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CN111057680A - 用于肺部肿瘤细胞的培养基和三维培养方法 - Google Patents

用于肺部肿瘤细胞的培养基和三维培养方法 Download PDF

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CN111057680A CN201911261165.3A CN201911261165A CN111057680A CN 111057680 A CN111057680 A CN 111057680A CN 201911261165 A CN201911261165 A CN 201911261165A CN 111057680 A CN111057680 A CN 111057680A
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郑敏
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Abstract

本发明提供了一种用于肺部肿瘤细胞的培养基，其特别适合于体外三维培养肺部肿瘤细胞，特别是来自肺癌患者血液的循环肿瘤细胞。本发明还提供了一种体外三维培养循环肿瘤细胞以形成类器官的方法。

Description

用于肺部肿瘤细胞的培养基和三维培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养领域，涉及体外培养循环肿瘤细胞并使其分化形成肿瘤类器官组织的方法，以及用于这种方法的培养基。具体来说，本发明涉及体外培养来自肺部肿瘤的循环肿瘤细胞。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)是由肿瘤原发灶中某些高侵袭、高转移能力的少数细胞突破基底膜，进入循环系统形成的，与肿瘤的转移和复发有密切联系。近年来，在各种恶性肿瘤中都广泛报道了CTC与患者的生存期和治疗反应有显著相关性，特别是CTC中的循环肿瘤干细胞(Circulating Tumor Stem Cell,CTSC)，是癌症治疗的重要靶标，因此CTC和CTSC作为诊断和预后的生物标记物有广阔的应用前景。但是目前大多数研究还停留在CTC计数和分子分型上，如果需要进行CTC功能分型、蛋白质组和转录组特征分析、CTC致瘤能力评价以及肿瘤复发转移机制研究，就必须建立一种理想的CTC体外培养和扩增手段。
然而，体外成功培养CTC特别是CTSC具有极大的挑战，鲜有报道，原因之一在于CTC特别是CTC中的循环肿瘤干细胞(CTSC)极其稀少，使得捕获和扩增都非常困难，富集分离到具有高细胞活性和高纯度的CTC在现有技术手段下仍有一定难度。另一个局限在于CTC体外成功培养的案例大部分是通过2D悬浮培养进行的，但是通过这种方法很难扩增获得有“干性”的CTSC，因为在普通2D培养条件下无法提供干细胞维持功能所需的龛位(niche)，干性会很快消失。此外，这样的2D培养方式无法模拟机体内环境，使得建立的体外模型与体内肿瘤微环境存在差异，所以这种2D培养方案不适合推广。
近年来有一些关于CTC细胞系成功体外培养的报道。Yu等人利用含有EGF、bFGF和B27的RPMI-1640培养基和超低吸附培养皿，从转移性乳腺癌患者的8ml血样中成功富集并培养出CTC细胞系(Min Yu et al.,Science 11 Jul 2014:Vol.345,Issue 6193,pp.216-220)；Laure Cayrefourcq团队运用了相似的方案建立了结肠直肠癌CTC细胞系(LaureCayrefourcq et al.,CancerResearch 75(5)·January 2015)。此外，Zhang等人用添加了胰岛素、氢化可的松、EGF、FGF2的DEME/F12培养基也成功建立了CTC培养体系(Lixin Zhanget al.,SciTransl Med.2013Apr 10；5(180))。
现有的技术具有很大的局限性，因其对血液样本中CTC数量和培养环境有严格要求，如CTC数量要大于每毫升300个，培养条件要求在低氧培养箱中进行培养，诸如此类。此外建立的细胞系是在2D悬浮状况下培养出的，不能模拟机体内微环境，所以目前培养方案不适合推广。
另一方面，CTC中的一部分具有干细胞特性，被称为循环肿瘤干细胞(CirculatingTumor Stem Cell,CTSC)，其具有自我更新能力、干细胞标志物表达能力、甚至免疫逃逸能力，被认为是肿瘤转移和复发的根源。分离捕获肿瘤患者外周血中的CTSC并进行体外3D细胞培养形成个体特异性的类器官，可进一步进行药敏试验、基因检测等，并有助于指导治疗。CTSC形成的类器官最大优势在于它们既来源于患者原发肿瘤组织，又代表了极有可能形成的转移肿瘤。但是在体外构建任何一种类型的类器官面临的最大挑战是确定在培养皿中形成所需的营养物、细胞因子和培养方法。对于不同的肿瘤和组织类型，这些确切的培养条件存在着显著性差异并且难以预知。
因此，本领域仍然需要改进的CTC特别是CTSC细胞的体外培养手段以及由此形成类器官的手段，以满足研究、诊断等需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的发明人通过大量实验探索，获得了一种特别适合于培养肺部肿瘤细胞的培养基。该培养基还特别适合于培养从肺癌患者血液样本中分离捕获的循环肿瘤细胞，并能保留其中循环肿瘤干细胞的干性。除此之外，本发明还涉及一种使用该培养基在体外三维培养来自肺癌患者的循环肿瘤细胞，以形成其中保留了循环肿瘤干细胞干性的肿瘤类器官的方法，由此完成了本发明。
因此在第一方面，本发明提供一种用于体外培养肿瘤细胞的培养基，所述培养基包含细胞因子和激酶抑制剂，所述细胞因子包含EGF、FGF2、FGF10、头蛋白(Noggin)和R-Spondin或由EGF、FGF2、FGF10、头蛋白(Noggin)和R-Spondin组成，所述激酶抑制剂包含ROCK抑制剂、ALK抑制剂和p38抑制剂或由ROCK抑制剂、ALK抑制剂和p38抑制剂组成。
优选地，所述ROCK抑制剂是ROCK1和ROCK2的双重抑制剂。更优选地所述ROCK抑制剂是Y-27632。
优选地，所述ALK抑制剂是A83-01。
优选地，所述p38抑制剂是SB202190。
在具体的实施方案中，本发明的培养基包含浓度为3-7ng/ml，优选浓度为4-6ng/ml，最优选浓度为5ng/ml的EGF；浓度为15-35ng/ml，优选浓度为20-30ng/ml，最优选浓度为25ng/ml的FGF2；浓度为50-150ng/ml，优选浓度为75-125ng/ml，最优选浓度为100ng/ml的FGF10；浓度为50-150ng/ml，优选浓度为75-125ng/ml，更优选浓度为90-110ng/ml，最优选浓度为100ng/ml的头蛋白；和浓度为350-650ng/ml，优选浓度为400-600ng/ml，更优选浓度为450-550ng/ml，最优选浓度为500ng/ml的R-Spondin 1。此外或者可选地，本发明的培养基包含浓度为6-14μM，优选浓度为9-11μM，最优选浓度为10μM的ROCK抑制剂，优选ROCK1和ROCK2的双重抑制剂，最优选Y-27632；浓度为350-650nM，优选浓度为400-600nM，更优选浓度为450-550nM，最优选浓度为500nM的ALK抑制剂，优选A83-01；和浓度为6-14μM，优选浓度为9-11μM，最优选浓度为10μM的p38抑制剂，优选p38α/β的选择性抑制剂，最优选SB202190。
在一个具体的实施方案中，本发明的培养基包含3-7ng/ml的EGF，15-35ng/ml的FGF2，50-150ng/ml的FGF10，50-150ng/ml的头蛋白，350-650ng/ml的R-Spondin 1；以及6-14μM的ROCK抑制剂，350-650nM的ALK抑制剂，6-14μM的p38抑制剂。更具体地，本发明的培养基包含3-7ng/ml的EGF，15-35ng/ml的FGF2，50-150ng/ml的FGF10，50-150ng/ml的头蛋白，350-650ng/ml的R-Spondin 1；以及6-14μM的Y-27632，350-650nM的A83-01，6-14μM的SB202190。
在一个具体的实施方案中，本发明的培养基包含5ng/ml的EGF，25ng/ml的FGF2，100ng/ml的FGF10，100ng/ml的头蛋白，500ng/ml的R-Spondin 1；以及10μM的ROCK抑制剂，500nM的ALK抑制剂，10μM的p38抑制剂。更具体地，本发明的培养基包含5ng/ml的EGF，25ng/ml的FGF2，100ng/ml的FGF10，100ng/ml的头蛋白，500ng/ml的R-Spondin 1；以及10μM的Y-27632，500nM的A83-01，10μM的SB202190。
在进一步的实施方案中，本发明的培养基包含维生素，优选烟酰胺。在具体的实施方案中，所述烟酰胺的浓度是4-11mM，优选5mM。
在进一步的实施方案中，本发明的培养基包含氨基酸，优选L-谷氨酰胺或N-乙酰半胱氨酸，更优选L-谷氨酰胺和N-乙酰半胱氨酸。在具体的实施方案中，N-乙酰半胱氨酸的浓度是1-1.5mM，优选1.25mM。
在进一步的实施方案中，本发明的培养基包含激素，优选前列腺素，更优选前列腺素E2。在具体的实施方案中，前列腺素E2的浓度为0.5-1.5μM，优选0.75-1.25μM，最优选1.0μM。
在一个具体的实施方案中，本发明的培养基包含：EGF、FGF2、FGF10、头蛋白、R-Spondin 1、ROCK抑制剂、ALK抑制剂、p38抑制剂、L-谷氨酰胺、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、前列腺素E2更具体地，本发明的培养基包含：EGF、FGF2、FGF10、头蛋白、R-Spondin 1、Y-27632、A83-01、SB202190、L-谷氨酰胺、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、前列腺素E2。
在一个具体的实施方案中，本发明的培养基包含如表1所述含量的上述成分。
在另一个实施方案中，本发明的培养基任选地包含抗生素，优选青霉素和/或链霉素。
本发明的第一方面的肿瘤细胞优选是来自患有肺部肿瘤的患者的肿瘤细胞，更优选是循环肿瘤细胞(CTC)。在具体的实施方案中，所述肺部肿瘤是恶性肿瘤。
第二方面，本发明涉及一种培养方法，其使用了第一方面的培养基。
第三方面，本发明提供体外三维培养肺部肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：(1)从患有肺部肿瘤的受试者获得肿瘤细胞，(2)使用第一方面的培养基和基质胶培养步骤(1)获得的肿瘤细胞。
在具体的实施方案中，步骤(1)通过从所述受试者的血液样品富集循环肿瘤细胞进行。
在优选的实施方案中，所述血液样品是肺静脉血样品。优选地，所述静脉血样品不少于约3ml，不少于约4ml，不少于约5ml。具体而言，所述静脉血样品为约4ml。
在进一步的实施方案中，步骤(1)中通过密度梯度离心从血液样品富集循环肿瘤细胞。优选地，所述密度梯度离心为免疫密度梯度分选。更优选地，所述密度梯度离心采用RossetteSepTM方法进行。
在优选的实施方案中，所述基质胶为MatrigelTM。
在优选的实施方案中，先将基质胶与富集的细胞混合，待凝固后再加入第一方面的培养基。
鉴于本发明的细胞因子和激酶抑制剂的组合的独特性，在第四方面，本发明涉及细胞因子和激酶抑制剂的组合在前列腺肿瘤细胞的培养中的用途，所述细胞因子包含EGF、FGF2、FGF10、头蛋白(Noggin)和R-Spondin或由EGF、FGF2、FGF10、头蛋白(Noggin)和R-Spondin组成，所述激酶抑制剂包含ROCK抑制剂、ALK抑制剂和p38抑制剂或由ROCK抑制剂、ALK抑制剂和p38抑制剂组成。在第四方面的用途的优选实施方案中，所述细胞因子和激酶抑制剂包含在培养基中使用。
第五方面，本发明涉及包含第一方面的培养基的试剂盒。
第六方面，本发明涉及第一方面的培养基和第四方面的试剂盒用于培养细胞的用途，所述细胞优选肺部肿瘤细胞，更优选是来自患有肺部肿瘤患者的循环肿瘤细胞。
本发明的培养基和方法支持从循环肿瘤细胞着手在体外构建肺癌类器官，提供了一种能够更好模拟体内肿瘤微环境的体外模型，在肺癌的研究、诊断、预后、用药方案制定等方面具有广泛用途。
附图简述
图1是通过本发明实施例1的方法和培养基培养的肺腺癌细胞在培养1天、2天、3天、7天后在光学显微镜下拍摄的照片。
图2是通过本发明的方法和培养基培养的肺腺癌细胞在光学显微镜下拍摄的照片。
图3是通过本发明的方法和培养基培养的肺鳞癌细胞在光学显微镜下拍摄的照片。
图4是3D培养免疫荧光图，包含四幅小图，浅色区域表示荧光的发生。左上小图为EpCAM蛋白荧光标记图，说明培养的细胞团表达EpCAM；右上小图为CD133蛋白荧光标记图，培养的细胞团表达CD133；左下小图为hochest33342染色，标记细胞核；右下小图为前三幅照片的拟合图。
图5比较了肺癌H2347细胞在普通2D培养和本发明的3D培养条件下干性相关基因(CD133、CD44和ABCG2)的表达水平。
图6展示了当使用的生长因子含量过低(低于本发明限定的浓度范围的下限值)时，无法获得细胞群体的对比例。
发明详述
本发明的术语具有细胞领域技术人员熟知的含义，除非本文另有定义。本领域技术人员可以理解，本发明上下文中限定的数值范围涵盖点值，限定的点值可以涵盖因系统误差导致的近似值。
“培养基”是指为了在体外培养细胞所使用的一种基质，其为细胞提供生长所需的物质。“成分确定的培养基”是相对于源自组织提取物和体液的天然培养基而言的术语，其特征在于化学成分明确。最终用于本发明的培养方法的培养基也被成为“类器官培养基”。
“基础培养基”在本文的上下文中是指本领域常用的、未加入本发明所独有的添加剂、补充剂组合的培养基，其通常是通用培养基，即可以广泛用于各种类型的细胞，不具有定制性。具体到本文的背景中，所述基础培养基优选为用于培养动物细胞的培养基。用于配制本发明的类器官培养基的基础培养基和缓冲液可以是适合于培养目标细胞的培养基，并且可以是本领域技术人员已知的。本发明的类器官培养基中使用的基础培养基可以是常用于培养动物细胞特别是肿瘤细胞的培养基，特别是用于培养肿瘤干细胞的培养基，尤其是用于培养肺部肿瘤干细胞的培养基。具体来说，所述基础培养基可以是Eagles’s最少基础培养基(Eagle’s Minimal Essential Medium；MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、高级DMEM(advanced DMEM)培养基、RPMI1640培养基。在本发明优选的实施方案中，使用的基础培养基是F12培养基与高级DMEM培养基的混合物，简称为“adDMEM/F12培养基”。通过混合营养成分浓度相对较低但种类更为丰富的F12培养基与营养成分浓度较高的高级DMEM培养基，提供了一种性能平衡的基础培养基，作为进一步定制化用于特定细胞类型的培养基的基础。
用于某种具体用途，例如用于培养特定类型的细胞的用途的培养基需要通过向基础培养基中加入特定的添加剂和补充剂来配制。这些添加剂和补充剂可以在配制时自行调配，特别是对于稳定性较差的添加剂如谷氨酰胺、血清、生长因子、激素；补充物也可以是可商购的混合物。如前文所述，循环肿瘤干细胞难以培养，因此调配添加剂的组成和含量是为本发明的关键所在。如本领域技术人员所理解的，可以将加入了各种添加物和补充物之后的培养基称为“完全培养基”，因为其包含用于培养某种特定细胞的全部成分。
本发明的类器官培养基是特定用于培养来自肺部肿瘤患者的细胞，特别是循环肿瘤细胞和循环肿瘤干细胞的培养基，其包含独特的细胞因子组合，且优选还包含独特的激酶抑制剂组合。
“细胞因子”是由细胞分泌的具有生物活性的物质的统称。在本文的上下文中，将生长因子理解为细胞因子中的一个亚类，其能够促进细胞生长，通常为多肽。本领域已经发现了众多的生长因子，包括表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、成纤维细胞生长因子(FGF)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF)、白介素(IL)等。生长因子可能在多种不同的组织中具有活性，也可能作用于某些特定类型的组织细胞，即具有特异性。不同生长因子之间或是生长因子与其他物质如激素、旁分泌因子之间可以实现协同作用。因此，对于特定细胞类型的培养，培养基中添加的生长因子的组合，以及生长因子和其他添加物的组合的方式需要审慎的选择。
本发明的独特细胞因子组合包含生长因子EGF、FGF2、FGF10以及头蛋白(Noggin)和R-Spondin 1，或者由EGF、FGF2、FGF10、头蛋白(Noggin)和R-Spondin 1组成。在具体的实施方案中，本发明的培养基包含浓度为3-7ng/ml，优选浓度为4-6ng/ml，最优选浓度为5ng/ml的EGF。在具体的实施方案中，本发明的培养基包含浓度为15-35ng/ml，优选浓度为20-30ng/ml，最优选浓度为25ng/ml的FGF2。在具体的实施方案中，本发明的培养基包含浓度为50-150ng/ml，优选浓度为75-125ng/ml，最优选浓度为100ng/ml的FGF10。在具体的实施方案中，本发明的培养基包含浓度为50-150ng/ml，优选浓度为75-125ng/ml，更优选浓度为90-110ng/ml，最优选浓度为100ng/ml的头蛋白。在具体的实施方案中，本发明的培养基包含浓度为350-650ng/ml，优选浓度为400-600ng/ml，更优选浓度为450-550ng/ml，最优选浓度为500ng/ml的R-Spondin 1。
本发明的培养基中的另一组必要成分是“激酶抑制剂”，其能够抑制激酶的活性，通常为小分子化合物。在本发明的培养基中同时使用三种激酶抑制剂的组合，即ROCK抑制剂、ALK抑制剂和p38抑制剂，这点是至关重要且具有创新性的。
“ROCK抑制剂”或“Rho激酶抑制剂”是一类对干细胞中的Ras同源基因家族(Rho)激酶具有抑制作用的物质。Rho激酶在调控细胞生长、分裂、迁移、转化和侵袭等方面具有重要作用。Rho激酶有两个亚类，分别称为ROCK1和ROCK2。ROCK抑制剂可以是ROCK1或ROCK2的选择性抑制剂，也可以是ROCK1和ROCK2的双重抑制剂。在本发明优选的实施方案中，所述ROCK抑制剂是ROCK1和ROCK2的双重抑制剂，优选Y-27632。在进一步的实施方案中，本发明的培养基中包含浓度为6-14μM，优选浓度为9-11μM，最优选浓度为10μM的ROCK抑制剂，优选ROCK1和ROCK2的双重抑制剂，最优选Y-27632。
“ALK抑制剂”是对间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)具有抑制作用的物质。在本发明的实施方案中，所述ALK抑制剂优选是A83-01。A83-01能够有效抑制TGF-βI受体ALK5、ALK4和ALK7，能够降低ALK5、ALK4和ALK7这些激酶诱导的转录，同时对于组成型活性的ALK-6、ALK-2、ALK-3和ALK-1也具有弱抑制作用。在进一步的实施方案中，本发明的培养基中包含浓度为350-650nM，优选浓度为400-600nM，更优选浓度为450-550nM，最优选浓度为500nM的ALK抑制剂，优选A83-01。
“p38 MAPK抑制剂”或“p38抑制剂”是指抑制p38丝裂原活化蛋白激酶的活性的物质。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族包含ERK、p38、JNK和ERK5四种亚族，其中p38又进一步包含相互之间具有较高同源性的p38α、p38β、p38γ和p38δ。p38激酶存在于多种肿瘤细胞中表达，但是所起作用因肿瘤类型而异。已经发现了多种p38抑制剂，例如蛋白激酶B和p38的双重抑制剂SB203580，抑制p38α/β/γ/δ的泛p38抑制剂Doramapimod等。在本发明的实施方案中，p38抑制剂优选SB202190。在进一步的实施方案中，本发明的培养基中包含浓度为6-14μM，优选浓度为9-11μM，最优选浓度为10μM的p38抑制剂，优选p38α/β的选择性抑制剂，最优选SB202190。
本领域技术人员可以理解的是，除了上文所列必需包含的细胞因子和激酶抑制剂之外，本发明的培养基还可以额外包含其他添加剂和补充剂，如维生素、氨基酸、蛋白质、激素、盐类等等。
在一个实施方案中，本发明的培养基进一步包含维生素或氨基酸等营养物质，特别是因为不稳定需要在使用前临场添加，和/或因基础培养基、其它补充剂中含量不足以支持目标细胞的培养而需要额外添加的那些。在本发明的具体实施方案中，所述额外添加的氨基酸优选L-谷氨酰胺或N-乙酰半胱氨酸，最优选L-谷氨酰胺和N-乙酰半胱氨酸。在本发明培养基中使用的N-乙酰半胱氨酸的浓度可以是1-1.5mM，优选1.25mM。在本发明的具体实施方案中，所述额外添加的维生素是烟酰胺。在本发明培养基中使用的烟酰胺的浓度可以是4-11mM，优选5mM。
在一个实施方案中，本发明的培养基进一步包含可商购的补充剂，其为多种物质的混合物，优选B27补充剂。所述可商购的补充剂可以以其制造商推荐的浓度使用。
本发明的培养基中还可包含激素，如前列腺素，优选前列腺素E2。在具体的实施方案中，在本发明培养基中使用浓度为0.5-1.5μM，优选0.75-1.25μM，最优选1.0μM的前列腺素，优选前列腺素E2。
在培养基中添加“抗生素”可以避免污染产生，特别是用于控制微生物特别是细菌的污染。然而，本领域技术人员也能够理解，使用抗生素也会带来一些负面效应，比如抗生素可能使得隐蔽性的污染无法被发现，使得支原体感染无法被发现，导致抗生素抗性微生物的产生，还有可能对后续研究产生影响。因此，在本发明中可以任选地添加抗生素。可用于细胞培养的抗生素是本领域技术人员已知的，包括但不限于：作用于细菌(包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌)的抗生素，如氨苄青霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、青霉素；作用于真菌的抗生素，如两性霉素B、制霉菌素；作用于支原体的抗生素，如MRA、环丙沙星。在具体的实施方案中，本发明使用的抗生素为青霉素和链霉素。在本发明的具体实施方案中，使用的抗生素是青霉素和/或链霉素，如100U·ml-1的青霉素和/或100μg·ml-1的链霉素。在进一步的实施方案中，同时使用青霉素和链霉素，如使用100U·ml-1的青霉素和100μg·ml-1的链霉素。
用于本发明的缓冲液可以是常用于细胞培养的Good’s缓冲液如HEPES、Tricine等。在本发明具体的实施方案中，使用HEPES缓冲液，例如以10mM或20mM的浓度使用，优选以10mM的浓度使用。
本领域技术人员应该理解的是可能出现这样的情况，当上文所列的一种或多种额外添加剂或补充剂作为混合物提供时，只要最终获得并用于细胞培养的培养基中包含该添加剂或补充剂并且其含量符合本发明限定的数值范围，则也被认为落入了本发明要求保护的范围。
“三维培养”是相对于在平面上进行的“二维培养”而言的一种培养方法，其特征在于营造一种更近似于体内的生长环境，以便于诱导细胞分化形成三维组织并保持下去，甚至模拟出组织应有的功能。二维细胞培养中的细胞往往贴附于一个二维表面，使得细胞的生长只能在该表面上进行，增殖也只能沿着表面扩张，细胞往往呈纺锤形或扁圆形的附着生长，也无法形成很好的汇集。三维细胞培养技术则是通过利用具有微观“脚手架”结构的支架材料或其他手段，使细胞能够在立体的空间中向各个方向生长、增殖，细胞形态呈不规则多边形或球形，细胞会形成三维网络结构并伴有大量的细胞-基质和细胞-细胞相互作用，并汇集成簇。相较于二维细胞培养，三维细胞培养能够更好地模拟细胞在体内的生长环境，也有望增加细胞间的相互作用和信号传导这些二维培养中缺失的重要因素。
三维培养通常需要通过为培养的细胞提供类似于体内的生长条件以及模拟细胞外基质的物理支持物即支架材料来实现，后者通常包括胶原、纤维素、壳聚糖、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白等，以及可商购的产品如Corning的MatrigelTM系列产品。其多为来源于动物或人体的天然高分子，其所具有的网状结构、成分、生物力学环境适合细胞的增殖、粘附和新陈代谢,而且这些材料抗原性低、无毒性、可降解、能促进细胞生长和粘附，因此越来越受到研究者的重视。在不使用支架材料的情况下，也可以使用其他手段如微载体、磁悬浮等物理手段使细胞悬浮于培养基中，以实现三维培养。
另一方面，由于细胞间相互作用、细胞与基质间的相互作用的复杂性，针对不同来源细胞进行三维细胞培养需要定制的条件。尽管对细胞间相互作用和细胞与基质间的相互作用的认知不断发展，目前仍然需要付出大量实验才能探索出适用于一些特定类型细胞的理想培养条件。同时考虑到体外三维培养通常缺乏体内组织中的毛细血管网络，使得营养物质对细胞的可及性、代谢废物的扩散能力会因为细胞形成的三维堆叠而受到限制，因此培养方法和条件的摸索也至关重要。
“循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)”在本文中是指来源于实体瘤病灶(包括原发灶和转移灶)，并自发地或因诊疗操作脱落释放进入外周血中的肿瘤细胞。CTC根据形态特征可以分为：单个细胞CTC和细胞团CTC。单个细胞CTC中一部分具有干细胞特性，称为循环肿瘤干细胞(Circulating Tumor Stem Cell,CTSC)，其具有自我更新能力、干细胞标志物表达能力、甚至免疫逃逸能力，被认为是肿瘤转移和复发的根源，因此也被认为是肿瘤治疗的重要靶标。肿瘤循环细胞存在于血液中，其可用于预测肿瘤治疗的预后、监控治疗效果。另外，绝大多数因癌致死的患者中都发生了转移，而研究CTC也有助于阐释癌症转移的生物学机理。从血液中获得CTC的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于流式细胞术(FACS)、微流控设备、离心法、密度梯度离心、免疫密度梯度离心、磁珠吸附。然而，血液中的CTC数量非常有限，而其中的CTSC则更为稀少，因此近些年来有诸多研究致力于在体外培养出稳定的CTC和CTSC细胞系。
很多肿瘤细胞在体外难以生长，其原因复杂并且很可能与肿瘤细胞的特殊性有关。肿瘤细胞本是体内的一种调控异常的细胞，其营养需求不同于来源于同样组织的正常细胞，对于不同营养物和刺激物的反应也不同于正常细胞。例如，肿瘤细胞需要的生长因子与正常组织的细胞可能并不相同。在探索肿瘤细胞培养条件的过程中，肿瘤细胞本身的变异性和异质性也使得这项工作变得更为艰难。
肿瘤干细胞的成功培养依赖于多种因素，包括物理化学条件，三维培养所提供的维持干细胞正常活性的“龛位”，细胞间相互作用以及细胞与胞外基质的相互作用的影响。另外，生长因子以及其他信号分子如激素也能促进干细胞功能的获得。目前尚没有建立确切的、普适的保持肿瘤干细胞的培养方法。
肿瘤细胞的成功培养可以通过视觉观察来确定，例如是否成功地形成了具有一定大小的细胞团。除此之外或者可选地，可以通过鉴定相应的肿瘤细胞表达的特异性标志物来确认。例如，可以通过使用特异性结合肿瘤表面抗原的单抗进行免疫荧光染色来确认。所述肿瘤表面抗原包括EpCAM、CD133等。另外，也可以通过测定肿瘤特异性表达的蛋白的转录、表达水平来确认。
“类癌微球”在本文中指通过体外培养CTC细胞形成的细胞团块，其展现出类似于癌症的细胞结构特征并具有一定的体积大小，例如大约50μm左右的直径，并且可以进行传代。类癌微球的成功形成可以通过观察细胞学上的结构来鉴定，流入通过制作病理切片并使用苏木精-伊红染色法(HE染色法)来确认其结构及细胞类型。在本文的上下文中，“类癌微球”与“类癌器官”或“癌类器官”可以互换使用。“类癌器官”或“癌类器官”在本文语境中也可被简称为“类器官”。具体而言，本发明的类器官是肺癌类器官。
本文的方法适用于培养来自患有肺部肿瘤的受试者的循环肿瘤细胞，特别是肺部肿瘤的循环干细胞。在具体的实施方案中，所述肺部肿瘤是良性肿瘤或恶性肿瘤，优选恶性肿瘤。肺部的恶性肿瘤按照形态一般可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌通常可以进一步分为鳞状细胞癌、肺腺癌、大细胞癌。本发明的方法优选用于来自肺鳞癌和肺腺癌患者的循环肿瘤细胞和循环肿瘤干细胞的培养。
本发明的方法包括如下步骤：(1)从患有肺部肿瘤的受试者获得肿瘤细胞，(2)使用本发明的类器官培养基在基质胶中培养步骤(1)获得的肿瘤细胞。
在一个实施方案中，步骤(1)通过从所述受试者的血液样品富集循环肿瘤细胞进行。在一个实施方案中，所述血液样品是外周血样品，优选肺静脉血样品。在使用外周血的情况下，步骤(1)中使用至少约8ml血液。在使用肺静脉血的情况下，步骤(1)中使用至少约4ml血液。
所述富集可以通过本领域已知的方法完成，例如，密度梯度离心，具体而言可以是免疫密度梯度分选。优选地，所述密度梯度离心采用RossetteSepTM方法进行。
本发明的基质胶优选Matrigel。如本领域技术人员所知，Matrigel是一种可商购的产品。
细胞培养过程中的温度、pH、氧气水平、二氧化碳/碳酸水平、渗透压和表面张力都会对培养造成影响，其可以通过调节培养基组成或培养环境来调整至合适的值。通常而言，可以将这些参数调整至与被培养的细胞在体内所处环境所具有的相类似的参数值。在具体的实施方案中，本发明的培养基的pH值约为7.2-7.4。
具体实施方式
为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例1.使用类器官培养基培养肺腺癌患者的循环肿瘤细胞
按照表1所示配方根据本领域的常规方法配制用于培养来自肺癌患者的肿瘤循环细胞的类器官培养基。本实施例中采用的是表1中第3栏的具体浓度，各成分来源参见表1中的第2栏。本领域技术人员能够了解，虽然本实施例中列明了各成分的具体厂商和批号，但是本发明不限于这些具体的可商购成分，而是同时还包括它们的等效物。表1中的第4栏给出了各个成分在本发明中的浓度范围，以供参考。
表1
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Figure BDA0002311613210000141
发明人在调整实验培养基配方的过程中发现，细胞因子特别是生长因子的组合或含量对于细胞培养至关重要。在将EGF、FGF2、FGF10中任何一个从培养基中去掉时，细胞培养变得比较困难。R-Spondin1和Noggin的添加量也对细胞培养的结果有影响，当添加的量过小(即低于上文表1中第4栏浓度范围的下限值)时，细胞生长会受到影响，导致无法获得健康的细胞克隆(图6)。
按照如下步骤对来自肺癌患者的细胞进行培养。
循环肿瘤细胞的富集：
1)将4ml肺静脉血加入200μlRossetteSepTM CD45耗尽混合物(depletioncocktail)，在室温下孵育20min后，加入与样品等量的(4ml)PBS+2％FBS并充分混匀以稀释样品。
2)向15ml离心管中加入4ml密度离心液(ficoll)，然后将步骤1)中获得的稀释样品小心地加入到ficoll上，注意贴壁添加，动作轻柔、迅速。
3)在室温下以1200g离心20min使血浆层与ficoll层分离，松开离心机刹车，结束后将温度设置为4度。
4)去除血浆，从分离层(血浆层与ficoll层之间)吸取富集的细胞约2ml，移至新的15ml离心管中，并向其中加入4mlPBS+2％FBS并充分混匀。
5)在4度以200g离心10min。
富集细胞的培养：
6)准备基质胶Matrigel，预冷200μl枪头并预热24孔板。
7)将步骤5)中离心后的样品中的上清去除，加入1ml无血清adDMEM/F12+/+/+(adDMEM/F12，事先加入了青霉素/链霉素、10mM HEPES和2mMGlutaMAX)培养基，在室温以200g离心5min。
8)去除上清，保留10μl液体。
9)加入步骤6)中准备好的40μl基质胶并混匀，然后滴加到24孔板的孔中央，并将24孔板置于培养箱中，在37℃、5％CO2条件下培养。
10)5min后迅速翻转24孔板，再放置10min。
11)加入0.5ml配制好的类器官培养基。
12)每隔3天更换一次新鲜的类器官培养基，2-3周进行传代。
根据上述方法对来自肺腺癌患者的循环肿瘤细胞进行了培养，在7天时获得了直径大约50μm的细胞团(图1)。
为了鉴定细胞团的细胞组成，使用抗EpCAM单抗和抗CD133单抗对细胞团进行了免疫荧光染色，结果均呈现阳性(图4，左上和右上小图)，表明培养形成的细胞团中的细胞具有所述两种肿瘤细胞特异性蛋白的表达，进而说明通过本发明的方法能够直接以患者血液为起点，基于血液中的循环肿瘤细胞成功培养出肿瘤类器官。
实施例2.使用类器官培养基培养肺鳞癌患者的循环肿瘤细胞
使用与实施例1相同的培养基和方法，对来自肺鳞癌患者的血液样品进行了处理，通过富集并培养该血液样品中的循环肿瘤细胞，成功获得了肿瘤类器官(图3)。
实施例3.培养细胞的干性
为了确定通过本发明的三维培养获得的细胞团是否保留了肿瘤干细胞的干性，发明人对干性相关基因CD133、CD44和ABCG2的表达水平进行了测定，并与在普通二维(2D)培养条件下使用相同培养基培养的模拟样本中相关基因的表达水平进行了比较，模拟样本通过向4ml外周血中加入10个肿瘤细胞系细胞(人非小细胞肺癌细胞H2347细胞)获得，结果如图5所示。从图5中可以看出，在通过本发明的三维(3D)培养方法获得的细胞团中，CD133和ABCG2的表达水平显著高于普通2D培养的细胞，其中3D培养细胞的CD133表达水平是2D培养细胞的两百多倍，ABCG2的表达水平也为2D培养细胞的约5倍，说明3D培养细胞表现出更强的干性。

Claims (18)

1.一种用于体外培养肺部肿瘤细胞的培养基，所述培养基包含细胞因子和激酶抑制剂，所述细胞因子包含EGF、FGF2、FGF10、头蛋白(Noggin)和R-Spondin或由EGF、FGF2、FGF10、头蛋白(Noggin)和R-Spondin组成，所述激酶抑制剂包含ROCK抑制剂、ALK抑制剂和p38抑制剂或由ROCK抑制剂、ALK抑制剂和p38抑制剂组成。
2.权利要求1的培养基，所述培养基包含3-7ng/ml的EGF，15-35ng/ml的FGF2，50-150ng/ml的FGF10，50-150ng/ml的头蛋白，350-650ng/ml的R-Spondin 1；以及6-14μM的ROCK抑制剂，350-650nM的ALK抑制剂，6-14μM的p38抑制剂。
3.权利要求2的培养基，所述培养基包含3-7ng/ml的EGF，15-35ng/ml的FGF2，50-150ng/ml的FGF10，50-150ng/ml的头蛋白，350-650ng/ml的R-Spondin 1；以及6-14μM的Y-27632，350-650nM的A83-01，6-14μM的SB202190。
4.权利要求1至3中任一项的培养基，进一步包含4-11mM的烟酰胺。
5.权利要求1至4中任一项的培养基，进一步包含1-1.5mM的L-谷氨酰胺和/或1-1.5mM的N-乙酰半胱氨酸。
6.权利要求1至5中任一项的培养基，进一步包含0.5-1.5μM的前列腺素E2。
7.权利要求1至6中任一项的培养基，所述肺部肿瘤细胞是来自受试者血液的循环肿瘤细胞(CTC)。
8.一种细胞培养方法，其使用权利要求1至7中任一项的培养基。
9.一种肺部肿瘤细胞的三维培养方法，包括如下步骤：
(1)从患有肺部肿瘤的受试者获得肿瘤细胞，和
(2)使用权利要求1至7中任一项的培养基和基质胶培养步骤(1)获得的肿瘤细胞。
10.权利要求9的方法，步骤(1)通过从所述受试者的血液样品富集循环肿瘤细胞进行。
11.权利要求10的方法，所述血液样品是肺静脉血样品。
12.权利要求11的方法，所述血液样品不少于3ml。
13.权利要求10至12中任一项的方法，所述富集通过密度梯度离心进行。
14.权利要求9至13中任一项的方法，所述基质胶为MatrigelTM。
15.权利要求9至14中任一项的方法，在步骤(2)中先将基质胶与富集的细胞混合，待凝固后再加入所述培养基。
16.细胞因子和激酶抑制剂的组合在前列腺肿瘤细胞的培养中的用途，所述细胞因子包含EGF、FGF2、FGF10、头蛋白(Noggin)和R-Spondin或由EGF、FGF2、FGF10、头蛋白(Noggin)和R-Spondin组成，所述激酶抑制剂包含ROCK抑制剂、ALK抑制剂和p38抑制剂或由ROCK抑制剂、ALK抑制剂和p38抑制剂组成。
17.权利要求16的用途，所述前列腺肿瘤细胞是来自受试者血液的循环肿瘤细胞(CTC)。
18.权利要求16或17的用途，其中所述细胞因子和激酶抑制剂包含在培养基中使用。
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