CN115850473B - Il-8抗体及其应用 - Google Patents
Il-8抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115850473B CN115850473B CN202211499692.XA CN202211499692A CN115850473B CN 115850473 B CN115850473 B CN 115850473B CN 202211499692 A CN202211499692 A CN 202211499692A CN 115850473 B CN115850473 B CN 115850473B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- amino acid
- chain variable
- acid sequence
- variable region
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 title claims abstract description 78
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 abstract description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 7
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 4
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 101001055222 Homo sapiens Interleukin-8 Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 abstract 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 abstract 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 abstract 1
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 63
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 59
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 29
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 9
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 102000010681 interleukin-8 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010038415 interleukin-8 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000011242 neutrophil chemotaxis Effects 0.000 description 4
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 102100028989 C-X-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 description 3
- 108010018951 Interleukin-8B Receptors Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 102100036166 C-X-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100036153 C-X-C motif chemokine 6 Human genes 0.000 description 2
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010014423 Chemokine CXCL6 Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000947174 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102000010400 1-phosphatidylinositol-3-kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 101100355569 Dictyostelium discoideum rabV gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100034221 Growth-regulated alpha protein Human genes 0.000 description 1
- 101001069921 Homo sapiens Growth-regulated alpha protein Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 102100026236 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108010018976 Interleukin-8A Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000394658 Prymnesium kappa Species 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001188 anti-phage Effects 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了IL‑8抗体及其应用。本发明以人IL‑8为抗原,以兔为免疫对象,通过皮下注射免疫兔,经过多轮免疫后,提取兔的脾脏,分离单核细胞,提取总RNA,反转录成cDNA,使用特定引物扩增获得全部重链可变区和轻链可变区,构建噬菌体抗体库。通过噬菌体抗体库,筛选到与IL‑8结合的单克隆抗体。本发明的抗IL‑8单克隆抗体与IL‑8特异性结合,可用于诊断或治疗与IL‑8表达异常相关的疾病。
Description
技术领域
本发明属于单克隆抗体筛选、制备及应用技术领域,具体涉及一种抗IL-8单克隆抗体及其应用。
背景技术
白介素-8(IL-8)又称CXCL8,属于CXC亚型,是最早发现的趋化性细胞因子。IL-8分为α和β两个亚群,IL-8初始翻译产物为99个氨基酸,在单核和巨噬细胞中剪切成72个氨基酸,分子量为8KDa活性物质。IL-8主要由单核细胞和巨噬细胞分泌,功能是募集和活化中性粒细胞,促使炎症反应和细胞杀伤。另外肿瘤细胞、成纤维细胞、内皮细胞等在IL-1β、肿瘤坏死因子α、脂多糖等促炎症因子的作用下,通过自分泌或旁分泌影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及肿瘤血管的形成。
IL-8通过与IL-8受体结合发挥作用,IL-8有2种受体,分别是CXCR1(IL-8RA)和CXCR2(IL-8RB),这2个受体存在77%的同源性,都属于G蛋白偶联受体。因为N端存在结构差异,2个受体与IL-8的亲和性不同,CXCR1与IL-8亲和性较高。在正常组织细胞中,CXCR1首先与粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)结合形成复合体,然后与IL-8结合发挥作用;CXCR2与IL-8的亲和性较低,除IL-8外,CXCR2还可以与CXCL1、2、3、5、7等多种配体结合。IL-8对中性粒细胞有明显趋化和功能活化作用,还可诱导CD4+和CD8+T细胞的趋化,参与多种疾病的发展和组织损伤,如风湿性关节炎、牛皮藓、缺血回灌综合征(包括心肌梗死和多器官功能衰竭)、肾小球肾炎以及其他各类感染性疾病等;IL-8与受体结合可通过激活PI3K/Akt、PLC/PKC以及MAPK等多个下游信号通路促进肿瘤的发生发展。因此筛选IL-8拮抗性单克隆抗体,可有效治疗IL-8介导的疾病。
以IL-8为免疫原,免疫兔子,构建抗IL-8噬菌体抗体库,可有效的筛选到拮抗IL-8的抗体,通过基因工程和蛋白表达技术,可大规模生产拮抗IL-8抗体,用于IL-8异常相关疾病的诊断和治疗。
发明内容:
本发明的主要目的是提供针对IL-8的特异单克隆抗体及其应用。从免疫后的兔获取脾脏,构建抗IL-8噬菌体抗体库,快速筛选针对IL-8抗体,该抗体可用于IL-8表达异常导致的疾病诊断和治疗。
本发明筛选到的IL-8抗体包括:YX20
YX20重链CDR序列:
CDRH1氨基酸序列GFSLNNYA,见SEQ NO.1;
CDRH2氨基酸序列VGSDDIP,见SEQ NO.2
CDRH3氨基酸序列ASGYVGDDRYNI,见SEQ NO.3;
YX20轻链CDR序列:
CDRL1氨基酸序列PSVYNNNY,见SEQ NO.4;
CDRL2氨基酸序列AAS,见SEQ NO.5;
CDRL3氨基酸序列AGAYSNDSDDG,见SEQ NO.6。
YX20重链可变区氨基酸序列:
GSTGDQEQLVESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMSWVRQAPGKGLEYIGVVGSDDIPFYA SWAKGRFAISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCASGYVGDDRYNIWGPGTLVTISS,见SEQ NO.7;
YX20轻链可变区氨基酸序列:
GSTGDAAVVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSPSVYNNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYAASTLASG VPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGAYSNDSDDGFGGGTKLEIK,见SEQ NO.8。
所述抗体分子包括但不限于:免疫球蛋白、Fab、(Fab′)2或单链抗体。
所述的IL-8抗体用于制备诊断IL-8表达异常疾病的制剂。
所述的IL-8抗体用于制备治疗IL-8表达异常相关的疾病。
IL-8表达异常相关的疾病包括肿瘤。
本发明原核表达IL-8,将获得的IL-8按照1mg/只的剂量皮下注射兔子进行免疫,共进行4轮免疫,每轮间隔2周,免疫结束后,处死兔子,摘取脾脏,将脾脏研磨成单细胞悬液,分离获得单核细胞,获取单核细胞并提取总RNA,合成cDNA,使用重链可变区和轻链可变区兼并引物,扩增重链可变区和轻链可变区,获得的重链可变区和轻链可变区进行随机组合,并与噬菌体载体进行重组,重组产物转化XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13获得滴度≈1013大小噬菌体抗体库。使用抗原IL-8,筛选出抗IL-8的抗体,通过测序,获得能与IL-8结合的重链可变区和轻链可变区序列,重链可变区组装上人IgG1的Fc片段,抗体重链和轻链同时在哺乳动物细胞中表达,表达出人源化改造的抗IL-8的抗体。通过体外实验,本发明筛选到的抗IL-8单克隆抗体可以与IL-8特异性结合,可用于检测或治疗IL-8表达异常引发的疾病。
附图说明:
图1IL-8基因克隆;
图2纯化后IL-8SDS-PAGE电泳检测;
图3抗IL8抗体重链可变区基因克隆;
图4抗IL8抗体轻链可变区基因克隆;
图5抗IL8抗体重链和轻链可变区基因拼接;
图6抗IL8噬菌体阳性克隆鉴定;
图7ELISA鉴定第5轮筛选噬菌体库;
图8抗体重链和轻链与pcDNA3.4连接PCR鉴定;
图9抗体YX20纯化产物SDS-PAGE电泳检测;
图10抗IL8抗体对中性粒细胞趋化性抑制;
图11抗IL8抗体对体内HCT116生长抑制。
具体实施方式:
以下结合具体实施例对本发明作进一步的描述,而不会形成对本发明的限制。
本发明实施例中使用的IL-8蛋白实验室自行制备。
本发明噬菌体抗体库构建方法参考于:Antony S.Dimitrov(ed.),Generationand Selection of Rabbit Antibody Libraries by Phage Display,2009,TherapeμticAntibodies:Methods and Protocols,vol.525,101-128.
实施例1
一、IL-8蛋白制备
以人单核细胞cDNA为模板,使用引物IL-8F和IL-8R克隆IL-8片段,并将该片段导入pGEX-4T-1载体(淼灵,P0001),筛选获得构建成功的pGEX-4T-1-IL-8,在IPTG诱导条件下表达,纯化获得IL-8蛋白。
具体包括以下步骤:
1、克隆IL-8片段
将单核细胞cDNA稀释10倍
(1)体系配制如下表1:
表1
cDNA | 2μl |
IL-8F | 4μl |
IL-8R | 4μl |
ddH2O | 40μl |
PrimerSTAR(购自TAKARA) | 50μl |
Total | 100μl |
注:克隆IL8基因引物
IL8-F:GTTCCGCGTGGATCCCCGGAAGAAGGTGCAGTTTTGCCAAG,见SEQ NO.9,
IL8-R:TCGAGTCGACCCGGGAATTTCATGAATTCTCAGCCCTCTTCA,见SEQ NO.10;
(2)反应条件见下表
表2
Step1 | 98℃ | 15s |
Step2 | 98℃ | 10s |
Step3 | 55℃ | 5s |
Step4 | 72℃ | 5s |
Go to Step 2x34 | ||
Step5 | 72℃ | 1m 30s |
Step6 | 4℃ | Forever |
(3)电泳
取25μl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,确定是否扩增到目的条带,大小约240bp(见图1)。
(4)将240bp大小条带切下,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,28706)进行回收,测定浓度。
2、IL-8片段与载体pGEX-4T-1连接转化
使用北京金沙生物科技有限公司Uniclone one step seamless cloning kit,货号SC612
(1)连接
体系配置
表3
组分 | 目的重组 |
2X Uniclone seamless cloning Mix | 5ul |
线性化pGEX-4T-1 | 1ul |
IL-8片段 | 3ul |
ddH2O | 1ul |
反应条件
50℃,15min
(2)转化
取步骤(1)产物2.5ul加入到50ulDH5α,冰上放置30min,42℃热击90s,冰上放置2min,加入1mlLB培养基,37℃,220rpm培养1h,取100ul均匀的涂抹在含氨苄抗性的平板上,37℃恒温箱过夜培养。
(3)阳性克隆鉴定
挑选步骤(2)单克隆,使用引物IL-8F/IL-8R进行菌落PCR鉴定,鉴定为阳性的克隆,送测序公司进一步测序鉴定,序列正确的克隆保留。
3、IL-8表达与纯化
(1)挑取单克隆加入到10ml含氨苄抗性LB液体培养基中,37℃,220rpm过夜培养,
(2)在100ml含氨苄抗性空白LB液体培养基中,接种1%步骤(1)菌液,37℃,220rpm过夜培养,OD600达到0.6时,加入0.2mmol/L的IPTG诱导4h。
(3)诱导结束后,将菌液倒入50ml离心管,4000rpm离心15min,弃上清,加入10ml平衡液(140mM NaCl,2.7mMKCl,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,pH7.4)重悬菌体。超声破碎,至菌液澄清。
(4)将破碎后的菌液转移到离心管,15000g,4℃离心20min,取上清过0.45um滤器,滤液冰上放置。
(5)将Glutathlone Beads 4FF重力柱(常州天地人和生物科技有限公司,货号SA010005)用10倍平衡液平衡,加入步骤(4)上清,让样品穿过柱子,重复4次。
(6)加入15倍平衡液洗柱子。
(7)加入5倍体积的洗脱液洗脱蛋白(140mM NaCl,2.7mMKCl,10mM Na2HPO4,1.8mMKH2PO4,10mM还原性谷胱甘肽,pH7.4)。
(8)获得的目的蛋白用10Kd超滤管进行浓缩,并使用10mMPBS置换缓冲液。
(9)浓缩后的IL-8测定蛋白浓度和SDS-PAGE检测(见图2)
二、IL-8免疫兔子
(1)首次免疫500ulIL-8(1mg)与500ul弗氏完全佐剂混匀,2月龄新西兰大白兔,背部皮下多点注射。
(2)每间隔2周,500ulIL-8(1mg)与500ul弗氏不完全佐剂混匀
新西兰大白兔背部皮下多点注射,间隔免疫3次。
三、噬菌体抗体库的构建
新西兰大白兔免疫结束后,处死,摘取脾脏,分离单核细胞,提取总RNA,反转录成cDNA,使用重链可变区和轻链可变区兼并引物,扩增获得重链可变区和轻链可变区片段,将抗体重链可变区和轻链可变区进行随机拼接并与噬菌体载体连接,并转化XL1-Blue菌(购自于唯地生物科技有限公司),在辅助噬菌体VSCM13(购自NTCC国家典型培养物保藏中心)存在条件下,组装成噬菌体抗体展示库。
具体包括以下步骤:
1、单核细胞分离
使用人外周血淋巴分离液(LTS1077-1,天津灏洋生物制品科技有限责任公司,)分离单核细胞。
(1)制备细胞悬液:将脾脏放置在细胞筛,放入加有培养基的培养皿中,使用2.5ml针头注射器推杆,轻轻的挤压,直到脾脏完全挤碎,细胞悬液转入15mL离心管中。
(2)将装有细胞悬液的15mL离心管,100g,10min。
(3)将上层细胞悬液,转入含等体积淋巴分离液的15ml离心管,用吸管小心吸取细胞悬液加于分离液之液面上,500-1100g(1800rpm),离心10min,加速度5,减速度4。
(4)离心后,此时离心管中由上至下分为四层;第二层为环状乳白色淋巴细胞层。
(5)用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层转移到新的15mL离心管中,向所得离心管中加入10mLPBS,混匀细胞。
(6)1800rpm,离心10min,加速度5,减速度4。
(7)弃上清,每支15ml离心管加入5ml的红细胞裂解液,稍微混匀后室温静置5min。
(8)1800rpm,离心10min,加速度5,减速度4。
(9)弃上清,吸取10mL PBS重悬所得细胞。
(10)1800rpm,离心10min,加速度5,减速度4。
(11)弃上清,沉淀为单核细胞。
2、总RNA提取
将获得的单核细胞,按照5X106个细胞加入0.75ml Trizol(Thermo fisher)提取总RNA,然后各取1μg RNA将18份RNA等量混合。
(1)5X106个细胞中加入0.75ml Trizol。
(2)上下混匀数次,冰上孵育5min,保证细胞充分裂解。
(3)4℃12000rpm离心10分钟,将上清转移到干净离心管。
(4)1mlTrizol中加入0.2ml氯仿,混匀。
(5)冰上孵育2-3min。
(6)4℃12000rpm离心15分钟。
(7)转移上清水相到干净离心管。
(8)上清中加入等体积的异丙醇混匀。
(9)室温孵育10min,4℃12000rpm离心10-15分钟。
(10)弃上清,保留沉淀。
(11)加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀。
(12)4℃12000rpm离心5分钟。
(13)尽可能弃去上清。
(15)室温干燥5-10min,管壁上看不到液体。
(16)加入20-50μl无RNAse的水回溶RNA。
(17)取1μlRNA电泳检测及测定RNA浓度。
(18)将RNA分装保存于-80℃冰箱,避免反复冻融。
3、cDNA的合成
取5μg的RNA,使用cDNA合成试剂盒(K1612,Thermo fisher)。
(1)取5μg RNA量合成cDNA。
(2)10μl的RNA/primer mixtμre体系见下表4,包括:
表4
体系成份 | 体积 |
RNA | 5μg |
50μM Oligo(dT)20 | 1μl |
Hex Random Primer | 1μl |
10mM dNTP | 1μl |
DEPC-treated water | 总体积10μl |
(3)65℃孵育5min,置于冰上放置1min。
(4)按下表5添加其他试剂,准备cDNA Synthesis Mix进行下一步反应。
表5
体系成分 | 1反应 |
10xRT buffer | 2μl |
25mM MgCl2 | 4μl |
0.1M DTT | 2μl |
RNaseOΜT(40Μ/μl) | 1μl |
Superscript III RT(200Μ/μl) | 1μl |
(5)加入10μl的cDNA Synthesis Mix到RNA/primer mixture轻轻混匀,离心,按下表6条件进行反应:
表6
Step1 | 50℃ | 50min |
Step2 | 85℃ | 5min |
冰上冷却,简短离心 | ||
Step3 | RNaseH | 1μl |
Step4 | 37℃ | 20min |
(6)cDNA产物分装保存于-20℃。
4、抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)扩增
将合成的cDNA稀释10倍,用于扩增重链可变区和轻链可变区的模板。
(1)体系配制如下表7,以VH为例:
表7
(2)反应条件见下表
表8
Step1 | 98℃ | 15s |
Step2 | 98℃ | 10s |
Step3 | 55℃ | 5s |
Step4 | 72℃ | 5s |
Go to Step 2x34 | ||
Step5 | 72℃ | 1m 30s |
Step6 | 4℃ | Forever |
(3)电泳
取10μl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,确定是否扩增到目的条带,大小约400bp(见图3)。
(4)将所有扩增的VH等量混合,加入0.1倍体积的3M乙酸钠和2.2倍体积的乙醇,混匀,-20℃放置过夜。
(5)4℃,16000g离心15min,去上清,使用1ml 70%乙醇漂洗(室温),室温干燥,加入200μl水回溶,1%的胶进行凝胶电泳。
(6)将400bp大小条带切下,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,28706)进行回收,测定浓度。
(7)VL的扩增及回收按照步骤(1)-(6)进行操作,结果见图4。
(8)调整VH和VL纯化后核酸浓度,终浓度为100ng/μl,放-20℃储存。
5、扩增Cκ-pelB
(1)以载体pCκ和pCL(载体购自于add gene)(100ng/μl)为模版扩增Cκ-pelB和CL-pelB
以扩增Cκ-pelB为例,见表9。
表9
pCκ | 10μl |
HCK(序列见前述的参考文献) | 60μl |
Pelb(序列见前述的参考文献) | 60μl |
ddH2O | 370μl |
PrimerSTAR | 500μl |
Total | 1000μl |
(2)反应条件见表10
表10
(3)取10μl产物电泳检测,条带大小约400bp。
(4)将所有扩增的Cκ-pelB混合,加入0.1倍体积的3M乙酸钠和2.2倍体积的乙醇,混匀,-20℃放置过夜。
(5)4℃,16000g离心15min,去上清,使用1ml 70%乙醇漂洗(室温),室温干燥,加入200μl水回溶,使用1%的胶进行凝胶电泳。
(6)将400bp大小条带切下,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,28706)进行回收,测定浓度。
(7)稀释纯化后的Cκ-pelB,终浓度为100ng/μl,放-20℃储存。
(8)扩增CL-pelB,按照步骤(1)-(7)进行操作,扩增模板pCκ换成pCL。
6、Rab Vκ/Rab Cκ/CL/Rab VH融合
(1)按下表11将不同量的VL、VH、Ck-pelB混合
VL浓度100ng/μl,VH浓度100ng/μl,Cκ-pelB浓度100ng/μl
表11
VL | 10μl |
VH | 10μl |
Ck-pelB | 10μl |
Primerstar Mix | 500μl |
H2O | 470μl |
Total | 1000μl |
(2)反应条件见表12
表12
(3)扩增Rab VL/Rab Cκ/Rab VH,见表13
表13
拼接产物 | 50μl |
C-5'SFIVL(序列见前述的参考文献) | 4μl |
c-3'sfivh(序列见前述的参考文献) | 4μl |
ddH2O | 17μl |
PrimerSTAR | 25μl |
Total | 100μl |
(4)扩增条件见表14
表14
Step1 | 98℃ | 15s |
Step2 | 98℃ | 10s |
Step3 | 55℃ | 5s |
Step4 | 72℃ | 5s(Go to Step2 x 39) |
Step5 | 72℃ | 1m 30s |
Step6 | 4℃ | Forever |
(5)电泳检测
取10μlPCR产物,电泳检测,融合后目的基因条带大小1.2Kb。(见图5)
(6)将所有扩增的Rab VL/Rab Cκ/Rab VH,加入0.1倍体积的3M乙酸钠和2.2倍体积的乙醇,混匀,-20℃放置过夜。
(7)4℃,16000g离心15min,去上清,使用1ml 70%乙醇漂洗(室温),室温干燥,加入200μl水回溶,使用1%的胶进行凝胶电泳。
(8)将1.2Kb大小条带切下,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,28706)进行回收,测定浓度。
(9)稀释Rab VL/Rab Cκ/Rab VH纯化的核酸,终浓度为150ng/μl,放-20℃储存。
(10)Rab Vλ/Rab CL/Rab VH的融合按照步骤(1)-(9)进行操作。
7、SfiI酶切Rab Vκ/Rab Cκ/CL/Rab VH和RabVλ/RabCL/Rab VH
以Rab Vκ/Rab Cκ/CL/Rab VH酶切为例
(1)酶切体系见表15
表15
human Vκ/human Cκ/CL/human VH(150ng/μl) | 200μl |
10Xbuffer | 30μl |
H2O | 60μl |
SfiI 40u/μl | 10μl |
(2)50℃水浴,酶切反应3h。
(3)使用1%凝胶进行电泳,将1.2kb大小的条带切下,使用QIAquick GelExtraction Kit(QIAGEN,28706)进行回收。
(4)检测SfiI酶切后回收Rab VL/Rab Ck/Rab VH片段,调整浓度50ng/μl,-20℃保存。
(5)酶切Rab Vλ/Rab CL/Rab VH,按照步骤(1)-(4)进行操作。
8、SfiI酶切pC3C(载体购自于add gene)
(1)酶切体系见表16
表16
pC3C 1μg/μl | 50μl |
10Xbuffer | 30μl |
H2O | 208μl |
SfiI 40u/μl | 12μl |
(2)50℃水浴,酶切反应3h。
(3)使用1%凝胶进行电泳,会切出两条带,一条3.5Kb和一条1.2kb大小片段。
(4)使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,28706)回收3.5Kb的载体骨架。
(5)Sfi酶切后回收载体骨架浓度调整为100ng/μl。
9、连接pC3C(SfiI)和Rab VL/human Cκ/Rab VH(SfiI)
(1)连接体系见表17
表17
100ng/μl SfiI酶切后pC3C | 1.5μl |
50ng/μl SfiI酶切后human VL/human Cκ/human VH | 2μl |
10XT4 DNA ligase buffer | 2μl |
H2O | 13.5μl |
T4 DNA ligase 2000u/μl | 1μl |
对照组见表18
表18
100ng/μl SfiI酶切后pC3C | 1.5μl |
10XT4 DNA ligase buffer | 2μl |
H2O | 15.5μl |
T4 DNA ligase 2000u/μl | 1μl |
(2)16℃反应过夜。
(3)合并所有连接反应物,加入1/10体积的3M乙酸钠溶液。
(4)加入2.2倍体积预冷的无水乙醇,上下混合均匀,-20℃沉淀过夜。
(5)16000g,4℃离心30min,小心弃上清。
(6)加入70%乙醇轻轻清洗沉淀,16000g,4℃离心5min,弃上清。
(7)室温干燥。
(8)用适量的水进行溶解,通常1个连接反应用1μl体积ddH2O进行充分溶解,置-20℃保存。
(9)连接pC3C(SfiI)和Rab Vλ/Rab CL/Rab VH按照步骤(1)-(8)进行操作。
10、连接产物转化XL1-Blue
(1)XL1-Blue电击感受态冰上放置10min进行溶解。
(2)取19μl沉淀浓缩后的连接产物加入到1.5ml离心管,冰浴,加入300μl的XL1-Blue电击感受态混匀,快速的转入2mm电击杯,冰上放置1min。
(3)电击条件:2.5KV,4ms
(4)电转结束后快速加入5ml(1ml+2ml+2ml)SOC培养基,转入50ml尖底离心管,37℃,250rpm,培养1h。取2μl菌液加入198μl的LB中,同时均匀的涂在含100μg/μl羧苄青霉素LB平板上,37℃放置过夜培养,用于计算转化效率及菌落PCR鉴定阳性率。PCR结果见图6。
(5)加入10ml SB培养基,3μl 100μg/μl羧苄青霉素,和30μl 5μg/μl四环素。37℃,250rpm,培养1h。
(6)加入4.5μl 100μg/μl羧苄青霉素,继续37℃,250rpm,培1-4h。
(7)将培养后的菌转移到500ml培养瓶,加入84ml SB培养基,42.5μl 100μg/μl羧苄青霉素,170μl 5μg/μl四环素,加1ml VCMS13辅助噬菌体(1011-1012pfu/ml),37℃,275rpm,90min。
(8)加入140μl 50μg/μl卡那霉素,37℃,275rpm,过夜培养。
(9)3000g,4℃离心15min。
(10)沉淀噬菌体
上清(200ml)转移到500ml干净离心管,加入8g PEG-8000和6g NaCl,放入37℃,300rpm,5min促进溶解。冰上放置30min-1h。15000g,4℃离心15min。弃上清,将离心瓶颠倒放置在滤纸上放置10min干燥,小心的移去多余液体。使用含1%的BSA的TBS 2ml重悬噬菌体(移液器上下混匀),16000g,4℃离心5min,上清过0.22μm滤膜(Millipore),转移到2ml离心管。短时间可直接放冰上存储,或者加0.01倍体积的2%叠氮化钠放4℃,对于长时间存储加1倍体积甘油放-20℃存储。
二、噬菌体抗体库筛选以IL-8噬菌体抗体筛选为例
使用包被IL-8蛋白的96孔板,进行5轮筛选,然后挑选单克隆鉴定IL-8特异性抗体。
1、抗原包被
(1)将IL-8加入到碳酸缓冲液,浓度2μg/ml,
(2)康宁高蛋白吸附酶联免疫96孔板,每孔加入50μlIL-8,4℃放置过夜;
(3)弃去上清,加入5%的脱脂奶粉200μl/孔,37℃放置1h;
(4)弃上清,0.05%的TBST洗涤5次。
2、IL-8抗体筛选
(1)将噬菌体抗体库用2%的脱脂奶粉稀释10倍,取2个包被有IL-8抗原的96孔微孔,加入100μl稀释后的噬菌体,37℃放置1h。
(2)弃上清,0.05%的TBST洗涤5次,加入100μl 100mM甘氨酸,37℃放置15min,期间不断进行吹打,加入9μl 1M Tris。
(3)将步骤(2)洗脱下来的噬菌体加入到2ml的XL1-Blue菌中,室温放置15min。
(4)加入6ml SB培养基,加入1.6μl 100μg/μl的羧苄青霉素,12μg 5μg/μl的四环素,37℃,250rpm培养1h。
(5)加入2.4μl 100μg/μl的羧苄青霉素继续培养1h;
(6)加入1ml辅助噬菌体VCSM13(1011-1012pfu/ml),转移到500ml培养瓶,加入91mlSB培养基,加入46μl100μg/μl的羧苄青霉素,184μl5μg/μl的四环素,37℃,250rpm培养1.5h,加入140μl 50μg/μl的卡那霉素,37℃,250rpm过夜培养。
(7)噬菌体抗体浓缩:将上一步菌液离心去菌体,收集上清(100ml);加入4gPEG-8000和3g NaCl,放入37℃,300rpm,5min促进溶解。冰上放置30min-1h。15000g,4℃离心15min。弃上清,将离心瓶颠倒放置在滤纸上放置10min干燥,小心移去多余液体。使用含1%BSA的TBS 2ml重悬噬菌体(移液器上下混匀),16000g,4℃离心5min,上清过0.22μm滤膜(Millipore),转移至2ml离心管。短时间可直接放冰上存储,或者加0.01倍体积的2%叠氮化钠放4℃,对于长时间存储加1倍体积甘油放-20℃存储。
(8)取步骤(7)噬菌体,按照步骤(1)-(7)进行5轮筛选。
(9)五轮筛选的抗体库的ELISA鉴定:
1)ELISA 96孔板,每孔包被100ng的IL-8;
2)加入100μl噬菌体(2%脱脂奶粉稀释10倍)37℃孵育1h;
3)0.05%的TBST洗涤5次;
4)加入5%脱脂奶粉稀释2000倍的抗M13-HRP抗体(购自北京义翘神州生物技术有限公司)100μl,37℃孵育1h;
5)0.05%的TBST洗涤5次;
6)加入100μl TMB,避光显色5min;
7)加入50μl 1M H2SO4终止反应。
8)使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
结果见图7和表19。
表19 ELISA鉴定第5轮筛选噬菌体库
3、IL-8单克隆抗体鉴定
(1)取第5轮筛选的IL-8噬菌体,稀释10-7,取1μl加入到200μl XL1-Blue菌,室温放置15min;
(2)将步骤(1)菌全部涂在含100μg/ml羧苄青霉素LB个体培养基上,37℃过夜培养;
(3)挑选200个单克隆,加入到6ml的含10μg/ml四环素和100μg/ml羧苄青霉素的液体LB培养基中,37℃,250rpm培养4个小时,取少量菌液,进行菌液PCR鉴定,挑选能扩增出条带大小为1200bp的克隆。
菌落PCR扩增体系见表20:
表20
菌液 | 0.5μl |
VHSEQ(序列见前述的参考文献) | 0.2μl |
vlseq(序列见前述的参考文献) | 0.2μl |
ddH2O | 4.1μl |
PrimerSTAR | 5μl |
Total | 10μl |
菌落PCR反应条件见表21:
表21
(4)将步骤(3)的阳性克隆菌液均匀分成2份,一份入3μl辅助噬菌体VCSM13(1011-1012pfu/ml),室温放置20min,加入2.1μl 50μg/μl的卡那霉素,另外一份不加任何物质,37℃,250rpm过夜培养;
(5)将加入辅助噬菌体的菌4000rpm离心10min,将上清转入干净离心管,上清进行10倍稀释,取100μl加入到包被IL-8的酶联免疫板,37℃孵育1h,0.05%的TBST洗涤5次,加入2000倍稀释的抗噬菌体带HRP标记的抗体(购于北京义翘神州生物技术有限公司),37℃孵育1h,0.05%的TBST洗涤5次,加入100μlTMB,显色2min,加入50μl 1M的H2SO4终止反应,使用酶标仪在450nm处测定吸光度,吸光度高于对照2.1倍的为阳性克隆。
(6)挑选步骤(5)阳性克隆,没有加入辅助噬菌体的菌,提取质粒,并进行测序,获得重链可变区和轻链可变区序列。
三、全人源化抗体的表达及活性鉴定
1、全人源化载体构建
(1)根据获得的抗体重链可变区或轻链可变区序列,设计相应的引物,分别扩增后,在重链和轻链N端都加入分泌信号肽,重链C端加入IgG1的Fc片段;
(2)将重链可变区和轻链可变区分别同源重组到pcDNA3.4载体。(见图8)(pcDNA3.4载体购自于武汉淼灵生物科技有限公司)
2、全人源化抗体的表达
(1)使用除内毒素中提试剂盒(购自OMEGA),分别提取对应的重链表达载体和轻链表达载体;
(2)当293T细胞(购自于武汉普诺赛生命科技有限公司)融合度达到80%时,使用PEI进行转染;
(3)转染后12h,更换成无血清蛋白表达培养基,37℃,5% CO2培养7天;
(4)使用protein A/G填料纯化抗体。结果见图9。
3、全人源化抗体活性鉴定
以IL-8抗体活性鉴定为例
(1)ELISA鉴定
将获得的抗体调整为浓度1mg/ml,使用5%的脱脂奶粉稀释2000倍,加入到包被IL-8抗原的酶联免疫孔中,37℃孵育1h,0.05%的TBST洗涤5次,加入5%的脱脂奶粉稀释2000倍抗人Fab-HRP二抗(购自于北京索莱宝生物科技有限公司),37℃孵育1h,0.05%的TBST洗涤5次,加入100μlTMB,显色2min,加入50μl1M的H2SO4终止反应,使用酶标仪在450nm处测定吸光度。结果见表22。
表22 ELISA鉴定纯化后YX20与IL-8结合
(2)利用YX20为固定抗体,YX5、YX20、YX40为检测抗体组合检测IL-8蛋白如下:
采用ELISA夹心法进行检测,将单克隆全人源化抗体YX20包被ELISA板,加入抗原IL-8,加入筛选出来的YX5、YX20、YX40生物素标记抗体(生物素品牌:Thermo,货号:VF300852),并进行不同的组合,再加带HRP标记的链霉亲和素(品牌:ThermoFisher,货号:VE302151),检测显色,颜色越深说明对IL-8抗原捕获能力越强,同时也说明该对抗体适合于IL-8抗原的检测。空白对照是指游离相不加入抗体,只加入带HRP标记的链霉亲和素。
具体操作如下:
1)ELISA 96孔板,每孔包被100ng的YX20抗体;
2)加入100μl IL-8(250ng/ml),37℃孵育1h;
3)0.05%的TBST洗涤5次;
4)加入用5%脱脂奶粉稀释2000倍YX5、YX20、YX40生物素标记抗体,37℃孵育1h;
5)0.05%的TBST洗涤5次;
6)加入5%脱脂奶粉稀释5000倍的带HRP标记的链霉亲和素,室温孵育10min;
7)0.05%的TBST洗涤5次;
8)加入100μl TMB,避光显色5min;
9)加入50μl 1M H2SO4终止反应。
10)使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
结果见表23。
表23夹心法鉴定抗体对检测IL8
注:纵列包被相,横列检测相,OD450吸光值。
(3)中性粒细胞趋化抑制
1)从人外周血分离中性粒细胞(天津灏洋,TBD LZS11131),使用1640将中性粒细胞浓度调整为5X106个/ml;
2)使用24孔Trans-well板(Corning Costar,3415),孔径3um,实验分为3组:空白组,下室加入400ul空白1640;阳性对照组,下室加入400ul含浓度10nMIL8的1640;实验组,下室加入400ul含浓度10nM IL8和5ug/mlIL8抗体的1640;所有的3组,上室均加入200ul(浓度5X106个/ml)的中性粒细胞;
3)5% CO2,37℃放置2h,丢弃上室,细胞计数仪计算下室细胞量。
结果见表24和表25,图10。
表24抗IL8抗体抑制中性粒细胞对IL8趋化
表25抗IL8抗体对中性粒细胞趋化抑制(单位:%)
复孔1 | 复孔2 | 复孔3 | |
YX20 | 100 | 103.3582102 | 110.0746306 |
(4)抗IL8抗体对肿瘤抑制
1)将裸鼠分为2组,实验组和对照组,每组3只,实验开始前,每组裸鼠背部皮下均注射100ul 1X106个HCT116肿瘤细胞(结肠肿瘤细胞);
2)3天后,对照组每只裸鼠腹腔注射200ulPBS,实验组每只裸鼠腹腔注射200ul含500ug抗IL8抗体的PBS,每间隔3天注射一次;
3)注射4轮后,注射最后一次第3天,处死裸鼠,摘取肿瘤,进行称量。结果见表26和图11。
表26抗IL8抗体对肿瘤抑制(单位:g)
编号 | 1 | 2 | 3 |
control | 0.27 | 0.26 | 0.3 |
YX20 | 0.06 | 0.03 | 0.19 |
Claims (5)
1.IL-8抗体,其特征在于,为单克隆抗体YX20,重链和轻链CDR氨基酸序列如下:
YX20重链CDR序列:
CDRH1氨基酸序列GFSLNNYA
CDRH2氨基酸序列VGSDDIP
CDRH3氨基酸序列ASGYVGDDRYNI;
YX20轻链CDR序列:
CDRL1氨基酸序列PSVYNNNY
CDRL2氨基酸序列AAS
CDRL3氨基酸序列AGAYSNDSDDG。
2.根据权利要求1所述的IL-8抗体,其特征在于,单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列如下:
YX20重链可变区氨基酸序列:
GSTGDQEQLVESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMSWVRQAPGKGLEYIGVVGSDDIPFYASWAKGRFAISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCASGYVGDDRYNIWGPGTLVTISS;
YX20轻链可变区氨基酸序列:
GSTGDAAVVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSPSVYNNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYAASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGAYSNDSDDGFGGGTKLEIK。
3.根据权利要求1所述的IL-8抗体,其特征在于,所述抗体包括但不限于:免疫球蛋白、Fab、(Fab′)2或单链抗体。
4.权利要求1-3任一项所述的IL-8抗体的应用,其特征在于,用于制备检测IL-8的制剂。
5.权利要求1-3任一项所述的IL-8抗体的应用,其特征在于,用于制备治疗结肠肿瘤的制剂。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211499692.XA CN115850473B (zh) | 2022-11-28 | 2022-11-28 | Il-8抗体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211499692.XA CN115850473B (zh) | 2022-11-28 | 2022-11-28 | Il-8抗体及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115850473A CN115850473A (zh) | 2023-03-28 |
CN115850473B true CN115850473B (zh) | 2023-12-08 |
Family
ID=85667115
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211499692.XA Active CN115850473B (zh) | 2022-11-28 | 2022-11-28 | Il-8抗体及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115850473B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115850474B (zh) * | 2022-11-28 | 2024-11-05 | 中南大学湘雅医院 | 一种il-8单克隆抗体及其应用 |
CN115850472B (zh) * | 2022-11-28 | 2024-11-05 | 中南大学湘雅医院 | 一种针对人白介素-8的单克隆抗体yx5及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1660912A (zh) * | 2004-12-08 | 2005-08-31 | 叶庆炜 | 抗il-8单克隆抗体、其可变区序列及其应用 |
CN101343323A (zh) * | 2008-08-29 | 2009-01-14 | 浙江大学 | 抗白细胞介素-8抗体 |
CN102199210A (zh) * | 2011-03-28 | 2011-09-28 | 华绍炳 | 抗白细胞介素-8抗体 |
-
2022
- 2022-11-28 CN CN202211499692.XA patent/CN115850473B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1660912A (zh) * | 2004-12-08 | 2005-08-31 | 叶庆炜 | 抗il-8单克隆抗体、其可变区序列及其应用 |
CN101343323A (zh) * | 2008-08-29 | 2009-01-14 | 浙江大学 | 抗白细胞介素-8抗体 |
CN102199210A (zh) * | 2011-03-28 | 2011-09-28 | 华绍炳 | 抗白细胞介素-8抗体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115850473A (zh) | 2023-03-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN115850473B (zh) | Il-8抗体及其应用 | |
CN108250296B (zh) | 全人源抗人pd-l1单克隆抗体及其应用 | |
CN115109151B (zh) | 新型冠状病毒单克隆抗体xy6及其应用 | |
CN114262377B (zh) | 一种阻断cd70与其配体cd27结合的抗人cd70纳米抗体的制备方法及其编码序列 | |
WO2015089881A1 (zh) | 全人源抗cd26抗体及其应用 | |
CN115850472B (zh) | 一种针对人白介素-8的单克隆抗体yx5及其应用 | |
CN115850474B (zh) | 一种il-8单克隆抗体及其应用 | |
CN110423277B (zh) | Pd-1的纳米抗体及其临床应用 | |
CN116948022B (zh) | 抗猪Gasdermin D蛋白单克隆抗体及其应用 | |
CN116284401B (zh) | 人源抗il-1r3抗体及其应用 | |
CN117164709B (zh) | 抗猪gsdmd蛋白单克隆抗体及其应用 | |
CN112625132A (zh) | 纳米抗体及其编码基因、表达载体、宿主细胞和应用 | |
CN111253489A (zh) | 一种tim-3纳米抗体、制备方法及其应用 | |
CN114057880A (zh) | 一种dll3单克隆抗体 | |
CN111763255A (zh) | 一种经基因修饰的vegfa蛋白及其单克隆抗体与应用 | |
CN113528467B (zh) | 一种靶向性双展示噬菌体及其制备方法和应用 | |
CN110003334B (zh) | 多肽、cd19单域抗体及其制备方法、核苷酸序列及试剂盒 | |
CN114380905B (zh) | 靶向SARS-CoV-2RBD蛋白的鲨源纳米抗体、制备方法和应用 | |
CN116496395B (zh) | 一种结合Dsg3的单克隆抗体及其应用 | |
CN114773462B (zh) | 用于检测牛crp蛋白的重组单链抗体及其应用 | |
CN114891098B (zh) | 一种产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体及其应用 | |
CN111647083B (zh) | 一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用 | |
CN114835813A (zh) | 皮肌炎特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途 | |
CN116514990A (zh) | 一种识别cd276-car分子的纳米抗体及其应用 | |
CN115975011A (zh) | 一种针对p72蛋白的抗非洲猪瘟病毒的抗体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |