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CN111334472A - Pbmc体外3d胶原蛋白水凝胶培养基及其制备方法 - Google Patents

Pbmc体外3d胶原蛋白水凝胶培养基及其制备方法 Download PDF

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CN111334472A CN202010228132.5A CN202010228132A CN111334472A CN 111334472 A CN111334472 A CN 111334472A CN 202010228132 A CN202010228132 A CN 202010228132A CN 111334472 A CN111334472 A CN 111334472A
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Abstract

本发明公开了一种PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基，所述培养基含有以下组分：1640培养液、胎牛血清、胶原蛋白；各组分含量如下：1640培养液10mg/mL，胎牛血清10‑20v/v％，胶原蛋白1.5‑2.5mg/mL。本发明还公开了PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基的制备方法。本发明通过将胶原蛋白与适合的培养基结合，通过对二者配比进行优化，配制成稳定的PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基，对PBMC细胞培养能够达到较高的扩增倍数及细胞纯度，在细胞形态、增殖分化、功能活性方面与体内接近，可用于体外诊断目的的PBMC培养，从而为进一步的检测奠定了基础。

Description

PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种人外周血单个核细胞体外3D胶原蛋白水凝胶培养基及其制备方法。
背景技术
体外细胞培养是指通过模拟机体内的生理条件，将从生物机体内取出的器官、组织或细胞等，在体外进行培养，并使其继续生存、生长和繁殖的过程。体外细胞培养已经成为现代生物研究的基本技术之一，广泛应用于现代生物医学和生物科学研究的各个方面。
目前，体外细胞水平的研究很大程度上是在二维培养条件下完成的。当细胞在二维条件下生长时，由于细胞与其基质之间复杂的细胞信号无法再现，细胞逐渐丧失了其体内原有的性状，在形态、结构和功能方面都与其在体内自然生长的状态相去甚远，因此体外实验数据无法完全转化为临床试验。近年来发展的3D(三维，three-dimensional)细胞培养技术则是应对这一挑战，作为一个更好的模型而更准确地体现体内生理条件，因此3D体外细胞培养方法获得的细胞在形态结构、增殖分化、基因表达及细胞的功能活动等方面均与二维培养存在显著不同。3D细胞培养能更好的模拟体内细胞生长的微环境，克服二维细胞培养方式的缺陷，为细胞水平的研究提供了一种更简单、更安全、更可靠的方法。
细胞在体外培养主要呈现悬浮型和贴壁型两种状态。其中贴附型细胞包括1、成纤维细胞型；2、上皮型细胞；3、游走细胞型；4、多型细胞型。悬浮型细胞见于少数特殊的细胞，如PBMC(外周血单个核细胞)、某些类型的癌细胞及白血病细胞。悬浮型细胞胞体呈圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。与之对应，细胞体外培养也分为两大类如下：
一、贴壁培养法：指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长，大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。其基本操作过程是：先将采集到的活体动物组织在无菌条件下采用物理(机械分散法)或化学(酶消化法)的方法分散成细胞悬液，经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿(瓶、板)中，再放入二氧化碳培养箱进行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察，适于实验室研究。但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性，一旦细胞形成单层，生长就会受到抑制，细胞产量有限。如要继续培养，还需将已形成单层的细胞再分散，稀释后重新接种，然后进行传代培养。
二、悬浮培养法：指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程，使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。悬浮培养法是在微生物发酵的基础上发展起来的，主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如人外周血单个核细胞(PBMC)、杂交瘤细胞等。该法将采集到的活体动物组织分散、过滤、离心、纯化、漂洗后接种到适宜的培养液中，并置于特定条件下进行自由悬浮培养。便于进行定量研究。适于悬浮培养的动物细胞种类很少，大多数动物细胞属于贴壁依赖性的，因此不能悬浮培养。
胶原是生物体内一种纤维蛋白，由三股缠绕形成多肽链组，主要存在于皮肤、骨、软骨及肌腱等组织中，以纤维形式形成胶原，占人体或其他动物体总蛋白含量的25％-30％。胶原蛋白相对分子质量从约2kD至300kD不等，具有很强的延伸力，不溶于冷水、稀酸、稀碱溶液，具有良好的保水性和乳化性。胶原蛋白不易被一般的蛋白酶水解，但能被动物胶原酶断裂，断裂的碎片自动变性，可被普通蛋白酶水解。当环境pH低于中性时，胶原的变性温度为40～41℃，当环境pH为酸性时，胶原的变性温度为38～39℃。胶原蛋白因其优良的生物学特性而广泛地应用于生物医用材料领域。胶原蛋白具有诸多优势，如低抗原性、生物可降解性、优越的生物相容性并有利于细胞贴附和迁移等特点，为细胞增殖和功能分化提供了合适的微环境，是开发具有相关功能性生物医疗器械的好材料。
发明内容
PBMC作为悬浮型细胞，更适合于使用3D培养体系进行体外培养，本发明提供了一种均一、稳定的PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基及其制备方法。具体技术方案如下：
一种PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基，所述培养基含有以下组分：1640培养液、胎牛血清、胶原蛋白；各组分含量如下：1640培养液10mg/mL，胎牛血清10-20v/v％，胶原蛋白1.5-2.5mg/mL。
一种PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、细胞液体积计算：根据所要配制3D胶原蛋白培养基的体积E mL、终细胞浓度浓度G万/mL，由待培养细胞液浓度X万/mL计算所需细胞液体积YmL＝E*G/X；
步骤二、取胶原蛋白并调pH：在4℃及无菌的条件下，吸取一定体积浓度为5mg/mL牛皮或鼠尾胶原蛋白备用；如果胶原蛋白的pH值为7.0-7.4，则直接使用；如果胶原蛋白为酸性，则需要使用适量1N NaOH溶液调节pH值至7.0-7.4；
步骤三、配制3D胶原蛋白培养基：在4℃及无菌的条件下，依次加入胎牛血清、1640培养液、提前配制好的Y mL细胞液，快速混合；
步骤四、根据实验需要，将配制好的包含细胞的3D胶原蛋白培养基加入到培养皿，然后放置在37℃、95％CO2培养箱中，30-60min即可观察到水凝胶形成。
本发明通过将胶原蛋白与适合的培养基结合，通过对二者配比进行优化，配制成稳定的PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基，对PBMC细胞培养能够达到较高的扩增倍数及细胞纯度，在细胞形态、增殖分化、功能活性方面与体内接近，可用于体外诊断目的的PBMC培养，从而为进一步的检测奠定了基础。
本发明提供的PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基及其制备方法，与现有技术相比具有以下有益效果：
1.本发明提供的PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基配方简单、制备容易、成本可控，有利于大规模、标准化生产；
2.本发明提供的PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基用于体外诊断目的的PBMC培养，可以充分模拟和反映PBMC在体内的生理活性，从而为进一步检测奠定基础。
附图说明
图1为不同胶原蛋白含量的PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基PBMC细胞培养刃天青染色结果。
图2为不同胶原蛋白含量的PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基PBMC细胞培养活性细胞荧光结果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图及本发明的优选实施例进行详细描述。
实施例1
一种PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基，所述培养基含有以下组分：1640培养液、胎牛血清、胶原蛋白；各组分含量如下：1640培养液10mg/mL，胎牛血清12.5v/v％，胶原蛋白1.5mg/mL。
以配制10mL胶原蛋白浓度1.5mg/mL，终细胞浓度为30万/mL的3D培养基为例，具体步骤如下：
步骤一、细胞液体积计算：确定待培养细胞液浓度为X万/mL，则需要细胞液体YmL＝10*30/X＝300/X；例如待培养细胞液浓度为80万/mL，则需要细胞液3.75mL；
步骤二、取胶原蛋白并调pH：在4℃及无菌的条件下，吸取3mL浓度为5mg/mL的牛皮或鼠尾胶原蛋白备用；如果胶原蛋白的pH值为7.0-7.4，则直接使用；如果胶原蛋白为酸性，则需要使用适量1N NaOH调节pH值至7.0-7.4；
步骤三、细胞分离：
1.取血液5mL；
2.加Hanks液2mL适度稀释血液；
3.稀释血液
3.1.取淋巴细胞分离液置于离心管内，在分离液上层1cm处缓慢加入稀释血液(稀释血液与分离液体积比例为2:1)；
4.离心
4.1.离心条件：2500rpm，25min；
5.吸取白膜层；
6.洗涤白膜层
6.1.将白膜层吸取到新的离心管中，加两倍PBS稀释后离心(1500rpm，5min)；
6.2.离心(1500rpm，5min)后，再次弃去上清液，加同等量PBS再次洗涤；
7.计数
7.1.离心后，弃去上清液，加入1mL培养基吹打均匀；
7.2.将吹打均匀的细胞予以稀释(稀释比例为：10ul cell悬液+90ul培养基)；
7.3.计数得:细胞总数/4×10cells/mL；
8.细胞培养
8.1.配置细胞培养液：主要成份为1640培养基(10mg/mL)、胎牛血清(15％v/v％)；
8.2.每一百万细胞加1mL培养液(根据实验调整密度，最大密度不超过200万/mL)，如：计数为一千三百万，即加培养液10.3mL；
8.3.阴性对照：从上步已配好的细胞培养液中抽取1mL，作为阴性对照；
8.4.其它含细胞的培养液作为试验细胞培养标本，加入PHA(3ul/mL)，混匀待用；
步骤四、配制3D胶原蛋白培养基：在4℃及无菌的条件下，依次加入按步骤二配置的胶原蛋白4mL，1.25mL胎牛血清、5X 1640培养液1mL、按步骤三配制好的细胞液2mL，最后使用1640培养液1.75mL达到终培养液体积为10mL(1640终浓度10mg/mL，胎牛血清终浓度12.5％，胶原蛋白浓度2mg/mL)；
步骤五、将配制好的包含细胞的3D胶原蛋白培养基充分混合后加入到培养皿，25-30℃放置30分钟形成水凝胶，然后放置在37℃、95％CO2培养箱中培养。
实施例2
一种PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基，所述培养基含有以下组分：1640培养液、胎牛血清、胶原蛋白；各组分含量如下：1640培养液10mg/mL，胎牛血清12.5v/v％，胶原蛋白2.5mg/mL。
以配制10mL胶原蛋白浓度2mg/mL，终细胞浓度为20万/mL的3D培养基为例，具体步骤如下：
步骤一、细胞液体积计算：确定待培养细胞液浓度为X万/mL，则需要细胞液体YmL＝10*20/X＝200/X；例如待培养细胞液浓度为100万/mL，则需要细胞液2mL；
步骤二、取胶原蛋白并调pH：在4℃及无菌的条件下，吸取5mL浓度为5mg/mL的牛皮或鼠尾胶原蛋白备用；如果胶原蛋白的pH值为7.0-7.4，则直接使用；如果胶原蛋白为酸性，则需要使用适量1N NaOH调节pH值至7.0-7.4；
步骤三、细胞分离：
1.取血液5mL；
2.加Hanks液2mL适度稀释血液；
3.稀释血液
3.1.取淋巴细胞分离液置于离心管内，在分离液上层1cm处缓慢加入稀释血液(稀释血液与分离液体积比例为2:1)；
4.离心
4.1.离心条件：2500rpm，25min；
5.吸取白膜层；
6.洗涤白膜层
6.1.将白膜层吸取到新的离心管中，加两倍PBS稀释后离心(1500rpm，5min)；
6.2.离心(1500rpm，5min)后，再次弃去上清液，加同等量PBS再次洗涤；
7.计数
7.1.离心后，弃去上清液，加入1mL培养基吹打均匀；
7.2.将吹打均匀的细胞予以稀释(稀释比例为：10ul cell悬液+90ul培养基)；
7.3.计数得:细胞总数/4×10cells/mL；
8.细胞培养
8.1.配置细胞培养液：主要成份为1640培养基(10mg/mL)、胎牛血清(15％v/v％)；
8.2.每一百万细胞加1mL培养液(根据实验调整密度，最大密度不超过200万/mL)，如：计数为一千三百万，即加培养液10.3mL；
8.3.阴性对照：从上步已配好的细胞培养液中抽取1mL，作为阴性对照；
8.4.其它含细胞的培养液作为试验细胞培养标本，加入PHA(3ul/mL)，混匀待用；
步骤四、配制3D胶原蛋白培养基：在4℃及无菌的条件下，依次加入按步骤二配置的胶原蛋白5mL，1.25mL胎牛血清、6X 1640培养液1mL、按步骤三配制好的细胞液2mL，最后使用1640培养液0.75mL达到终培养液体积为10mL(1640终浓度10mg/mL，胎牛血清终浓度12.5％，胶原蛋白浓度2.5mg/mL)；
步骤五、将配制好的包含细胞的3D胶原蛋白培养基充分混合后加入到培养皿，25-30℃放置45分钟形成水凝胶，然后放置在37℃、95％CO2培养箱中培养。
采用本发明实施例1～2提供的培养基对PBMC细胞进行培养，在培养第4天采取刃天青染色及酶标仪读取荧光读数(反映活细胞数量)，结果如图1和图2所示。
结果分析：
从图1阳性和阴性培养结果(阴、阳性的区别在于是否添加淋巴细胞增生刺激剂PHA)对比可以看出，在本发明提供的胶原蛋白3D培养体系下，淋巴细胞在阴、阳性环境下均保持了细胞的活性；
从图2可知，本发明提供的胶原蛋白3D培养体系下，阳性环境检测到的活性细胞荧光数显著高于阴性环境，表明可以反映代表细胞数量和活性，从而为体外定性和半定量检测淋巴细胞数量和活性建立基础。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基，其特征在于，所述培养基含有以下组分：1640培养液、胎牛血清、胶原蛋白；各组分含量如下：1640培养液10mg/mL，胎牛血清10-20v/v％，胶原蛋白1.5-2.5mg/mL。
2.一种权利要求1所述PBMC体外3D胶原蛋白水凝胶培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、细胞液体积计算：根据所要配制3D胶原蛋白培养基的体积E mL、终细胞浓度浓度G万/mL，由待培养细胞液浓度X万/mL计算所需细胞液体积YmL＝E*G/X；
步骤二、取胶原蛋白并调pH：在4℃及无菌的条件下，吸取一定体积浓度为5mg/mL牛皮或鼠尾胶原蛋白备用；如果胶原蛋白的pH值为7.0-7.4，则直接使用；如果胶原蛋白为酸性，则需要使用1N NaOH溶液调节pH值至7.0-7.4；
步骤三、配制3D胶原蛋白培养基：在4℃及无菌的条件下，依次加入胎牛血清、1640培养液、提前配制好的Y mL细胞液，快速混合；
步骤四、根据实验需要，将配制好的包含细胞的3D胶原蛋白培养基加入到培养皿，然后放置在37℃、95％CO2培养箱中，30-60min即可观察到水凝胶形成。
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