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CN115850473B - Il-8抗体及其应用 - Google Patents

Il-8抗体及其应用 Download PDF

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CN115850473B
CN115850473B CN202211499692.XA CN202211499692A CN115850473B CN 115850473 B CN115850473 B CN 115850473B CN 202211499692 A CN202211499692 A CN 202211499692A CN 115850473 B CN115850473 B CN 115850473B
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CN
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antibody
amino acid
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acid sequence
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陈小平
龙凤英
徐义
杜胤骁
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Xiangya Hospital of Central South University
Original Assignee
Xiangya Hospital of Central South University
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Abstract

本发明公开了IL‑8抗体及其应用。本发明以人IL‑8为抗原,以兔为免疫对象,通过皮下注射免疫兔,经过多轮免疫后,提取兔的脾脏,分离单核细胞,提取总RNA,反转录成cDNA,使用特定引物扩增获得全部重链可变区和轻链可变区,构建噬菌体抗体库。通过噬菌体抗体库,筛选到与IL‑8结合的单克隆抗体。本发明的抗IL‑8单克隆抗体与IL‑8特异性结合,可用于诊断或治疗与IL‑8表达异常相关的疾病。

Description

IL-8抗体及其应用
技术领域
本发明属于单克隆抗体筛选、制备及应用技术领域,具体涉及一种抗IL-8单克隆抗体及其应用。
背景技术
白介素-8(IL-8)又称CXCL8,属于CXC亚型,是最早发现的趋化性细胞因子。IL-8分为α和β两个亚群,IL-8初始翻译产物为99个氨基酸,在单核和巨噬细胞中剪切成72个氨基酸,分子量为8KDa活性物质。IL-8主要由单核细胞和巨噬细胞分泌,功能是募集和活化中性粒细胞,促使炎症反应和细胞杀伤。另外肿瘤细胞、成纤维细胞、内皮细胞等在IL-1β、肿瘤坏死因子α、脂多糖等促炎症因子的作用下,通过自分泌或旁分泌影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及肿瘤血管的形成。
IL-8通过与IL-8受体结合发挥作用,IL-8有2种受体,分别是CXCR1(IL-8RA)和CXCR2(IL-8RB),这2个受体存在77%的同源性,都属于G蛋白偶联受体。因为N端存在结构差异,2个受体与IL-8的亲和性不同,CXCR1与IL-8亲和性较高。在正常组织细胞中,CXCR1首先与粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)结合形成复合体,然后与IL-8结合发挥作用;CXCR2与IL-8的亲和性较低,除IL-8外,CXCR2还可以与CXCL1、2、3、5、7等多种配体结合。IL-8对中性粒细胞有明显趋化和功能活化作用,还可诱导CD4+和CD8+T细胞的趋化,参与多种疾病的发展和组织损伤,如风湿性关节炎、牛皮藓、缺血回灌综合征(包括心肌梗死和多器官功能衰竭)、肾小球肾炎以及其他各类感染性疾病等;IL-8与受体结合可通过激活PI3K/Akt、PLC/PKC以及MAPK等多个下游信号通路促进肿瘤的发生发展。因此筛选IL-8拮抗性单克隆抗体,可有效治疗IL-8介导的疾病。
以IL-8为免疫原,免疫兔子,构建抗IL-8噬菌体抗体库,可有效的筛选到拮抗IL-8的抗体,通过基因工程和蛋白表达技术,可大规模生产拮抗IL-8抗体,用于IL-8异常相关疾病的诊断和治疗。
发明内容:
本发明的主要目的是提供针对IL-8的特异单克隆抗体及其应用。从免疫后的兔获取脾脏,构建抗IL-8噬菌体抗体库,快速筛选针对IL-8抗体,该抗体可用于IL-8表达异常导致的疾病诊断和治疗。
本发明筛选到的IL-8抗体包括:YX20
YX20重链CDR序列:
CDRH1氨基酸序列GFSLNNYA,见SEQ NO.1;
CDRH2氨基酸序列VGSDDIP,见SEQ NO.2
CDRH3氨基酸序列ASGYVGDDRYNI,见SEQ NO.3;
YX20轻链CDR序列:
CDRL1氨基酸序列PSVYNNNY,见SEQ NO.4;
CDRL2氨基酸序列AAS,见SEQ NO.5;
CDRL3氨基酸序列AGAYSNDSDDG,见SEQ NO.6。
YX20重链可变区氨基酸序列:
GSTGDQEQLVESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMSWVRQAPGKGLEYIGVVGSDDIPFYA SWAKGRFAISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCASGYVGDDRYNIWGPGTLVTISS,见SEQ NO.7;
YX20轻链可变区氨基酸序列:
GSTGDAAVVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSPSVYNNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYAASTLASG VPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGAYSNDSDDGFGGGTKLEIK,见SEQ NO.8。
所述抗体分子包括但不限于:免疫球蛋白、Fab、(Fab′)2或单链抗体。
所述的IL-8抗体用于制备诊断IL-8表达异常疾病的制剂。
所述的IL-8抗体用于制备治疗IL-8表达异常相关的疾病。
IL-8表达异常相关的疾病包括肿瘤。
本发明原核表达IL-8,将获得的IL-8按照1mg/只的剂量皮下注射兔子进行免疫,共进行4轮免疫,每轮间隔2周,免疫结束后,处死兔子,摘取脾脏,将脾脏研磨成单细胞悬液,分离获得单核细胞,获取单核细胞并提取总RNA,合成cDNA,使用重链可变区和轻链可变区兼并引物,扩增重链可变区和轻链可变区,获得的重链可变区和轻链可变区进行随机组合,并与噬菌体载体进行重组,重组产物转化XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13获得滴度≈1013大小噬菌体抗体库。使用抗原IL-8,筛选出抗IL-8的抗体,通过测序,获得能与IL-8结合的重链可变区和轻链可变区序列,重链可变区组装上人IgG1的Fc片段,抗体重链和轻链同时在哺乳动物细胞中表达,表达出人源化改造的抗IL-8的抗体。通过体外实验,本发明筛选到的抗IL-8单克隆抗体可以与IL-8特异性结合,可用于检测或治疗IL-8表达异常引发的疾病。
附图说明:
图1IL-8基因克隆;
图2纯化后IL-8SDS-PAGE电泳检测;
图3抗IL8抗体重链可变区基因克隆;
图4抗IL8抗体轻链可变区基因克隆;
图5抗IL8抗体重链和轻链可变区基因拼接;
图6抗IL8噬菌体阳性克隆鉴定;
图7ELISA鉴定第5轮筛选噬菌体库;
图8抗体重链和轻链与pcDNA3.4连接PCR鉴定;
图9抗体YX20纯化产物SDS-PAGE电泳检测;
图10抗IL8抗体对中性粒细胞趋化性抑制;
图11抗IL8抗体对体内HCT116生长抑制。
具体实施方式:
以下结合具体实施例对本发明作进一步的描述,而不会形成对本发明的限制。
本发明实施例中使用的IL-8蛋白实验室自行制备。
本发明噬菌体抗体库构建方法参考于:Antony S.Dimitrov(ed.),Generationand Selection of Rabbit Antibody Libraries by Phage Display,2009,TherapeμticAntibodies:Methods and Protocols,vol.525,101-128.
实施例1
一、IL-8蛋白制备
以人单核细胞cDNA为模板,使用引物IL-8F和IL-8R克隆IL-8片段,并将该片段导入pGEX-4T-1载体(淼灵,P0001),筛选获得构建成功的pGEX-4T-1-IL-8,在IPTG诱导条件下表达,纯化获得IL-8蛋白。
具体包括以下步骤:
1、克隆IL-8片段
将单核细胞cDNA稀释10倍
(1)体系配制如下表1:
表1
cDNA 2μl
IL-8F 4μl
IL-8R 4μl
ddH2O 40μl
PrimerSTAR(购自TAKARA) 50μl
Total 100μl
注:克隆IL8基因引物
IL8-F:GTTCCGCGTGGATCCCCGGAAGAAGGTGCAGTTTTGCCAAG,见SEQ NO.9,
IL8-R:TCGAGTCGACCCGGGAATTTCATGAATTCTCAGCCCTCTTCA,见SEQ NO.10;
(2)反应条件见下表
表2
Step1 98℃ 15s
Step2 98℃ 10s
Step3 55℃ 5s
Step4 72℃ 5s
Go to Step 2x34
Step5 72℃ 1m 30s
Step6 4℃ Forever
(3)电泳
取25μl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,确定是否扩增到目的条带,大小约240bp(见图1)。
(4)将240bp大小条带切下,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,28706)进行回收,测定浓度。
2、IL-8片段与载体pGEX-4T-1连接转化
使用北京金沙生物科技有限公司Uniclone one step seamless cloning kit,货号SC612
(1)连接
体系配置
表3
组分 目的重组
2X Uniclone seamless cloning Mix 5ul
线性化pGEX-4T-1 1ul
IL-8片段 3ul
ddH2O 1ul
反应条件
50℃,15min
(2)转化
取步骤(1)产物2.5ul加入到50ulDH5α,冰上放置30min,42℃热击90s,冰上放置2min,加入1mlLB培养基,37℃,220rpm培养1h,取100ul均匀的涂抹在含氨苄抗性的平板上,37℃恒温箱过夜培养。
(3)阳性克隆鉴定
挑选步骤(2)单克隆,使用引物IL-8F/IL-8R进行菌落PCR鉴定,鉴定为阳性的克隆,送测序公司进一步测序鉴定,序列正确的克隆保留。
3、IL-8表达与纯化
(1)挑取单克隆加入到10ml含氨苄抗性LB液体培养基中,37℃,220rpm过夜培养,
(2)在100ml含氨苄抗性空白LB液体培养基中,接种1%步骤(1)菌液,37℃,220rpm过夜培养,OD600达到0.6时,加入0.2mmol/L的IPTG诱导4h。
(3)诱导结束后,将菌液倒入50ml离心管,4000rpm离心15min,弃上清,加入10ml平衡液(140mM NaCl,2.7mMKCl,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,pH7.4)重悬菌体。超声破碎,至菌液澄清。
(4)将破碎后的菌液转移到离心管,15000g,4℃离心20min,取上清过0.45um滤器,滤液冰上放置。
(5)将Glutathlone Beads 4FF重力柱(常州天地人和生物科技有限公司,货号SA010005)用10倍平衡液平衡,加入步骤(4)上清,让样品穿过柱子,重复4次。
(6)加入15倍平衡液洗柱子。
(7)加入5倍体积的洗脱液洗脱蛋白(140mM NaCl,2.7mMKCl,10mM Na2HPO4,1.8mMKH2PO4,10mM还原性谷胱甘肽,pH7.4)。
(8)获得的目的蛋白用10Kd超滤管进行浓缩,并使用10mMPBS置换缓冲液。
(9)浓缩后的IL-8测定蛋白浓度和SDS-PAGE检测(见图2)
二、IL-8免疫兔子
(1)首次免疫500ulIL-8(1mg)与500ul弗氏完全佐剂混匀,2月龄新西兰大白兔,背部皮下多点注射。
(2)每间隔2周,500ulIL-8(1mg)与500ul弗氏不完全佐剂混匀
新西兰大白兔背部皮下多点注射,间隔免疫3次。
三、噬菌体抗体库的构建
新西兰大白兔免疫结束后,处死,摘取脾脏,分离单核细胞,提取总RNA,反转录成cDNA,使用重链可变区和轻链可变区兼并引物,扩增获得重链可变区和轻链可变区片段,将抗体重链可变区和轻链可变区进行随机拼接并与噬菌体载体连接,并转化XL1-Blue菌(购自于唯地生物科技有限公司),在辅助噬菌体VSCM13(购自NTCC国家典型培养物保藏中心)存在条件下,组装成噬菌体抗体展示库。
具体包括以下步骤:
1、单核细胞分离
使用人外周血淋巴分离液(LTS1077-1,天津灏洋生物制品科技有限责任公司,)分离单核细胞。
(1)制备细胞悬液:将脾脏放置在细胞筛,放入加有培养基的培养皿中,使用2.5ml针头注射器推杆,轻轻的挤压,直到脾脏完全挤碎,细胞悬液转入15mL离心管中。
(2)将装有细胞悬液的15mL离心管,100g,10min。
(3)将上层细胞悬液,转入含等体积淋巴分离液的15ml离心管,用吸管小心吸取细胞悬液加于分离液之液面上,500-1100g(1800rpm),离心10min,加速度5,减速度4。
(4)离心后,此时离心管中由上至下分为四层;第二层为环状乳白色淋巴细胞层。
(5)用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层转移到新的15mL离心管中,向所得离心管中加入10mLPBS,混匀细胞。
(6)1800rpm,离心10min,加速度5,减速度4。
(7)弃上清,每支15ml离心管加入5ml的红细胞裂解液,稍微混匀后室温静置5min。
(8)1800rpm,离心10min,加速度5,减速度4。
(9)弃上清,吸取10mL PBS重悬所得细胞。
(10)1800rpm,离心10min,加速度5,减速度4。
(11)弃上清,沉淀为单核细胞。
2、总RNA提取
将获得的单核细胞,按照5X106个细胞加入0.75ml Trizol(Thermo fisher)提取总RNA,然后各取1μg RNA将18份RNA等量混合。
(1)5X106个细胞中加入0.75ml Trizol。
(2)上下混匀数次,冰上孵育5min,保证细胞充分裂解。
(3)4℃12000rpm离心10分钟,将上清转移到干净离心管。
(4)1mlTrizol中加入0.2ml氯仿,混匀。
(5)冰上孵育2-3min。
(6)4℃12000rpm离心15分钟。
(7)转移上清水相到干净离心管。
(8)上清中加入等体积的异丙醇混匀。
(9)室温孵育10min,4℃12000rpm离心10-15分钟。
(10)弃上清,保留沉淀。
(11)加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀。
(12)4℃12000rpm离心5分钟。
(13)尽可能弃去上清。
(15)室温干燥5-10min,管壁上看不到液体。
(16)加入20-50μl无RNAse的水回溶RNA。
(17)取1μlRNA电泳检测及测定RNA浓度。
(18)将RNA分装保存于-80℃冰箱,避免反复冻融。
3、cDNA的合成
取5μg的RNA,使用cDNA合成试剂盒(K1612,Thermo fisher)。
(1)取5μg RNA量合成cDNA。
(2)10μl的RNA/primer mixtμre体系见下表4,包括:
表4
体系成份 体积
RNA 5μg
50μM Oligo(dT)20 1μl
Hex Random Primer 1μl
10mM dNTP 1μl
DEPC-treated water 总体积10μl
(3)65℃孵育5min,置于冰上放置1min。
(4)按下表5添加其他试剂,准备cDNA Synthesis Mix进行下一步反应。
表5
体系成分 1反应
10xRT buffer 2μl
25mM MgCl2 4μl
0.1M DTT 2μl
RNaseOΜT(40Μ/μl) 1μl
Superscript III RT(200Μ/μl) 1μl
(5)加入10μl的cDNA Synthesis Mix到RNA/primer mixture轻轻混匀,离心,按下表6条件进行反应:
表6
Step1 50℃ 50min
Step2 85℃ 5min
冰上冷却,简短离心
Step3 RNaseH 1μl
Step4 37℃ 20min
(6)cDNA产物分装保存于-20℃。
4、抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)扩增
将合成的cDNA稀释10倍,用于扩增重链可变区和轻链可变区的模板。
(1)体系配制如下表7,以VH为例:
表7
(2)反应条件见下表
表8
Step1 98℃ 15s
Step2 98℃ 10s
Step3 55℃ 5s
Step4 72℃ 5s
Go to Step 2x34
Step5 72℃ 1m 30s
Step6 4℃ Forever
(3)电泳
取10μl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,确定是否扩增到目的条带,大小约400bp(见图3)。
(4)将所有扩增的VH等量混合,加入0.1倍体积的3M乙酸钠和2.2倍体积的乙醇,混匀,-20℃放置过夜。
(5)4℃,16000g离心15min,去上清,使用1ml 70%乙醇漂洗(室温),室温干燥,加入200μl水回溶,1%的胶进行凝胶电泳。
(6)将400bp大小条带切下,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,28706)进行回收,测定浓度。
(7)VL的扩增及回收按照步骤(1)-(6)进行操作,结果见图4。
(8)调整VH和VL纯化后核酸浓度,终浓度为100ng/μl,放-20℃储存。
5、扩增Cκ-pelB
(1)以载体pCκ和pCL(载体购自于add gene)(100ng/μl)为模版扩增Cκ-pelB和CL-pelB
以扩增Cκ-pelB为例,见表9。
表9
pCκ 10μl
HCK(序列见前述的参考文献) 60μl
Pelb(序列见前述的参考文献) 60μl
ddH2O 370μl
PrimerSTAR 500μl
Total 1000μl
(2)反应条件见表10
表10
(3)取10μl产物电泳检测,条带大小约400bp。
(4)将所有扩增的Cκ-pelB混合,加入0.1倍体积的3M乙酸钠和2.2倍体积的乙醇,混匀,-20℃放置过夜。
(5)4℃,16000g离心15min,去上清,使用1ml 70%乙醇漂洗(室温),室温干燥,加入200μl水回溶,使用1%的胶进行凝胶电泳。
(6)将400bp大小条带切下,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,28706)进行回收,测定浓度。
(7)稀释纯化后的Cκ-pelB,终浓度为100ng/μl,放-20℃储存。
(8)扩增CL-pelB,按照步骤(1)-(7)进行操作,扩增模板pCκ换成pCL。
6、Rab Vκ/Rab Cκ/CL/Rab VH融合
(1)按下表11将不同量的VL、VH、Ck-pelB混合
VL浓度100ng/μl,VH浓度100ng/μl,Cκ-pelB浓度100ng/μl
表11
VL 10μl
VH 10μl
Ck-pelB 10μl
Primerstar Mix 500μl
H2O 470μl
Total 1000μl
(2)反应条件见表12
表12
(3)扩增Rab VL/Rab Cκ/Rab VH,见表13
表13
拼接产物 50μl
C-5'SFIVL(序列见前述的参考文献) 4μl
c-3'sfivh(序列见前述的参考文献) 4μl
ddH2O 17μl
PrimerSTAR 25μl
Total 100μl
(4)扩增条件见表14
表14
Step1 98℃ 15s
Step2 98℃ 10s
Step3 55℃ 5s
Step4 72℃ 5s(Go to Step2 x 39)
Step5 72℃ 1m 30s
Step6 4℃ Forever
(5)电泳检测
取10μlPCR产物,电泳检测,融合后目的基因条带大小1.2Kb。(见图5)
(6)将所有扩增的Rab VL/Rab Cκ/Rab VH,加入0.1倍体积的3M乙酸钠和2.2倍体积的乙醇,混匀,-20℃放置过夜。
(7)4℃,16000g离心15min,去上清,使用1ml 70%乙醇漂洗(室温),室温干燥,加入200μl水回溶,使用1%的胶进行凝胶电泳。
(8)将1.2Kb大小条带切下,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,28706)进行回收,测定浓度。
(9)稀释Rab VL/Rab Cκ/Rab VH纯化的核酸,终浓度为150ng/μl,放-20℃储存。
(10)Rab Vλ/Rab CL/Rab VH的融合按照步骤(1)-(9)进行操作。
7、SfiI酶切Rab Vκ/Rab Cκ/CL/Rab VH和RabVλ/RabCL/Rab VH
以Rab Vκ/Rab Cκ/CL/Rab VH酶切为例
(1)酶切体系见表15
表15
human Vκ/human Cκ/CL/human VH(150ng/μl) 200μl
10Xbuffer 30μl
H2O 60μl
SfiI 40u/μl 10μl
(2)50℃水浴,酶切反应3h。
(3)使用1%凝胶进行电泳,将1.2kb大小的条带切下,使用QIAquick GelExtraction Kit(QIAGEN,28706)进行回收。
(4)检测SfiI酶切后回收Rab VL/Rab Ck/Rab VH片段,调整浓度50ng/μl,-20℃保存。
(5)酶切Rab Vλ/Rab CL/Rab VH,按照步骤(1)-(4)进行操作。
8、SfiI酶切pC3C(载体购自于add gene)
(1)酶切体系见表16
表16
pC3C 1μg/μl 50μl
10Xbuffer 30μl
H2O 208μl
SfiI 40u/μl 12μl
(2)50℃水浴,酶切反应3h。
(3)使用1%凝胶进行电泳,会切出两条带,一条3.5Kb和一条1.2kb大小片段。
(4)使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,28706)回收3.5Kb的载体骨架。
(5)Sfi酶切后回收载体骨架浓度调整为100ng/μl。
9、连接pC3C(SfiI)和Rab VL/human Cκ/Rab VH(SfiI)
(1)连接体系见表17
表17
100ng/μl SfiI酶切后pC3C 1.5μl
50ng/μl SfiI酶切后human VL/human Cκ/human VH 2μl
10XT4 DNA ligase buffer 2μl
H2O 13.5μl
T4 DNA ligase 2000u/μl 1μl
对照组见表18
表18
100ng/μl SfiI酶切后pC3C 1.5μl
10XT4 DNA ligase buffer 2μl
H2O 15.5μl
T4 DNA ligase 2000u/μl 1μl
(2)16℃反应过夜。
(3)合并所有连接反应物,加入1/10体积的3M乙酸钠溶液。
(4)加入2.2倍体积预冷的无水乙醇,上下混合均匀,-20℃沉淀过夜。
(5)16000g,4℃离心30min,小心弃上清。
(6)加入70%乙醇轻轻清洗沉淀,16000g,4℃离心5min,弃上清。
(7)室温干燥。
(8)用适量的水进行溶解,通常1个连接反应用1μl体积ddH2O进行充分溶解,置-20℃保存。
(9)连接pC3C(SfiI)和Rab Vλ/Rab CL/Rab VH按照步骤(1)-(8)进行操作。
10、连接产物转化XL1-Blue
(1)XL1-Blue电击感受态冰上放置10min进行溶解。
(2)取19μl沉淀浓缩后的连接产物加入到1.5ml离心管,冰浴,加入300μl的XL1-Blue电击感受态混匀,快速的转入2mm电击杯,冰上放置1min。
(3)电击条件:2.5KV,4ms
(4)电转结束后快速加入5ml(1ml+2ml+2ml)SOC培养基,转入50ml尖底离心管,37℃,250rpm,培养1h。取2μl菌液加入198μl的LB中,同时均匀的涂在含100μg/μl羧苄青霉素LB平板上,37℃放置过夜培养,用于计算转化效率及菌落PCR鉴定阳性率。PCR结果见图6。
(5)加入10ml SB培养基,3μl 100μg/μl羧苄青霉素,和30μl 5μg/μl四环素。37℃,250rpm,培养1h。
(6)加入4.5μl 100μg/μl羧苄青霉素,继续37℃,250rpm,培1-4h。
(7)将培养后的菌转移到500ml培养瓶,加入84ml SB培养基,42.5μl 100μg/μl羧苄青霉素,170μl 5μg/μl四环素,加1ml VCMS13辅助噬菌体(1011-1012pfu/ml),37℃,275rpm,90min。
(8)加入140μl 50μg/μl卡那霉素,37℃,275rpm,过夜培养。
(9)3000g,4℃离心15min。
(10)沉淀噬菌体
上清(200ml)转移到500ml干净离心管,加入8g PEG-8000和6g NaCl,放入37℃,300rpm,5min促进溶解。冰上放置30min-1h。15000g,4℃离心15min。弃上清,将离心瓶颠倒放置在滤纸上放置10min干燥,小心的移去多余液体。使用含1%的BSA的TBS 2ml重悬噬菌体(移液器上下混匀),16000g,4℃离心5min,上清过0.22μm滤膜(Millipore),转移到2ml离心管。短时间可直接放冰上存储,或者加0.01倍体积的2%叠氮化钠放4℃,对于长时间存储加1倍体积甘油放-20℃存储。
二、噬菌体抗体库筛选以IL-8噬菌体抗体筛选为例
使用包被IL-8蛋白的96孔板,进行5轮筛选,然后挑选单克隆鉴定IL-8特异性抗体。
1、抗原包被
(1)将IL-8加入到碳酸缓冲液,浓度2μg/ml,
(2)康宁高蛋白吸附酶联免疫96孔板,每孔加入50μlIL-8,4℃放置过夜;
(3)弃去上清,加入5%的脱脂奶粉200μl/孔,37℃放置1h;
(4)弃上清,0.05%的TBST洗涤5次。
2、IL-8抗体筛选
(1)将噬菌体抗体库用2%的脱脂奶粉稀释10倍,取2个包被有IL-8抗原的96孔微孔,加入100μl稀释后的噬菌体,37℃放置1h。
(2)弃上清,0.05%的TBST洗涤5次,加入100μl 100mM甘氨酸,37℃放置15min,期间不断进行吹打,加入9μl 1M Tris。
(3)将步骤(2)洗脱下来的噬菌体加入到2ml的XL1-Blue菌中,室温放置15min。
(4)加入6ml SB培养基,加入1.6μl 100μg/μl的羧苄青霉素,12μg 5μg/μl的四环素,37℃,250rpm培养1h。
(5)加入2.4μl 100μg/μl的羧苄青霉素继续培养1h;
(6)加入1ml辅助噬菌体VCSM13(1011-1012pfu/ml),转移到500ml培养瓶,加入91mlSB培养基,加入46μl100μg/μl的羧苄青霉素,184μl5μg/μl的四环素,37℃,250rpm培养1.5h,加入140μl 50μg/μl的卡那霉素,37℃,250rpm过夜培养。
(7)噬菌体抗体浓缩:将上一步菌液离心去菌体,收集上清(100ml);加入4gPEG-8000和3g NaCl,放入37℃,300rpm,5min促进溶解。冰上放置30min-1h。15000g,4℃离心15min。弃上清,将离心瓶颠倒放置在滤纸上放置10min干燥,小心移去多余液体。使用含1%BSA的TBS 2ml重悬噬菌体(移液器上下混匀),16000g,4℃离心5min,上清过0.22μm滤膜(Millipore),转移至2ml离心管。短时间可直接放冰上存储,或者加0.01倍体积的2%叠氮化钠放4℃,对于长时间存储加1倍体积甘油放-20℃存储。
(8)取步骤(7)噬菌体,按照步骤(1)-(7)进行5轮筛选。
(9)五轮筛选的抗体库的ELISA鉴定:
1)ELISA 96孔板,每孔包被100ng的IL-8;
2)加入100μl噬菌体(2%脱脂奶粉稀释10倍)37℃孵育1h;
3)0.05%的TBST洗涤5次;
4)加入5%脱脂奶粉稀释2000倍的抗M13-HRP抗体(购自北京义翘神州生物技术有限公司)100μl,37℃孵育1h;
5)0.05%的TBST洗涤5次;
6)加入100μl TMB,避光显色5min;
7)加入50μl 1M H2SO4终止反应。
8)使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
结果见图7和表19。
表19 ELISA鉴定第5轮筛选噬菌体库
3、IL-8单克隆抗体鉴定
(1)取第5轮筛选的IL-8噬菌体,稀释10-7,取1μl加入到200μl XL1-Blue菌,室温放置15min;
(2)将步骤(1)菌全部涂在含100μg/ml羧苄青霉素LB个体培养基上,37℃过夜培养;
(3)挑选200个单克隆,加入到6ml的含10μg/ml四环素和100μg/ml羧苄青霉素的液体LB培养基中,37℃,250rpm培养4个小时,取少量菌液,进行菌液PCR鉴定,挑选能扩增出条带大小为1200bp的克隆。
菌落PCR扩增体系见表20:
表20
菌液 0.5μl
VHSEQ(序列见前述的参考文献) 0.2μl
vlseq(序列见前述的参考文献) 0.2μl
ddH2O 4.1μl
PrimerSTAR 5μl
Total 10μl
菌落PCR反应条件见表21:
表21
(4)将步骤(3)的阳性克隆菌液均匀分成2份,一份入3μl辅助噬菌体VCSM13(1011-1012pfu/ml),室温放置20min,加入2.1μl 50μg/μl的卡那霉素,另外一份不加任何物质,37℃,250rpm过夜培养;
(5)将加入辅助噬菌体的菌4000rpm离心10min,将上清转入干净离心管,上清进行10倍稀释,取100μl加入到包被IL-8的酶联免疫板,37℃孵育1h,0.05%的TBST洗涤5次,加入2000倍稀释的抗噬菌体带HRP标记的抗体(购于北京义翘神州生物技术有限公司),37℃孵育1h,0.05%的TBST洗涤5次,加入100μlTMB,显色2min,加入50μl 1M的H2SO4终止反应,使用酶标仪在450nm处测定吸光度,吸光度高于对照2.1倍的为阳性克隆。
(6)挑选步骤(5)阳性克隆,没有加入辅助噬菌体的菌,提取质粒,并进行测序,获得重链可变区和轻链可变区序列。
三、全人源化抗体的表达及活性鉴定
1、全人源化载体构建
(1)根据获得的抗体重链可变区或轻链可变区序列,设计相应的引物,分别扩增后,在重链和轻链N端都加入分泌信号肽,重链C端加入IgG1的Fc片段;
(2)将重链可变区和轻链可变区分别同源重组到pcDNA3.4载体。(见图8)(pcDNA3.4载体购自于武汉淼灵生物科技有限公司)
2、全人源化抗体的表达
(1)使用除内毒素中提试剂盒(购自OMEGA),分别提取对应的重链表达载体和轻链表达载体;
(2)当293T细胞(购自于武汉普诺赛生命科技有限公司)融合度达到80%时,使用PEI进行转染;
(3)转染后12h,更换成无血清蛋白表达培养基,37℃,5% CO2培养7天;
(4)使用protein A/G填料纯化抗体。结果见图9。
3、全人源化抗体活性鉴定
以IL-8抗体活性鉴定为例
(1)ELISA鉴定
将获得的抗体调整为浓度1mg/ml,使用5%的脱脂奶粉稀释2000倍,加入到包被IL-8抗原的酶联免疫孔中,37℃孵育1h,0.05%的TBST洗涤5次,加入5%的脱脂奶粉稀释2000倍抗人Fab-HRP二抗(购自于北京索莱宝生物科技有限公司),37℃孵育1h,0.05%的TBST洗涤5次,加入100μlTMB,显色2min,加入50μl1M的H2SO4终止反应,使用酶标仪在450nm处测定吸光度。结果见表22。
表22 ELISA鉴定纯化后YX20与IL-8结合
(2)利用YX20为固定抗体,YX5、YX20、YX40为检测抗体组合检测IL-8蛋白如下:
采用ELISA夹心法进行检测,将单克隆全人源化抗体YX20包被ELISA板,加入抗原IL-8,加入筛选出来的YX5、YX20、YX40生物素标记抗体(生物素品牌:Thermo,货号:VF300852),并进行不同的组合,再加带HRP标记的链霉亲和素(品牌:ThermoFisher,货号:VE302151),检测显色,颜色越深说明对IL-8抗原捕获能力越强,同时也说明该对抗体适合于IL-8抗原的检测。空白对照是指游离相不加入抗体,只加入带HRP标记的链霉亲和素。
具体操作如下:
1)ELISA 96孔板,每孔包被100ng的YX20抗体;
2)加入100μl IL-8(250ng/ml),37℃孵育1h;
3)0.05%的TBST洗涤5次;
4)加入用5%脱脂奶粉稀释2000倍YX5、YX20、YX40生物素标记抗体,37℃孵育1h;
5)0.05%的TBST洗涤5次;
6)加入5%脱脂奶粉稀释5000倍的带HRP标记的链霉亲和素,室温孵育10min;
7)0.05%的TBST洗涤5次;
8)加入100μl TMB,避光显色5min;
9)加入50μl 1M H2SO4终止反应。
10)使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
结果见表23。
表23夹心法鉴定抗体对检测IL8
注:纵列包被相,横列检测相,OD450吸光值。
(3)中性粒细胞趋化抑制
1)从人外周血分离中性粒细胞(天津灏洋,TBD LZS11131),使用1640将中性粒细胞浓度调整为5X106个/ml;
2)使用24孔Trans-well板(Corning Costar,3415),孔径3um,实验分为3组:空白组,下室加入400ul空白1640;阳性对照组,下室加入400ul含浓度10nMIL8的1640;实验组,下室加入400ul含浓度10nM IL8和5ug/mlIL8抗体的1640;所有的3组,上室均加入200ul(浓度5X106个/ml)的中性粒细胞;
3)5% CO2,37℃放置2h,丢弃上室,细胞计数仪计算下室细胞量。
结果见表24和表25,图10。
表24抗IL8抗体抑制中性粒细胞对IL8趋化
表25抗IL8抗体对中性粒细胞趋化抑制(单位:%)
复孔1 复孔2 复孔3
YX20 100 103.3582102 110.0746306
(4)抗IL8抗体对肿瘤抑制
1)将裸鼠分为2组,实验组和对照组,每组3只,实验开始前,每组裸鼠背部皮下均注射100ul 1X106个HCT116肿瘤细胞(结肠肿瘤细胞);
2)3天后,对照组每只裸鼠腹腔注射200ulPBS,实验组每只裸鼠腹腔注射200ul含500ug抗IL8抗体的PBS,每间隔3天注射一次;
3)注射4轮后,注射最后一次第3天,处死裸鼠,摘取肿瘤,进行称量。结果见表26和图11。
表26抗IL8抗体对肿瘤抑制(单位:g)
编号 1 2 3
control 0.27 0.26 0.3
YX20 0.06 0.03 0.19

Claims (5)

1.IL-8抗体,其特征在于,为单克隆抗体YX20,重链和轻链CDR氨基酸序列如下:
YX20重链CDR序列:
CDRH1氨基酸序列GFSLNNYA
CDRH2氨基酸序列VGSDDIP
CDRH3氨基酸序列ASGYVGDDRYNI;
YX20轻链CDR序列:
CDRL1氨基酸序列PSVYNNNY
CDRL2氨基酸序列AAS
CDRL3氨基酸序列AGAYSNDSDDG。
2.根据权利要求1所述的IL-8抗体,其特征在于,单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列如下:
YX20重链可变区氨基酸序列:
GSTGDQEQLVESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMSWVRQAPGKGLEYIGVVGSDDIPFYASWAKGRFAISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCASGYVGDDRYNIWGPGTLVTISS;
YX20轻链可变区氨基酸序列:
GSTGDAAVVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSPSVYNNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYAASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGAYSNDSDDGFGGGTKLEIK。
3.根据权利要求1所述的IL-8抗体,其特征在于,所述抗体包括但不限于:免疫球蛋白、Fab、(Fab′)2或单链抗体。
4.权利要求1-3任一项所述的IL-8抗体的应用,其特征在于,用于制备检测IL-8的制剂。
5.权利要求1-3任一项所述的IL-8抗体的应用,其特征在于,用于制备治疗结肠肿瘤的制剂。
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