CN111621475A - 脐带间充质干细胞膜片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脐带间充质干细胞膜片及其制备方法，所述脐带间充质干细胞膜片含有脐带间充质干细胞及其在增殖过程中分泌的全部细胞外基质和生长因子。本发明的方法在不使用酶及类似物消化且不通过物理剥离的情况下，将脐带间充质干细胞及其在增殖过程中分泌的细胞外基质和生长因子完全保留并从培养皿表面分离，得到片层状的细胞膜片。
Description
技术领域
本发明涉及再生医学及细胞生物学领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞膜片及其制备方法。
背景技术
细胞膜片(cell sheet)技术是一种新的干细胞移植及应用的技术。从一定意义上讲，细胞膜片工程能够最大限度地模拟胚胎发育组织形成的过程。自从1993年Okano等发明细胞膜片技术以来，细胞膜片技术已经广泛应用于组织工程研究中。
脐带间充质干细胞存在于哺乳动物脐带的华通氏胶中，具有良好的体外扩增能力、多向分化能力和免疫调节能力。
目前脐带间充质干细胞在自身组织修复的基础研究和临床应用中，主要是作为细胞悬浮液直接注射或者与组织工程支架材料结合后移植，这两者均具有一定的局限性。干细胞悬液直接注射会导致大量干细胞丢失，细胞利用率低，干细胞发挥组织修复的功能有限；而细胞与组织工程支架结合后进行移植虽然解决了细胞丢失的问题，但是支架材料在生物体内可能会引起不同程度的炎症反应，且材料的降解产物可能改变局部组织的微环境，引发更严重的病变。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞膜片及其制备方法。
在第一个方面，本发明提供了一种脐带间充质干细胞膜片，其含有脐带间充质干细胞及其在增殖过程中分泌的全部细胞外基质和生长因子。本发明的脐带间充质干细胞膜片中的脐带间充质干细胞密度高，膜片厚度均一，边缘整齐。本发明的脐带间充质干细胞膜片能够分泌包括血管生成和免疫调节在内的多种细胞因子，参与组织器官的修复。
在具体实施方式中，本发明的脐带间充质干细胞膜片可用于再生角膜、心肌组织、肝脏组织或骨组织。在具体实施方式中，本发明的脐带间充质干细胞膜片可用于治疗多种疾病如神经损伤、心肌损伤。不拘于理论，认为本发明的脐带间充质干细胞膜片能够通过分泌细胞因子从而修复受损的组织器官或者促进受损的组织器官自我修复而达到治疗效果。这些因子主要包括白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、转化生长因子-β(transforminggrowth factor-β,TGF-β)、前列腺素 E2(prostaglandin E2,PGE2)、肝细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素生长因子、基质细胞衍生生长因子-1、色氨酸代谢酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)和一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)等。
在第二个方面，本发明提供了一种制备脐带间充质干细胞膜片的方法，其特征在于：不使用酶及类似物消化，将脐带间充质干细胞及其在增殖过程中分泌的细胞外基质和生长因子完全保留并从培养皿表面分离而形成脐带间充质干细胞膜片。具体地，本发明的制备脐带间充质干细胞膜片的方法包括以下步骤：(1)在温敏培养皿表面包被一层基质；(2)将脐带间充质干细胞的单细胞悬液加入温敏培养皿中进行培养；(3)降低温度，脐带间充质干细胞及其分泌的细胞外基质成片层状脱离，得到脐带间充质干细胞膜片。
A.脐带间充质干细胞的分离及培养
脐带间充质干细胞分离的方法主要有贴壁法和酶消化法两种。其中酶消化法能获得较高纯度的脐带间充质干细胞，但获取的效率较低、成本较高，单细胞贴壁能力弱且容易对细胞造成损伤。组织块贴壁法操作简便，成本低，对细胞损伤较小，适合临床应用。
此外，间充质干细胞培养基同样对细胞得率以及细胞质量至关重要。在目前已知来源中，间充质干细胞含量较低，因此为获得足够数量的间充质干细胞，不但需要对分离方法进行优化，增加细胞得率，同时需要对获得的间充质干细胞进行体外培养和传代扩增。
具体地，本发明提供了一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，其是在组织块贴壁法的基础上结合传代培养，其包括以下步骤：
从脐带组织分离华通氏胶；
将所述华通氏胶切碎以获得组织块；
将所述组织块铺于培养容器中进行培养；
加入适量的完全培养基覆盖组织块，并继续培养；
当所述组织块周围出现附着于培养容器的细胞且所述细胞长至 70～100％汇合时，移除所述组织块，并对细胞进行传代操作。
在具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：使用PBS缓冲液或生理盐水将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污。将脐带进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶用无菌剪均匀剪碎成组织块。随后将组织块均匀铺在包被有基质的培养容器中，将培养容器置于培养箱中，2～7天后加入适量的完全培养基覆盖组织块，细胞在8～21天从华通氏胶组织块中爬出并在组织块周围贴壁生长。细胞呈成纤维状，形态均一。待爬出细胞长至70～100％汇合时，移除组织块，对细胞进行传代操作。
在具体实施方式中，使用不含青链双抗的PBS缓冲液或生理盐水来冲洗脐带组织。
在具体实施方式中，将华通氏胶剪碎成直径为0.1-2.5mm(优选 1-2mm)的组织块。
在具体实施方式中，将组织块按照2～30mm的间距均匀铺在包被有基质的培养容器中。
在具体实施方式中，培养箱的条件为37℃、5％CO2。
在具体实施方式中，间充质干细胞培养基为用于培养间充质干细胞的基础培养基+营养添加剂+生长因子。具体地，基础培养基可以是 1640，DMEM，α-MEM，DMEM/F12，F12等。营养添加剂可以包括但不限于胎牛血清，小牛血清，新生牛血清，人血清，浓度为 2％-20％。生长因子可以包括但不限于人成纤维细胞生长因子，人表皮细胞生长因子，人肝细胞生长因子等。
对细胞进行传代操作可以包括：将细胞与培养容器分离并将细胞均匀分散于培养基中，然后接种于培养容器中。加入适量培养基，根据细胞生长状态每1～5天更换适量新鲜的培养基，待细胞长至 70～100％汇合时，重复传代操作。细胞每次进行传代操作，代数增加 1。脐带间充质干细胞贴壁生长，呈成纤维状，形态均一。
在具体实施方式中，将细胞与培养容器分离的方法包括但不限于胰酶及类似物质消化、使用细胞刮等。
在具体实施方式中，将细胞通过搅拌、涡旋等方法均匀分散于培养基中，然后接种。优选地，接种密度为500～100000/cm2。
任选地，在培养获得脐带间充质干细胞之后，可以通过MTT法、 WST法、DNA含量检测法、ATP检测法等测定细胞生长曲线，以评估脐带间充质干细胞的生长活性。另外，可通过流式细胞术检测细胞表面标志物、三向分化测定以及PCR法检测细胞表达基因来鉴定所分离培养的脐带间充质干细胞。
B.脐带间充质干细胞膜片的制备
经分离、培养、鉴定的脐带间充质干细胞可进一步根据本发明的方法制备成脐带间充质干细胞膜片。特别地，本发明利用温敏培养皿制备细胞膜片，在细胞膜片剥离过程中不使用酶及类似物消化也不使用物理方法剥离。本发明的方法能够将脐带间充质干细胞及其在增殖过程中分泌的细胞外基质和生长因子完全保留并从培养皿地面分离，由此得到的脐带间充质干细胞膜片细胞密度高，膜片厚度均一，边缘整齐，能够分泌包括血管生成和免疫调节在内的多种细胞因子，参与组织器官的修复。此外，通过本发明的方法制备的脐带间充质干细胞膜片中的活细胞比率很高。
具体地，本发明提供了一种制备脐带间充质干细胞膜片的方法，包括：
在温敏培养皿表面包被一层基质；
将脐带间充质干细胞悬液加入上述温敏培养皿中进行培养；
降低温度，脐带间充质干细胞及其分泌的细胞外基质成片层状脱离，得到脐带间充质干细胞膜片。
在具体实施方式中，用于包被温敏培养皿的基质选自血清、胶原、明胶、纤连蛋白，玻连蛋白，层粘连蛋白，多聚鸟氨酸，多聚赖氨酸。优选地，所述基质为胎牛血清(FBS)。在具体实施方式中，包被温度是20-40℃(例如20℃，25℃，30℃，35℃，或40℃；例如37℃)。在具体实施方式中，包被时间是0.5～48h，例如2～48h，2～24h。在具体实施方式中，包被比例不少于0.1ml FBS/cm2。
具体地，可以使用磷酸盐缓冲溶液或生理盐水稀释的 30～100％(v/v)的FBS于20-40℃(例如20℃，25℃，30℃，35℃，或40℃；例如37℃)包被0.5～48h(例如2～48h，2～24h，例如包被过夜)，包被比例不少于0.1ml FBS/cm2。当不包被或使用不足30％血清包被时，制作的细胞膜片本身很薄，且在未改变温度的时候部分提前自发起膜，造成与未起膜部分的撕扯，使膜片破碎，提前起膜部分也将皱缩并长在一起，即便进行后续吹打等处理，也无法平展开来。
在一些实施方式中，将间充质干细胞的单细胞悬液以5×105-2×106个细胞/cm2的密度加入所述温敏培养皿中，培养约4～24h，以使得所接种的间充质干细胞形成片层状。
在另一些实施方式中，将间充质干细胞的单细胞悬液以 1×103-1×106个细胞/cm2的密度加入所述温敏培养皿中，培养约 24～168h，以使得所接种的间充质干细胞增殖并形成片层状。在具体实施方式中，在上述培养过程中隔天更换培养基。
本文所述的“温敏培养皿”是指表面涂覆了一层温度敏感性高分子物质的培养皿，该高分子物质在不同温度下分子链段的伸展情况不同，从而表现出亲水性或疏水性，使得该高分子物质的亲疏水性能够随外部温度变化而变化。当温敏培养皿表面呈现亲水性时，与细胞及其分泌的细胞外基质粘合性变差，细胞将成层状脱落。在具体实施方式中，当降低温度至该高分子物质的低临界溶解温度(LCST)之下，该温敏培养皿表面呈现亲水性，从而使得细胞将成层状脱落。
本发明利用温敏培养皿，成功实现了在不使用酶及类似物消化也不使用物理方法剥离的情况下的脐带间充质干细胞的制备。因此，在具体实施方式中，降低温度至32℃以下(例如，4～32℃，或4～30℃)，脐带间充质干细胞将成片层状从温敏培养皿底部脱离，成为保留有细胞外基质完整连结的细胞膜片。
在具体实施方式中，所述脐带间充质干细胞通过上述A中所提供的脐带间充质干细胞的分离培养方法制备。
C.脐带间充质干细胞膜片的表征
通过本发明的方法制备的脐带间充质干细胞膜片含有脐带间充质干细胞及其在增殖过程中分泌的全部细胞外基质和生长因子。另外，由于未使用酶及类似物消化也未使用物理方法剥离，本发明的脐带间充质干细胞膜片中的脐带间充质干细胞密度高，膜片厚度均一，边缘整齐。此外，本发明的脐带间充质干细胞膜片中的活细胞比率很高。
任选地，在制备得到脐带间充质干细胞膜片之后，可以通过扫描电子显微镜观察细胞膜片的表面结构。另外，可以检测细胞膜片分泌的细胞因子数量，细胞膜片中细胞外基质所含蛋白情况等。
在具体实施方式中，本发明的脐带间充质干细胞膜片内的细胞密度为约0.025×106-25×106。
在具体实施方式中，本发明的脐带间充质干细胞膜片包含1-120 层细胞。在具体实施方式中，所述脐带间充质干细胞膜片包含1-120 层脐带间充质干细胞层。在具体实施方式中，所述脐带间充质干细胞膜片包含层叠的至少2层(例如2-120层)脐带间充质干细胞层。
在具体实施方式中，本发明的脐带间充质干细胞膜片的厚度为约 20-5000μm。
在具体实施方式中，本发明的脐带间充质干细胞膜片呈灰白色，结构致密，表面光滑平整。
在具体实施方式中，本发明的脐带间充质干细胞膜片能够至少分泌白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等。在具体实施方式中，本发明的脐带间充质干细胞膜片能够大量分泌IL-6、HGF和VEGF。
在具体实施方式中，本发明的脐带间充质干细胞膜片中细胞外基质至少包含纤连蛋白(Fibronectin)、整联蛋白族、玻连蛋白等。在具体实施方式中，本发明的脐带间充质干细胞膜片中细胞外基质包含大量的纤连蛋白(Fibronectin)、整联蛋白族、玻连蛋白。
本发明的有益效果
1.与传统注射方法相比，脐带间充质干细胞膜片避免了脐带间充质干细胞流失、提高了脐带间充质干细胞的利用率。脐带间充质干细胞膜片可以直接对贴附处的组织或器官分泌细胞因子，这些因子可以达到抑制炎症反应、修复受损组织器官和促进受损组织器官自我修复的作用。
2.脐带间充质干细胞膜片避免了外源性生物支架材料的使用，避免了外源生物材料在体内降解可能引起的炎症反应。
3.本发明利用温敏智能培养皿，在不使用酶及类似物消化且不通过物理剥离的情况下，将脐带间充质干细胞及其在增殖过程中分泌的细胞外基质和生长因子完全保留并从培养皿表面分离，得到片层状的细胞膜片。以该方法得到的细胞膜片细胞密度高、活细胞比率高、厚度均一、结构完整。通过本发明的方法制备得到的细胞膜片未损失细胞外基质，其中的纤粘蛋白可以使细胞膜片贴附于目的组织或器官表面而不需要额外的缝合等固定方法。
4.相比于成体来源间充质干细胞如骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞更年轻，增殖能力更旺盛，免疫原性低，组织修复和免疫调节相关因子分泌旺盛，是再生医学理想的种子资源细胞。
附图说明
图1分别示出了P0(组织块)、P3和P6脐带间充质干细胞的代表性图片。
图2示出了脐带间充质干细胞的示例性生长曲线。
图3示出了脐带间充质干细胞成脂、成骨、成软骨三向分化免疫荧光染色。
图4示出了使用温敏智能培养皿并正确包被血清制备得到的脐带间充质干细胞膜片(图4A)、未包被或包被液FBS浓度不够时得到的脐带间充质干细胞膜片(图4B)和用普通培养皿制备得到的细胞膜片(图4C)。
图5示出了脐带间充质干细胞膜片分泌因子情况。
图6脐带间充质干细胞膜片细胞表面基质Fibronectin和 Integrin-β1表达情况。
图7-8示出了脐带间充质干细胞微观形貌。
具体实施方式
以下基于实施例对本发明进行描述，但是本发明并不仅仅限于这些实施例。
实施例1.脐带间充质干细胞的分离及培养
使用不含青链双抗的1xPBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污。将脐带进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶用无菌剪均匀剪碎成2 mm3的组织块。随后将组织块按照30mm的间距均匀铺在包被有FBS(购自Gibco)的直径100mm培养皿(购自Corning)中，将培养容器置于37℃、5％CO2培养箱中，2天后加入适量DMEM完全培养基 (配方为90％DMEM+10％FBS，DMEM购自Corning)覆盖组织块，细胞在21天从华通氏胶组织块中爬出并在组织块周围贴壁生长。。待爬出细胞长至85％汇合时，移除组织块，用胰酶(购自Sigma)将细胞从培养容器上消化下来，并将细胞均匀分散于上述DMEM完全培养基中，然后按照10000/cm2的密度接种于培养容器中。加入适量培养基，根据细胞生长状态每3天更换50％新鲜的培养基，待细胞长至 85％汇合时，重复传代操作。细胞每次进行传代操作，代数增加1。脐带间充质干细胞贴壁生长，呈成纤维状，形态均一。P3和P6代脐带间充质干细胞的代表性图片如图1所示。
实施例2.脐带间充质干细胞的鉴定
2.1脐带间充质干细胞的生长活性测定
将实施例1制备的脐带间充质干细胞分散，参考WST试剂盒说明书以一定密度接种至培养孔板中，按照正常培养条件进行换液操作。在一段时间的每天的固定时间，根据说明书对细胞活性进行检测，得到细胞活性或数量的数据。如图2中所示，在7天内每天固定时间利用WST试剂检测脐带间充质干细胞的活性，其方法为将WST试剂按照说明书推荐比例加入正在培养的细胞孔板中，在细胞培养箱内孵育固定时间后用酶标仪或紫外分光光度计检测该孔版小室液体在450 nm波长处的吸光度值，该值反应了细胞活性成都，与细胞数量成正相关。从其结果可看到随培养时间延长，小室内细胞活性增加，即可推断细胞数量随培养时间延长而增加。
2.2.脐带间充质干细胞表面标志物鉴定
将脐带间充质干细胞分散于培养基中后离心，用血清或血清蛋白含量为1～20％的与等渗生理溶液中，根据所购买的试剂说明书对细胞表面标记蛋白进行染色，包括但不限于CD73、CD90、CD105、CD34、 CD11B、CD19、CD45、HLA-DR。其中CD73、CD90、CD105的表型为阳性，其比率应不小于95％，CD34、CD11B、CD19、CD45、 HLA-DR的表型为阴性，其比率应不大于2％。表1为某P5代脐带间充质干细胞流式细胞术检测结果。
表1：脐带间充质干细胞(UCMSC)细胞表面marker表达情况
2.3脐带间充质干细胞的三向诱导分化
将实施例1制备的脐带间充质干细胞按照三向诱导分化试剂说明书的比例接种于合适的培养器皿中，待成骨诱导检测的细胞生长至 50～90％汇合，成脂肪诱导检测的细胞生长至90％以上汇合时，分别加入成骨和成脂肪诱导培养基。成软骨诱导时将一定数量的细胞离心至离心管底部，而后加入成软骨诱导培养基，待细胞团成小球后，使细胞小球离开管底，保证与诱导培养基完全接触。
诱导培养7天以上时对细胞进行检测。成骨诱导可用包括但不限于茜素红、anti-Osteocalcin染色，成脂肪诱导可用包括但不限于油红 O、anti-mFABP4染色，成软骨诱导可以用包括但不限于阿尔新蓝、番红O、anti-Aggrecan染色。
如图3荧光显微镜照片所示，P5代脐带间充质干细胞在经过成脂肪诱导分化后可以被anti-mFABP4染色(红色)、经过成骨诱导分化后可以被anti-hAggrecan染色(红色)，经过成软骨诱导分化后可以被anti-Aggrecan染色(红色)，细胞核均被DAPI染色(蓝色)。
实施例3.脐带间充质干细胞膜片制备
预先在温敏智能培养皿表面包被FBS，包被条件是使用磷酸盐缓冲溶液或生理盐水稀释的FBS(30～100％(v/v))，37度过夜包被，包被比例不少于0.1ml FBS/cm2。而后将间充质干细胞的单细胞悬液以 1×106个细胞/cm2的接种于经包被的温敏智能培养皿中，培养16h；或者，以26700个细胞/cm2的密度接种于35mm经包被的温敏智能培养皿中，培养3天。降低温度至32℃以下，脐带间充质干细胞将成片层状从温敏智能培养皿底部脱离，成为保留有细胞外基质完整连结的细胞膜片，细胞膜片宏观形貌如图4A所示，脐带间充质干细胞膜片呈灰白色，结构致密，表面光滑平整。
当不包被或使用不足30％血清包被温皿时，制作的细胞膜片本身很薄，且在未改变温度的时候部分提前自发起膜，造成与未起膜部分的撕扯，使膜片破碎，提前起膜部分也将皱缩并长在一起，即便进行后续吹打等处理，也无法平展开来。其示例性图片见图4B。
作为对比，还使用普通培养皿以相同条件制备了脐带间充质干细胞膜片。使用普通培养皿，改变温度时皿底与细胞间的联系不会发生改变，采用刮刀处理，细胞成破碎的的片层状被铲下，与利用温敏培养皿制备得到的膜片相比完整性差，质地也更脆。使用普通培养皿制备得到的细胞膜片有破碎、皱褶、裂痕、不平坦，其示例性图片见图 4C。
实施例4.脐带间充质干细胞膜片的表征
4.1酶联免疫法检测细胞膜片分泌因子
按照酶联免疫试剂盒说明书对实施例3细胞膜片制备过程中的上清液进行检测，测定细胞膜片分泌的白细胞介素-6(interleukin-6， IL-6)、肝细胞生长因子(hepatocytegrowth factor，HGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的含量。分泌因子含量如图5所示。
4.2.组织切片观察细胞膜片中蛋白情况
将实施例3制备得到的细胞膜片用多聚甲醛或福尔马林固定液固定，而后通过石蜡切片法或冰冻切片法将细胞膜片制成厚度为4～10μm 的组织切片进行染色，观察细胞膜片中细胞外基质所含蛋白情况，其中蛋白包括但不限于纤连蛋白(Fibronectin)、整联蛋白族、玻连蛋白等，通常在染色同时用DAPI或Hoest 33258染色等荧光染料对细胞核进行染色，用于辅助定位。除免疫荧光方法外，还可采用包括但不限于免疫组化方法等进行染色观察。此处以纤连蛋白和整联蛋白-β1 为例进行说明，如图6所示，纤连蛋白和整联蛋白-β1均用有荧光素标记的抗体染料进行染色，细胞核用DAPI进行染色，可见制备得到的细胞膜片含有大量的纤连蛋白和整联蛋白-β1。
4.3扫描电子纤维镜观察细胞膜片的表面结构
将上述得到的细胞膜片就2.5％的戊二醛固定液固定，而后通过梯度酒精进行脱水，自然晾干后得到干燥的细胞膜片用于扫描电子显微镜分析。将干燥的细胞膜片用导电双面胶粘贴在样品台表面，而后用真空磁控溅射法进行表面喷金处理，使被观察样品表面导电。将样品台放入扫描电子显微镜内(所用为Hitachi S-4800)进行观察。其形貌图片如图7、8所示。
其中图7为细胞膜片接触智能培养皿的一面，表面形貌较平整，与其他培养体系相比，有血清培养体系得到的细胞膜片更容易成膜，成膜时底部比其他培养体系得到的膜片更光滑，图片展红圆形凸起为间充质干细胞，也可见细胞间蛋白连接。图8为细胞膜片不接触智能培养皿的一面，可见细胞的堆叠。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。
Claims (18)
1.一种制备脐带间充质干细胞膜片的方法，包括：
在温敏培养皿表面包被一层基质；
将脐带间充质干细胞的细胞悬液加入温敏培养皿中进行培养；
降低温度，脐带间充质干细胞及其分泌的细胞外基质成片层状脱离，得到脐带间充质干细胞膜片。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述包被基质选自血清、胶原、明胶、纤连蛋白，玻连蛋白，层粘连蛋白，多聚鸟氨酸，多聚赖氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述包被基质浓度是30～100％(v/v)。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中包被温度是20-40℃。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中包被时间为0.5～48h。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中包被比例不少于0.1ml FBS/cm2。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中：
将脐带间充质干细胞的单细胞悬液以5×105-2×106个细胞/cm2的密度加入所述温敏培养皿中，培养约4～24h；或者，
将脐带间充质干细胞的单细胞悬液以1×103-1×106个细胞/cm2的密度加入所述温敏培养皿中，培养约24～168h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述细胞膜片未经分散剂处理而从培养皿剥离。
9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述细胞膜片未经刮擦处理而从培养皿剥离。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述温敏培养皿表面涂覆了一层温度敏感性高分子物质，该高分子物质的亲疏水性能够随温度变化而变化。
11.通过权利要求1-10任一项的方法制备的脐带间充质干细胞膜片。
12.根据权利要求11所述的脐带间充质干细胞膜片，其基本上保留了脐带间充质干细胞分泌的所有细胞外基质。
13.根据权利要求11或12所述的脐带间充质干细胞膜片，其中所制备的脐带间充质干细胞膜片具备以下特征中的一项或多项：
(i)所述脐带间充质干细胞膜片内的细胞密度为约0.025×106-25×106；
(ii)所述脐带间充质干细胞膜片包含1-120层细胞；
(iii)所述脐带间充质干细胞膜片的厚度为约20-5000μm。
14.根据权利要求11-13任一项所述的脐带间充质干细胞膜片，其中所述脐带间充质干细胞膜片能够至少分泌IL-6、HGF和VEGF。
15.根据权利要求11-14任一项所述的脐带间充质干细胞膜片，其中所述脐带间充质干细胞膜片中的细胞外基质至少包含纤连蛋白(Fibronectin)、整联蛋白族、玻连蛋白。
16.一种分离培养脐带间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：
(1)从脐带组织分离华通氏胶；
(2)将所述华通氏胶切碎以获得组织块；
(3)将所述组织块铺于培养容器中进行培养；
(4)加入适量的完全培养基覆盖组织块，并继续培养；
(5)当所述组织块周围出现附着于培养容器的细胞且所述细胞长至70～100％汇合时，移除所述组织块，并对细胞进行传代操作。
17.权利要求16所述的方法，在步骤(1)之前，所述方法还包括下述步骤：使用PBS缓冲液或生理盐水将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污。
18.权利要求16或17所述的方法，其具备以下特征中的一项或多项：
(i)在步骤(2)中，将华通氏胶剪碎成直径为0.1-2.5mm(优选1-2mm)的组织块；
(ii)在步骤(3)中，将组织块按照2～30mm的间距均匀铺在包被有基质的培养容器中；
(iii)在步骤(3)-(4)中，培养条件为37℃、5％CO2。
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