CN113416702A - 造血干细胞体外3d水凝胶培养体系及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的主要目的在于提供一种造血干细胞体外3D水凝胶培养体系及其构建方法，其中：所述造血干细胞体外3D水凝胶培养体系的构建方法包括：获取原代骨髓造血干细胞；采用含有胎牛血清的IMDM培养基重悬造血干细胞；将I型胶原蛋白酸性溶液、1N氢氧化钠溶液、10xPBS混匀，待PH调至中性后加入造血干细胞混匀并形成水凝胶；向水凝胶中加入含胎牛血清及细胞因子的IMDM培养液；分别配制胶原酶溶液和柠檬酸钠缓冲液，分别向水凝胶中加入柠檬酸钠缓冲液和胶原酶溶液，溶解水凝胶并收集细胞。本发明具有细胞相容性良好，适宜的机械强度，易于降解，可维持细胞干性和髓系分化能力的性能。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种造血干细胞体外3D水凝胶培养体系及其构建方法。
背景技术
现有技术多采用普通悬浮培养体系通过添加不同的细胞因子组合，来进行造血干细胞的体外培养和定向调控，但悬浮培养体系缺乏力学支撑，并不能完全模拟造血干细胞所处的真实的体内微环境；
也有部分研究采用合成高分子材料制备的二维或三维纳米纤维支架，具有一定的粘弹性，虽然能够提供细胞生存的物理支撑，取得了一定的进展。但由于高分子材料的毒性较大、生物相容性较差，机械性能过强等因素，存在细胞扩增或分化效果不理想，难以从支架材料上分离，分离过程易造成细胞损伤等问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种造血干细胞体外3D水凝胶培养体系及其构建方法，以解决现有技术存在的上述问题，其中：
根据本发明实施例提出一种造血干细胞体外3D水凝胶培养体系，其包括以下组分：海藻酸钠、I型胶原蛋白、IMDM培养基、胎牛血清、生长因子；其中，海藻酸钠0.05-0.5wt％、I型胶原蛋白1-3mg/mL、IMDM培养基10mg/mL、胎牛血清10v/v％。
其中，所述IMDM培养基包括：SCF 50ng/ml、Flt3L 20ng/ml、TPO 20ng/ml。
根据本发明实施例还提出一种造血干细胞体外3D水凝胶培养体系的构建方法，其包括：获取原代骨髓造血干细胞；采用含有胎牛血清的IMDM培养基重悬造血干细胞；将I型胶原蛋白酸性溶液、1N氢氧化钠溶液、10xPBS混匀，待PH调至中性后加入造血干细胞混匀并形成水凝胶；向水凝胶中加入含胎牛血清及细胞因子的IMDM培养液；分别配制胶原酶溶液和柠檬酸钠缓冲液，分别向水凝胶中加入柠檬酸钠缓冲液和胶原酶溶液，溶解水凝胶并收集细胞。
其中，所述方法还包括：配制海藻酸钠溶液，将海藻酸钠溶液与I型胶原蛋白酸性溶液、1N氢氧化钠溶液、10xPBS混匀，待PH调至中性后加入造血干细胞混匀并形成水凝胶；向水凝胶表面滴加CaCl2溶液，使CaCl2与海藻酸钠进行交联以增强水凝胶的基质刚度；洗去水凝胶的CaCl2溶液。
其中，所述配制海藻酸钠溶液的步骤包括：将海藻酸钠粉溶解于无菌去离子水中，得到海藻酸钠溶液；对海藻酸钠溶液进行高温高压灭菌处理。
其中，所述获取原代骨髓造血干细胞步骤包括：采集骨髓，通过密度梯度离心法收集得到骨髓单个核细胞；磁珠分选出骨髓单个核细胞中的Lin-祖细胞；磁珠分选出骨髓单个核细胞中的Lin-CD117+细胞。
其中，所述IMDM培养基包括：以下细胞因子：SCF、TPO、Flt3L。
根据本发明的造血干细胞体外3D水凝胶培养体系，具有细胞相容性良好，适宜的机械强度，易于降解，可维持细胞干性和髓系分化能力的性能。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是根据本发明实施例的造血干细胞体外3D水凝胶培养体系的构建方法的流程图；
图2A和图2B是根据本发明实施例构建的三维水凝胶培养体系的细胞相容性检测的示意图；
图3是根据本发明实施例构建的三维水凝胶培养体系(3D)与二维水平的培养(2D)和常规流体培养(NC)的造血干细胞体外扩增效果的示意图；
图4A和图4B是根据本发明实施例构建的三维水凝胶培养体系(3D)可调控巨噬细胞系的分化示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下结合附图，详细说明本发明各实施例提供的技术方案。
图1是根据本发明实施例的造血干细胞体外3D水凝胶培养体系的构建方法的流程图，该方法包括以下步骤：
步骤S102，获取原代骨髓造血干细胞；
步骤S104，采用含有胎牛血清的IMDM培养基重悬造血干细胞；
其中，胎牛血清10v/v％，IMDM培养基包括SCF 50ng/ml,Flt3L 20ng/ml,TPO20ng/ml。
步骤S106，将I型胶原蛋白酸性溶液、1N氢氧化钠溶液、10xPBS混匀，待PH调至中性后加入造血干细胞混匀并形成水凝胶；
步骤S108，向水凝胶中加入含胎牛血清及细胞因子的IMDM培养液；
步骤S110，分别配制胶原酶溶液和柠檬酸钠缓冲液，分别向水凝胶中加入柠檬酸钠缓冲液和胶原酶溶液，溶解水凝胶并收集细胞。
在本申请的一些实施例中，水凝胶的组分中还可包括海藻酸钠溶液，也就是说，三维胶原水凝胶细胞培养体系具体包括以下组分：海藻酸钠、I型胶原蛋白、IMDM培养基、胎牛血清、生长因子。其中，各组分含量为：海藻酸钠0.05-0.5wt％，胶原I1-3mg/mL，IMDM培养基10mg/mL，胎牛血清10v/v％，SCF 50ng/ml,Flt3L 20ng/ml,TPO 20ng/ml。
然后，向水凝胶表面滴加CaCl2溶液，使CaCl2与海藻酸钠进行交联以增强水凝胶的基质刚度。接下来，洗去水凝胶的CaCl2溶液后，加入含胎牛血清及细胞因子的IMDM培养液。
下面结合附图详细描述本申请实施例。
根据本申请实施例一的HSCs体外3D水凝胶培养体系的构建方法包括以下步骤：
一、获取原代骨髓造血干细胞。
1、采集骨髓，采用密度梯度离心法收集细胞，加入4℃预冷的PBS缓冲液洗涤2次，弃上清后，得到骨髓单个核细胞；
2、磁珠分选Lin-祖细胞。
(1)免疫磁珠标记单个核细胞。
每108个细胞用400μl磁珠分选缓冲液重悬，加入100μl生物素抗体混合物标记细胞；轻柔混匀，置于4℃孵育10min；加入300μl磁珠分选缓冲液；加入200μl抗生物素微珠，混匀后置于4℃孵育15min；加入10ml磁珠分选缓冲液，300Xg，10min，弃上清；加入500ul缓冲液重悬细胞；
(2)磁性分选阴性细胞。
将MAC中型磁头紧贴于磁架正中位置，放置LS分选柱；用3ml缓冲液充分浸润分选柱；将标记好的骨髓单个核细胞悬液从中间位置匀速滴加进分选柱，避免产生气泡，从分选柱下收集Lin-细胞；将分选柱用3ml缓冲液冲洗3次；将收集好的Lin-悬液进行细胞计数；
3、磁珠分选Lin-CD117+细胞。
(1)免疫磁珠标记Lin-细胞。
将步骤2收集的Lin-细胞悬液离心，300g，5min，弃上清；每108个细胞加入800μl的磁珠分选缓冲液；加入200μl CD117微珠标记Lin-细胞；轻柔混匀并置于4℃孵育15min；加入10ml缓冲液，300×g，10min，弃上清；加入500μl缓冲液备用；
(2)磁性分选阳性细胞。
将MAC小型磁头紧贴于磁架正中位置，放置MS分选柱；用500μl缓冲液充分浸润分选柱；将标记好CD117抗体的Lin-细胞悬液从中间位置匀速滴加进分选柱，避免产生气泡；将分选柱用500μl缓冲液冲洗3次；将结合有阳性细胞的MS柱移出磁场，置于干净的15ml离心管上；向分选柱中心匀速滴加1ml缓冲液，用MS柱适配的活塞轻轻加压推出带有磁性标记的阳性细胞；将收集好的Lin-CD117+细胞进行细胞计数；
二、三维水凝胶细胞培养体系制备，其中体系组分包括：IMDM培养基、胎牛血清、胶原I、生长因子；各组分含量如下：胶原I1-3mg/mL，IMDM培养基液10mg/mL，胎牛血清10v/v％，SCF 50ng/ml,Flt3L 20ng/ml,TPO 20ng/ml。
1、配制含有胎牛血清10v/v％，SCF 50ng/ml,Flt3L 20ng/ml,TPO 20ng/ml的IMDM培养基，用新鲜配制的培养基重悬造血干细胞；
2、将I型胶原蛋白酸性溶液，1N氢氧化钠溶液，10xPBS，预冷后取出，置于冰上操作；
3、取1-3mg胶原，迅速混匀置于冰上预冷2min；
4、预冷后取出，用氢氧化钠溶液和调整PH至中性；
5、加入100μl 10xPBS，迅速混匀，预冷；
6、加入5x105个新鲜提取的造血干细胞，轻柔混匀；
7、加入无菌水将体系体积补足至1ml；
8、将步骤2所得的胶原蛋白-细胞混合液铺于12孔板内，1ml/孔，置于37℃细胞培养箱30min；
9、成胶后取出孔板，加入含细胞因子(SCF+TPO+Flt3L)的IMDM培养基，置于37℃细胞培养箱进行细胞培养。
三、胶原水凝胶体系的降解及细胞分离。
1、配制胶原酶溶液。
(1)称取50-100mg胶原酶粉末，加入无菌去离子水定容至50ml，配制成1-2mg/ml的胶原酶溶液；
(2)待粉末完全溶解，用一次性滤器进行过滤除菌；
(3)用无菌离心管收集后分装，-20℃保存待用；
2、水凝胶的消化。
(1)吸取水凝胶上的培养液，每孔加入1ml胶原酶溶液，37℃下孵育1h；
(2)轻微晃动，待胶原水凝胶完全消化溶解后，离心1000rpm，5min收集细胞。
根据本申请实施例二的HSCs体外3D水凝胶培养体系的构建方法包括以下步骤：
一、配制海藻酸钠溶液。
1、称量0.5-1g海藻酸钠粉末，在晃动下慢慢地加250mL到无菌锥形瓶中，持续晃动，直至所有海藻酸钠粉末润湿且分散均匀；
2、取80mL无菌去离子水加入锥形瓶中，搅拌，放入60℃水浴锅加热12h；
3、采用高温高压灭菌锅进行灭菌，120℃，20min，灭菌结束后，室温下降温，加适量无菌去离子水定容到100mL，冷却后置于冰箱内4℃保存待用。
二、获取原代骨髓造血干细胞。
1、采集骨髓，采用密度梯度离心法收集细胞，加入4℃预冷的PBS缓冲液洗涤2次，弃上清后，得到骨髓单个核细胞；
2、磁珠分选Lin-祖细胞。
(1)免疫磁珠标记单个核细胞。
每108个细胞用400μl磁珠分选缓冲液重悬，加入100μl生物素抗体混合物标记细胞；轻柔混匀，置于4℃孵育10min；加入300μl磁珠分选缓冲液；加入200μl抗生物素微珠，混匀后置于4℃孵育15min；加入10ml磁珠分选缓冲液，300Xg，10min，弃上清；加入500ul缓冲液重悬细胞。
(2)磁性分选阴性细胞。
将MAC中型磁头紧贴于磁架正中位置，放置LS分选柱；用3ml缓冲液充分浸润分选柱；将标记好的骨髓单个核细胞悬液从中间位置匀速滴加进分选柱，避免产生气泡，从分选柱下收集Lin-细胞；将分选柱用3ml缓冲液冲洗3次；将收集好的Lin-悬液进行细胞计数。
3、磁珠分选Lin-CD117+细胞。
(1)免疫磁珠标记Lin-细胞。
将步骤2收集的Lin-细胞悬液离心，300g，5min，弃上清；每108个细胞加入800μl的磁珠分选缓冲液；加入200μl CD117微珠标记Lin-细胞；轻柔混匀并置于4℃孵育15min；加入10ml缓冲液，300×g，10min，弃上清；加入500μl缓冲液备用。
(2)磁性分选阳性细胞。
将MAC小型磁头紧贴于磁架正中位置，放置MS分选柱；用500μl缓冲液充分浸润分选柱；将标记好CD117抗体的Lin-细胞悬液从中间位置匀速滴加进分选柱，避免产生气泡；将分选柱用500μl缓冲液冲洗3次；将结合有阳性细胞的MS柱移出磁场，置于干净的15ml离心管上；向分选柱中心匀速滴加1ml缓冲液，用MS柱适配的活塞轻轻加压推出带有磁性标记的阳性细胞；将收集好的Lin-CD117+细胞进行细胞计数。
三、三维水凝胶细胞培养体系制备，其中体系组分包括：IMDM培养基、胎牛血清、海藻酸钠、胶原I、生长因子；各组分含量如下：海藻酸钠0.05-0.1wt％，胶原I1-3mg/mL，IMDM培养基液10mg/mL，胎牛血清10v/v％，SCF 50ng/ml,Flt3L 20ng/ml,TPO 20ng/ml。
1、配制含有胎牛血清10v/v％，SCF 50ng/ml、Flt3L 20ng/ml、TPO 20ng/ml的IMDM培养基，用新鲜配制的培养基重悬造血干细胞；
2、将I型胶原蛋白酸性溶液，1N氢氧化钠溶液，10xPBS，海藻酸钠溶液及10-60mg/ml CaCl2溶液预冷后取出，置于冰上操作；
3、取1-3mg胶原，加入100μl海藻酸钠溶液，迅速混匀置于冰上预冷2min；
4、预冷后取出，用氢氧化钠溶液和调整PH至中性；
5、加入100μl 10xPBS，迅速混匀，预冷；
6、加入5x105个新鲜提取的造血干细胞，轻柔混匀；
7、加入无菌水将体系体积补足至1ml；
8、将步骤2所得的胶原蛋白-细胞混合液铺于12孔板内，1ml/孔，置于37℃细胞培养箱30min；
9、成胶后取出，向水凝胶表面均匀滴加1ml 10-60mg/ml CaCl2，置于37℃细胞培养箱交联20min；
10、取出孔板，吸走CaCl2，利用hepes缓冲液清洗3次，加入含细胞因子(SCF+TPO+Flt3L)的IMDM培养基，置于37℃细胞培养箱进行细胞培养。
四、胶原水凝胶体系的降解及细胞分离。
1、配制胶原酶溶液。
称取50-100mg胶原酶粉末，加入无菌去离子水定容至50ml，配制成1-2mg/ml的胶原酶溶液；待粉末完全溶解，用一次性滤器进行过滤除菌；用无菌离心管收集后分装，-20℃保存待用；
2、配制0.05-0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液。
称取4.17-8.34g柠檬酸钠粉末，加入去离子水定容至100ml；120℃，20min高温高压灭菌；
3、水凝胶的消化。
取出用于水凝胶培养的12孔板，弃掉上清培养液，每孔加入1ml柠檬酸钠缓冲液，37℃下孵育20min；吸取水凝胶上清液，每孔加入1ml胶原酶溶液，37℃下孵育1h；轻微晃动，待胶原水凝胶完全消化溶解后，离心1000rpm，5min收集细胞。
根据本申请实施例三的HSCs体外3D水凝胶培养体系的构建方法包括以下步骤：
一、配制海藻酸钠溶液。
1、称量2.5-5.0g海藻酸钠粉末，在晃动下慢慢地加250mL到无菌锥形瓶中，持续晃动，直至所有海藻酸钠粉末润湿且分散均匀；
2、取80mL无菌去离子水加入锥形瓶中，搅拌，放入60℃水浴锅加热12h；
3、采用高温高压灭菌锅进行灭菌，120℃，20min，灭菌结束后，室温下降温，加适量无菌去离子水定容到100mL，冷却后置于冰箱内4℃保存待用。
二、获取原代骨髓造血干细胞。
1、采集骨髓，采用密度梯度离心法收集细胞，加入4℃预冷的PBS缓冲液洗涤2次，弃上清后，得到骨髓单个核细胞；
2、磁珠分选Lin-祖细胞。
(1)免疫磁珠标记单个核细胞。
每108个细胞用400μl磁珠分选缓冲液重悬，加入100μl生物素抗体混合物标记细胞；轻柔混匀，置于4℃孵育10min；加入300μl磁珠分选缓冲液；加入200μl抗生物素微珠，混匀后置于4℃孵育15min；加入10ml磁珠分选缓冲液，300Xg，10min，弃上清；加入500ul缓冲液重悬细胞；
(2)磁性分选阴性细胞。
将MAC中型磁头紧贴于磁架正中位置，放置LS分选柱；用3ml缓冲液充分浸润分选柱；将标记好的骨髓单个核细胞悬液从中间位置匀速滴加进分选柱，避免产生气泡，从分选柱下收集Lin-细胞；将分选柱用3ml缓冲液冲洗3次；将收集好的Lin-悬液进行细胞计数；
3、磁珠分选Lin-CD117+细胞。
(1)免疫磁珠标记Lin-细胞。
将步骤2收集的Lin-细胞悬液离心，300g，5min，弃上清；每108个细胞加入800μl的磁珠分选缓冲液；加入200μl CD117微珠标记Lin-细胞；轻柔混匀并置于4℃孵育15min；加入10ml缓冲液，300×g，10min，弃上清；加入500μl缓冲液备用。
(2)磁性分选阳性细胞。
将MAC小型磁头紧贴于磁架正中位置，放置MS分选柱；用500μl缓冲液充分浸润分选柱；将标记好CD117抗体的Lin-细胞悬液从中间位置匀速滴加进分选柱，避免产生气泡；将分选柱用500μl缓冲液冲洗3次；将结合有阳性细胞的MS柱移出磁场，置于干净的15ml离心管上；向分选柱中心匀速滴加1ml缓冲液，用MS柱适配的活塞轻轻加压推出带有磁性标记的阳性细胞；将收集好的Lin-CD117+细胞进行细胞计数。
三、三维水凝胶细胞培养体系制备，其中体系组分包括：IMDM培养基、胎牛血清、海藻酸钠、胶原I、生长因子；各组分含量如下：海藻酸钠0.25-0.50wt％，胶原I1-3mg/mL，IMDM培养基液10mg/mL，胎牛血清10v/v％，SCF 50ng/ml,Flt3L 20ng/ml,TPO 20ng/ml。
1、配制含有胎牛血清10v/v％，SCF 50ng/ml、Flt3L 20ng/ml、TPO 20ng/ml的IMDM培养基，用新鲜配制的培养基重悬造血干细胞；
2、将I型胶原蛋白酸性溶液，1N氢氧化钠溶液，10xPBS，海藻酸钠溶液及10-60mg/ml CaCl2溶液预冷后取出，置于冰上操作；
3、取1-3mg胶原，先加入100μl海藻酸钠溶液，迅速混匀置于冰上预冷2min；
4、预冷后取出，用氢氧化钠溶液和调整PH至中性；
5、加入100μl 10xPBS，迅速混匀，预冷；
6、加入5x105个新鲜提取的造血干细胞，轻柔混匀；
7、加入无菌水将体系体积补足至1ml；
8、将步骤2所得的胶原蛋白-细胞混合液铺于12孔板内，1ml/孔，置于37℃细胞培养箱30min；
9、成胶后取出，向水凝胶表面均匀滴加1ml 56mg/ml CaCl2，置于37℃细胞培养箱交联20min；
10、取出孔板，吸走CaCl2，利用hepes缓冲液清洗3次，加入含细胞因子(SCF+TPO+Flt3L)的IMDM培养基，置于37℃细胞培养箱进行细胞培养。
四、胶原水凝胶体系的降解及细胞分离。
1、配制胶原酶溶液。
称取50-100mg胶原酶粉末，加入无菌去离子水定容至50ml，配制成1-2mg/ml的胶原酶溶液；待粉末完全溶解，用一次性滤器进行过滤除菌；用无菌离心管收集后分装，-20℃保存待用；
2、配制0.05-0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液。
称取4.17-8.34g柠檬酸钠粉末，加入去离子水定容至100ml；120℃，20min高温高压灭菌；
3、水凝胶的消化。
取出用于水凝胶培养的12孔板，弃掉上清培养液，每孔加入1ml柠檬酸钠缓冲液，37℃下孵育20min；吸取水凝胶上清液，每孔加入1ml胶原酶溶液，37℃下孵育1h；轻微晃动，待胶原水凝胶完全消化溶解后，离心1000rpm，5min收集细胞。
根据上述三个实施例分别构建的三维水凝胶培养体系，对其进行弹性模型表征，结果如表1所示：
表1
| 实施例一 | 实施例二 | 实施例三 |
| 40.76±0.30(Pa) | 450.1±12.08(Pa) | 23.30±0.26(kPa) |
参考图2A和图2B，根据实施例一，实施例二，实施例三的方案分别构建的三维水凝胶培养体系，用流式细胞术对其进行细胞相容性检测表明：细胞存活率>60％，即具有良好的细胞相容性。具体地，实施例一的细胞存活率为66.0％(Q4区域)，实施例三的细胞存活率为70.9％(Q4区域)，实施例三的细胞存活率为69.3％(Q4区域)。
参考图3，通过流式细胞术检测干细胞表面标记，依据实施例一构建的三维水凝胶培养体系(3D)，与二维水平的培养(2D)和常规流体培养(NC)相比较(细胞培养24h、48h、72h)，可在体外维持造血干细胞的干性，促进细胞增殖。
参考图4A，通过生物信息学分析，依据实施例一构建的三维水凝胶培养体系(3D)可调控巨噬细胞系的分化。其中，图4A示出，与二维水平的培养(2D)相比较，三维水凝胶(3D)改变了巨噬细胞系的分化方向，产生了一簇活性更强的巨噬细胞亚群，即“三维-巨噬细胞”；图4B示出“三维-巨噬细胞”高表达多种趋化因子和转录因子。
通过本申请的上述实施例具有以下效果：
1.本发明以胶原蛋白I，海藻酸钠作为主要材料，开发了一种新型的三维骨髓龛仿生水凝胶。以不同浓度的CaCl2作交联剂以实现对体系基质刚度的调控，可针对不同的细胞培养需求，制备刚度特异性的培养环境，可使细胞处于完全包裹状态，在满足细胞培养所需的机械强度的同时，又具有细胞相容性良好，易于降解的特点，在体外能更好的模拟细胞所处的体内结构；
2.本发明制备的水凝胶培养体系，大大缩短了制备时间，便于操作，成本低廉，无需额外专用设备，便于扩大化生产；
3.本发明开发的水凝胶培养体系，在体外维持造血干细胞的增殖和干性；并可用于实现造血干细胞-单核细胞-巨噬细胞轴的体外调控，无需添加诱导因子，即可产生特殊化的“三维巨噬细胞”，具有广阔的组织工程应用前景。
以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。
Claims (7)
1.一种造血干细胞体外3D水凝胶培养体系，其特征在于，包括以下组分：海藻酸钠、I型胶原蛋白、IMDM培养基、胎牛血清、生长因子；
其中，海藻酸钠0.05-0.5wt％、I型胶原蛋白1-3mg/mL、IMDM培养基10mg/mL、胎牛血清10v/v％。
2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述IMDM培养基包括：SCF 50ng/ml、Flt3L 20ng/ml、TPO 20ng/ml。
3.一种造血干细胞体外3D水凝胶培养体系的构建方法，其特征在于，包括：
获取原代骨髓造血干细胞；
采用含有胎牛血清的IMDM培养基重悬造血干细胞；
将I型胶原蛋白酸性溶液、1N氢氧化钠溶液、10xPBS混匀，待PH调至中性后加入造血干细胞混匀并形成水凝胶；
向水凝胶中加入含胎牛血清及细胞因子的IMDM培养液；
分别配制胶原酶溶液和柠檬酸钠缓冲液，分别向水凝胶中加入柠檬酸钠缓冲液和胶原酶溶液，溶解水凝胶并收集细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括：
配制海藻酸钠溶液，将海藻酸钠溶液与I型胶原蛋白酸性溶液、1N氢氧化钠溶液、10xPBS混匀，待PH调至中性后加入造血干细胞混匀并形成水凝胶；
向水凝胶表面滴加CaCl2溶液，使CaCl2与海藻酸钠进行交联以增强水凝胶的基质刚度；
洗去水凝胶的CaCl2溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述配制海藻酸钠溶液的步骤包括：
将海藻酸钠粉溶解于无菌去离子水中，得到海藻酸钠溶液；
对海藻酸钠溶液进行高温高压灭菌处理。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述获取原代骨髓造血干细胞步骤包括：
采集骨髓，通过密度梯度离心法收集得到骨髓单个核细胞；
磁珠分选出骨髓单个核细胞中的Lin-祖细胞；
磁珠分选出骨髓单个核细胞中的Lin-CD117+细胞。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述IMDM培养基包括：以下细胞因子：SCF、TPO、Flt3L。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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