CN115975011A - 一种针对p72蛋白的抗非洲猪瘟病毒的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，具体涉及一种针对p72蛋白的抗非洲猪瘟病毒的抗体。该抗体属于一种仅包括重链可变区VH与轻链可变区VL的单链抗体。本申请中，基于现有成熟噬菌体抗体库筛选技术，筛选获得了一个对非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72蛋白具有高亲和力的特异性scFv‑Fc抗体。初步实验结果表明，该单链抗体较好保留了对抗原的亲和活性，可以特异性的识别并结合衣壳蛋白p72；而且由于其分子量小、穿透力强，因此易于通过基因工程技术手段借助于原核或真核表达系统进行大量制备，可为非洲猪瘟病毒的检测、预防和治疗药物的开发奠定一定技术基础。

Description

一种针对p72蛋白的抗非洲猪瘟病毒的抗体

技术领域

本发明属于抗体制备技术领域，具体涉及一种针对p72蛋白的抗非洲猪瘟病毒的抗体。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是一种高传染性和急性出血性病毒性疾病，感染发病后家猪死亡率接近100％。自1921年ASF首次在肯尼亚发现以来，已经给各国生猪养殖行业造成了巨大破坏。

已有研究表明，造成非洲猪瘟的非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus，ASFV)的基因组为双股线状DNA，大小170－190kb，但结构复杂。由于对病毒编码的多种蛋白功能研究较为有限，加上病毒变异等原因，使得目前尚缺乏商业化的较好用于预防非洲猪瘟的疫苗产品。

发明内容

结合相关噬菌体筛选技术，本申请目的在于提供一种针对非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72蛋白具有高亲和力的特异性scFv-Fc(single-chain variable fragment Fc(FragmentCrystallization))抗体，从而为相关疫苗制备奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案简述如下。

一种针对p72蛋白的抗非洲猪瘟病毒的抗体，该抗体属于一种单链抗体(即，仅包括重链可变区与轻链可变区)，其包括：重链可变区VH和轻链可变区VL；

所述重链可变区VH，长度为391bp，其核苷酸序列(如SEQ ID No.1所示)，具体如下：

GAGGAGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTCGGCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTACCTACATTAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGCAGTGGCTTGCAGCTATTAGTACTAGTGGTGGTAGCACCTACTACACAGACTCTATGGAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACTCCCAGAACACGGCCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAACAGAAGACACGGCCCGCTATTACTGTGCAACCATCCGGGGTTGCTATAGCTATGGTGCTAGTTGCTATCGTTCCTGGGCGTCCTTTATGGATCTCTGGGGCCCAGGCGTTGAAGTCGTCGTGTCCTCAG；

所述重链高变区VH所编码氨基酸序列，由130个氨基酸组成，其氨基酸序列，具体为：

EEKLVESGGGLVQPGGSLRLSCVGSGFTFSSTYINWVRQAPGKGLQWLAAISTSGGSTYYTDSMEGRFTISKDNSQNTAYLQMNSLRTEDTARYYCATIRGCYSYGASCYRSWASFMDLWGPGVEVVVSS；

该重链可变区VH含有三个高变区，对应碱基序列分别为：

457～480位处的:GATTCACCTTCAGTATACCTAC(对应编码的氨基酸序列：GFTFSSTY)；

532～555位处的：ATTAGTACTAGTGGTGGTAGCACC(对应编码的氨基酸序列为：ISTSGGST)；

670～73位处的：GCAACCATCCGGGGTTGCTATAGCTATGGTGCTAGTTGCTATCGTTCCTGGGCGTCCTTT

ATGGATCTC(对应编码的氨基酸序列为：ATIRGCYSYGASCYRSWASFMDL)；

所述轻链可变区VL，长度为321bp，其核苷酸序列(如SEQ ID No.2所示)，具体如下：

TCCTATGAGCTGACTCAGCCGTCTTCAGAGTCAGTGGCCTTGGGAAGTACGGCCAAGATCACCTGCTCCGGGGATCTGCTGGATGAAAAATATACGCAATGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCCCTGCTGCTCATTTATAAGGACAATGAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGGTTCTCTGGGTCCAGCTCAGGGAAAACGGCCACCCTGACCATCACTGGGGCCCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTCGTGTCAGTCAGGTGACAGGATTAATAATGCTATTTTCGGCGGTGGGACCCATCTGACCGTCCTC；

所述轻链可变区VL由107个氨基酸组成，其氨基酸序列具体为：

SYELTQPSSESVALGSTAKITCSGDLLDEKYTQWYQQKPGQAPLLLIYKDNERPSGIP ERFSGSSSGKTATLTITGAQAEDEADYSCQSGDRINNAIFGGGTHLTVL；

该轻链可变区VL含有三个高变区，对应碱基序列分别为：

82～99位处的：CTGCTGGATGAAAAATAT(对应编码的氨基酸序列为:LLDEKY)；

151～159位处的：AAGGACAAT(对应编码的氨基酸序列为:KDN)；

268～297位处的：CAGTCAGGTGACAGGATTAATAATGCTAT(对应编码的氨基酸序列为:为QSGDRINNAI)；

应用时，重链可变区VH和轻链可变区VL之间连接子序列可参考为：GGTGGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGTTCAGGAGGAGGAGGAGGAAGC；

(其对应编码的氨基酸序列为：GGGGGGSGGGGSGGGGGS)。

在上述轻链可变区VL、重链可变区VH基础上，结合Fc片段，本申请提供了一种抗非洲猪瘟p72蛋白的scFv-Fc抗体，其碱基序列长度为1494bp，碱基序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

ATGGCCTCCTATGAGCTGACTCAGCCGTCTTCAGAGTCAGTGGCCTTGGGAAGTACGGCCAAGATCACCTGCTCCGGGGATCTGCTGGATGAAAAATATACGCAATGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCCCTGCTGCTCATTTATAAGGACAATGAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGGTTCTCTGGGTCCAGCTCAGGGAAAACGGCCACCCTGACCATCACTGGGGCCCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTCGTGTCAGTCAGGTGACAGGATTAATAATGCTATTTTCGGCGGTGGGACCCATCTGACCGTCCTCGGTGGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGTTCAGGAGGAGGAGGAGGAAGCGAGGAGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTCGGCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTACCTACATTAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGCAGTGGCTTGCAGCTATTAGTACTAGTGGTGGTAGCACCTACTACACAGACTCTATGGAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACTCCCAGAACACGGCCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAACAGAAGACACGGCCCGCTATTACTGTGCAACCATCCGGGGTTGCTATAGCTATGGTGCTAGTTGCTATCGTTCCTGGGCGTCCTTTATGGATCTCTGGGGCCCAGGCGTTGAAGTCGTCGTGTCCTCAGCTAGTGGCCAGGCCGGCCTGGCATCTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA；

该碱基序列对应所编码氨基酸序列，长度为498个氨基酸，氨基酸序列具体为：

MASYELTQPSSESVALGSTAKITCSGDLLDEKYTQWYQQKPGQAPLLLIYKDNERPSGIPERFSGSSSGKTATLTITGAQAEDEADYSCQSGDRINNAIFGGGTHLTVLGGGGGGSGGGGSGGGGGSEEKLVESGGGLVQPGGSLRLSCVGSGFTFSSTYINWVRQAPGKGLQWLAAISTSGGSTYYTDSMEGRFTISKDNSQNTAYLQMNSLRTEDTARYYCATIRGCYSYGASCYRSWASFMDLWGPGVEVVVSSASGQAGLASEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

所述抗非洲猪瘟p72蛋白的scFv-Fc抗体，通过如下步骤制备获得：

(一)制备重组表达载体

首先，获得正确的抗体核苷酸序列；

随后，以真核表达质粒(例如采用pINFUSE质粒)为载体，重组上述抗体核苷酸序列，构建获得可翻译表达SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的重组真核表达载体；

以质粒pINFUSE-mIgG2b-Fc2为例(InvivoGen公司产品)为例，重组时，重组SEQIDNo.1和SEQ ID No.2核苷酸序列即可(若采用不含Fc片段的质粒载体，则需重组SEQIDNo.3所示序列)；具体重组操作参考如下：

利用限制性内切酶EcoRI和NcoI分别真核表达载体pINFUSE-mIgG2b-Fc2进行酶切并回收酶切产物，再利用T4 DNA连接酶将所回收酶切产物与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2核苷酸序列进行连接；

连接完成后，将连接产物进行电转化入TG1感受态细胞，并进行筛选和鉴定，确保质粒重组正确，并提取重组后表达载体质粒备用；

(二)进行抗体蛋白表达

参照SinoBiological的SMM 293-TII Expression Medium(SMM 293-TII表达培养基)和Sinofection转染试剂说明书，利用Sinofection转染试剂，将步骤(一)中构建正确的重组质粒载体转化细胞状态良好的293F细胞，培养5-7天后，收集含有scFv-Fc重组抗体的培养物；

(三)纯化获得scFv-Fc抗体

对步骤(二)所得培养物，4℃、5000g离心10min，去除细胞沉淀，留上清，上清即为含有单链scFv-Fc抗体的溶液；

进一步利用15KD截留分子量的Millipore超滤离心管对上清进行浓缩处理后，利用ProteinA亲和填料对其进行纯化，即可获得纯化的scFv-Fc抗体。

现有技术中，由于对感染非洲猪瘟病毒(ASFV)后生猪的先天免疫和适应性免疫的研究较为有限，因此，深入探究病毒感染后各种抗体蛋白的表达水平，了解这些抗体蛋白间相互作用情况，对于ASFV感染的准确诊断、关键抗原表位的挖掘以及疫苗设计具有重要的技术意义。

本申请中，基于现有成熟噬菌体抗体库筛选技术，筛选获得了一个对非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72蛋白具有高亲和力的特异性scFv-Fc抗体。该抗体属于一种只含有重链可变区与轻链可变区的单链抗体，而该单链抗体不仅保留了对抗原的亲和活性，而且由于具有分子量小、穿透力强的技术优点，因此在ASFV的诊断和治疗中具有较好的应用潜力。初步实验结果表明，该单链抗体较好保留了对抗原的亲和活性，可以特异性的识别并结合衣壳蛋白p72；而且由于其分子量小、穿透力强，因此易于通过基因工程技术手段借助于原核或真核表达系统进行大量制备，可为非洲猪瘟病毒的检测、预防和治疗药物的开发奠定一定技术基础，因此具有较好的应用前景。

附图说明

图1为凝胶电泳检测VH和VL基因PCR产物，其中M：DNA Marker DL5000；

图2为凝胶电泳检测scFv基因SOE-PCR扩增结果，其中M：DNA Marker DL2000；1：VH-VL(κ)拼接成的scFv；2：VH-VL(λ)拼接成的scFv；

图3为凝胶电泳检测抗体库插入片段的PCR扩增结果，其中M：DNA Marker DL5000；1-24：噬菌体抗体库单菌落；

图4为phage-ELISA检测重组噬菌体抗体的亲和性；

图5为SDS-PAGE检测Protein A纯化后ASFV-scFv-83-Fc，其中：M,蛋白Marker；1：空白对照293F细胞；2：真核表达的特异性scFv-83培养物；

图6为Western blot纯化分析结果，其中：M,蛋白Marker；1：纯化后ASFV-scFv-83-Fc的Western blot结果；

图7为Western blotting法分析ASFV-scFv-83与灭活ASFV病毒感染PAM细胞的反应性；1：空白对照组PAM细胞；2：ASFV HLJ/18感染的PAM细胞；

图8为IFA鉴定scFv-p72-83抗体活性；p72表示Mock表示对照组；DAPI为细胞核染色结果图；MERGE表示组合图；

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

大肠杆菌TG1、pHEN2噬菌粒载体、真核表达载体pFUSE-Fc、增殖型M13KO7、DH5α感受态细胞等，均为现有生物学研究中常见生物材料，可由公开渠道获得(例如，擎科生物公司)；

主要试剂及试剂盒：

猪外周血淋巴细胞分离液Kit，购自索莱宝生物制品公司；

DL2000DNAMarker、6×Loading Buffer等，购自宝生物公司；

SfiI-HF、EcoRI和NcoI限制性内切酶，NEB公司产品；

DNA片段回收试剂盒，购自Thermo Fisher Scientific公司；

Trizol、Protein A亲和层析树脂，购自金斯瑞生物公司；

质粒提取试剂盒，为北京全式金公司产品。

下述实施例中所涉及的重组p72蛋白，由发明人采用现有生物技术由ASFV衣壳蛋白p72与其伴侣蛋白pB602L在人胚肾293(HEK293)细胞中表达制备的三聚体重组p72蛋白，其氨基酸序列可参考：Pig/HLJ/18GenBank:MK333180.1。

实施例1

结合相关噬菌体筛选技术，本申请筛选获得了一种针对非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72蛋白具有高亲和力的特异性猪源scFv-Fc抗体。在介绍具体筛选过程前，需要解释的是，由于猪源天然免疫单链抗体(scFv)的文库构建是相关抗体筛选的基础(筛选过程中，库的靶标是抗体序列)，因此，结合文库构建的过程就相关筛选过程简要介绍如下。

(一)重叠PCR扩增方法获得全长scFv基因

首先，获得非洲猪瘟抗体阳性猪的cDNA模板，具体操作时：

以非洲猪瘟抗体阳性的猪外周血作为样品，在分离获得外周血单个核细胞后，参考相关试剂盒说明书，提取总RNA并反转录合成cDNA，-80℃保存备用。

其次，以上述所制备cDNA为模板，采用重叠延伸PCR方法扩增制备全长scFv基因，具体PCR扩增时：共进行三轮PCR扩增，扩增过程中：先分别PCR扩增制备获得V(κ)、VL和VH基因，最后再采用重叠PCR扩增方法获得全长scFv基因，具体过程简介如下。

第一轮PCR扩增时：

针对V(κ)基因，设计如下引物对：

正向引物：

Vκ-F-1:GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCATCCAGCTGACCCAGTCTCC，

Vκ-F-2:GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCATYGTGCTGACCCAGACTCC，

Vκ-F-3:GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATTGTGCTGACCCAGTCTGC，

Vκ-F-4:GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAACAACASTCACTCAATCTCC，

Vκ-F-5:GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCATGGTGTTGACCCAGAGTGC；

反向引物：

Vκ-R-1:CCAGAGCCGCCGCCGCCGCCTTTGAKYTCCAGCTTAGTCCCG，

Vκ-R-2:CCAGAGCCGCCGCCGCCGCCTTTGGGCTCCACTTTGGTCCCCG，Vκ-R-3:CCAGAGCCGCCGCCGCCGCCTTCAATCTCCACGGATGTCCCT，

Vκ-R-4:CCAGAGCCGCCGCCGCCGCCTTTGAGTTCCAGCTTGGTTCC；

PCR扩增V(κ)基因时，正向引物与反向引物随机配对组合进行PCR扩增；

针对VH基因扩增，设计如下引物对：

正向引物：

VH-F-1：ggttcaggaggaggaggaggaagc GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGA，

VH-F-2：ggttcaggaggaggaggaggaagc GAGGAGAAGCTGGTGGAGTCTGGA；

反向引物：

VH-R-1:tgtgcagatgatgaccgcgGCTAGCTGAGGACACGACGACTTCAAC，

VH-R-2:tgtgcagatgatgaccgcgGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCTCGAC，

VH-R-3:tgtgcagatgatgaccgcgGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGA；

PCR扩增VH基因时，正向引物与反向引物随机配对组合进行PCR扩增；

针对VL基因，设计如下引物对：

正向引物：

VL-F-1:GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGACTGTGATCCAGGAGCC，

VL-F-2:GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTCCTATGAGSTGACTCAGCC，

VL-F-3:GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGCTGTGCTGACTCAGCCG，

VL-F-4:GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCC；

反向引物：

VL-R-1:CCAGAGCCGCCGCCGCCGCCACCGAGGACGGTCAGATGGGT；

PCR扩增VL基因时，正向引物与反向引物随机配对组合进行PCR扩增；

PCR扩增时，25μL体系设计如下：

2×Taq Master Mix，12μL；

上、下游引物，各0.5μL；

cDNA模板，1μL；

去离子水，11.5μL；

扩增程序为：95℃、5min，95℃、30s，56℃、30s，72℃、20s，30个循环；72℃、10min；

PCR扩增结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶检测，并对目的条带进行提取、纯化和鉴定。

第二轮PCR扩增时(由于本申请采用重叠PCR反应方式来制备全长scFv基因片段，为此，为便于将第二轮PCR产物用于后续重叠PCR反应，发明人通过延长引物长度方式来对扩增用引物进行重新设计)，具体PCR扩增用引物序列设计如下：

VLκ-F：ACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCAT，

VLκ-R：TGAACCACCACCACCAGAGCCGCCGCCGCCGCC；

PCR扩增时，25μL扩增体系设计如下：

2×Taq Master Mix，12μL；

上、下游引物，各0.5μL；

cDNA模板(为第一轮扩增产物)，1μL；

去离子水，11.5μL；

扩增程序为：95℃、5min；95℃、30s，56℃、30s，72℃、20s，30个循环；72℃、10min；

PCR扩增结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶检测(部分扩增片段的电泳结果参见图1)，并对目的条带进行提取、纯化和鉴定。

第三轮PCR扩增时：

以第二轮扩增产物为模板，采用重叠延伸PCR拼接方法以获得全长scFv基因；PCR扩增时，引物序列设计为：

scFv-F:AGGAGGCGCGCATAATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGT T，

scFv-R:tgtgcagatgatgaccgcgGCTAGCTG；

PCR扩增时，25μL扩增体系设计如下：

2×Taq Master Mix，12μL；

上、下游引物，各0.5μL；

cDNA模板(为第二轮扩增产物)，1μL；

去离子水，11μL；

扩增程序为：95℃、5min；95℃、30s，56℃、30s，72℃、20s，30个循环；72℃、10min；

PCR扩增结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶检测(部分扩增结果参见图2)，在紫外灯下切胶回收约750bp左右大小位置的目的条带，并利用胶回收试剂盒回收约750bp大小位置的目的条带、纯化DNA片段，所得即为：VH基因和VL基因随机拼接而成的scFv。

(二)构建噬菌体抗体文库

在上述步骤获得scFv基因基础上，利用SfiI-HF限制性内切酶分别对所得猪scFv基因(文库)和噬菌粒载体pHEN2载体进行酶切，并回收酶切产物，进一步利用T4 DNA连接酶对酶切产物进行连接；

再后，采用电击转化法，将连接产物转化入大肠杆菌TG1感受态细胞，并涂板进行抗性筛选，进一步随机挑选阳性单菌落进行菌落PCR鉴定以验证scFv基因转化率(部分检测结果参见图3)，以及通过测序分析scFv噬菌体库的多样性，确保文库中scFv基因序列的多样性以满足靶标筛选应用(筛选应用时，进一步用M13KO7辅助噬菌体将含有噬菌体DNA的细菌文库包装成噬菌体文库)。

通过菌落计算的测定结果表明，本申请中所构建scFv文库容量为3.2×10⁹，具有库容量好、多样性好等特点，可以较好的满足筛选应用需要。

(三)噬菌体筛选

在上述所构建文库基础上，下面就(抗非洲猪瘟p72蛋白抗体)噬菌体的筛选实施步骤简介如下。

采用微孔板筛选法，以重组p72蛋白作为靶分子，对上述所构建的单链抗体库进行特异性抗体淘选筛选。筛选流程为：抗原与噬菌体抗体库孵育→洗脱未结合的非特异性噬菌体→扩增噬菌体抗体，经过3轮(本实施例经过3轮)筛选后可获得富集的特异性噬菌体抗体。具体操作参考如下。

(1)取重组p72蛋白作为靶分子，用包被液CBS(0.1M NaHCO₃，pH＝9.6)将蛋白稀释至需要的浓度(第一轮筛选时，包被液靶分子浓度为2μg/孔，后面每轮进行4倍稀释)，每孔100ul；4℃孵育过夜；

第二天，吸弃孔内液体，用200μL TBST洗涤板孔1次，吸弃液体；加入200μL封闭液(含有5％脱脂奶粉和0.25％ Tween20的TBS溶液)，37℃孵育板孔2h；

最后，弃尽孔内液体，用200μL含0.25％ Tween20的TBS洗涤孔板1次(根据情况，后续淘选操作时根据情况调节吐温浓度)；

(2)弃尽孔内液体后，加入制备好的抗体噬菌体抗体文库(1×10¹³/孔)，37℃静置孵育1h；

孵育结束后，弃尽孔内液体，拍甩干净，用含有0.25％ Tween20的TBST洗涤5次，每次5min，吸弃液体，拍甩干；

(3)加1mg/ml的Trypin(胰蛋白酶)，100ul/孔，室温缓摇8min，用移液器反复吹吸，吸出上清；

再加入100ul的4％脱脂奶-PBS进行中和(得到洗脱产物)，直接进行后续操作或者4℃保存备用；

(4)在提前培养的TG1单克隆菌液(挑取提前划线涂板活化TG1的单克隆，接种于20ml的2×YT培养基中，37℃、250rpm震荡培养至对数期，OD600＝0.5左右)中，加入步骤(3)中的洗脱产物，混匀后37℃静置30min以进行侵染，然后补加抗性成份(Amp，终浓度20ug/ml)，继续37℃、180rpm缓摇60min以进行抗性筛选；

(5)向步骤(4)的培养物中加入相应量的M13KO7(辅助噬菌体的数:菌体数≥10:1)，37℃静置20min以辅助进行侵染；

随后，补加30ml的2×YT培养基及Amp(终浓度20ug/ml)，37℃、180rpm缓摇60min；

(6)培养结束后，5000rpm离心10min，收集菌体，将菌体重悬在50ml的2×YT培养基中(Amp 50ug/ml+Kan 10ug/ml)，30℃、220rpm培养过夜；

培养结束后，4℃、12000rpm离心10min，将上清转移至新的离心管中，再次对上清液4℃、12000rpm离心10min；

离心结束后，再次将离心后上清液转移至新的离心管中，加入1/4体积的PEG8000/NaCl，4℃沉淀4h/冰沉淀2小时；

(7)冰沉结束后，4℃、12000rpm离心20min，弃上清，将沉淀重悬于0.5ml PBS中，4℃、12000rpm离心10min(以使残余细胞沉淀)；

最后，将上清转移至一新的离心管中(此为扩增产物)，测扩增产物滴度(测定滴度方法：接种TG1单克隆于2×YT无抗培养基中，37℃、220rpm培养至OD600≈1.0，取噬菌体库梯度稀释到10^-10，取100ul稀释液加入到200uL培养好的TG1中，37℃培养箱静置30min，全部涂布至氨苄抗性平板上，37℃过夜培养，第二天统计板上克隆数，计算滴度)。

筛选过程中，对上述步骤(3)的洗脱产物进行阳性情况鉴定时，采用PCR方式进行鉴定，20μl扩增体系设计如下(引物序列分别为F:TggAATTgTgAgCggATAACAATT,R:ATTCAGATCCTCTTCTGAGAT)：

rTaq，5ul；

10×Buffer，1ul；

模板(单克隆菌落)，1ul；

F引物，1ul；

R引物，1ul；

H₂O，加至10ul；

PCR条件：94℃、4min；94℃、30s，53℃、30s，72℃、40s，25个循环；72℃、2min，10℃、10s；至此，完成一轮淘选。

根据第一轮淘选结果，通过适当降低靶分子包被的浓度，或者提高洗涤液中Tween20的浓度和洗涤次数及时间，降低靶分子与噬菌体库的结合时间和温度，提高淘选压力，进行第二、三轮淘选，以降低背景，进一步富集高亲和力的噬菌体。筛选过程中，分别在第2轮和第3轮淘选之后，随机挑选10个单克隆进行测序分析，分析抗体重链可变区序列、抗体轻链可变区序列特征。

筛选过程中，采用ELISA试验检测每轮亲和筛选后亲合力情况。具体实验方法参考如下：

(1)包被：用包被液稀释靶蛋白至3μg/mL，按照100μL/孔的量包被ELISA板孔，4℃静置过夜；

(2)封闭：甩出多余包被液，倒置平板并在干净纸巾上拍甩去除残液，PBS洗板3次后，加入封闭液，200ul/孔，37℃静置1h；

(3)加样：甩出多余封闭液，倒置平板并在干净纸巾上拍甩去除残液，PBS洗板3次后，加入phage上清，50ul/孔，37℃静置1h；

(4)二抗：甩出多余phage上清(噬菌体上清液)后，倒置平板并在干净纸巾上拍甩去除残液，PBS洗板3次后，加入用1％ Milk-PBS 1:1000稀释的HRP兔抗M13，加入量50ul/孔，37℃孵育1h；

(5)显色：甩出多余溶液，倒置平板并在干净纸巾上拍甩去除残液，PBS洗板4次后，加入TMB显色液(50ul/孔)，充分反应显色结束后，加入2M H₂SO₄终止显色，450nm检测。

结果如图4所示。可以看出，scFV-83可以高特异性识别并结合p72蛋白。

相关上述测序分析结果表明，scFV-83作为一种针对p72蛋白的抗非洲猪瘟病毒的抗体，其属于一种单链抗体(即，仅包括重链可变区与轻链可变区)，其重链可变区VH序列如SEQ ID No.1所示，轻链可变区VL如SEQ ID No.2所示，具体如下：

重链可变区VH：

GAGGAGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTCGGCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTACCTACATTAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGCAGTGGCTTGCAGCTATTAGTACTAGTGGTGGTAGCACCTACTACACAGACTCTATGGAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACTCCCAGAACACGGCCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAACAGAAGACACGGCCCGCTATTACTGTGCAACCATCCGGGGTTGCTATAGCTATGGTGCTAGTTGCTATCGTTCCTGGGCGTCCTTTATGGATCTCTGGGGCCCAGGCGTTGAAGTCGTCGTGTCCTCAG；

轻链可变区VL：

TCCTATGAGCTGACTCAGCCGTCTTCAGAGTCAGTGGCCTTGGGAAGTACGGCCAAGATCACCTGCTCCGGGGATCTGCTGGATGAAAAATATACGCAATGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCCCTGCTGCTCATTTATAAGGACAATGAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGGTTCTCTGGGTCCAGCTCAGGGAAAACGGCCACCCTGACCATCACTGGGGCCCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTCGTGTCAGTCAGGTGACAGGATTAATAATGCTATTTTCGGCGGTGGGACCCATCTGACCGTCCTC。

在上述序列基础上，可以明确抗非洲猪瘟p72蛋白的scFv-Fc抗体的碱基序列(如SEQ ID No.3)如下：

ATGGCCTCCTATGAGCTGACTCAGCCGTCTTCAGAGTCAGTGGCCTTGGGAAGTACGGCCAAGATCACCTGCTCCGGGGATCTGCTGGATGAAAAATATACGCAATGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCCCTGCTGCTCATTTATAAGGACAATGAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGGTTCTCTGGGTCCAGCTCAGGGAAAACGGCCACCCTGACCATCACTGGGGCCCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTCGTGTCAGTCAGGTGACAGGATTAATAATGCTATTTTCGGCGGTGGGACCCATCTGACCGTCCTCGGTGGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGTTCAGGAGGAGGAGGAGGAAGCGAGGAGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTCGGCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTACCTACATTAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGCAGTGGCTTGCAGCTATTAGTACTAGTGGTGGTAGCACCTACTACACAGACTCTATGGAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACTCCCAGAACACGGCCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAACAGAAGACACGGCCCGCTATTACTGTGCAACCATCCGGGGTTGCTATAGCTATGGTGCTAGTTGCTATCGTTCCTGGGCGTCCTTTATGGATCTCTGGGGCCCAGGCGTTGAAGTCGTCGTGTCCTCAGCTAGTGGCCAGGCCGGCCTGGCATCTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。

实施例2

在实施例1基础上，可以看出，scFV-83与p72蛋白具有较强结合力，为进一步对蛋白的应用前景进行评估，发明人利用InvivoGen公司的pINFUSE-mIgG2b-Fc2质粒(该质粒重组有CH2-CH3序列，CH2-CH3序列参考：GenBank:BAE20056.1；需要强调的是，采用该质粒仅是基于实际实验的便捷性，并不表示本申请技术方案必须依赖于该质粒，采用其他通用性质粒，亦可实现抗体表达)作为载体，并利用293F细胞进行了相关蛋白表达，进一步利用Protein A获得了纯化的猪源抗p72的单链scFv-Fc抗体。具体制备过程介绍如下。

(一)对真核表达载体pINFUSE-mIgG2b-Fc2进行重组

首先，将噬菌体83号(scFV-83)对应的单克隆接种于1mL的含有氨苄(100μg/mL)和四环素抗性(15μg/mL)的2×YT液体培养基中，37℃、260rpm振荡培养过夜，采用质粒小提试剂盒(TRANS公司产品，参考说明书进行操作)对培养物进行质粒提取(利用NanoDrop2000紫外分光光度计对提取物中质粒浓度进行测定，确保满足后续使用需要)；

随后，用限制性内切酶EcoRI和NcoI分别酶切所提取质粒和真核表达载体pINFUSE-mIgG2b-Fc2，并对酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收酶切产物，并用T4 DNA连接酶对酶切产物进行连接。

操作过程中，酶切体系(20μL)设计如下：

所提取质粒(或真核表达载体pINFUSE-mIgG2b-Fc2)，2μg；

EcoRI和NcoI，各2μL；

10×CutSmart Buffer，2μL；

ddH2O补足至20μL；

50℃,酶切2h。

T4 DNA连接酶连接时，连接体系(10μL)设计如下：

所提取质粒酶切产物，100ng；

pFUSE-Fc酶切产物，60ng；

T4 DNA ligase，0.5μl；

10×T4 DNAligase Buffer，1μl；

ddH2O补足至10μL；

16℃,连接3h。

再后，采用热激转化法，将连接产物转化入TG1感受态细胞，具体操作参考为：

取10μL连接产物加入到TG1感受态中，冰浴30min，42℃热激45s，再于冰上孵育5min；加入600μL无抗2×YT液体培养基，37℃、260rpm复苏1h后涂布于含有氨苄(100μg/mL)和四环素抗性(15μg/mL)的2×YT平板上，37℃过夜培养。

最后，挑取阳性单克隆进行测序验证，将重组质粒表达载体命名为：pINFUSE-scFV-83。

(二)进行scFV-Fc抗体表达

参照SinoBiological的SMM 293-TII Expression Medium和Sinofection转染试剂说明书，将上述步骤(一)中构建正确的重组质粒载体pINFUSE-scFV-83转化入细胞状态良好的293F细胞，置于细胞摇床37℃，120rpm，5％ CO₂培养5-7天后，收集含有scFv-Fc重组抗体的培养物。

(三)纯化获得单链scFV-Fc抗体

对步骤(二)所收集的培养物，4℃、5000g离心10min，去除细胞沉淀留上清，上清即为表达后含有单链scFv-Fc抗体的溶液。

进一步地，利用15KD截留分子量的Millipore超滤离心管对上清进行浓缩处理，并利用ProteinA亲和填料对其进行纯化、洗脱，即可获得纯化的scFv-Fc抗体。

对所得纯化后scFv-Fc抗体进行SDS-PAGE鉴定，结果如图5所示。SDS-PAGE图中所示泳道1为空白对照293F细胞，泳道2为重组抗体，泳道显示单一的目的条带，表明纯度较好。进一步对纯化洗脱后目的蛋白进行Western blot分析，结果如图6所示，可以看出：其大小符合预期，进一步证明本发明获得的重组抗体活性良好、纯度较好。

(四)鉴定

对上述所得scFv-Fc抗体，发明人进一步利用IFA和Western blot方法检测了其分别与p72和灭活病毒的结合情况。具体情况简介如下。

(1)Western Blot抗体活性鉴定

以猪肺泡巨噬细胞(PAMs)作为样品，采用免疫印迹法研究scFV-83与灭活处理的感染ASFV HLJ/18株(由哈尔滨兽医研究所提供)猪肺泡巨噬细胞(PAMs)样品的反应情况。

实验过程中，以ASFV HLJ/18株感染的PAM细胞和空白对照组的未感染ASFV的PAM细胞作为SDS-PAGE的样品，所有样品在95℃，30min变性处理；然后用SDS-PAGE(12.5％PAGE凝胶快速制备试剂盒，BioMan)对样品进行解析，采用半干法将蛋白转移到PVDF膜上；

然后，将PVDF膜用5％的脱脂奶在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中室温封闭1h；

再后，用收集的scFV-83培养物原液作为一抗，PBST洗涤5次后，加入1:4000稀释的HRP标记山羊抗猪IgG(H+L)(Proteintech,China)作为二抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤5次；

最后，使用ECL对PVDF膜进行可视化。

结果如图7所示。可以看出：此抗体可以特异性识别并结合ASFV HLJ/18感染的PAM细胞，而不与空白组的PAM细胞反应，证明了scFV-83的确是针对于ASFV病毒的抗体。

(2)IFA鉴定抗体活性

试验过程及操作参考如下：

参考前述操作及现有技术，利用擎科生物技术公司构建合成的含有p72基因(Pig/HLJ/18GenBank:MK333180.1)的p3xFLAG-CMV-14表达载体，转染PK15细胞，同时设立空载阴性对照；转染后24h，弃培养基，PBS轻轻冲洗细胞一遍；

4％多聚甲醛固定40min，PBS洗三次；0.1％Triton-100通透细胞10min，PBS洗三次；

再以5％ BSA室温封闭40min后，加入纯化后的scFv-Fc抗体(1μg/mL)作为一抗，37℃、孵育1h，PBS洗三次；

FITC-Goat Anti-Pig IgG(H+L)(1:100)，37℃避光孵育1h，PBS洗三次；

超纯水洗3次，加入DAPI染核10min，PBS洗三次，封片，上镜观察。

结果如图8所示。可以看出，本申请所制备抗体可以特异性与细胞质中的p72蛋白发生反应，而且scFV-Fc的荧光主要分布于细胞核，说明scFV-Fc靶向于细胞核。总体上，间接免疫荧光试验也进一步验证该抗体亲和力与反应性良好。

Claims (8)

1.一种针对p72蛋白的抗非洲猪瘟病毒的抗体，其特征在于，该抗体属于一种仅包括重链可变区VH与轻链可变区VL的单链抗体；

所述重链可变区VH，长度为391bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区VL，长度为321bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述针对p72蛋白的抗非洲猪瘟病毒的抗体，其特征在于，重链可变区VH和轻链可变区VL之间设有连接子，连接子序列为：

GGTGGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGTTCAGGAGGAGGAGGAGGAAGC。

3.一种抗非洲猪瘟p72蛋白的scFv-Fc抗体，其特征在于，其碱基序列长度为1494bp，碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求3所述抗非洲猪瘟p72蛋白的scFv-Fc抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(一)制备重组表达载体

首先，获得正确的抗体核苷酸序列；

随后，以真核表达质粒为载体，重组上述抗体核苷酸序列，构建获得可翻译表达SEQ IDNO.3所示核苷酸序列的重组真核表达载体；

(二)进行抗体蛋白表达

将步骤(一)中构建正确的重组质粒载体转化293F细胞，培养5-7天后，收集含有scFv-Fc重组抗体的培养物；

(三)纯化获得单链scFv-Fc抗体

对步骤(二)所得培养物，离心去除细胞沉淀，留上清，上清即为含有单链scFv-Fc抗体的溶液。

5.如权利要求4所述抗非洲猪瘟p72蛋白的scFv-Fc抗体的制备方法，其特征在于，步骤(一)中，所述真核表达质粒为pINFUSE-mIgG2b-Fc2质粒。

6.如权利要求4所述抗非洲猪瘟p72蛋白的scFv-Fc抗体的制备方法，其特征在于，步骤(三)中，对所得上清液，进一步利用15KD截留分子量的Millipore超滤离心管进行浓缩处理后，利用ProteinA亲和填料对其进行纯化，获得纯化的scFv-Fc抗体。

7.权利要求1所述针对p72蛋白的抗非洲猪瘟病毒的抗体在非洲猪瘟病毒检测或预防中的应用。

8.权利要求2所述抗非洲猪瘟p72蛋白的scFv-Fc抗体在非洲猪瘟病毒检测或预防中的应用。

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