmittelraischung für PVC umfaßt Petr.oläther mit einem Siedebereich von 30 bis 60 C und Toluol. Andere Lösungsmittel oder Mischungen derselben können zum Anquellen von PVC oder
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anderen Polymermaterialien benutzt werden, diese sind jedoch' dem Fachmann bekannt oder sie können durch einfache Versuche ermittelt werden.
Eine typische Kohlenwasserstoffverbindung· mit einer reaktiven Stelle ist n-Decanol. Weitere im Rahmen der Erfindung besonders brauchbare Verbindungen sind n-Hexanol, n-Decylamin, n-Hexyl-amin, n-Decansäure und dergleichen Verbindungen mit beweglichem Wasserstoff. . ;
Nach Tränken der polymeren Membran mit dem Lösungsmittelsystem für eine ausreichend lange Zeitdauer zur Herbeiführung des erforderlichen Quellungsgrades wird die Membran, bei einer geeigneten Temperatur zur Entfernung des Lösungsmittels ohne Abtrennung wesentlicher Mengen der Kohlenwasserstoff verbindung mit der reaktiven Stelle getrocknet. Wenn Petroläther, Toluol und Lösungsmittel von ähnlichem Siedebereich benutzt werden, liegt eine typische Trockentemperatur bei etwa 50 bis 100 C zweckmäßigerweise 50 bis 60 C (vorzugsweise unter vermindertem Druck). Die Entfernung des Lösungsmittels liefert eine Membran mit einer geringen Konzentration an anhängenden Kohlenwasserstoffketten, von denen jede eine reaktive Gruppe, wie beispielsweise Hydroxyl-, Amin- oder Carboxylgruppe, aufweist. .
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Die Auswahl des Lösungsmittels (und damit seines Siedepunkts) und der anzuwendenden Drucke bei seiner Entfernung erfolgt unter Berücksichtigung der Natur und Eigenschaften der Membran und des Kohlenwasserstoffs. Für die hier benutzten Polymeren sind Lösungsmittel/von denen sie angequollen werden, bekannt.
Anschließend an die Anfügung der Kohlenwasserstoffkette. an die- polymere Membran kann eine Serie von Behandlungen zur Erzielung einer spezifisch reaktiven Membran/d.h. einer Mebran mit der Fähigkeit zum Einfang einer spezifischen Verbindung,beispielsweise eines Proteins, eines Enzyms oder eines Mono- oder Polysaccharids, wie bei einer immunochemischen Reaktion folgen. ·
Es ist zu bemerken, daß die Kohlenwasserstoffkette mit einer geeigneten spezifischen reaktiven Gruppe versehen werden kann, bevor sie in die Membran eingeführt wird (in diesem Falle sollte natürlich sichergestellt werden, daß die ' Gruppe eine genügende Freiheit zur Entfaltung ihrer Reaktivität besitzt - vorzugsweise durch Sicherstellung, daß sie nicht weniger als etwa 4 bis 6 Kohlenstoffatone von der Membran entfernt ist) oder aber die Gruppe kann in die Kette nach deren Anfügung an die Membran eingeführt bzw. eingebaut werden. Spezifische reaktive Gruppen können durch Kontakt der Membran mit einem geeigneten Material erhalten werden, das zur · Reaktion mit der Kohlenwasserstoffkette zur Herbei-
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führung der erforderlichen spezifischen Aktivität hefähigt .ist oder es kann die Anwendung einer verknüpfenden Gruppierung notwendig sein, um die. reaktive Gruppe an der Kette zur Bindung einer geeigneten spezifischen reaktiven Gruppe zu befähigen. Derartige Alternativen ergeben sich dem Fachmann ohne weiteres, und die Auswahl der geeigneten Sequenz (Arbeitsfolge wird im Hinblick auf die Eigenart der verschiedenen beteiligten Materialien und Gruppen getroffen werden.
So kann die Anwendung einer verknüpfenden Gruppierung für Protein zu den folgenden Arbeitsschritten führen: Nach dem Trocknen der polymeren Membran, wird diese in eine Lösung getaucht, die eine Verbindung mit einer spezi f< .·. -h -h protein-reativen Stelle und einer weiteren reaktiven Stelle enthält, die mit der reaktiven Gruppe der nun der Membran angefügten Kohlenwasserstoffkette reagieren kann. Wenn die reaktive Gruppe der Kohlenwasserstoffkette beispielsweise eine Hydroxylgruppe ist, so kann als typische proteiri-reaktive Verbindung ein Epichlorhydrin angewandt werden, wodurch eine verknüpfende Gruppierung mit Epoxyd und Äther gebildet wird. Andere Kohlenwasserstoffmoleküle können in die Membran eingeführt werden,wie beispielsweise aliphatische Amine, vorzugsweise primäre und sekundäre Amine, earboxylhaltige aliphatische Verbindungen und dgl., und diese können zur Reaktion mit Epichlorhydrin oder einem Bis-Epoxyd befähigt sein, in dem ein Oxiranringpaar für eine Umsetzung vorhanden ist. Er-
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wünschtermaßen sollte keine Wahrscheinlichkeit für eine Vernetzung zwischen einem Paar von anhängenden Gruppen bestehen, die an der Membranoberfläche hängen.
Eine geeignete Behandlungsserie für einen an einer polymeren Membran hängenden (bzw. von dieser herabhängenden) aliphatischen Alkohol wird nachfolgend skizziert:
Membran /, ÖR + Cl-CH2CH-CH '—
. ./aliphatischen Alkohol Epich^rhydrin
: ν
0-CH9-CH-CH + HCl
ν--
■-.·: J J..I jCI
Proteine mit Aminogruppen sind in der Lage, mit der Oxyrangruppe zu reagieren, die der Membran angefügt ist,unter Bildung einer Membran.mit einem immobilisierten Protein, das zum Einfang eines spezifischen Proteins in einer Reaktion vom immunochemisehen Typ befähigt ist. .
Zu weiteren Techniken zur Herstellung einer proteinimmobilisierenden Membran gehören:
(a) Thiophosgen- oder Isocyanatkopplung
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Membran /»——-NH2 + CSCl2
/aliphatisches Amin . · Phosgen
-N=C=S 2 HC Ι
Α /
N=C=S
(b) Azo-Kupplung
P-NH.
Protein· ./
-N-C-N-P -. ■ H . M
Membran
V:
NH2 / ■ aliphatisches Amin
c*o.
NO2 ' ·
para-Nitrobenzoy!chlorid
/
■ /
N-C- f-N
H|l U
+ ■
0. NO.
Nä-triumthiosulfat
N-C-f^ +.
Q NH,
NaNO.
(HCl)
η Ii U.
0., N=NH Protein
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Ein weiteres Proteinkupplungssystem umfaßt die Erzeugung einer Diimidverknüpfung zwischen der Kohlenwasserstoffkette und einem Proteinmolekül; eine aliphatische Verbindung mit einer Carboxylgruppe wird mit Carbodiimid umgesetzt, dessen Reaktionsprodukt mit einem geeigneten Protein zur Reaktion gebracht wird.
Nach Umsetzung der protein-reaktiven verknüpfenden Verbindung ( d.h. der eine immobilisierende Gruppe enthaltenden Verbindung wie z.B. Epichlorhydrin)mit dem beweglichen Wasserstoff der von der Membranoberfläche herabhängenden Kette zur Bildung der proteinverknüpfenden Gruppierung wird diese vorzugsweise gewaschen und in eine Lösung gebracht, die das zu immobilisierende Protein enthält. Zimmertemperatur ist eine bevorzugte Reaktionstemperatur und der Ablauf der Reaktion über ein bis zwei Tage wird im allgemeinen bevorzugt. Die Reaktion erfolgt im allgemeinen in einem leicht basischen Medium.
Nach Anfügung des Proteins erfolgt eine Behandlung zum Fortspülen von Resten nicht-umgesetzter Materialien und ferner eine Umsetzung mit einer Verbindung zur Neutralisation irgendwelcher nicht-umgesetzter protein-reaktiver d.h. immobilisierender Gruppen, die nach Reaktion mit dem Proteinmolekül verblieben sind. (Nicht-umgesetzte protein-reaktive Gruppen haben die Tendenz, polar zu sein und sie sind ebenfalls unerwünscht, da sie unspezifisch mit Proteine^ reagieren und
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bei einem Proteinnachweis fehlerhafte Ergebnisse liefern können) .
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im allgemeinen die Verwendung einer Kohlenwasserstoffverbindung bevorzugt/die eine so große Kettenlänge hat, daß eine gewisse Entfernung der reaktiven Gruppe von der Membranoberfläche ernßglictfc wird. Im allgemeinen hat die erfindungsgemäß angewandte Kohlenwasserstoffverbindung, zumindest 6 Kohlenstoff atome in der Hauptkette. Bevorzugt werden Kettenlängen,bei denen die Hauptkette der Kohlenwasserstoffverbindung etwa 8 bis 12 Kohlenstoff atome enthält und auf alle Fälle wird die Kettenlänge vorzugsweise so gewählt, daß die spezifische reaktive Gruppe von der Membranoberfläche um zumindest At vorzugsweise zumindest.6 oder sogar 8 Kohlenstoffatome entfernt ist. Wenn eine protein-reaktive Verknüpfende Verbindung,die damit zur Reaktion gebracht .wird, eine bedeutende Kettenlänge besitzt, so daß die am Ende gebildete protein-reaktive Gruppe von der Oberfläche um zumindest 6 Kohlenstoffatome entfernt hängt, muß die Kettenlänge des Kohlenwasserstoffs mit so lang sein.
Die erfindungsgemäßen Membranen sind in der Weise besonders nützlich, daß sie in Vorrichtungen zum qualitativen und vorzugsweise quantitativen Nachweis der Anwesenheit einer speziellen Verbindung in einer gegebenen Mischung,wie z.B. einer die Verbindung enthaltenden Lösung/ benutzt werden können.
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Eine Beschichtung oder Hülle aus der eine Kohlenwasserstoff kette mit einer reaktiven Gruppe enthaltenden hydrophoben polymeren Membran wird auf der Meßelektrode (der "Irnmunoelektrode" ) in einer Dicke von etwa 10 bis 50 /a gebildet, wobei Dicken von etwa 20 bis 40 μ besonders bevorzugt werden. Vorzugsweise ist die Membran nicht dicker als 100 μ und nicht dünner als 5 ^u. Ein Protein oder eine andere geeignete Verbindung eines immunochemischen Paares wird in.bzw. an der . Membran immobilisiert· Die Meßelektrode wird in Verbindung mit einer Bezugselektrode verwendet. Die beiden Elektroden werden in eine Mischung,typischerweise eine Lösung/eingetaucht, die ein Protein oder eine andere Verbindung des zu identifizierenden Typs enthält. Die Meßelektrode und die Bezugselektrode werden mit einem Meßgerät verbunden, das auf sehr geringe Änderungen des elektrischen Potentials anspricht. Beim Einfang des speziellen Proteins durch die Meßelektrode ändert sich das elektrische Potential an der Polymer/Lösungsgrenzfläche. Diese geringe Änderung wird vom Meßgerät nachgewiesen, das in der elektrischen Schaltung eine hohe Impedanz besitzt und die Anwesenheit der Verbindung somit anzeigt. Durch Eichung kann das Meßgerät für eine quantitative Bestimmung der in der Lösung anwesenden Verbindungsmenge verwendet werden.
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Die Bezugselektrode kann aus irgendeinem von einem weiten Bereich von geeigneten Elektrodenmaterialien bestehen, von denen viele bekannt sind, obgleich gefunden wurde, daß es vorteilhaft ist/als Bezugselektrode eine zweite Immurioelektrode zu verwenden, die mit der Meßelektrode im wesentlichen identisch ist,nur daß die spezifischen reaktiven Stellen durch ein geeignet reaktives Blockierungsmittel blockiert sind, so daß die Bezugselektrode nicht mehr auf das zu prüfende spezielle Material anspricht. Sie spricht dagegen(wie die Meßeiektrode) auf eine nicht-selektive AJaorption anderer Moleküle der Testlösüng an,so daß der Effekt einer solchen nicht-selektiven Adsorption/im Falle daß sie auftritt/kompensiert werden kann; durch Messung.des Potentials einer aktiven Meß-Immunoelektrode gegenüber dem Potential einer identischen Bezugs-Immunoelektrode mit blockierten Bindungsstellen kann der Einfluß nicht-spezifischer Wechselwirkungen wirksam ausgeschaltet werden'.
Beispiel 1 . .
Eine proteinimmobilisierte Membran wurde durch Tauchbeschichtung der Elektrode in Polyvinylchloridlösung auf einer Platinelektrode gebildet. Die Beschichtung wurde getrocknet und hatte eine Dicke von etwa 25 μ.
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Die mit.Polyvinylchlorid beschichtete Elektrode wurde 3 Stunden lang bei Zimmertemperatur in eine Lösungsmittellösung getaucht. Das Lösungsmittel wurde durch 4,5 Volumenteile Petroläther und 4,5 Volumenteile Toluol gebildet und enthielt 1; Volumteil des Kohlenwasserstoffs (bzw. der Kohlenwasserstoff kette von) n-Decanöl. Die Elektrode wurde dann etwa 16 Stunden lang in einen Vakuümofen von 50 C gebracht.
Die getrocknete Elektrode wurde 2 Stunden lang bei etwa 60°G in eine Lösung getaucht, die 10 % Epichlorhydrin in 1 molarer Natriumhydroxydlösung enthielt. Die Elektrode wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und etwa 48. Stunden lang bei Zimmertemperatur in eine 0,5 molare Natriumbicarbonatlösung mit dem Protein Koncanavalin A gebracht.
Die Meß-Immunoelektrode wurde dann aus der Lösung entfernt und mit 0,5 molarer Bicarbonatpufferlösung sowie, mit 0,1 molarem Kaliumhydrogenphthalatpuffer bei einem pH von 3,0 mit 1 molarem Natriumchloridgehalt und dann mit destilliertem Wasser und schließlich mit 0,1 molarer Lösung von Tris-(hydroxylmethyl)-aminomethan-Puffer mit einem pH von 7,8 mit einem Gehalt an 0,5 molarer Äthanolaminlösung gewaschen. (Das Athanolamin wurde zur Blockierung von irgendwelchen nicht-umgesetzten Epoxygruppen verwendet).
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Die Meßelektrode wurde dann über ein empfindliches Meßgerät mit einer Bezugselektrode verbunden. Das verbindende System zwischen den beiden Elektroden sollte im allgemeinen eine hohe Impedanz besitzen. Von Koncanavalin A ist.bekannt,. daß es gewisse verzweigte Polysaccharide,die nicht-reduzierende alpha-D-Hexapyranosyl- oder beta-p-Fructofuranosylendgruppen enthalten, selektiv aisfällt. Hefe-Mannan gehört zu dieser Gruppe und ist als am reaktivsten bekannt. Das Ansprechen einer Koncanavalin A Immunoelektrode auf unterschiedliche Hefe-Mannankonzentrationen bei pH 6,0 und 3,5 ist in Fig·. 1 dargestellt. Wie man sieht,ändert sich das Potential des Systems mit der Konzentration der Hefe-Mannanlösung. Dagegen wird keine Potentialänderung beobachtet, wenn eine Agarlösung zu der gemessenen Lösung hinzugegeben wurde. Agar ist ein PoIysaccharid, das mit Koncanavalin A nicht reagiert. Das Ausbleiben einer Änderung der elektrischen Eigenschaften des Systems bei der Zugabe von Agar besagt, daß die Selektivität des . Koncanavalins A trotz seiner Immobilisierung an der hydrophoben Membran erhalten bleibt.
Beispiel 2
Ein weiters Beispiel für die spezifische Eigenart der Immunoelektrode wird in Fig. 3 veranschaulicht.
Eine Immunoelektrode wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Mit den anhängenden Expoydgruppen würde Kanirichen-
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Antihuman-7S-gamma-Globulin umgesetzt. Die Immunoelektrode wurde dann in eine Lösung von Human-7S-gamma-Globulin bei pH 5,QO getaucht,deren Konzentration verändert wurde. Die Konzentrationsänderung wurde elektrisch nachgwiesen.
Man weiß, daß die immunochemiche Reaktion zwischen Antihuman-7S-gamma-Globulin vom Kaninchen und Human-7S-gamma-Globulin bei pH 7,8 nicht auftritt. Wenn die immobilisiertes Antihuman-7S-gamma-Globulin vom Kaninchen enthaltende Immunoelektrode in eine Lösung von Human-7S-gamma-Globulin getaucht wurde, konnte (unter diesen Bedingungen) kein elektrisches Ansprechen beobachtet werden. · .
Die immunocheitiischen Reaktionen blieben erhalten j auch wenn eine Verbindung auf einer hydrophoben polymeren Membran immobilisiert war.
Das bevorzugte Elektrodenmaterial ist Platin, obgleich irgendwelche anderen geeigneten leitenden Materialien, und zwar entweder Metalle wie z.B. Kupfer oder Silber oder Nicht-Metalle wie z.B. Kohlenstoff angewandt werden können. Die Elektrode kann von beliebiger geeigneter Gestalt wie z.B. ein Stfeb Draht oder. Blech sein» Die nicht von der Membran.bedeckten oder umhüllten Bereiche der Elektrode sollten erwünschtermaßen isoliert sein, was zweckmäßigerweise durch anderweitige Umhüllung der freiliegenden Teile der Elektrode
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und (wo angemessen)ihrer zugehörigen Zuleitungen mit einem geeigneten Isoliermaterial erreicht wird; bei Platin wird beispielsweise eine Glasisolierung bevorzugt, obgleich andere Materialien wie z.B. Polytetrafluoräthylen angewandt werden können.
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Claims (15)

Patentansprüche
1. Spezifisch reaktive Membran, gekennzeichnet durch ein hydrophobes organisches polymeres Substrat mit anhängenden (im wesentlichen) Kohlenwasserstoffketten, die mit einer chemischen Verbindung spezifisch reaktive Gruppen tragen.
2. Hydrophobe proteinimmobilisierende Membran, gekennzeichnet durch:
(a) ein hydrophobes polymeres Substrat und
(b) partiell in der Oberfläche des polymeren Substrats absorbierte Kohlenwasserstoffketten, die eine protein-reaktive Gruppe umfassen.
3. Membran nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest einige der protein-reaktiven Gruppen ein Proteinmolekül enthalten.
4. Membran nach Anspruch 3, dadurah gekennzeichnet, daß nicht mit einem Proteinmolekül umgesetzte protein-reaktive Gruppen ein reaktionsblockierendes Molekül enthalten.
5. Membran nach Anspruch 2,3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die protein-reaktive Gruppe durch ein Epoxyd gebildet wird.
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6. Membran nach einem der vorangehenden Ansprüche , dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenwasserstoffkette zumindest sechs linear mit der reaktiven Gruppe verbundene Kohlenstoffatome enthält. ■
7. Membran nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das organische polymere Substrat durch organische Lösungsmittel, insbesondere durch aliphatische Lösungsmittel, quellbar ist.
8. Membran nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die protein-reaktive Gruppe durch das Reaktionsprodukt eines eine Kupplungsstelle aufweisenden protein-reaktiven Molküls mit einer Kohlenwasserstoffverbindung gebildet wird, die eine reaktive Stelle aufweist, welche mit der Kupplungsstelle der protein-reaktiven Verbindung reagiert.
9. Membran nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das protein-reaktive Molekül Epichlorhydrin ist.
10. Membran nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß d^e Kohlenwasserstoffverbindung ein aliphatischer Aiko- hol mit zumindest 6 Kohlenstoffatomen in der Hauptkette und vorzugsweise n-Decanol ist.
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11. Elektrische Potentialdiffercnzen messende quantitativ arbeitende Meßvorrichtung zum Nachweis von mit einem immobilisierten Protein unter Ausnutzung einer immunochemischen Reaktion reaktionsfähigen.Verbindungen, gekennzeichnet durch:
(a) eine Bezugselektrode und
(b). eine reaktive Elektrode mit:
(1) einem Leiter mit hoher elektrischer Leitfähigkeit
(2) einer den Leiter umhüllenden bzw. einfassenden hydrophoben polymeren Membran, auf der reaktive Gruppen vorhanden sind, die mit der nachzuweisenden Verbindung spezifisch reagieren und mit einer partiell in der Membranoberfläche absorbierten .Kohlenwasserstoffkette verbunden sind und
("c) elektrische Leitungen zur Verbindung der Bezugselektrode und der Meßelektrocje über ein für sehr leichte Änderungen des elektrischen Potentials empfindliches Meßgerät.
12. Verfahren zur Herstellung einer hydrophoben proteininjmobilisieren polymeren Membran mit anhängenden protein-reaktiven Gruppen, gekennzeichnet durch:
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(a) Behandlung eines hydrophoben polymeren Substrats mit einem Lösungsmittelsystem, das ein zur Anquellung des Polymersubstrats befähigtes Lösungsmittelsystem und eine aliphatische Verbindung mit . einer reaktiven Gruppe umfaßt,die zumindest 6 Kohlenstoffatome von einem Ende derselben entfernt ist;
(b) Trocknen des lösungsmittelbeladenen polymeren Substrats zur im wesentlichen vollständigen Entfernung, des Lösungsmittels unter Bildung eines Substrats mit einer partiell in der Oberfläche absorbierten aliphatischen Kette, die eine reaktive Gruppe auf- · weist und
(c) Umsetzung einer protein-reaktiven Verbindung mit reaktiver Gruppe mit der (reaktiven Gruppe der) aliphatischen Kette unter Bildung eines Substrats mit daran hängender proteiri-reaktiver Gruppe. .
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein mit spezifischer Antikörper-Antigenreaktivität mit der protein-reaktiven Gruppe umgesetzt wird, zur Bildung eines Substrats mit anhängendem immobilisierten Protein.
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14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung mit nicht-umgesetzten protein-reaktiven Gruppen zur Blockierung weiterer Reaktionen derselben umgesetzt wird. .
•
15. Verfahren zum Nachweis einer Verbindung in einer die Verbindung enthaltenden Mischung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vorrichtung nach Anspruch 11 mit der Mischung in Kontakt bringt und Änderungen der elektrischen Ladung an der Oberfläche der polymeren Membran nachweist.
16. Verfahren zum Nachweis einer Verbindung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vorrichtung nach Anspruch 11.mit einer die Verbindung enthaltenden Mischung in Kontakt bringt, die Änderungen der elektrischen Ladung an der Oberfläche der polymeren Membran nachweist und diese Änderungen mit einem Standard zur Ermittlung der Konzentration der Verbindung in der Mischung vergleicht.
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