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CN115850472B - 一种针对人白介素-8的单克隆抗体yx5及其应用 - Google Patents

一种针对人白介素-8的单克隆抗体yx5及其应用 Download PDF

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CN115850472B
CN115850472B CN202211499540.XA CN202211499540A CN115850472B CN 115850472 B CN115850472 B CN 115850472B CN 202211499540 A CN202211499540 A CN 202211499540A CN 115850472 B CN115850472 B CN 115850472B
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antibody
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徐义
王然
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袁伟杰
龙凤英
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Xiangya Hospital of Central South University
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Xiangya Hospital of Central South University
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Abstract

本发明公开了一种针对人白介素‑8的单克隆抗体YX5及其应用。本发明从免疫后的兔获取脾脏，构建抗人白介素‑8噬菌体抗体库，快速筛选针对人白介素‑8抗体，该抗体YX5可用于人白介素‑8表达异常导致的疾病诊断和治疗。

Description

一种针对人白介素-8的单克隆抗体YX5及其应用
技术领域
本发明属于人白介素-8单克隆抗体制备和应用技术领域，具体涉及一种针对人白介素-8的单克隆抗体YX5及其应用。
背景技术
白介素-8(IL-8)又称CXCL8，属于CXC亚型，是最早发现的趋化性细胞因子。IL-8分为α和β两个亚群，IL-8初始翻译产物为99个氨基酸，在单核和巨噬细胞中剪切成72个氨基酸，分子量为8KDa活性物质。IL-8主要由单核细胞和巨噬细胞分泌，功能是募集和活化中性粒细胞，促使炎症反应和细胞杀伤。另外肿瘤细胞、成纤维细胞、内皮细胞等在IL-1β、肿瘤坏死因子α、脂多糖等促炎症因子的作用下，通过自分泌或旁分泌影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及肿瘤血管的形成。
IL-8通过与IL-8受体结合发挥作用，IL-8有2种受体，分别是CXCR1(IL-8RA)和CXCR2(IL-8RB)，这2个受体存在77％的同源性，都属于G蛋白偶联受体。因为N端存在结构差异，2个受体与IL-8的亲和性不同，CXCR1与IL-8亲和性较高。在正常组织细胞中，CXCR1首先与粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)结合形成复合体，然后与IL-8结合发挥作用；CXCR2与IL-8的亲和性较低，除IL-8外，CXCR2还可以与CXCL1、2、3、5、7等多种配体结合。IL-8对中性粒细胞有明显趋化和功能活化作用，还可诱导CD4+和CD8+T细胞的趋化，参与多种疾病的发展和组织损伤，如风湿性关节炎、牛皮藓、缺血回灌综合征(包括心肌梗死和多器官功能衰竭)、肾小球肾炎以及其他各类感染性疾病等；IL-8与受体结合可通过激活PI3K/Akt、PLC/PKC以及MAPK等多个下游信号通路促进肿瘤的发生发展。因此筛选IL-8拮抗性单克隆抗体，可有效治疗IL-8介导的疾病。
以IL-8为免疫原，免疫兔子，构建抗IL-8噬菌体抗体库，可有效的筛选到拮抗IL-8的抗体，通过基因工程和蛋白表达技术，可大规模生产拮抗IL-8抗体，用于IL-8异常相关疾病的诊断和治疗。
发明内容
本发明的第一个目的是提供针对人白介素-8的特异单克隆抗体。该抗体可用于IL-8表达异常导致的疾病诊断和治疗。
一种针对人白介素-8的单克隆抗体YX5，
YX5重链可变区核酸序列：
GGTTCCACTGGTGACCAGGAGCAGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTG
ACACTCACCTGCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAATAACTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCA
GGGAAGGGGCTGGAATACATCGGAGTCATCGGCTCTGATAATATTCCATACTACGCGACCTGGGCGAAA
GGCCGATTCGCCATCTCCAAAACCTCGACCAGGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGAC
ACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGCGGATATGTTGGTGATGATAGATATAACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCTTCA，见SEQ NO.1；
YX5轻链可变区核酸序列：
GGTTCCACTGGTGACGCCGACATTGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCGGCTATTGGAGGC
ACAGTCACCATCAATTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAGTAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAG
AAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGG
TTCAAGGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCC
ACTTACTACTGTGCAGGCGCTTATAGTAATGATAGTGATGATGGTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAA，见SEQ NO.2。
本发明针对人白介素-8的单克隆抗体YX5，
YX5重链CDR序列：
CDRH1氨基酸序列GFSLNNYA，见SEQ NO.3；
CDRH2氨基酸序列IGSDNIP，见SEQ NO.4；
CDRH3氨基酸序列ASGYVGDDRYNI，见SEQ NO.5；
YX5轻链CDR序列：
CDRL1氨基酸序列QSVYSNNY，见SEQ NO.6；
CDRL2氨基酸序列AAS，见SEQ NO.7；
CDRL3氨基酸序列AGAYSNDSDDG，见SEQ NO.8。
进一步地，所述的针对人白介素-8的单克隆抗体YX5，YX5重链可变区氨基酸序列：
GSTGDQEQLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMSWVRQAPGKGLEYIGVIGSDNIPYYATWAKGRFAISKTSTRVDLKITSPTTEDTATYFCASGYVGDDRYNIWGPGTLVTVSS，见SEQ NO.9；YX5轻链可变区氨基酸序列：
GSTGDADIVLTQTASPVSAAIGGTVTINCQSSQSVYSNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYAASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGAYSNDSDDGFGGGTKLEIK，见SEQ NO.10。
更进一步地，所述抗体分子包括但不限于：免疫球蛋白、Fab、(Fab′)2或单链抗体。
本发明的第二个目的是提供所述的针对人白介素-8的单克隆抗体YX5的应用，用于制备诊断人白介素-8表达异常疾病的制剂。
本发明的第三个目的是提供所述的针对人白介素-8的单克隆抗体YX5的应用，用于制备治疗人白介素-8表达异常相关的疾病。
进一步地，所述的人白介素-8表达异常相关的疾病包括肿瘤。
本发明使用抗原人白介素-8，筛选出抗人白介素-8的抗体，通过测序，获得能与人白介素-8结合的重链可变区和轻链可变区序列，重链可变区组装上人IgG1的Fc片段，抗体重链和轻链同时在哺乳动物细胞中表达，表达出人源化改造的抗人白介素-8的抗体。通过体外实验，本发明筛选到的抗人白介素-8单克隆抗体可以与人白介素-8特异性结合，可用于检测或治疗人白介素-8表达异常引发的疾病。
附图说明
图1IL-8基因克隆；
图2纯化后IL-8SDS-PAGE电泳检测；
图3抗IL8抗体重链可变区基因克隆；
图4抗IL8抗体轻链可变区基因克隆；
图5抗IL8抗体重链和轻链可变区基因拼接；
图6抗IL8噬菌体阳性克隆鉴定；
图7ELISA鉴定第5轮筛选噬菌体库；
图8抗体重链和轻链与pcDNA3.4连接PCR鉴定；
图9抗体YX5纯化产物SDS-PAGE电泳检测；
图10抗IL8抗体对中性粒细胞趋化性抑制；
图11抗IL8抗体对体内HCT116生长抑制。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的描述，而不会形成对本发明的限制。
本发明实施例中使用的IL-8蛋白实验室自行制备。
本发明噬菌体抗体库构建方法参考于：Antony S.Dimitrov(ed.),Generationand Selection of Rabbit Antibody Libraries by Phage Display，2009，TherapeμticAntibodies:Methods and Protocols,vol.525，101-128.
实施例1
一、IL-8蛋白制备以人单核细胞cDNA为模板，使用引物IL-8F和IL-8R克隆IL-8片段，并将该片段导入pGEX-4T-1载体(淼灵，P0001)，筛选获得构建成功的pGEX-4T-1-IL-8，在IPTG诱导条件下表达，纯化获得IL-8蛋白。
具体包括以下步骤：
1、克隆IL-8片段
将单核细胞cDNA稀释10倍
(1)体系配制如下表1：
表1
cDNA 2μl
IL-8F 4μl
IL-8R 4μl
ddH2O 40μl
PrimerSTAR(购自TAKARA) 50μl
Total 100μl
注：克隆IL8基因引物
IL8-F：GTTCCGCGTGGATCCCCGGAAGAAGGTGCAGTTTTGCCAAG，见SEQ NO.11；
IL8-R：TCGAGTCGACCCGGGAATTTCATGAATTCTCAGCCCTCTTCA，见SEQ NO.12。
(2)反应条件见下表
表2
Step1 98℃ 15s
Step2 98℃ 10s
Step3 55℃ 5s
Step4 72℃ 5s
Go to Step 2x34
Step5 72℃ 1m 30s
Step6 4℃ Forever
(3)电泳
取25μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确定是否扩增到目的条带，大小约240bp(见图1)。
(4)将240bp大小条带切下，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN，28706)进行回收，测定浓度。
2、IL-8片段与载体pGEX-4T-1连接转化
使用北京金沙生物科技有限公司Uniclone one step seamless cloning kit,货号SC612
(1)连接
体系配置
表3
组分 目的重组
2X Uniclone seamless cloning Mix 5ul
线性化pGEX-4T-1 1ul
IL-8片段 3ul
ddH2O 1ul
反应条件
50℃，15min
(2)转化
取步骤(1)产物2.5ul加入到50ul DH5α，冰上放置30min，42℃热击90s，冰上放置2min，加入1ml LB培养基，37℃，220rpm培养1h，取100ul均匀的涂抹在含氨苄抗性的平板上，37℃恒温箱过夜培养。
(3)阳性克隆鉴定
挑选步骤(2)单克隆，使用引物IL-8F/IL-8R进行菌落PCR鉴定，鉴定为阳性的克隆，送测序公司进一步测序鉴定，序列正确的克隆保留。
3、IL-8表达与纯化
(1)挑取单克隆加入到10ml含氨苄抗性LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养，
(2)在100ml含氨苄抗性空白LB液体培养基中，接种1％步骤(1)菌液，37℃，220rpm过夜培养，OD600达到0.6时，加入0.2mmol/L的IPTG诱导4h。
(3)诱导结束后，将菌液倒入50ml离心管，4000rpm离心15min，弃上清，加入10ml平衡液(140mM NaCl，2.7mMKCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.4)重悬菌体。超声破碎，至菌液澄清。
(4)将破碎后的菌液转移到离心管，15000g，4℃离心20min，取上清过0.45um滤器，滤液冰上放置。
(5)将Glutathlone Beads 4FF重力柱(常州天地人和生物科技有限公司，货号SA010005)用10倍平衡液平衡，加入步骤(4)上清，让样品穿过柱子，重复4次。
(6)加入15倍平衡液洗柱子。
(7)加入5倍体积的洗脱液洗脱蛋白(140mM NaCl，2.7mMKCl，10mM Na2HPO4，1.8mMKH2PO4，10mM还原性谷胱甘肽，pH 7.4)。
(8)获得的目的蛋白用10Kd超滤管进行浓缩，并使用10mM PBS置换缓冲液。
(9)浓缩后的IL-8测定蛋白浓度和SDS-PAGE检测(见图2)
二、IL-8免疫兔子
(1)首次免疫500ul IL-8(1mg)与500ul弗氏完全佐剂混匀，2月龄新西兰大白兔，背部皮下多点注射。
(2)每间隔2周，500ul IL-8(1mg)与500ul弗氏不完全佐剂混匀
新西兰大白兔背部皮下多点注射，间隔免疫3次。
三、噬菌体抗体库的构建
新西兰大白兔免疫结束后，处死，摘取脾脏，分离单核细胞，提取总RNA，反转录成cDNA，使用重链可变区和轻链可变区兼并引物，扩增获得重链可变区和轻链可变区片段，将抗体重链可变区和轻链可变区进行随机拼接并与噬菌体载体连接，并转化XL1-Blue菌(购自于唯地生物科技有限公司)，在辅助噬菌体VSCM13(购自NTCC国家典型培养物保藏中心)存在条件下，组装成噬菌体抗体展示库。
具体包括以下步骤：
1、单核细胞分离
使用人外周血淋巴分离液(LTS1077-1，天津灏洋生物制品科技有限责任公司，)分离单核细胞。
(1)制备细胞悬液：将脾脏放置在细胞筛，放入加有培养基的培养皿中，使用2.5ml针头注射器推杆，轻轻的挤压，直到脾脏完全挤碎，细胞悬液转入15mL离心管中。
(2)将装有细胞悬液的15mL离心管，100g，10min。
(3)将上层细胞悬液，转入含等体积淋巴分离液的15ml离心管，用吸管小心吸取细胞悬液加于分离液之液面上，500-1100g(1800rpm)，离心10min，加速度5，减速度4。
(4)离心后，此时离心管中由上至下分为四层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层。
(5)用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层转移到新的15mL离心管中，向所得离心管中加入10mLPBS，混匀细胞。
(6)1800rpm，离心10min，加速度5，减速度4。
(7)弃上清，每支15ml离心管加入5ml的红细胞裂解液，稍微混匀后室温静置5min。
(8)1800rpm，离心10min，加速度5，减速度4。
(9)弃上清，吸取10mL PBS重悬所得细胞。
(10)1800rpm，离心10min，加速度5，减速度4。
(11)弃上清，沉淀为单核细胞。
2、总RNA提取
将获得的单核细胞，按照5X106个细胞加入0.75ml Trizol(Thermo fisher)提取总RNA，然后各取1μg RNA将18份RNA等量混合。
(1)5X106个细胞中加入0.75ml Trizol。
(2)上下混匀数次，冰上孵育5min，保证细胞充分裂解。
(3)4℃12000rpm离心10分钟，将上清转移到干净离心管。
(4)1mlTrizol中加入0.2ml氯仿，混匀。
(5)冰上孵育2-3min。
(6)4℃12000rpm离心15分钟。
(7)转移上清水相到干净离心管。
(8)上清中加入等体积的异丙醇混匀。
(9)室温孵育10min，4℃12000rpm离心10-15分钟。
(10)弃上清，保留沉淀。
(11)加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀。
(12)4℃12000rpm离心5分钟。
(13)尽可能弃去上清。
(15)室温干燥5-10min，管壁上看不到液体。
(16)加入20-50μl无RNAse的水回溶RNA。
(17)取1μlRNA电泳检测及测定RNA浓度。
(18)将RNA分装保存于-80℃冰箱，避免反复冻融。
3、cDNA的合成
取5μg的RNA，使用cDNA合成试剂盒(K1612，Thermo fisher)。
(1)取5μg RNA量合成cDNA。
(2)10μl的RNA/primer mixtμre体系见下表4，包括：
表4
(3)65℃孵育5min，置于冰上放置1min。
(4)按下表5添加其他试剂，准备cDNA Synthesis Mix进行下一步反应。
表5
体系成分 1反应
10xRT buffer 2μl
25mM MgCl2 4μl
0.1M DTT 2μl
RNaseOΜT(40Μ/μl) 1μl
Superscript III RT(200Μ/μl) 1μl
(5)加入10μl的cDNA Synthesis Mix到RNA/primer mixture轻轻混匀，离心，按下表6条件进行反应：
表6
Step1 50℃ 50min
Step2 85℃ 5min
冰上冷却，简短离心
Step3 RNaseH 1μl
Step4 37℃ 20min
(6)cDNA产物分装保存于-20℃。
4、抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)扩增
将合成的cDNA稀释10倍，用于扩增重链可变区和轻链可变区的模板。
(1)体系配制如下表7，以VH为例：
表7
(2)反应条件见下表
表8
Step1 98℃ 15s
Step2 98℃ 10s
Step3 55℃ 5s
Step4 72℃ 5s
Go to Step 2x34
Step5 72℃ 1m 30s
Step6 4℃ Forever
(3)电泳
取10μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确定是否扩增到目的条带，大小约400bp(见图3)。
(4)将所有扩增的VH等量混合，加入0.1倍体积的3M乙酸钠和2.2倍体积的乙醇，混匀，-20℃放置过夜。
(5)4℃，16000g离心15min，去上清，使用1ml 70％乙醇漂洗(室温)，室温干燥，加入200μl水回溶，1％的胶进行凝胶电泳。
(6)将400bp大小条带切下，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN，28706)进行回收，测定浓度。
(7)VL的扩增及回收按照步骤(1)-(6)进行操作，结果见图4。
(8)调整VH和VL纯化后核酸浓度，终浓度为100ng/μl，放-20℃储存。
5、扩增Cκ-pelB
(1)以载体pCκ和pCL(载体购自于add gene)(100ng/μl)为模版扩增Cκ-pelB和CL-pelB
以扩增Cκ-pelB为例，见表9。
表9
pCκ 10μl
HCK(序列见前述的参考文献) 60μl
Pelb(序列见前述的参考文献) 60μl
ddH2O 370μl
PrimerSTAR 500μl
Total 1000μl
(2)反应条件见表10
表10
Step1 98℃ 15s
Step2 98℃ 10s
Step3 55℃ 5s
Step4 72℃ 5s
Go to Step 2x34
Step5 72℃ 1m 30s
Step6 4℃ Forever
(3)取10μl产物电泳检测，条带大小约400bp。
(4)将所有扩增的Cκ-pelB混合，加入0.1倍体积的3M乙酸钠和2.2倍体积的乙醇，混匀，-20℃放置过夜。
(5)4℃，16000g离心15min，去上清，使用1ml 70％乙醇漂洗(室温)，室温干燥，加入200μl水回溶，使用1％的胶进行凝胶电泳。
(6)将400bp大小条带切下，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN，28706)进行回收，测定浓度。
(7)稀释纯化后的Cκ-pelB，终浓度为100ng/μl，放-20℃储存。
(8)扩增CL-pelB，按照步骤(1)-(7)进行操作，扩增模板pCκ换成pCL。
6、Rab Vκ/Rab Cκ/CL/Rab VH融合
(1)按下表11将不同量的VL、VH、Ck-pelB混合
VL浓度100ng/μl，VH浓度100ng/μl，Cκ-pelB浓度100ng/μl
表11
VL 10μl
VH 10μl
Ck-pelB 10μl
Primerstar Mix 500μl
H2O 470μl
Total 1000μl
(2)反应条件见表12
表12
Step1 98℃ 15s
Step2 98℃ 10s
Step3 50℃ 5s
Step4 72℃ 5s
Step5 Go to Step 2x10
Step6 72℃ 1m 30s
Step7 4℃ Forever
(3)扩增Rab VL/Rab Cκ/Rab VH，见表13表13
拼接产物 50μl
C-5'SFIVL(序列见前述的参考文献) 4μl
c-3'sfivh(序列见前述的参考文献) 4μl
ddH2O 17μl
PrimerSTAR 25μl
Total 100μl
(4)扩增条件见表14
表14
(5)电泳检测
取10μlPCR产物，电泳检测，融合后目的基因条带大小约为1.2Kb。(见图5)
(6)将所有扩增的Rab VL/Rab Cκ/Rab VH，加入0.1倍体积的3M乙酸钠和2.2倍体积的乙醇，混匀，-20℃放置过夜。
(7)4℃，16000g离心15min，去上清，使用1ml 70％乙醇漂洗(室温)，室温干燥，加入200μl水回溶，使用1％的胶进行凝胶电泳。
(8)将1.2Kb大小条带切下，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN，28706)进行回收，测定浓度。
(9)稀释Rab VL/Rab Cκ/Rab VH纯化的核酸，终浓度为150ng/μl，放-20℃储存。
(10)Rab Vλ/Rab CL/Rab VH的融合按照步骤(1)-(9)进行操作。
7、SfiI酶切Rab Vκ/Rab Cκ/CL/Rab VH和RabVλ/RabCL/Rab VH
以Rab Vκ/Rab Cκ/CL/Rab VH酶切为例
(1)酶切体系见表15
表15
human Vκ/human Cκ/CL/human VH(150ng/μl) 200μl
10Xbuffer 30μl
H2O 60μl
SfiI 40u/μl 10μl
(2)50℃水浴，酶切反应3h。
(3)使用1％凝胶进行电泳，将1.2kb大小的条带切下，使用QIAquick GelExtraction Kit(QIAGEN，28706)进行回收。
(4)检测SfiI酶切后回收Rab VL/Rab Ck/Rab VH片段，调整浓度50ng/μl，-20℃保存。
(5)酶切Rab Vλ/Rab CL/Rab VH，按照步骤(1)-(4)进行操作。
8、SfiI酶切pC3C(载体购自于add gene)
(1)酶切体系见表16
表16
pC3C 1μg/μl 50μl
10Xbuffer 30μl
H2O 208μl
SfiI 40u/μl 12μl
(2)50℃水浴，酶切反应3h。
(3)使用1％凝胶进行电泳，会切出两条带，一条3.5Kb和一条1.2kb大小片段。
(4)使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN，28706)回收3.5Kb的载体骨架。
(5)Sfi酶切后回收载体骨架浓度调整为100ng/μl。
9、连接pC3C(SfiI)和Rab VL/human Cκ/Rab VH(SfiI)
(1)连接体系见表17
表17
100ng/μl SfiI酶切后pC3C 1.5μl
50ng/μl SfiI酶切后human VL/human Cκ/human VH 2μl
10XT4 DNA ligase buffer 2μl
H2O 13.5μl
T4 DNA ligase 2000u/μl 1μl
对照组见表18
表18
100ng/μl SfiI酶切后pC3C 1.5μl
10XT4 DNA ligase buffer 2μl
H2O 15.5μl
T4 DNA ligase 2000u/μl 1μl
(2)16℃反应过夜。
(3)合并所有连接反应物，加入1/10体积的3M乙酸钠溶液。
(4)加入2.2倍体积预冷的无水乙醇，上下混合均匀，-20℃沉淀过夜。
(5)16000g，4℃离心30min，小心弃上清。
(6)加入70％乙醇轻轻清洗沉淀，16000g，4℃离心5min，弃上清。
(7)室温干燥。
(8)用适量的水进行溶解，通常1个连接反应用1μl体积ddH2O进行充分溶解,置-20℃保存。
(9)连接pC3C(SfiI)和Rab Vλ/Rab CL/Rab VH按照步骤(1)-(8)进行操作。
10、连接产物转化XL1-Blue
(1)XL1-Blue电击感受态冰上放置10min进行溶解。
(2)取19μl沉淀浓缩后的连接产物加入到1.5ml离心管，冰浴，加入300μl的XL1-Blue电击感受态混匀，快速的转入2mm电击杯，冰上放置1min。
(3)电击条件：2.5KV，4ms
(4)电转结束后快速加入5ml(1ml+2ml+2ml)SOC培养基，转入50ml尖底离心管，37℃，250rpm，培养1h。取2μl菌液加入198μl的LB中，同时均匀的涂在含100μg/μl羧苄青霉素LB平板上，37℃放置过夜培养，用于计算转化效率及菌落PCR鉴定阳性率。PCR结果见图6。
(5)加入10ml SB培养基，3μl 100μg/μl羧苄青霉素，和30μl 5μg/μl四环素。37℃，250rpm，培养1h。
(6)加入4.5μl 100μg/μl羧苄青霉素，继续37℃，250rpm，培1-4h。
(7)将培养后的菌转移到500ml培养瓶，加入84ml SB培养基，42.5μl 100μg/μl羧苄青霉素，170μl 5μg/μl四环素，加1ml VCMS13辅助噬菌体(1011-1012pfu/ml)，37℃，275rpm，90min。
(8)加入140μl 50μg/μl卡那霉素，37℃，275rpm，过夜培养。
(9)3000g，4℃离心15min。
(10)沉淀噬菌体
上清(200ml)转移到500ml干净离心管，加入8g PEG-8000和6g NaCl，放入37℃，300rpm，5min促进溶解。冰上放置30min-1h。15000g，4℃离心15min。弃上清，将离心瓶颠倒放置在滤纸上放置10min干燥，小心的移去多余液体。使用含1％的BSA的TBS 2ml重悬噬菌体(移液器上下混匀)，16000g，4℃离心5min，上清过0.22μm滤膜(Millipore)，转移到2ml离心管。短时间可直接放冰上存储，或者加0.01倍体积的2％叠氮化钠放4℃，对于长时间存储加1倍体积甘油放-20℃存储。
二、噬菌体抗体库筛选以IL-8噬菌体抗体筛选为例
使用包被IL-8蛋白的96孔板，进行5轮筛选，然后挑选单克隆鉴定IL-8特异性抗体。
1、抗原包被
(1)将IL-8加入到碳酸缓冲液，浓度2μg/ml，
(2)康宁高蛋白吸附酶联免疫96孔板，每孔加入50μlIL-8，4℃放置过夜；
(3)弃去上清，加入5％的脱脂奶粉200μl/孔，37℃放置1h；
(4)弃上清，0.05％的TBST洗涤5次。
2、IL-8抗体筛选
(1)将噬菌体抗体库用2％的脱脂奶粉稀释10倍，取2个包被有IL-8抗原的96孔微孔，加入100μl稀释后的噬菌体，37℃放置1h。
(2)弃上清，0.05％的TBST洗涤5次，加入100μl 100mM甘氨酸，37℃放置15min,期间不断进行吹打，加入9μl 1M Tris。
(3)将步骤(2)洗脱下来的噬菌体加入到2ml的XL1-Blue菌中，室温放置15min。
(4)加入6ml SB培养基，加入1.6μl 100μg/μl的羧苄青霉素，12μg 5μg/μl的四环素，37℃，250rpm培养1h。
(5)加入2.4μl 100μg/μl的羧苄青霉素继续培养1h；
(6)加入1ml辅助噬菌体VCSM13(1011-1012pfu/ml)，转移到500ml培养瓶，加入91mlSB培养基，加入46μl100μg/μl的羧苄青霉素，184μl5μg/μl的四环素，37℃，250rpm培养1.5h，加入140μl 50μg/μl的卡那霉素，37℃，250rpm过夜培养。
(7)噬菌体抗体浓缩：将上一步菌液离心去菌体，收集上清(100ml)；加入4gPEG-8000和3g NaCl，放入37℃，300rpm，5min促进溶解。冰上放置30min-1h。15000g，4℃离心15min。弃上清，将离心瓶颠倒放置在滤纸上放置10min干燥，小心移去多余液体。使用含1％BSA的TBS 2ml重悬噬菌体(移液器上下混匀)，16000g，4℃离心5min，上清过0.22μm滤膜(Millipore)，转移至2ml离心管。短时间可直接放冰上存储，或者加0.01倍体积的2％叠氮化钠放4℃，对于长时间存储加1倍体积甘油放-20℃存储。
(8)取步骤(7)噬菌体，按照步骤(1)-(7)进行5轮筛选。
(9)五轮筛选的抗体库的ELISA鉴定：
1)ELISA 96孔板，每孔包被100ng的IL-8；
2)加入100μl噬菌体(2％脱脂奶粉稀释10倍)37℃孵育1h；
3)0.05％的TBST洗涤5次；
4)加入5％脱脂奶粉稀释2000倍的抗M13-HRP抗体(购自北京义翘神州生物技术有限公司)100μl，37℃孵育1h；
5)0.05％的TBST洗涤5次；
6)加入100μl TMB，避光显色5min；
7)加入50μl 1M H2SO4终止反应。
8)使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
结果见图7和表19。
表19ELISA鉴定第5轮筛选噬菌体库
3、IL-8单克隆抗体鉴定
(1)取第5轮筛选的IL-8噬菌体，稀释10-7，取1μl加入到200μl XL1-Blue菌，室温放置15min；
(2)将步骤(1)菌全部涂在含100μg/ml羧苄青霉素LB个体培养基上，37℃过夜培养；
(3)挑选200个单克隆，加入到6ml的含10μg/ml四环素和100μg/ml羧苄青霉素的液体LB培养基中，37℃，250rpm培养4个小时，取少量菌液，进行菌
液PCR鉴定，挑选能扩增出条带大小约为1200bp的克隆。
菌落PCR扩增体系见表20：
表20
菌液 0.5μl
VHSEQ(序列见前述的参考文献) 0.2μl
vlseq(序列见前述的参考文献) 0.2μl
ddH2O 4.1μl
PrimerSTAR 5μl
Total 10μl
菌落PCR反应条件见表21：
表21
Step1 98℃ 3min
Step2 98℃ 10s
Step3 50℃ 5s
Step4 72℃ 15s
Step5 Go to Step 2x34
Step6 72℃ 1m 30s
Step7 4℃ Forever
(4)将步骤(3)的阳性克隆菌液均匀分成2份，一份入3μl辅助噬菌体VCSM13(1011-1012pfu/ml)，室温放置20min，加入2.1μl 50μg/μl的卡那霉素，另外一份不加任何物质，37℃，250rpm过夜培养；
(5)将加入辅助噬菌体的菌4000rpm离心10min，将上清转入干净离心管，上清进行10倍稀释，取100μl加入到包被IL-8的酶联免疫板，37℃孵育1h，0.05％的TBST洗涤5次，加入2000倍稀释的抗噬菌体带HRP标记的抗体(购于北京义翘神州生物技术有限公司)，37℃孵育1h，0.05％的TBST洗涤5次，加入100μlTMB，显色2min，加入50μl 1M的H2SO4终止反应，使用酶标仪在450nm处测定吸光度，吸光度高于对照2.1倍的为阳性克隆。
(6)挑选步骤(5)阳性克隆，没有加入辅助噬菌体的菌，提取质粒，并进行测序，获得重链可变区和轻链可变区序列。
三、全人源化抗体的表达及活性鉴定
1、全人源化载体构建
(1)根据获得的抗体重链可变区或轻链可变区序列，设计相应的引物，分别扩增后，在重链和轻链N端都加入分泌信号肽，重链C端加入IgG1的Fc片段；
(2)将重链可变区和轻链可变区分别同源重组到pcDNA3.4载体。(见图8)(pcDNA3.4载体购自于武汉淼灵生物科技有限公司)
2、全人源化抗体的表达
(1)使用除内毒素中提试剂盒(购自OMEGA)，分别提取对应的重链表达载体和轻链表达载体；
(2)当293T细胞(购自于武汉普诺赛生命科技有限公司)融合度达到80％时，使用PEI进行转染；
(3)转染后12h，更换成无血清蛋白表达培养基，37℃，5％ CO2培养7天；
(4)使用protein A/G填料纯化抗体。结果见图9。
3、全人源化抗体活性鉴定
以IL-8抗体活性鉴定为例
(1)ELISA鉴定
将获得的抗体调整为浓度1mg/ml，使用5％的脱脂奶粉稀释2000倍，加入到包被IL-8抗原的酶联免疫孔中，37℃孵育1h，0.05％的TBST洗涤5次，加入5％的脱脂奶粉稀释2000倍抗人Fab-HRP二抗(购自于北京索莱宝生物科技有限公司)，37℃孵育1h，0.05％的TBST洗涤5次，加入100μlTMB，显色2min，加入50μl1M的H2SO4终止反应，使用酶标仪在450nm处测定吸光度。结果见表22。
表22ELISA鉴定纯化后YX5与IL-8结合
(2)利用YX5为固定抗体，YX5、YX20、YX40为检测抗体组合检测IL-8蛋白如下：
采用ELISA夹心法进行检测，将单克隆全人源化抗体YX5包被ELISA板，加入抗原IL-8，加入筛选出来的YX5、YX20、YX40生物素标记抗体(生物素品牌：Thermo，货号：VF300852)，并进行不同的组合，再加带HRP标记的链霉亲和素(品牌：ThermoFisher，货号：VE302151)，检测显色，颜色越深说明对IL-8抗原捕获能力越强，同时也说明该对抗体适合于IL-8抗原的检测。空白对照是不加抗体，只加带HRP标记的链霉亲和素。
具体操作如下：
1)ELISA 96孔板，每孔包被100ng的YX5抗体；
2)加入100μl IL-8(250ng/ml)，37℃孵育1h；
3)0.05％的TBST洗涤5次；
4)加入用5％脱脂奶粉稀释2000倍YX5、YX20、YX40生物素标记抗体，37℃孵育1h；
5)0.05％的TBST洗涤5次；
6)加入5％脱脂奶粉稀释5000倍的带HRP标记的链霉亲和素，室温孵育10min；
7)0.05％的TBST洗涤5次；
8)加入100μl TMB，避光显色5min；
9)加入50μl 1M H2SO4终止反应。
10)使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
结果见表23。
表23夹心法鉴定抗体对检测IL8
注：纵列包被相，横列检测相，OD450吸光值。
(3)中性粒细胞趋化抑制
1)从人外周血分离中性粒细胞(天津灏洋，TBD LZS11131)，使用1640将中性粒细胞浓度调整为5X106个/ml；
2)使用24孔Trans-well板(Corning Costar,3415)，孔径3um，实验分为3组：空白组，下室加入400ul空白1640；阳性对照组，下室加入400ul含浓度10nM IL8的1640；实验组，下室加入400ul含浓度10nM IL8和5ug/ml IL8抗体的的1640；所有的3组，上室均加入200ul(浓度5X106个/ml)的中性粒细胞；
3)5％ CO2，37℃放置2h，丢弃上室，细胞计数仪计算下室细胞量。
结果见表24和表25，图10。
表24抗IL8抗体抑制中性粒细胞对IL8趋化
表25抗IL8抗体对中性粒细胞趋化抑制(单位：％)
复孔1 复孔2 复孔3
YX5 91.04 112.31 117.91
(4)抗IL8抗体对肿瘤抑制
1)将裸鼠分为2组，实验组和对照组，每组3只，实验开始前，每组裸鼠背部皮下均注射100ul 1X106个HCT116肿瘤细胞(结肠肿瘤细胞)；
2)3天后，对照组每只裸鼠腹腔注射200ul PBS，实验组每只裸鼠腹腔注射200ul含500ug抗IL8抗体的PBS，每间隔3天注射一次；
3)注射4轮后，注射最后一次第3天，处死裸鼠，摘取肿瘤，进行称量。结果见表26和图11。
表26抗IL8抗体对肿瘤抑制(单位：g)
编号 1 2 3
control 0.27 0.26 0.3
YX5 0.01 0.15 0.01

Claims (4)

1.一种针对人白介素-8的单克隆抗体YX5，其特征在于，
YX5重链可变区核酸序列：
GGTTCCACTGGTGACCAGGAGCAGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAATAACTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGAGTCATCGGCTCTGATAATATTCCATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCGCCATCTCCAAAACCTCGACCAGGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGCGGATATGTTGGTGATGATAGATATAACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCTTCA；
YX5轻链可变区核酸序列：
GGTTCCACTGGTGACGCCGACATTGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCGGCTATTGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAGTAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAGGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGCTTATAGTAATGATAGTGATGATGGTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAA。
2.一种针对人白介素-8的单克隆抗体YX5，其特征在于，
YX5重链CDR序列：
CDRH1氨基酸序列GFSLNNYA
CDRH2氨基酸序列IGSDNIP
CDRH3氨基酸序列ASGYVGDDRYNI；
YX5轻链CDR序列：
CDRL1氨基酸序列QSVYSNNY
CDRL1氨基酸序列AAS
CDRL1氨基酸序列AGAYSNDSDDG。
3.根据权利要求2所述的针对人白介素-8的单克隆抗体YX5，其特征在于，
YX5重链可变区氨基酸序列：
GSTGDQEQLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMSWVRQAPGKGLEYIGVIGSDNIPYYATWAKGRFAISKTSTRVDLKITSPTTEDTATYFCASGYVGDDRYNIWGPGTLVTVSS；
YX5轻链可变区氨基酸序列：
GSTGDADIVLTQTASPVSAAIGGTVTINCQSSQSVYSNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYAASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGAYSNDSDDGFGGGTKLEIK。
4.权利要求1-3任一项所述的针对人白介素-8的单克隆抗体YX5的应用，其特征在于，用于制备治疗结肠肿瘤的制剂。
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Citations (2)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115850473A (zh) * 2022-11-28 2023-03-28 中南大学湘雅医院 Il-8抗体及其应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE527278T1 (de) * 2002-12-16 2011-10-15 Genmab As Humane monoklonale antikörper gegen interleukin 8 (il-8)
CN1309738C (zh) * 2004-12-08 2007-04-11 叶庆炜 抗il－8单克隆抗体、其可变区序列及其应用
MX2007013058A (es) * 2005-04-20 2008-02-22 Amgen Fremont Inc Anticuerpos monoclonales de alta afinidad completamente humanos para interleucina-8 y epitopes para dichos anticuerpos.
CN101343323B (zh) * 2008-08-29 2011-02-16 浙江大学 抗白细胞介素-8抗体
CN113329770A (zh) * 2019-01-24 2021-08-31 中外制药株式会社 新型癌抗原及所述抗原的抗体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115850473A (zh) * 2022-11-28 2023-03-28 中南大学湘雅医院 Il-8抗体及其应用
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