CN107828716B - 一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法及其培养基组 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法，包括以下步骤：1)从离体皮肤组织中分离表皮干细胞，在表皮干细胞培养基进行传代培养；2)将步骤1)得到的表皮干细胞进行传代培养、加入汗腺细胞诱导培养基进行诱导分化；和3)利用汗腺细胞培养基进行传代与增殖。本发明同时提供了相对应的培养基组。该方法细胞源有效地避免了伦理学争议，该制备方法有助于制得细胞定向分化、增殖情况较均一的汗腺细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物组织培养技术领域，尤其涉及一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法及其培养基组。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，具有保护身体，排汗，感觉冷热和压力等功能。汗腺分泌汗液，散发体热。大面积的烧伤病人，创面修复后，汗腺缺失，导致体温调节功能受影响。人工皮肤修复创面，仅具有表皮、真皮层结构，无汗腺及其他皮肤附属器。组织工程化皮肤难以构建汗腺，是目前有待解决的难题。模拟汗腺的发生机制来诱导干细胞向汗腺细胞定向分化，可能是重建汗腺的唯一途径。以表皮干细胞来诱导分化汗腺细胞，而达到汗腺细胞扩增培养的目的，具有较好的应用前景，但表皮干细胞的细胞分化、代谢的机制尚不清晰，定向分化需要克服较多不确定因素。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种稳定的、定向分化的由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法。
本发明的目的之二在于提供上述由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的培养基组。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法，包括以下步骤：
1)从离体皮肤组织中分离表皮干细胞，在表皮干细胞培养基进行传代培养；
所述表皮干细胞培养基为含有氢化可的松、胰岛素、腺嘌呤、青霉素、人表皮生长因子、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基壳聚糖的DMEM培养基；
2)将步骤1)得到的表皮干细胞进行传代培养，待其融合度达到80％时，弃去培养基，用DMEM/F12清洗，加入汗腺细胞诱导培养基进行诱导分化；
所述汗腺细胞诱导培养为含有人表皮生长因子、霍乱毒素、三碘甲状腺原氨酸和氯化乙酰胆碱的DMEM培养基；
3)培养若干天后，待培养基内出现多边形、铺路石样的细胞，即为汗腺细胞，将培养基换成汗腺细胞培养基，培养若干天后，进行传代与增殖；
所述汗腺细胞培养基为含有EGF、牛垂体提取物、青霉素和链霉素的DMEM 培养基。
进一步地，步骤1)中，所述离体皮肤组织为健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮。
进一步地，步骤1)中，从离体皮肤组织中分离表皮干细胞具体操作为：取 3-6岁健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮，无菌条件下，氯霉素清洗皮肤组织，加分散酶于4℃作用18-24h，分离表皮组织；无菌PBS清洗表皮组织，0.25％胰酶-EDTA消化4h，加入表皮干细胞培养基终止，1000r/min，离心5min，收集表皮细胞，无菌PBS清洗三遍，加入表皮干细胞培养基重悬，置于Matrigel包被的培养板进行培养，得到表皮干细胞。
进一步地，步骤2)中，诱导分化时，每天更换汗腺细胞诱导培养基。
进一步地，所述表皮干细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的 DMEM培养基：0.1-2ng/mL氢化可的松、0.01-1ng/mL胰岛素、1-5×10-4mol/L 腺嘌呤、50-200IU/mL青霉素、5-50ng/mL人表皮生长因子、2-50μg/mL转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-20μM Y-27632和0.01-1mg/mL羧甲基壳聚糖。
进一步地，所述汗腺细胞诱导培养基为含有以最终浓度计的以下组分的 DMEM培养基：25-100ng/mL人表皮生长因子、0.1-2×10-10mol/L霍乱毒素、 0.5-5×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、2-8×10-5mol/L氯化乙酰胆碱。
进一步地，所述汗腺细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM 培养基：10-100ng/mL EGF、10-50mg/mL牛垂体提取物、50-200U/mL青霉素和 50-200μg/mL链霉素。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的培养基组，包括以下培养基：
表皮干细胞培养基：含有氢化可的松、胰岛素、腺嘌呤、青霉素、人表皮生长因子、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基壳聚糖的DMEM培养基；
汗腺细胞诱导培养：含有人表皮生长因子、霍乱毒素、三碘甲状腺原氨酸和氯化乙酰胆碱的DMEM培养基；
汗腺细胞培养基：含有EGF、牛垂体提取物、青霉素和链霉素的DMEM培养基。
进一步地，所述表皮干细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的 DMEM培养基：0.1-2ng/mL氢化可的松、0.01-1ng/mL胰岛素、1-5×10-4mol/L 腺嘌呤、50-200IU/mL青霉素、5-50ng/mL人表皮生长因子、2-50μg/mL转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-20μM Y-27632和0.01-1mg/mL羧甲基壳聚糖。
进一步地，所述汗腺细胞诱导培养基为含有以最终浓度计的以下组分的 DMEM培养基：25-100ng/mL人表皮生长因子、0.1-2×10-10mol/L霍乱毒素、0.5-5 ×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、2-8×10-5mol/L氯化乙酰胆碱；
所述汗腺细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基： 10-100ng/mL EGF、10-50mg/mL牛垂体提取物、50-200U/mL青霉素和50-200 μg/mL链霉素。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1)本发明开创性地使用人体离体组织样本作为取样标本，有效了避免取血样、骨髓样等不必要的痛苦，同时避免了伦理学顾虑，其具有长远的意义；
2)本发明提供的方法，表皮干细胞的获取比较方便快捷，免疫原型比较低且所用培养基为无血清培养，避免了病原菌的污染，保证了安全的可靠性；
3)本发明配制了有益于表皮干细胞均一生长、分化阶段一致的培养基组，适用于分离、诱导分化培养和增殖培养的不同阶段，从免疫荧光鉴定图谱可见，表皮干细胞的形态具有较好的一致性；
4)本发明提供的培养基组能较好地控制细胞的生长、定向分化和增殖，其作为相配套的培养基组，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的免疫荧光鉴定图；
图2为本发明实施例2的免疫荧光鉴定图；
图3为本发明实施例3的免疫荧光鉴定图；
图4为本发明实施例1-3的流式细胞仪检测图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
本发明提供由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法，以人体离体组织为原料来源，取样及制备过程不存在伦理学争议。
以下具体实施方式中，如未特殊说明所采用的试剂或仪器，均可通过市售方式或常规的实验手段获得。
本发明提供一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法，包括以下步骤：
1)从离体皮肤组织中分离表皮干细胞，在表皮干细胞培养基进行传代培养；
所述表皮干细胞培养基为含有氢化可的松、胰岛素、腺嘌呤、青霉素、人表皮生长因子、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基壳聚糖的DMEM培养基；
该表皮干细胞培养基中不含有血清，羧甲基壳聚糖是一种壳聚糖的衍生物，在表皮干细胞培养基作为载体，与表皮干细胞具有较好的相容性，能够使帮助表皮干细胞均一地、形态可控地生长；
2)将步骤1)得到的表皮干细胞进行传代培养，待其融合度达到80％时，弃去培养基，用DMEM/F12清洗，加入汗腺细胞诱导培养基进行诱导分化；
所述汗腺细胞诱导培养为含有人表皮生长因子、霍乱毒素、三碘甲状腺原氨酸和氯化乙酰胆碱的DMEM培养基；该汗腺细胞诱导培养能均一诱导表皮干细胞定向向汗腺细胞分化；
3)培养若干天后，待培养基内出现多边形、铺路石样的细胞，即为汗腺细胞，将培养基换成汗腺细胞培养基，培养若干天后，进行传代与增殖；
所述汗腺细胞培养基为含有EGF、牛垂体提取物、青霉素和链霉素的DMEM 培养基；该汗腺细胞培养基有助于汗腺细胞均一地、形态可控地传代与增殖。
实施例1：
1)培养基的配制：
取DMEM培养基，配制得到含有0.5ng/mL氢化可的松、0.05ng/mL胰岛素、 1.8×10- 4mol/L腺嘌呤、100IU/mL青霉素、15ng/mL人表皮生长因子、10μg/mL 转铁蛋白、5μg/mL谷氨酸、5μM Y-27632和0.1mg/mL羧甲基壳聚糖的DMEM 培养基；
汗腺细胞诱导培养基：取DMEM培养基，配制得到含有50ng/mL人表皮生长因子、1×10-10mol/L霍乱毒素、1×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、5×10-5mol/L 氯化乙酰胆碱的DMEM培养基；
汗腺细胞培养基：取DMEM培养基，配制得到含有50ng/mL EGF、25mg/mL 牛垂体提取物、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基。
2)表皮干细胞的获取及培养
从离体皮肤组织中分离表皮干细胞具体操作为：取3-6岁健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮，无菌条件下，氯霉素清洗皮肤组织，加分散酶于4℃作用 18-24h，分离表皮组织；无菌PBS清洗表皮组织，0.25％胰酶-EDTA消化4h，加入表皮干细胞培养基终止，1000r/min，离心5min，收集表皮细胞，无菌PBS 清洗三遍，加入表皮干细胞培养基重悬，置于Matrigel包被的培养板进行培养，得到表皮干细胞；
3)汗腺细胞的诱导及培养
将步骤2)制备好的表皮干细胞进行传代培养，待其融合度达到80％时，弃去培养基，DMEM/F12洗一次，加入汗腺细胞诱导培养进行诱导分化；
每天换液，培养7d左右，待培养基内出现多边形、铺路石样的细胞，即为汗腺细胞，将培养基换成汗腺细胞培养基，培养3天后，进行传代与增殖。
实施例2：
实施例2与实施例1不同的是，
1)培养基的配制：
表皮干细胞培养基：取DMEM培养基，配制得到含有0.1ng/mL氢化可的松、0.01ng/mL胰岛素、1×10-4mol/L腺嘌呤、50IU/mL青霉素、5ng/mL人表皮生长因子、2μg/mL转铁蛋白、1μg/mL谷氨酸、1μM Y-27632和0.01mg/mL羧甲基壳聚糖的DMEM培养基；
汗腺细胞诱导培养基：取DMEM培养基，配制得到含有25ng/mL人表皮生长因子、0.1×10-10mol/L霍乱毒素、0.5×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、2×10-5mol/L 氯化乙酰胆碱的DMEM培养基；
汗腺细胞培养基：取DMEM培养基，配制得到含有10ng/mL EGF、10mg/mL 牛垂体提取物、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基。
实施例3：
实施例3与实施例1不同的是，1)培养基的配制：
表皮干细胞培养基：取DMEM培养基，配制得到含有2ng/mL氢化可的松、 1ng/mL胰岛素、5×10-4mol/L腺嘌呤、200IU/mL青霉素、50ng/mL人表皮生长因子、50μg/mL转铁蛋白、10μg/mL谷氨酸、20μM Y-27632和1mg/mL羧甲基壳聚糖的DMEM培养基；
汗腺细胞诱导培养基：取DMEM培养基，配制得到含有100ng/mL人表皮生长因子、2×10-10mol/L霍乱毒素、5×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、8×10-5mol/L 氯化乙酰胆碱的DMEM培养基；
汗腺细胞培养基：取DMEM培养基，配制得到含有100ng/mL EGF、50mg/mL 牛垂体提取物、200U/mL青霉素和200μg/mL链霉素的DMEM培养基。
对比例1：
对比例1与实施例1不同的是，汗腺细胞培养基为含有10vt％FBS的KSFM 培养基。
性能检测与效果评价：
1.MTT法检测细胞活力
取各实施例与对比例得到的表皮干细胞，采用MTT法检测，其活力如下表所示：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | |
| 活力[％] | 96.57 | 83.78 | 80.38 | 97.11 |
其中实施例1制得的细胞的活力显著高于实施例2-3(p<0.05)且与对比例1相比差异不明显(P>0.05)，说明无血清培养与市售的含血清培养达到了相同的效果。
2.免疫荧光鉴定汗腺细胞表面标志物
用0.25％胰酶消化实施例1制得的细胞，以1×105的接种量接种于12孔板中，待其贴壁，4％的多聚甲醛固定2h，PBS洗三遍；
加200μL的一抗稀释液常温封闭1-2h；所述一抗稀释液为含有10vt％血清、0.3vt％TritonX-100的PBS；
弃去一抗稀释液，加入200μL鼠源CK19、CK15一抗抗体(稀释度为1:100)， 4℃孵育过夜，PBS冲洗三次3次，每次5min；
加200μL FITC标记抗鼠二抗(1：400)，常温避光反应1h，PBS冲洗；上机检测前用PI染核。
荧光倒置显微镜下观察结果可见，汗腺细胞的阳性标志物CEA、CK14、 CK18、CK8在多数汗腺细胞中呈阳性表达。荧光素PE标记抗体与CEA、CK14、 CK18、CK8单克隆抗体结合，在胞浆中表现为红色荧光，DAPI试剂染汗腺组织来源细胞的胞核为蓝色。
其中，实施例1-3制得汗腺细胞的检测结果如图1-3。从图1-3可以看出， CEA、CK14、CK18、CK8蛋白是汗腺细胞的特异性标记蛋白，CEA、CK14、 CK18、CK8的表达量极高为阳性表达，说明诱导出的细胞为汗腺细胞。且实施例1的各蛋白阳性率明显高于实施例2-3(p<0.05)。
3.流式细胞仪检测汗腺细胞表面标志物
用0.25％胰酶消化表皮干细胞并收集细胞，细胞数为2×105个；
细胞胞重悬于1mLDPBS中洗涤2次，200g，离心5min，得到的细胞沉淀加入1mL70％预冷的酒精重悬固定2h；
离心弃去固定液，加入200μL鼠源CK19、CK15、CK10一抗抗体(稀释度为1:100)常温下孵育30min；
1mL PBS洗涤，分别与FITC标记二抗(稀释度为1:200)常温避光孵育 1h；
PBS洗两次后，弃去PBS，根据细胞量加入适量的PBS重悬细胞，利用流式细胞仪检测。
其中，对实施例1-3制得汗腺细胞的检测结果如图4。
通过流式细胞仪分析显示，实施例1在汗腺细胞中CK14蛋白的阳性表达量为95％以上，CEA蛋白的阳性表达量为75％以上，而MSX-1蛋白的阴性表达量在2％以下；实施例2在汗腺细胞中CK14蛋白的阳性表达量为82％以上，CEA 蛋白的阳性表达量为65％以上，而MSX-1蛋白的阴性表达量在4％以下；实施例3在汗腺细胞中CK14蛋白的阳性表达量为80％以上，CEA蛋白的阳性表达量为62％以上，而MSX-1蛋白的阴性表达量在5％以下，均符合汗腺细胞表面标记物的表达结果。且实施例1的各蛋白表达明显优于实施例2-3(p<0.05)。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法，包括以下步骤：
1)从离体皮肤组织中分离表皮干细胞，在表皮干细胞培养基进行传代培养；
所述表皮干细胞培养基为含有氢化可的松、胰岛素、腺嘌呤、青霉素、人表皮生长因子、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基壳聚糖的DMEM培养基；
2)将步骤1)得到的表皮干细胞进行传代培养，待其融合度达到80％时，弃去培养基，用DMEM/F12清洗，加入汗腺细胞诱导培养基进行诱导分化；
所述汗腺细胞诱导培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：25-100ng/mL人表皮生长因子、0.1-2×10-10mol/L霍乱毒素、0.5-5×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、2-8×10-5mol/L氯化乙酰胆碱；
3)培养若干天后，待培养基内出现多边形、铺路石样的细胞，即为汗腺细胞，将培养基换成汗腺细胞培养基，培养若干天后，进行传代与增殖；
所述汗腺细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：10-100ng/mLEGF、10-50mg/mL牛垂体提取物、50-200U/mL青霉素和50-200μg/mL链霉素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述离体皮肤组织为健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，从离体皮肤组织中分离表皮干细胞具体操作为：取3-6岁健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮，无菌条件下，氯霉素清洗皮肤组织，加分散酶于4℃作用18-24h，分离表皮组织；无菌PBS清洗表皮组织，0.25％胰酶-EDTA消化4h，加入表皮干细胞培养基终止，以1000r/min速度离心5min，收集表皮细胞，无菌PBS清洗三遍，加入表皮干细胞培养基重悬，置于Matrigel包被的培养板进行培养，得到表皮干细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，诱导分化时，每天更换汗腺细胞诱导培养基。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述表皮干细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：0.1-2ng/mL氢化可的松、0.01-1ng/mL胰岛素、1-5×10-4mol/L腺嘌呤、50-200IU/mL青霉素、5-50ng/mL人表皮生长因子、2-50μg/mL转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-20μM Y-27632和0.01-1mg/mL羧甲基壳聚糖。
6.一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的培养基组，包括以下培养基：
表皮干细胞培养基：含有氢化可的松、胰岛素、腺嘌呤、青霉素、人表皮生长因子、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基壳聚糖的DMEM培养基；
汗腺细胞诱导培养：含有人表皮生长因子、霍乱毒素、三碘甲状腺原氨酸和氯化乙酰胆碱的DMEM培养基；
汗腺细胞培养基：含有EGF、牛垂体提取物、青霉素和链霉素的DMEM培养基。
7.如权利要求6所述的培养基组，其特征在于，
所述表皮干细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：0.1-2ng/mL氢化可的松、0.01-1ng/mL胰岛素、1-5×10-4mol/L腺嘌呤、50-200IU/mL青霉素、5-50ng/mL人表皮生长因子、2-50μg/mL转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-20μM Y-27632和0.01-1mg/mL羧甲基壳聚糖。
8.如权利要求6所述的培养基组，其特征在于，
所述汗腺细胞诱导培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：25-100ng/mL人表皮生长因子、0.1-2×10-10mol/L霍乱毒素、0.5-5×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、2-8×10-5mol/L氯化乙酰胆碱；
所述汗腺细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：10-100ng/mLEGF、10-50mg/mL牛垂体提取物、50-200U/mL青霉素和50-200μg/mL链霉素。
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| CN104399125A (zh) * | 2014-12-01 | 2015-03-11 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法 |
| CN106860919A (zh) * | 2017-02-20 | 2017-06-20 | 广州润虹医药科技有限公司 | 交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用 |
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2017
- 2017-09-29 CN CN201710909244.5A patent/CN107828716B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104399125A (zh) * | 2014-12-01 | 2015-03-11 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 人外泌汗腺腺上皮细胞的生物学特性及体外重建汗腺的实验研究;雷霞;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 (博士)医药卫生科技辑》;20061115(第2006年11期);摘要、正文第26-28页 * |
| 体外重建外泌汗腺的初步研究;周立奉;《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20100615(第2010年6期);正文第8页 * |
| 羊水干细胞在皮肤损伤修复中的作用及机制研究;孙青;《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20160815(第2016年8期);正文第50页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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