CN112501121A

CN112501121A - 一种循环肿瘤细胞的基础培养基和培养方法

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Publication number: CN112501121A
Application number: CN202011333758.9A
Authority: CN
Inventors: 吴诗扬; 刘志明; 许嘉森; 黄洁芬; 曾杰
Original assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2020-11-24
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2040-11-24
Also published as: CN112501121B

Abstract

本发明涉及一种循环肿瘤细胞的基础培养基和培养方法。本发明培养基加入了多种复配成分,包括经灭活后的玫瑰褐链霉菌发酵液。玫瑰褐链霉菌菌株发酵液中的次级代谢产物可作为细胞生长的营养成分促进细胞增殖，同时其产生的抑菌成分可有效抑制细胞培养基中的细菌，减少细胞培养基中抗生素的使用，可在无需额外添加血清的情况下，使得细胞生长状态良好，其在降低培养成本的同时，减少因使用不同批次血清而产生的可能培养的差异问题，经济高效地同时扩大了其应用场景。同时使原代肿瘤细胞可以在体外大量，无限地传代培养，为肿瘤药敏试验的展开提供大量的细胞，为细胞模型的建立创造了可能性。

Description

一种循环肿瘤细胞的基础培养基和培养方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体是涉及一种循环肿瘤细胞的基础培养基和培养方法。

背景技术

1869年，澳大利亚籍医生Ashworth首次提出循环肿瘤细胞(Circulating TumorCell，简称CTC)的概念。1976年Nowell将CTC的定义修正为：来源于原发肿瘤或转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力并入侵通过组织基质进入血管的肿瘤细胞。目前CTC是指存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。

CTCs可用于癌症诊断和癌症状态的监测，是追踪肿瘤细胞转移的关键。临床研究证明，CTCs与多种癌症的疾病进展相关。因此，CTCs检测对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。

近年来CTCs检测技术不断发展，由于不同的富集和检测方法，在临床实践中CTCs的检测方法尚未标准化，其主要应用仍局限于简单的计数。虽然CTCs计数对癌症的早期诊断和临床治疗具有很大的指导价值，在检测方面却面临诸多困难与挑战。首先外周血中的CTCs数目极为稀少(每毫升血约含有1-100个)，这要求所用检测方法能高效准确地从大量非目标细胞中检测出极少的目标细胞。稍有偏差，对检测结果影响较大，易产生偶然性。其次，研究表明CTCs具有较大的异质性，因为进入外周血的CTCs已发生部分或完全的上皮-间质转化，而当前的检测方法几乎不能区分CTCs亚群之间的差异，也不能明确具有形成微转移或转移能力的CTCs来自哪一个亚群。最后，由于外周循环的剪切力、免疫系统攻击以及细胞附着和细胞-基质连接丧失，导致血液中的大部分CTCs处于凋亡状态，仅有一小部分具有高度活性与转移潜能的CTCs能够在血液循环中生存并发生远端器官的转移。这一部分极可能是真正具有临床意义、对治疗具有重要价值的CTCs。而这些仅通过对CTCs进行简单计数是无法得知的。

因此，对极少数目的CTCs实现有效的体外扩增将可突破这一瓶颈。目前关于体外培养CTCs的文献报道非常有限，其原因可能在于细胞难以富集，培养条件不当等，故亟待发展一种高效温和的CTCs富集方法，同时采用新的体外培养方法以有效实现CTCs的体外快速扩增，从而实现对其进行全面的分子与功能研究。这将更有利于提高检测结果的参考评估价值，辅助临床获取更为客观的检测结果，从而优化患者的治疗方案，有效提升治疗效率。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种循环肿瘤细胞的基础培养基，该基础培养基能够取代血清，并实现高效快速对循环肿瘤细胞的培养。

实现上述目的的技术方案如下。

一种循环肿瘤细胞的基础培养基，所述基础培养基中是RPMI1640/F12培养基加入有经灭活的玫瑰褐链霉菌的发酵液。

在其中一些实施例中，加入的玫瑰褐链霉菌的发酵液的量为1-20μg/ml(总浓度)，更优选的浓度范围为3-10μg/ml，更进一步优选为3-8μg/ml。

在其中一些实施例中，所述基础培养基中加入有5-10ng/mL碱性纤维生长因子FGF2、5-8μg/mL人重组胰岛素、0.8-1.2mM丙酮酸钠、8-12mg/L转铁蛋白、0.5-1mM的N-乙酰半胱氨酸、7-11mM的烟酰胺、0.5-0.7mg/mL牛磺酸、30-70U/mL青霉素以及30-70μg/mL链霉素，3-8μg/ml经灭活的玫瑰褐链霉菌的发酵液。

在其中一些实施例中，所述基础培养基中加入有8±1ng/mL碱性纤维生长因子FGF2、6±1μg/mL人重组胰岛素、1±0.1mM丙酮酸钠、11±1mg/L转铁蛋白、0.7±0.05mM的N-乙酰半胱氨酸、9mM的烟酰胺、0.6±0.05mg/mL牛磺酸、50±3U/mL青霉素、50±3μg/mL链霉素、5±1μg/ml经灭活的玫瑰褐链霉菌的发酵液。

在其中一些实施例中，所述基础培养基中加入有8ng/mL碱性纤维生长因子FGF2、6μg/mL人重组胰岛素、1mM丙酮酸钠、11mg/L转铁蛋白、0.7mM的N-乙酰半胱氨酸、9mM的烟酰胺、0.6mg/mL牛磺酸、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、5μg/ml经灭活的玫瑰褐链霉菌的发酵液。

在其中一些实施例中，所述RPMI1640/F12培养基是F12培养基和RPMI1640培养基按照1:0.8-1.2制备得到。

在其中一些实施例中，所述经灭活的玫瑰褐链霉菌的发酵液是以冻干粉的方式加入。

在其中一些实施例中，所述玫瑰褐链霉菌的发酵液冻干粉的制备包括如下步骤：

挑取菌株于种子培养基中进行种子发酵，28±1℃恒温振荡培养四天得到种子液；将所得种子液以6±0.5％接种量接种于已灭菌的ISPII培养基中，发酵培养12±1d，培养完成后，离心，分离发酵液上清，按固液比1:9-11加入活性炭，静态吸附后滤纸过滤；再进行滤膜过滤后，进行真空冷冻干燥，即得。

本发明的另一目的是提供一种循环肿瘤细胞的培养方法。

实现上述目的的技术方案如下。

1)将原代肿瘤细胞加入到所述循环肿瘤细胞的基础培养基中，制备成原代肿瘤细胞细胞悬液；或将细胞系加入到所述循环肿瘤细胞的基础培养基中，混匀，再加入含有血清的所述循环肿瘤细胞的基础培养基制备成细胞系细胞悬液；

2)然后加入到所述循环肿瘤细胞的基础培养基中，37±2℃，5±0.5％CO2和饱和湿度的培养箱内培养，2±1天后换所述循环肿瘤细胞的基础培养基，去掉悬浮细胞，之后隔2±0.5天换液一次。

在其中一些实施例中，所述的技术方案如下：

1)将原代肿瘤细胞加入到所述的循环肿瘤细胞的基础培养基中，制备成原代肿瘤细胞细胞悬液；或将细胞系加入到所述的培养基中，混匀，再加入含有血清的循环肿瘤细胞的基础培养基制备成细胞系细胞悬液；

2)细胞悬液经离心去上清后与Matrigel基质胶混合静置，再往其加入500±10μL所述的循环肿瘤细胞的基础培养基，于5±0.5％CO₂、37±2℃的培养箱中培养，观察细胞生长情况，每2±1天更换培养基。

在其中一些实施例中，所述的技术方案如下：

1)将原代肿瘤细胞加入到所述的循环肿瘤细胞的基础培养基中，制备成原代肿瘤细胞细胞悬液；或将细胞系加入到所述的循环肿瘤细胞的基础培养基中，混匀，再加入含有血清的循环肿瘤细胞的基础培养基制备成细胞系细胞悬液；

2)将Matrigel基质胶冻融呈液态后，将其均匀涂抹到孔板底部，将培养板置于37±2℃恒温二氧化碳培养箱内静置20±2分钟，使液态Matrigel基质胶凝固为胶体；

3)将细胞悬液加入已预先铺胶的孔板中，37±2℃，5±0.5％CO2和饱和湿度的培养箱内培养，2±1天后换液，去掉悬浮细胞，之后隔2±1天换液一次。

本发明还提供一种循环肿瘤细胞的完全培养基。

一种循环肿瘤细胞的完全培养基，其由上述循环肿瘤细胞的基础培养基以及加入基础培养基中的血清组成。

本发明所述循环肿瘤细胞的基础培养基还可用于制备完全培养基。完全培养基可用于培养从待检样本中分离得到的循环肿瘤细胞(原代CTC)或直接用于培养肿瘤细胞系(成熟的肿瘤细胞株)，其由上述循环肿瘤细胞的基础培养基和血清组成，其中血清为待检样本经凝血离心后获取的上清液，经微孔滤膜过滤而得或商品化的胎牛血清。

本发明所述循环肿瘤细胞的基础培养基不仅适用于二维细胞培养，还可进一步在三维细胞培养中应用。在使用本发明的所述循环肿瘤细胞的基础培养基进行肿瘤细胞培养时，由于加入了玫瑰褐链霉菌(SR)发酵液(冻干粉)，菌株发酵液中的次级代谢产物可作为细胞生长的营养成分促进细胞增殖，同时其产生的抑菌成分可有效抑制细胞培养基中的细菌，减少细胞培养基中抗生素的使用，进一步在添加合适的其他辅助成分，可在无需额外添加血清的情况下，使得细胞生长状态良好，其在降低培养成本的同时，减少因使用不同批次血清而产生的可能培养的差异问题，经济高效地同时扩大了其应用场景。同时使原代肿瘤细胞可以在体外大量，无限地传代培养，为肿瘤药敏试验的展开提供大量的细胞，为细胞模型的建立创造了可能性。

本发明中的循环肿瘤细胞培养的基础培养基可用于CTCs的原代培养，确保CTCs能够在所述循环肿瘤细胞的基础培养基中快速增殖，而其它非肿瘤细胞在所述循环肿瘤细胞的基础培养基中生长状态不佳，由此，所述循环肿瘤细胞的基础培养基不仅起到了筛选、除杂的目的，还能同时富集CTCs，为后续下游的病理学研究及相关分子分型检测提供充足的细胞样本。同时本发明的所述循环肿瘤细胞的基础培养基还可用于肿瘤细胞系的快速培养。

本发明解决了原代肿瘤细胞在体外难以培养的问题，培养的肿瘤细胞可以用来筛选新型抗肿瘤药物或检测肿瘤细胞对不同抗肿瘤药物的敏感性。药敏检测实验可提高肿瘤患者用药准确性，为临床医师确定个体化治疗方案和开展个体化治疗提供科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1：实施例2中不同浓度玫瑰褐链霉菌发酵液冻干粉对HEK293细胞活性影响分析统计图；

图2：实施例4中不同培养基下细胞生长情况分析统计图；

图3：实施例4中4组培养基下的细胞生长曲线图；

图4：实施例4中实验组3培养下的细胞第一天和第七天培养状态对比图(100X)；

图5：实施例4中实验组11培养下的细胞第一天(100X)和第七天(200X)培养状态对比图；

图6：实施例5中实验组1-B组培养0-1d状态对比图；

图7：实施例5中实验组II-A组培养后的CTC，在20X镜下进行观察的检测结果图，A为明场图，B为合成图，C为DAPI图，D为EpCAM-PE；

图8：实施例6使用不同培养基三维培养后的细胞状态对比图(100X)，A为本发明培养基三维培养后的细胞状态，B为对比培养基三维培养后的细胞状态；

图9：实施例6中使用本发明培养基培养后的细胞检测图(400X)，A为2D培养，B为3D培养；

图10：实施例6中使用对比培养基培养后的细胞检测图(400X)，A为2D培养，B为3D培养。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本申请中使用的引物和探针可以采用本领域公知的标准技术制备。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1玫瑰褐链霉菌发酵液冻干粉制备

一、菌种来源

购自中国工业微生物菌种保藏管理中心：玫瑰褐链霉菌(Streptomycesroseofuscus，菌种保藏编号：ACCC40123(平台编号：bio-52663)，下文按实验室简称SR表示)，已知其可用于抑制革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和丝状真菌。

二、培养基制备

1)种子培养基(g/L)：

葡萄糖20.0g，蛋白胨6.0g，NaCl10.0g，pH值7.0。

2)ISP2培养基(国际链霉菌规划会议拟定培养基)：

酵母提取物4.0g，麦芽提取物10.0g，葡萄糖4.0g，溶解后调节pH并定容至1.0L，经115℃高压(1.034×105Pa)蒸汽灭菌30分钟后(葡萄糖高温高压下会分解为糖酸有害微生物的培养，采用115℃30min可在消毒灭菌的同时，不分解葡萄糖)，4℃保存备用。

三、菌种复苏及发酵液冻干粉制备

挑取适量菌株于种子培养基中进行种子发酵，28℃恒温振荡培养四天得到种子液。将所得种子液以6％接种量接种于已灭菌的ISPII培养基(固体GYM:葡萄糖4g,麦芽抽提物4g,酵母粉10g,碳酸钙2g,琼脂粉18g,加水至1000毫升,灭菌)中液体发酵，于旋转控温式摇床(28℃180rpm)发酵培养12d，培养完成后，使用台式高速冷冻离心机在4000rpm，4℃条件下离心10min，在无菌环境下分离发酵液上清，按固液比1:10加入活性炭，静态吸附3h后滤纸过滤。再进行0.22μm滤膜过滤后，进行真空冷冻干燥，获得相应成品。

实施例2玫瑰褐链霉菌发酵液冻干粉细胞毒性实验

将HEK293细胞(人胚肾细胞)接种于培养瓶后，使用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基(Gibco)，37℃、5％CO₂环境中培养12-72h。取对数生长期的细胞，用培养基重悬细胞悬液，调整密度为1×10⁵个/mL，采用多通道移液器将100μLPBS加到96孔培养板的外围孔中，在其余孔中加入100μL密度为1×10⁵个/mL的细胞悬液。细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中孵育24h，吸出培养基，每孔加入100μL含0μg/ml(对照组)、0.3125μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml浓度SR发酵液冻干粉的培养基。置于培养箱中继续培养24h后取出，吸去培养基，每孔加入含10％CCK-8试剂的培养基，继续培养4h，随后用酶标仪(ELX800全自动酶标仪，美国宝特仪器有限公司)在激发波长为450nm条件下，测定各孔吸光度值，以只加等量的培养液和CCK-8为空白孔。按照下述公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(实验孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)×100％。每个浓度设置6个平行孔，实验重复3次，相关实验结果记录并计算后填写于下表中。

表1

SR发酵液冻干粉	复孔1	复孔2	复孔3	复孔4	复孔5	复孔6	平均值
								0.3125μg/ml	0.912	0.909	0.907	0.923	0.916	0.914	0.9135
0.625μg/ml	0.924	0.922	0.931	0.923	0.933	0.921	0.9257
								1.25μg/ml	0.924	0.928	0.919	0.922	0.928	0.917	0.923
2.5μg/ml	0.948	0.934	0.942	0.938	0.929	0.936	0.9378
								5μg/ml	0.953	0.947	0.959	0.963	0.960	0.955	0.9562
10μg/ml	0.948	0.931	0.940	0.941	0.943	0.936	0.9398
								15μg/ml	0.901	0.923	0.908	0.897	0.915	0.911	0.9092
20μg/ml	0.904	0.901	0.913	0.905	0.908	0.903	0.9057
								对照组(0μg/ml)	0.921	0.937	0.930	0.923	0.932	0.925	0.928
空白组	0.211	0.209	0.233	0.217	0.223	0.231	0.2207

以上述平均值计算各组细胞存活率，重复三个细胞板结果如下：

表2

SR发酵液冻干粉	细胞存活率1	细胞存活率2	细胞存活率3	平均值
					0.3125μg/ml	97.9％	96.7％	97.1％	97.2％
0.625μg/ml	99.7％	98.8％	99.2％	99.2％
					1.25μg/ml	99.3％	99.5％	99.6％	99.5％
2.5μg/ml	102.1％	101.6％	102.4％	102％
					5μg/ml	104.0％	103.5％	104.2％	103.9％
10μg/ml	101.7％	100.8％	101.2％	101.2％
					15μg/ml	97.3％	96.7％	96.2％	96.7％
20μg/ml	96.8％	95.8％	95.9％	96.2％

结果统计如上表及图1所示。

结果显示含上述使用浓度范围内玫瑰褐链霉菌发酵液冻干粉的培养基对细胞毒性低，细胞存活率均大于95％，对细胞生长不具有抑制作用，部分浓度下细胞增殖明显。但在上述使用浓度范围内，综合使用效率和成本考虑，最适使用浓度范围为3-10μg/ml。

实施例3试剂盒的组成及使用步骤

本发明试剂盒主要包括一种循环肿瘤细胞基础培养基，其具体包括以下浓度的组分：RPMI1640/F12培养基、8ng/mL碱性纤维生长因子FGF2、6μg/mL人重组胰岛素、1mM丙酮酸钠(抗氧化剂)、11mg/L转铁蛋白、0.7mM的N-乙酰半胱氨酸、9mM的烟酰胺(维生素B3衍生物)、0.6mg/mL牛磺酸、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、5μg/ml玫瑰褐链霉菌(SR)发酵液(冻干粉)；其中RPMI1640/F12培养基是F12培养基(Gibco，货号：11765062)和RPMI1640培养基(Gibco，货号：A1049101)按照1:1制备的。

其中该基础培养基还可用于制备完全培养基。完全培养基可由基础培养基和血清组成，其中血清可为全血经凝血离心后获取，或商品化的胎牛血清。

本发明可应用于原代培养或细胞系培养，培养对象分别根据如下步骤得到：

原代肿瘤细胞：

(1)取待检血液样本5ml，加入循环肿瘤细胞富集保存液15ml，两者充分混匀；

(2)在4℃放置20min，600g离心5min，弃上清液。

(3)加入4ml PBS，涡旋混匀。

(4)样本过滤：将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；在本保存管中加入4ml PBS，洗涤管壁后抽滤液体。

(5)将滤膜转移至离心管中，加入3±2mL(按后续培养使用的培养板或培养瓶的规格进行适应性加入)上述循环肿瘤细胞基础培养基，经轻柔吹打，滤膜上的CTCs掉落至培养基中，形成细胞悬液。

肿瘤细胞系细胞：

(1)将装有干净蒸馏水的玻璃烧杯置于恒温水浴锅中，37℃恒温加热20分钟后，从液氮罐中取出相应细胞冻存管，迅速置于恒温水浴的玻璃杯中，并不时摇动加速融化，待冻存管中固体融化2/3以上后取出，先用脱脂棉擦干管壁后再对整管进行75％酒精灭菌，置于洁净工作台待用。

(2)用移液枪吸取冻存管中融化后的细胞悬液，加入到已含有4.5±2mL RPMI1640培养基的离心管中，轻柔吹打混匀。

(3)经1000rpm，5分钟室温离心后，弃去上清液，加入含10％胎牛血清的上述循环肿瘤细胞基础培养基重悬细胞后，形成细胞悬液。接种至培养瓶，37℃，5％CO₂和饱和湿度的培养箱内培养，2-3天后换液，去掉悬浮细胞，之后隔2天换液一次。

本发明可同时应用于二维细胞培养或三维细胞培养，

一、二维细胞培养：

将细胞悬液加入已预先加入上述循环肿瘤细胞培养基的培养瓶中，37℃，5％CO₂和饱和湿度的培养箱内培养，2-3天后换液，去掉悬浮细胞，之后隔2天换液一次。

二、三维细胞培养(胶上培养)：

1、铺胶

取Matrigel基质胶放冰箱4℃过夜，约12小时后，观察Matrigel基质胶由固态变为液态。用提前置于冰上预冷的吸头吸取60-100μL液态的matrigel，轻柔并迅速地均匀涂抹孔板底部，使其厚度均匀，避免产生气泡，然后将培养板置于37℃恒温二氧化碳培养箱内静置20分钟，使液态Matrigel基质胶凝固为胶体。

2、培养

将细胞悬液加入已预先铺胶的孔板中，37℃，5％CO2和饱和湿度的培养箱内培养，2-3天后换液(实施例3所述基础培养基)，去掉悬浮细胞，之后隔2天换液一次。

三、三维细胞培养(胶内培养)：

细胞悬液经离心去上清，浓缩至适宜浓度后，将40μL基质胶加入到富集得到的细胞中并使细胞悬浮于基质胶中。把含有细胞的基质胶滴到24孔板的中央，置于细胞培养箱中37℃静置15分钟，加入500μL实施例3所述循环肿瘤细胞基础培养基，于5％CO2、37℃的培养箱中培养，观察细胞生长情况，每2-3天更换培养基。

实施例4细胞生长曲线(培养基筛选优化)

NCl-H1975细胞株经常规复苏后，用含10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基，置于37℃、5％CO₂、相对湿度90％的培养箱中培养。取对数生长期细胞悬液，用上述循环肿瘤细胞基础培养基重悬细胞悬液，调整密度为2.5×10⁴个/mL，采用多通道移液器将100μLPBS加到96孔培养板的外围孔中，在其余孔中加入100μL细胞悬液。细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中孵育24h，吸出培养基，每孔加入100μL如下表所示的1-10组培养基。每组设置6个复孔为平行对照。将上述各组细胞同时培养1-7天后各取出相应培养板进行如下检测：吸弃培养基，PBS小心冲洗1-2次，每孔加入100μLTCA(三氯乙酸)，4℃固定1小时；弃掉TCA，去离子水冲洗2-5遍，干燥。每孔加入100μL0.2％SRB(磺基罗丹明B)染液，室温下染色30分钟，弃掉染液，用1％醋酸洗掉未结合的染液，干燥。每孔加入200μL pH10.5的10mmol/L非缓冲Tris碱液，置摇床低速震荡20分钟，在酶标仪A490波长下测量各孔OD值，记录分析，并绘制生长曲线。

为进一步确认本发明所述循环肿瘤细胞培养基配方中玫瑰褐链霉菌发酵液冻干粉对细胞培养的影响程度，设置如下实验。其中抗生素为市售双抗(Gibco)，货号：10378016。

表3

表4各实验组OD值(平均数)

根据上表实验数据绘制相应柱状统计图，据图分析可知，在适当的培养时间内，随着细胞生长时间的延长，实验组1-2、9-10以及11的细胞生长时间对细胞生长的影响均呈现先增加再微弱降低的趋势，实验组3-8在统计时间内细胞生长随时间的增加而增加，其中1-5d之内各实验组OD值增加迅速，细胞生长较快；5-7d时，OD值增加趋势较弱。而其中第11组，由于是加入的灭活玫瑰褐链霉菌的菌体冻干粉，而非玫瑰褐链霉菌的发酵液，其效果与实验组10差不多，尽管比实验组10稍好一些，但是依然不足于取代培养基中的胎牛血清的作用，而且当培养6d后，细胞贴壁数量减少，细胞内部会出现空泡、黑点，细胞扁平且形状不规则，明显老化(参见图5)。

综合分析实验组3-8的数据，可知，实验组5的生长状态最优，实验组3的生长状态略次之，但实验组3培养基中使用的SR发酵液冻干粉浓度为5μg/ml，而实验组5中使用的浓度为20μg/ml，为获得优良效果的同时节约资源，优选实验组3的培养基配方。

针对实验组1，3，9，进一步对比其生长曲线可知，实验组3的培养效果几乎与实验组1(含有血清及双抗组)一致并略优于实验组1，说明本发明培养基可有效替代传统培养基中胎牛血清的使用，从而进一步增加本发明培养基的实用性，并减少在细胞培养中因不同批次血清添加所带来的不确定性、不稳定性等问题。

NCl-H1975细胞在实验组9和实验组11以及实验组3培养1d后均可正常贴壁，当培养7d后，实验组9和实验组11的细胞贴壁数量较少，细胞扁平且形状不规则，明显老化；实验组3贴壁细胞数量明显更多，细胞内部很少会出现空泡、黑点，绝大部分细胞生长状态良好，参见图4。说明玫瑰褐链霉菌发酵液冻干粉为5μg/ml时作为肿瘤细胞体外培养环境更佳。

针对本发明所述循环肿瘤细胞培养基中其他组分的配比筛选步骤同上述一致，具体数据省略。将得到的最优使用浓度各组分进一步进行如下各实验组组合，以下仅摘选部分)，从而研究本发明培养基的最优配方。

表5

表6各实验组OD值(平均数)

根据上述表中记录实验结果分析可知，上述含有SR的培养基组合与常规培养基(RPMI1640/F12培养基，5％FBS，1％抗生素)培养相比，OD值均大于同条件下的常规培养基培养下的检测值，即表明其培养效果均优于常规培养基培养，进一步研究实验组2-5可发现，实验组2加入了促生长因子，实验组3相比于实验组2还加入了辅助组分，实验组4相比于实验组2、3还加入了双抗，而实验组4的OD值增长最大，说明加入的组分能够促进细胞生长繁殖。实验组2-4加入了玫瑰褐链霉菌(SR)发酵液，而实验组5中加入的是经灭活的SR，仅经灭活的SR可能是由于缺少次级代谢产物，导致其培养效果并不好，所以实验组5的OD值相比于其他实验组都低。总体来看，使用实验4组的培养基培养细胞效果最佳。

实施例5 CTCs培养

取乳腺癌患者的血液样本(I-III，各取3管5ml血液样本A-C)进行上述实施例3所述CTCs提取，对提取得到的细胞悬液进行计数后平均接种到含有等量本发明培养基及下述对比例培养基的24孔板中进行常规二维细胞培养，即除培养基不同外，其他培养条件均一致。将3组细胞同时培养7天，每天计数并记录。7天后根据申请人前期公开的专利文件(专利号：2016100442557)中所述检测试剂盒及检测步骤对其进行相应检测，拍照并记录相关实验数据。

培养条件对比：

A组样本使用培养基：本发明所述循环肿瘤细胞基础培养基；

本发明所述循环肿瘤细胞培养基由以下浓度的组分构成：RPMI1640/F12培养基，8ng/mL碱性纤维生长因子FGF2、6μg/mL人重组胰岛素、1mM丙酮酸钠、11mg/L转铁蛋白、0.7mM的N-乙酰半胱氨酸、9mM的烟酰胺、0.6mg/mL牛磺酸、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、5μg/ml玫瑰褐链霉菌(发酵液冻干粉)。

B组样本使用培养基：RPMI1640/F12培养基，5％FBS，1％抗生素；

C组样本使用培养基：RPMI1640/F12培养基、8ng/mL碱性纤维生长因子FGF2、6μg/mL人重组胰岛素、1mM丙酮酸钠(抗氧化剂)、11mg/L转铁蛋白、0.7mM的N-乙酰半胱氨酸、9mM的烟酰胺(维生素B3衍生物)、0.6mg/mL牛磺酸、1％抗生素。

表7样本I-III中的CTCs在培养基A-C中培养情况统计表

由于从样本中分离得到CTCs数目稀少，细胞生长物质弥散到细胞外的比例将是细胞内达到低于最小限度的浓度，此时细胞不能再增殖，培养液中的pH变大(碱性增强)，抑制细胞生长，细胞变圆不能贴壁，甚至引起细胞死亡等。因此出现了I-B组情况，其0-1d的生长情况如图所示，当细胞正常接种和贴壁后，随培养时间的增加，细胞数量逐渐减少至0，即产生细胞最终全部死亡的现象。

采用本发明基础培养基(即培养基A)进行培养的样本I-III组的CTCs，较采用培养基B、C相比，细胞增殖数量及速度都明显更具有优势，其中，培养基C即为未加入SR发酵液冻干粉的培养基A，其中生长的CTCs虽未出现细胞减少的现象，但细胞增殖速度明显较A组慢，且培养7天后得到的细胞均较A组少。

培养7d后的各组细胞，参考发明人在先发明中的CTCs相关检测试剂盒及检测步骤，进行检测，其中采用A组培养基培养样本II的CTCs经检测后如图7所示，表明分离得到的CTCs均为上皮型，培养后得到的CTCs也均为上皮型。其他样本检测步骤及方法相同。

实施例6 2D与3D细胞培养对比

本发明所述基础培养基由以下浓度的组分构成：RPMI1640/F12培养基，8ng/mL碱性纤维生长因子FGF2、6μg/mL人重组胰岛素、1mM丙酮酸钠、11mg/L转铁蛋白、0.7mM的N-乙酰半胱氨酸、9mM的烟酰胺、0.6mg/mL牛磺酸、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、5μg/ml玫瑰褐链霉菌(发酵液冻干粉)。

取NCl-H1975细胞株经复苏培养后进行计数，实验组分为3D组和2D组，细胞分别采用本发明基础培养基和常规培养基(即对照，RPMI1640/F12培养基，5％FBS，1％抗生素)，置于37℃、5％CO₂、相对湿度90％的培养箱中分别培养。取对数生长期细胞悬液，以4×10³个细胞/孔的浓度200μl接种于普通96孔板中，到期后弃旧培养基，PBS洗涤2次，加入0.25％胰酶消化，室温1-2分钟后显微镜下观察细胞形态变化，当观察到细胞间隙变大、贴壁细胞突起收缩时，弃去胰蛋白酶，加入培养基终止消化作用，吹打重悬细胞传代、回收细胞，为2D培养组。以200μl同样的浓度加到已铺好Matrigel的96孔板里(实施例3中三维培养法二)，到期后用胰酶消化并回收细胞，即为3D培养组。每组设置3个复孔为平行对照。取细胞根据发明人前期公开的专利文件(专利号：CN2015109198154)中所述检测试剂盒及检测步骤对其进行相应检测，拍照并记录相关实验数据。

结果参见图8，经分析可知，在使用本发明培养基进行肺腺癌细胞三维培养较对比培养基三维培养而言，细胞增殖率明显更高，且细胞成球更多，细胞生长状态更佳。

结果参见图9-10，经分析可知，使用本发明所述基础培养基采用不同培养方式培养得到的肺腺癌细胞进行相应细胞检测后，相关基因标志物的探针检测结果中荧光点分散均匀，三种染色荧光点均可准确读取，可便于直观判读，实验结果均能被正常检测。而采用对比培养基进行培养得到的相关细胞采用相同方法检测时，其二维培养的细胞检测结果正常，但采用其进行三维培养的细胞并未得到良好的检测结果，分析其产生原因可能是因为培养环境的不适应性，导致部分细胞基因异常，因而产生部分探针检测信号显著增强/减弱的现象。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种循环肿瘤细胞的基础培养基，其特征是，所述基础培养基中是RPMI1640/F12培养基加入有经灭活的玫瑰褐链霉菌的发酵液。

2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的基础培养基，其特征是，加入玫瑰褐链霉菌的发酵液的量为1-20μg/ml，优选为3-10μg/ml。

3.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的基础培养基，其特征是，所述基础培养基中加入有5-10ng/mL碱性纤维生长因子FGF2、5-8μg/mL人重组胰岛素、0.8-1.2mM丙酮酸钠、8-12mg/L转铁蛋白、0.5-1mM的N-乙酰半胱氨酸、7-11mM的烟酰胺、0.5-0.7mg/mL牛磺酸、30-70U/mL青霉素以及30-70μg/mL链霉素，3-8μg/ml经灭活的玫瑰褐链霉菌的发酵液。

4.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞的基础培养基，其特征是，所述基础培养基中加入有8±1ng/mL碱性纤维生长因子FGF2、6±1μg/mL人重组胰岛素、1±0.1mM丙酮酸钠、11±1mg/L转铁蛋白、0.7±0.05mM的N-乙酰半胱氨酸、9mM的烟酰胺、0.6±0.05mg/mL牛磺酸、50±3U/mL青霉素、50±3μg/mL链霉素、5±1μg/ml经灭活的玫瑰褐链霉菌的发酵液。

5.根据权利要求4所述的循环肿瘤细胞的基础培养基，其特征是，所述基础培养基中加入有8ng/mL碱性纤维生长因子FGF2、6μg/mL人重组胰岛素、1mM丙酮酸钠、11mg/L转铁蛋白、0.7mM的N-乙酰半胱氨酸、9mM的烟酰胺、0.6mg/mL牛磺酸、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、5μg/ml玫瑰褐链霉菌经灭活的发酵液。

6.根据权利要求1-5任一项所述的循环肿瘤细胞的基础培养基，其特征是，所述RPMI1640/F12培养基是F12培养基和RPMI1640培养基按照1:0.8-1.2制备得到。

7.根据权利要求1-5任一项所述的循环肿瘤细胞的基础培养基，其特征是，所述经灭活的玫瑰褐链霉菌的发酵液是以冻干粉的方式加入。

8.根据权利要求7所述的循环肿瘤细胞的基础培养基，其特征是，所述瑰褐链霉菌的发酵液冻干粉的制备包括如下步骤：

9.一种循环肿瘤细胞的二维培养方法，其特征是，包括以下步骤：

1)将原代肿瘤细胞加入到权利要求1-8任一项所述的循环肿瘤细胞的基础培养基中，制备成原代肿瘤细胞细胞悬液；或将肿瘤细胞系加入到权利要求1-8任一项所述的循环肿瘤细胞的基础培养基中，混匀，再加入含有血清的循环肿瘤细胞的基础培养基制备成肿瘤细胞系细胞悬液；

2)然后加入到权利要求1-8任一项所述的循环肿瘤细胞的基础培养基中，37±2℃，5±0.5％CO₂和饱和湿度的培养箱内培养，2±1天后换所述循环肿瘤细胞的基础培养基，去掉悬浮细胞，之后隔2±0.5天换液一次。

10.一种循环肿瘤细胞的三维培养方法，其特征是，包括以下步骤：

1)将原代肿瘤细胞加入到权利要求1-8任一项所述的循环肿瘤细胞的基础培养基中，制备成原代肿瘤细胞细胞悬液；或将肿瘤细胞系加入到权利要求1-8任一项所述的循环肿瘤细胞的培养基中，混匀，再加入含有血清的所述循环肿瘤细胞的基础培养基制备成细胞系细胞悬液；

2)细胞悬液经离心去上清后与Matrigel基质胶混合静置，再往其加入500±10μL的权利要求1-8所述的循环肿瘤细胞的基础培养基，于5±0.5％CO₂、37±2℃的培养箱中培养，观察细胞生长情况，每2±1天更换培养基；

或包括以下步骤：

1)将原代肿瘤细胞加入到权利要求1-8任一项所述的循环肿瘤细胞的基础培养基中，制备成原代肿瘤细胞细胞悬液；或将肿瘤细胞系加入到权利要求1-8任一项所述的循环肿瘤细胞的基础培养基中，混匀，再加入含有血清的所述循环肿瘤细胞的基础培养基制备成细胞系细胞悬液；

3)将细胞悬液加入已预先铺胶的孔板中，37±2℃，5±0.5％CO₂和饱和湿度的培养箱内培养，2±1天后换液，去掉悬浮细胞，之后隔2±1天换液一次。