CN112048470B - 一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，属于细胞培养技术领域。利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法包括：诱导分化iPSC至iPSC‑MSC并扩增iPSC‑MSC和制备iPSC‑MSC制剂，其中还包括iPSC‑MSC特性的鉴定和iPSC‑MSC制剂的质控。本发明制备的临床级别间充质干细胞制剂具备为各种病人的个体化需求提供来源无限、质量稳定、同质性高、相对可控的间充质干细胞来源等优势，实现规模产业化，同时具有临床应用市场前景广阔的特点。

Description

一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法。

背景技术

器官组织内及体外培养的间充质干细胞(Mesenchymal stem/stromal cell,MSC)都具有天然的高异质性，既是其发挥多重功能活性的基础，也是影响MSC实验重复性、MSC质量乃至临床疗效的限制因素，给标准化和规范化评估MSC治疗的安全性和有效性造成了更多的变数和困难。基于细胞重编程技术的人诱导多能干细胞(inducedpluripotent stemcell，iPSC)及相关研究，显著提升了对干细胞维持多能性和干性及其分子调控机理的理解，同时也提供一个无限的病人特异性个体化干细胞的来源。随着非整合iPSC诱导技术的改进和优化，目前已可获得不含病毒载体和致瘤基因c-myc的iPSC。iPSC-MSC仍具有iPSC的优势，可从个体皮肤成纤维细胞或各种组织细胞诱导而成，免除异体移植相关的排斥、疾病传输、伦理等相关问题；iPSC从原理上来说可以无限传代，故MSC的来源可以无穷无尽；理论上由单个iPSC细胞克隆衍生的MSC，其同质性更高。基于这些特点，iPSC可提供稳定可靠的适合各种病人个体化需求的无限MSC来源，可用于体外无限扩增的规模化制备和生产，最终产品的质量稳定、相对可控，针对特定的临床疾病和个体化需求，可达到最优的治疗效果。

然而，目前现有技术的缺陷及临床需要，关节软骨损伤和退行性疾病在细胞移植治疗和组织工程中间充质干细胞仍存在来源有限、质量不稳定、同质性不高的难题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，满足市场对质量稳定可靠、适合各种病人个体化需求的间充质干细胞来源的需求，建立体外无限扩增的规模化制备和生产技术。

本发明提供了一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，包括以下步骤：

1)当人iPSC于6孔板中长至80～90％时，更换iPSC-MSC诱导培养基进行培养8～12d，每2～3d换液一次，获得贴壁细胞，消化，得到iPSC-MSC单细胞；

2)将所述iPSC-MSC单细胞按8×10⁴cell/cm²接种至25cm²细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P0，更换iPSC-MSC生长培养基进行培养4～7d，每2～3d换液一次，消化，以4×10⁴cell/cm²接种至25cm²细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P1，在iPSC-MSC生长培养基中继续培养4～7d，每2～3d换液，消化，以2×10⁴cell/cm²接种至75cm²细胞培养瓶中，以后的每4～7d待细胞长至80～90％时，以1×10⁴cell/cm²接种至175cm²细胞培养瓶，以1:3～1:4传代，得到大量的iPSC-MSC-P3细胞；

所述iPSC-MSC诱导培养基为含体积浓度2～5％人源血小板裂解物、体积浓度1％100×微量非必需氨基酸溶液、体积浓度1％100×谷氨酰胺添加剂、1.0g/LD-葡萄糖的DMEM培养基；

所述iPSC-MSC生长培养基为含体积浓度2～5％人源血小板裂解物、体积浓度1％100×微量非必需氨基酸溶液、体积浓度1％100×谷氨酰胺添加剂、4.5g/LD-葡萄糖的DMEM培养基；

3)将采用临床级别的无血清Recovery^TMCell Culture Freezing Medium冻存液中按1×10⁶～1×10¹⁰个/mL的浓度分装所述iPSC-MSC-P3细胞，制备的间充质干细胞制剂保存于细胞库。

优选的，步骤1)或步骤2)中所述消化用酶为TrypLE^TMSelect；所述消化的时间为5～8min。

优选的，所述消化后进行离心；所述离心的转速为1000～1500rpm；所述离心的时间为3～7min。

优选的，步骤2)中所述培养的温度为36～38℃。

优选的，步骤1)中所述人iPSC的培养方法为将人iPSC细胞株接种于包被有10μg/ml人多能干细胞培养贴壁基质的6孔板中在iPSC培养基中于37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养5～7d，每天更换新鲜培养基。

优选的，每1000μL的所述人多能干细胞培养贴壁基质包括960μlCellAdhere^TMDilutionBuffer和40ul 250μg/ml的Vitronectin XF^TM。

优选的，所述iPSC培养基为TeSR^TM-E8^TMBasal Medium和25×TeSR^TM-E8^TMSupplement，两者体积比为24:1。

优选的，所述分装前，对iPSC-MSC特性进行鉴定。

所述iPSC-MSC特性的鉴定指标包括干细胞特异性抗原、成骨、成软骨和成脂分化能力。

优选的，所述干细胞特异性抗原的鉴定方法包括测定iPSC-MSC表面标志物；所述iPSC-MSC表面标志物包括CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD34^-、CD45^-和HLA-DR^-；CD73⁺、CD90⁺和CD105⁺表达均超过95％为阳性，CD34^-、CD45^-和HLA-DR^-表达小于1％为阴性。

所述成骨、成软骨和成脂分化能力的鉴定为利用商品化的成骨、成软骨、成脂分化诱导试剂盒进行iPSC-MSC成骨、成软骨和成脂诱导，并分别采用茜素红、甲苯胺蓝、油红O染色评估iPSC-MSC体外成骨、成软骨、成脂分化能力；茜素红、甲苯胺蓝、油红O染色均为阳性，iPSC-MSC具备体外成骨、成软骨、成脂多向分化能力。

优选的，还包括间充质干细胞制剂的质控。

按照国际细胞治疗协会和/或部分地参照国家食药监局的关于成体干细胞的部分标准，对细胞产品进行检定、评价，提出相关流程、技术和规范，均合格的为成品；

细胞产品的检定和评价指标包括细胞活性、细胞质量和添加物质量。

本发明提供的利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，是通过戒除异种血清产品无滋养层细胞的体系(以免除异源病菌和细胞的污染)从人诱导多能干细胞分化并扩增培养出间充质干细胞，与其他来源的间充质干细胞相比，具有来源无限、质量稳定、同质性高、相对可控等优势，可为各种病人的个体化需求提供可靠的间充质干细胞并能为临床研究相关疾病及靶向药物提供重要的细胞模型，其规模产业化和临床应用市场前景非常广阔。

附图说明

图1为本发明人诱导多能干细胞来源间充质干细胞过程中的不同时间点光镜下的形态；

图2是本发明人诱导多能干细胞来源间充质干细胞的表面标志物流式鉴定图；

图3是本发明人诱导多能干细胞来源间充质干细胞体外成骨、成软骨、成脂定向诱导分化图。

具体实施方式

本发明提供了一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，包括以下步骤：

1)当人iPSC于6孔板中长至80～90％时，更换iPSC-MSC诱导培养基进行培养8～12d，每2～3d换液一次，获得贴壁细胞，消化，得到iPSC-MSC单细胞；

2)将所述iPSC-MSC单细胞按8×10⁴cell/cm²接种至25cm²细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P0，更换iPSC-MSC生长培养基进行培养4～7d，每2～3d换液一次，消化，以4×10⁴cell/cm²接种至25cm²细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P1，在iPSC-MSC生长培养基中继续培养4～7d，每2～3d换液，消化，以2×10⁴cell/cm²接种至75cm²细胞培养瓶中，以后的每4～7d待细胞长至80～90％时，以1×10⁴cell/cm²接种至175cm²细胞培养瓶，以1:3～1:4传代，得到大量的iPSC-MSC-P3细胞；

所述iPSC-MSC诱导培养基为含体积浓度2～5％人源血小板裂解物、体积浓度1％100×微量非必需氨基酸溶液、体积浓度1％100×谷氨酰胺添加剂、1.0g/LD-葡萄糖的DMEM培养基；

所述iPSC-MSC生长培养基为含体积浓度2～5％人源血小板裂解物、体积浓度1％100×微量非必需氨基酸溶液、体积浓度1％100×谷氨酰胺添加剂、4.5g/LD-葡萄糖的DMEM培养基；

3)将采用临床级别的无血清Recovery^TMCell Culture Freezing Medium冻存液中按1×10⁶～1×10¹⁰个/mL的浓度分装所述iPSC-MSC-P3细胞，并保存于细胞库。

本发明当人iPSC于6孔板中长至80～90％时，更换iPSC-MSC诱导培养基进行培养8～12d，每2～3d换液一次，获得贴壁细胞，消化，得到iPSC-MSC单细胞。

在本发明中，所述人iPSC的培养方法优选为将人iPSC细胞株接种于包被有10μg/ml人多能干细胞培养贴壁基质的6孔板中在iPSC培养基中于37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养5～7d，每天更换新鲜培养基。所述iPSC培养基优选为TeSR^TM-E8^TMBasal Medium和25×TeSR^TM-E8^TMSupplement，两者体积比24:1。TeSR^TM-E8^TM Basal Medium和TeSR^TM-E8^TMSupplement共同组成一种低蛋白、无饲养层的TeSR^TM-E8^TM培养基，能够维持人类多能干细胞生长，均购自STEMCELL^TM TECHNOLOGIES公司。本发明对所述人iPSC细胞株的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的人iPSC细胞株即可。所述人iPSC细胞株购自Nuwacell公司，为Nuwacell^TM科研级hiPSC细胞株(RC01001-B)。每1000μL的所述人多能干细胞培养贴壁基质优选包括960μl CellAdhere^TMDilutionBuffer和40μl 250μg/ml的Vitronectin XF^TM。

在本发明中，所述iPSC-MSC诱导培养基优选为含体积浓度2～5％临床级人源血小板裂解物、体积浓度1％100×微量非必需氨基酸溶液、体积浓度1％100×谷氨酰胺添加剂、1.0g/L D-葡萄糖的DMEM培养基。相对于其他本领域的其他配方的诱导培养基的优势：临床级人源血小板裂解物包含所有细胞生长所必需的生长因子和蛋白质，是一种有效的、高蛋白的人类细胞培养和扩增的补充，可以减少异种免疫反应或传播朊病毒和人畜共患病的风险。本发明对所述诱导培养基的组分来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的临床、微量非必需氨基酸溶液、谷氨酰胺添加剂、D-葡萄糖和DMEM培养基即可。

在本发明中，人iPSC于6孔板中长至优选为80～90％时细胞边缘光滑清晰，细胞间隙紧致，无明显分化，呈典型鹅卵石状克隆，可在此阶段消化诱导。

在本发明中，所述消化用酶优选为TrypLE^TMSelect；所述消化的时间优选为5～8min，更优选为6～7min。所述消化后进行离心收集单细胞；所述离心的转速优选为1000～1500rpm；所述离心的时间优选为3～7min。iPSC-MSC单细胞表示由人iPSC诱导分化得到的MSC单细胞。

得到iPSC-MSC单细胞后，本发明将所述iPSC-MSC单细胞按8×10⁴cell/cm²接种至25cm²细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P0，更换iPSC-MSC生长培养基进行培养4～7d，每2～3d换液一次，消化，以4×10⁴cell/cm²接种至25cm²细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P1，在iPSC-MSC生长培养基中继续培养4～7d，每2～3d换液，消化，以2×10⁴cell/cm²接种至75cm²细胞培养瓶中，以后的每4～7d待细胞长至80～90％时，以1×10⁴cell/cm²接种至175cm²细胞培养瓶，以1:3～1:4传代，得到大量的iPSC-MSC-P3细胞。

在本发明中，所述iPSC-MSC生长培养基优选为含体积浓度2～5％人源血小板裂解物、体积浓度1％100×微量非必需氨基酸溶液、体积浓度1％100×谷氨酰胺添加剂、4.5g/LD-葡萄糖的DMEM培养基。所述培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃。

在本发明中，在制备得到iPSC-MSC-P3细胞后，优选对iPSC-MSC特性进行鉴定；所述iPSC-MSC特性的鉴定指标优选包括干细胞特异性抗原、成骨、成软骨和成脂分化能力。所述干细胞特异性抗原的鉴定方法优选包括利用流式细胞仪测定iPSC-MSC表面标志物；所述iPSC-MSC表面标志物包括CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD34^-、CD45^-和HLA-DR^-；CD73⁺、CD90⁺和CD105⁺表达均超过95％为阳性，CD34^-、CD45^-和HLA-DR^-表达小于1％为阴性。

所述成骨、成软骨和成脂分化能力的鉴定优选为利用商品化的成骨、成软骨、成脂分化诱导试剂盒进行iPSC-MSC成骨、成软骨和成脂诱导，并分别采用茜素红、甲苯胺蓝、油红O染色评估iPSC-MSC体外成骨、成软骨、成脂分化能力。茜素红、甲苯胺蓝、油红O染色均为阳性，表明iPSC-MSC具备体外成骨、成软骨、成脂多向分化能力。

得到筛选特性合格的iPSC-MSC-P3细胞后，本发明将采用临床级别的无血清Recovery^TMCell Culture Freezing Medium冻存液中按1×10⁶～1×10¹⁰个/mL的浓度分装所述iPSC-MSC-P3细胞，制备的间充质干细胞制剂保存于细胞库。

在本发明中，所述分装的浓度优选为1×10⁷～1×10⁹个/mL，更优选为1×10⁸个/mL。

在本发明中，优选还包括间充质干细胞制剂的质控：按照国际细胞治疗协会和/或部分地参照国家食药监局的关于成体干细胞的部分标准，制定干细胞制剂制备工艺的标准操作流程及每一过程的标准操作程序(SOP)并定期审核和修订。干细胞制剂的制备工艺包括干细胞的诱导制备、纯化、扩增和传代，培养基、辅料和包材的选择标准及使用，细胞冻存、复苏、分装和标记，以及残余物去除等。应对制剂制备的全过程，进行全面的工艺研究和验证，制定合适的工艺参数和质量标准，确保对每一过程的有效控制。对细胞产品进行检定、评价，提出相关流程、技术和规范，均合格的为成品。

细胞产品的检定和评价指标优选包括细胞活性、细胞质量和添加物质量。细胞活性检测采用不同的细胞生物学活性检测方法判断细胞活性及生长状况。细胞基本的质量要求是具备明确的细胞鉴别特征，无外源微生物的感染。添加物的质量要求是应明确其来源、批号、质量检定合格报告，并尽量采用国家已批准的可临床应用的产品。

细胞制剂的相关资料需建档并长期保存。

下面结合实施例对本发明提供的一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，包括如下步骤：

一、人iPSC常规培养：所述人iPSC细胞株购自Nuwacell公司，为NuwacellTM科研级hiPSC细胞株(RC01001-B)，将其接种于10μg/ml Vitronectin XF^TM(组成包括960μlCellAdhere^TMDilutionBuffer+40μl 250μg/ml Vitronectin XF^TM)包被的6孔板中，使用iPSC常规培养基(1920μl TeSR^TM-E8^TMBasal Medium+80μl 25×TeSR^TM-E8^TMSupplement)于37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养6d。每天更换新鲜的上述常规培养基继续培养。期间采用光学显微镜拍摄不同培养时间的人iPSC形态。结果见图1。未分化的人iPSC在分化前Day-2于6孔板中生长至70％紧凑的、具有较高核质比并具有突出的核仁、边界清晰的鹅卵石状多细胞克隆团；在Day 0于6孔板中生长至90％紧凑的、具有较高核质比并具有突出的核仁、边界清晰的鹅卵石状多细胞克隆团。

二、诱导分化iPSC为iPSC-MSC并扩增iPSC-MSC：当人iPSC在Day 0于6孔板中长至90％时(细胞边缘光滑清晰，细胞间隙紧致，无明显分化，呈典型鹅卵石状克隆)更换为iPSC-MSC诱导培养基(含5％PLT GOLD Human Platelet Lysate(Clinical Grade)+1％MEMNon-Essential Amino Acids Solution(100×)+1％GultaMAX^TM(100×)的DMEM basic(1×)[+]1.0g/L D-Glucose培养基)，每2d换液一次，培养持续4d，获得贴壁细胞，用TrypLE^TMSelect(1×)消化7min，然后在1500rpm离心5min，收集沉淀。以8×10⁴cell/cm²接种量接种至25cm²细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P0，并更换为iPSC-MSC生长培养基(含5％PLT GOLD Human Platelet Lysate(Clinical Grade)+1％MEM Non-Essential AminoAcids Solution(100×)+1％GultaMAX^TM(100×)的DMEM basic(1×)[+]4.5g/L D-Glucose培养基)，每2d换液一次，培养4d后，用TrypLE^TMSelect(1×)消化，消化的单细胞以4×10⁴cell/cm²接种至25cm²细胞培养瓶，定义为iPSC-MSC-P1，继续培养4d，期间观察细胞生长状态，细胞应呈梭状生长，生长速度快，每2d换液。用TrypLE^TMSelect(1×)消化7min，然后在1200rpm离心5min，收集沉淀。以2×10⁴cell/cm²接种量接种至75cm²细胞培养瓶，定义为iPSC-MSC-P2，而后每4d当细胞长至90％时，以1×10⁴cell/cm²接种量接种至175cm²细胞培养瓶并以1:3传代，得到iPSC-MSC-P3。使用iPSC-MSC-P3代细胞进行后续iPSC-MSC鉴定和制剂制备。期间采用光学显微镜拍摄不同培养时间的人iPSC-MSC形态。结果见图1。Day10即出现梭形的IPSC-MSC P0，Day 14即出现数目明显增多的梭形IPSC-MSC P1，Day 18即出现呈密集纤维状的IPSC-MSC P2，Day 22即出现具有纺锤形和MSC样形态的同质细胞群iPSC-MSC-P3。

三、iPSC-MSC特性的鉴定：利用流式细胞仪进行iPSC-MSC表面标志物(CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD34^-、CD45^-、HLA-DR^-)测定，从而鉴定干细胞特异性抗原；结果见图2。CD73⁺、CD90⁺和CD105⁺表达均超过95％为阳性，CD34^-、CD45^-和HLA-DR^-表达小于1％为阴性。表明iPSC-MSC具备间充质干细胞特异性抗原。

分别利用商品化的成骨、成软骨、成脂分化诱导试剂盒进行iPSC-MSC成骨、成软骨和成脂诱导，并分别通过茜素红、甲苯胺蓝、油红O染色评估iPSC-MSC体外成骨、成软骨、成脂等多向分化能力。结果见图3。茜素红、甲苯胺蓝、油红O染色均为阳性，表明iPSC-MSC具备体外成骨、成软骨、成脂多向分化能力。

四、制备间充质干细胞制剂：所得的间充质干细胞在临床级别的无血清Recovery^TMCell Culture Freezing Medium冻存液中按1×10⁸个/mL的浓度分装保存于细胞库中。

五、间充质干细胞制剂的质控：按照国际细胞治疗协会和/或部分地参照国家食药监局的关于成体干细胞的部分标准，制定干细胞制剂制备工艺的标准操作流程及每一过程的标准操作程序(SOP)并定期审核和修订。干细胞制剂的制备工艺包括干细胞的诱导制备、纯化、扩增和传代，培养基、辅料和包材的选择标准及使用，细胞冻存、复苏、分装和标记，以及残余物去除等。应对制剂制备的全过程，进行全面的工艺研究和验证，制定合适的工艺参数和质量标准，确保对每一过程的有效控制。对细胞产品进行检定、评价，提出相关流程、技术和规范，均合格的为成品。

细胞产品的检定和评价指标优选包括细胞活性、细胞质量和添加物质量。细胞活性检测采用不同的细胞生物学活性检测方法。细胞基本的质量为本发明制备的iPSC-MSC具备明确的细胞特征，且无外源微生物的感染。添加物的质量要求是应明确其来源、批号、质量检定合格报告，并尽量采用国家已批准的可临床应用的产品。

细胞制剂的相关资料需建档并长期保存。

实施例2

一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，包括如下步骤：

一、人iPSC常规培养：将人iPSC细胞株(购自Nuwacell公司)接种于10μg/mlVitronectin XF^TM(组成包括960μl CellAdhere^TMDilutionBuffer+40μl 250μg/mlVitronectin XF^TM)包被的6孔板中，使用iPSC常规培养基(1920μl TeSR^TM-E8^TMBasalMedium+80μl 25×TeSR^TM-E8^TMSupplement)于37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养6d。每天更换新鲜的上述常规培养基继续培养。期间采用光学显微镜拍摄不同培养时间的人iPSC形态。结果见图1。未分化的人iPSC在分化前Day-2于6孔板中生长至70％紧凑的、具有较高核质比并具有突出的核仁、边界清晰的鹅卵石状多细胞克隆团；在Day 0于6孔板中生长至90％紧凑的、具有较高核质比并具有突出的核仁、边界清晰的鹅卵石状多细胞克隆团。

二、诱导分化iPSC为iPSC-MSC并扩增iPSC-MSC：当人iPSC在Day 0于6孔板中长至80％时(细胞边缘光滑清晰，细胞间隙紧致，无明显分化，呈典型鹅卵石状克隆)更换为iPSC-MSC诱导培养基(含2％PLT GOLD Human Platelet Lysate(Clinical Grade)+1％MEMNon-Essential Amino Acids Solution(100×)+1％GultaMAX^TM(100×)的DMEM basic(1×)[+]1.0g/L D-Glucose培养基)，每3d换液一次，培养持续7d，获得贴壁细胞，用TrypLE^TMSelect(1×)消化5min，然后在1000rpm离心7min，收集沉淀。以8×10⁴cell/cm²接种量接种至25cm²细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P0，并更换为iPSC-MSC生长培养基(含2％PLT GOLD Human Platelet Lysate(Clinical Grade)+1％MEM Non-Essential AminoAcids Solution(100×)+1％GultaMAX^TM(100×)的DMEM basic(1×)[+]4.5g/L D-Glucose培养基)，每3d换液一次，培养7d后，用TrypLE^TMSelect(1×)消化，消化的单细胞以4×10⁴cell/cm²接种至25cm²细胞培养瓶，定义为iPSC-MSC-P1，继续培养7d，期间观察细胞生长状态，细胞应呈梭状生长，生长速度快，每2d换液。用TrypLE^TMSelect(1×)消化5min，然后在1200rpm离心5min，收集沉淀。以2×10⁴cell/cm²接种量接种至75cm²细胞培养瓶，定义为iPSC-MSC-P2，而后每6d当细胞长至80％时，以1×10⁴cell/cm²接种量接种至175cm²细胞培养瓶并以1:4传代，得到iPSC-MSC-P3。使用iPSC-MSC-P3代细胞进行后续iPSC-MSC鉴定和制剂制备。期间采用光学显微镜拍摄不同培养时间的人iPSC-MSC形态。Day9即出现梭形的IPSC-MSC P0，Day12即出现数目明显增多的梭形IPSC-MSC P1，Day17即出现呈密集纤维状的IPSC-MSC P2，Day 21即出现具有纺锤形和MSC样形态的同质细胞群iPSC-MSC-P3。

三、iPSC-MSC特性的鉴定：利用流式细胞仪进行iPSC-MSC表面标志物(CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD34^-、CD45^-、HLA-DR^-)测定，从而鉴定干细胞特异性抗原。结果表明，CD73⁺、CD90⁺和CD105⁺表达均超过95％为阳性，CD34^-、CD45^-和HLA-DR^-表达小于1％为阴性。表明iPSC-MSC具备间充质干细胞特异性抗原。

分别利用商品化的成骨、成软骨、成脂分化诱导试剂盒进行iPSC-MSC成骨、成软骨和成脂诱导，并分别通过茜素红、甲苯胺蓝、油红O染色评估iPSC-MSC体外成骨、成软骨、成脂等多向分化能力。茜素红、甲苯胺蓝、油红O染色均为阳性，表明iPSC-MSC具备体外成骨、成软骨、成脂多向分化能力。

四、制备间充质干细胞制剂：所得的间充质干细胞在临床级别的无血清Recovery^TMCell Culture Freezing Medium冻存液中按1×10¹⁰个/mL的浓度分装保存于细胞库中；

五、间充质干细胞制剂的质控：按照国际细胞治疗协会和/或部分地参照国家食药监局的关于成体干细胞的部分标准，制定干细胞制剂制备工艺的标准操作流程及每一过程的标准操作程序(SOP)并定期审核和修订。干细胞制剂的制备工艺包括干细胞的诱导制备、纯化、扩增和传代，培养基、辅料和包材的选择标准及使用，细胞冻存、复苏、分装和标记，以及残余物去除等。应对制剂制备的全过程，进行全面的工艺研究和验证，制定合适的工艺参数和质量标准，确保对每一过程的有效控制。对细胞产品进行检定、评价，提出相关流程、技术和规范，均合格的为成品。

细胞产品的检定和评价指标优选包括细胞活性、细胞质量和添加物质量。细胞活性检测采用不同的细胞生物学活性检测方法。细胞基本的质量为本发明制备的iPSC-MSC具备明确的细胞特征，且无外源微生物的感染。添加物的质量要求是应明确其来源、批号、质量检定合格报告，并尽量采用国家已批准的可临床应用的产品。

细胞制剂的相关资料需建档并长期保存。

由上述实施例可知，本发明提供的方法只需更换含临床级别的人血小板裂解液的诱导培养基和生长培养基即可，之后使用非猪源胰酶消化液TrypLE^TMSelect(1×)进行连续梯度密度单细胞传代，成功优化出一种成本较低、简易高效地将人iPSC分化为临床级别的iPSC-MSC的方法。该方法克服了现有技术的不足，不涉及异种胎牛血清，无需明胶包被细胞载体，无需添加小分子化合物及生长因子，无需特殊培养条件及流式细胞仪分选，可以简易高效地产生大量适用于临床的人iPSC来源的iPSC-MSC。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）当人iPSC于6孔板中长至80~90%时，更换iPSC-MSC诱导培养基进行培养8~12d，每2~3d换液一次，获得贴壁细胞，消化，得到iPSC-MSC单细胞；

2）将所述iPSC-MSC单细胞按8×10⁴cell/cm²接种至25cm²细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P0，更换iPSC-MSC生长培养基进行培养4~7d，每2~3d换液一次，消化，以4×10⁴ cell/cm²接种至25cm²细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P1，在iPSC-MSC生长培养基中继续培养4~7d，每2~3d换液，消化，以2×10⁴ cell/cm²接种至75cm²细胞培养瓶中，以后的每4~7d待细胞长至80~90%时，以1×10⁴ cell/cm2接种至175cm²细胞培养瓶，以1:3~1:4传代，得到大量的iPSC-MSC-P3细胞；

所述iPSC-MSC诱导培养基为含体积浓度2~5%人源血小板裂解物、体积浓度1% 100×微量非必需氨基酸溶液、体积浓度1% 100×谷氨酰胺添加剂、1.0g/L D-葡萄糖的DMEM培养基；

所述iPSC-MSC生长培养基为含体积浓度2~5%人源血小板裂解物、体积浓度1% 100×微量非必需氨基酸溶液、体积浓度1% 100×谷氨酰胺添加剂、4.5g/L D-葡萄糖的DMEM培养基；

3）将采用临床级别的无血清Recovery™ Cell Culture Freezing Medium冻存液中按1×10⁶~1×10¹⁰个/mL的浓度分装所述iPSC-MSC-P3细胞，制备的间充质干细胞制剂保存于细胞库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）或步骤2）中所述消化用酶为TrypLE™ Select；所述消化的时间为5~8min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消化后进行离心；所述离心的转速为1000~1500rpm；所述离心的时间为3~7min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述培养的温度为36~38℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述人iPSC的培养方法为将人iPSC细胞株接种于包被有10μg/ml 人多能干细胞培养贴壁基质的6孔板中在iPSC培养基中于37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养5~7d，每天更换新鲜培养基。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，每1000μL的所述人多能干细胞培养贴壁基质包括960μl CellAdhere™DilutionBuffer和40μl 250μg/ml的Vitronectin XF™。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述iPSC培养基为体积比为24:1的TeSR™-E8™ Basal Medium和25×TeSR™-E8™ Supplement。

8.根据权利要求1~7任意一项所述的方法，其特征在于，所述分装前，对iPSC-MSC特性进行鉴定；

所述iPSC-MSC特性的鉴定指标包括干细胞特异性抗原、成骨、成软骨和成脂分化能力。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述干细胞特异性抗原的鉴定方法包括测定iPSC-MSC表面标志物；所述iPSC-MSC表面标志物包括CD73+、CD90+、CD105+、CD34-、CD45-和HLA-DR-；

CD73+、CD90+和CD105+表达均超过95%为阳性，CD34-、CD45- 和HLA-DR-表达小于1%为阴性；

所述成骨、成软骨和成脂分化能力的鉴定为利用商品化的成骨、成软骨、成脂分化诱导试剂盒进行iPSC-MSC成骨、成软骨和成脂诱导，并分别采用茜素红、甲苯胺蓝、油红O染色评估iPSC-MSC体外成骨、成软骨、成脂分化能力；

茜素红、甲苯胺蓝和油红O染色结果均为阳性，iPSC-MSC具备体外成骨、成软骨、成脂多向分化能力。

10.根据权利要求1~7任意一项所述的方法，其特征在于，还包括间充质干细胞制剂的质控；

按照国际细胞治疗协会和/或部分地参照国家食药监局的关于成体干细胞的部分标准，对细胞产品进行检定、评价，提出相关流程、技术和规范，均合格的为成品；

细胞产品的检定和评价指标包括细胞活性、细胞质量和添加物质量。

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