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CN110655580B - 一种杂交瘤细胞株及其用途 - Google Patents

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CN110655580B CN201911050879.XA CN201911050879A CN110655580B CN 110655580 B CN110655580 B CN 110655580B CN 201911050879 A CN201911050879 A CN 201911050879A CN 110655580 B CN110655580 B CN 110655580B
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Abstract

本发明涉及一种杂交瘤细胞株及其用途，具体涉及一种杂交瘤细胞株1C12/1G12及其用途。用杂交瘤技术制备分泌抗CD317单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C12/1G12，其产生的抗CD317单克隆抗体1C12/1G12可以用于免疫印迹，流式细胞技术、免疫组化和ELISA。

Description

一种杂交瘤细胞株及其用途
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株1C12/1G12及其用途。用杂交瘤技术制备分泌抗CD317单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C12/1G12，其产生的抗CD317单克隆抗体1C12/1G12可以用于免疫印迹，流式细胞技术、免疫组化和ELISA。
背景技术
CD317，即分化抗原簇317(Cluster of Differentiation 317)，又叫骨髓基质细胞抗原2(Bone Marrow Stromal Cell Antigen 2)、Tetherin或HM1.24，是1994年通过单克隆抗体发现的终末分化B细胞表面标志蛋白，可能在B细胞的发育过程中发挥重要作用。因其在多发性骨髓瘤细胞中高表达，被肿瘤免疫学家当作骨髓瘤
免疫疗法的靶向抗原，随之开展诸多靶向治疗相关的研究。期间发现CD317除了表达在骨髓基质细胞、成熟B细胞以及骨髓瘤细胞表面之外，在肺癌、乳腺癌等多种癌细胞中高表达。2008年首次被鉴定为干扰素诱导型宿主抗病毒因子，此后越来越多的科学家加入到该领域的探索中。经过近十年的研究，目前已经阐述了CD317结构、抗病毒及免疫特性等问题，也陆续发现了一些诸如参与肿瘤进展、束缚外泌体释放等新功能，研究热度不减当年。
作为生物学研究领域应用最广泛的工具，抗体产品的地位毋庸置疑。而抗体的特异性和应用范围长久以来困扰着抗体产业，也是整个生物学研究领域的极大危机。抗体产品糟糕的质量会直接导致实验结果的误差，以及研究结果无法被重复和再现。研究项目的进展往往会因为抗体带来的问题停滞不前，由此造成的损失也是惊人的。据2011年的数据统计，仅在美国，平均每年就有3.5亿美元被浪费在这些无效抗体上。而在世界范围内，每年竟有8亿美元被浪费，占到了全球科研抗体总开销的50％。
发明内容
本技术制备的抗CD317单克隆抗体特异性靶向结合人和鼠细胞的CD317分子，可以应用于免疫印迹，流式细胞技术、免疫组化和ELISA等实验，是研究CD317功能的有力工具。
本发明一个方面，提供了一种分离的特异性结合CD317的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分由保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，具有保藏号CCTCC NO：C2019156的杂交瘤细胞系1C12/1G12产生。
本发明另一个方面提供一种杂交瘤细胞系，其保藏信息为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号CCTCC NO：C2019156。
本发明另一个方面提供了一种组合物，包含前述的单克隆抗体或抗原结合部分。
本发明再一个方面提供了本发明所述的分离的抗CD317单克隆抗体或或其抗原结合部分在检测CD317在样品中的存在或其表达水平的用途，或者用于制备试剂盒或检测试剂的用途，所述试剂盒或检测试剂用于检测CD317在样品中的存在或其表达水平。
在本发明的技术方案中，所述样品包括但不限于，血液样品、组织样品和细胞样品。
在本发明的技术方案中，所述抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记。
在本发明的技术方案中，检测CD317在样品中的存在或其表达水平的方法包括ELISA检测方法、Western blot检测方法、流式细胞检测方法、免疫组化检测方法。
在本发明的技术方案中，所述试剂盒包括ELISA检测试剂盒或Western blot检测试剂盒，所述检测试剂包括流式细胞检测试剂、免疫组化检测试剂。
本发明再一个方面提供了本发明所述的分离的抗CD317单克隆抗体或其抗原结合部分在ELISA检测中的应用。
本发明再一个方面提供了本发明所述的分离的抗CD317单克隆抗体或其抗原结合部分在Western blot检测中的应用。
本发明再一个方面提供了本发明所述的分离的抗CD317单克隆抗体或其抗原结合部分在流式细胞检测中的应用。
本发明再一个方面提供了本发明所述的分离的抗CD317单克隆抗体或其抗原结合部分在免疫组化检测中的应用。
本发明再一个方面提供了ELISA检测试剂盒，其包括本发明所述的分离的抗CD317单克隆抗体或与或其抗原结合部分。优选地，所述抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记。所述试剂盒还可包含第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合部分；所述第二抗体结合部分还可包括可检测的标记。
本发明再一个方面提供Western blot检测试剂盒，其包括本发明所述的分离的抗CD317单克隆抗体或其抗原结合部分。优选地，所述抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记。所述试剂盒还可包含第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合部分；所述第二抗体结合部分还可包括可检测的标记。
本发明再一个方面提供了流式细胞检测试剂，其包括本发明所述的分离的抗CD317单克隆抗体或其抗原结合部分。优选地，所述抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记。所述细胞检测试剂还可包含第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合部分；所述第二抗体结合部分还可包括可检测的标记。
本发明再一个方面提供了免疫组化检测试剂，其包括本发明所述的分离的抗CD317单克隆抗体或其抗原结合部分。优选地，所述抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记。所述细胞检测试剂还可包含第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合部分；所述第二抗体结合部分还可包括可检测的标记。
在本发明中，术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，CD317)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，第2版，Raven Press，N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
在一些情况下，抗体的抗原结合部分是单链抗体(例如，scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如，Bird等人，Science 242：423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用于本发明的其它接头包括由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，CancerImmunol.描述的那些。
在一些情况下，抗体是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人，Structure 2：1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如C3和C16单克隆抗体)获得抗体的抗原结合部分(例如，上述抗体片段)，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。
如本文中所使用的，术语“杂交瘤”、“杂交瘤细胞系”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”、“杂交瘤细胞系”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
关于生物材料保藏的说明
本发明涉及下列已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)进行保藏的生物材料：
杂交瘤细胞株1C12/1G12(在本文中简称为1C12/1G12)，其保藏号为CCTCCNO:C2019156，保藏时间为2019年08月07日。
附图说明
图1为1C12/1G12抗体应用在流式检测人Hela细胞CD317的表达。
图2为1C12/1G12抗体应用在ELISA实验。
图3为1C12/1G12抗体应用在免疫印迹(Western blot)实验。1：一抗是PBS，2：一抗是1C12/1G12抗体，3：一抗是稀释10万倍的免疫小鼠血清。
图4为1C12/1G12抗体应用在免疫组化实验。左图是扁桃体组织切片，中间图是肺组织切片，右图是甲状旁腺组织切片。1C12/1G12抗体浓度为0.25ug/ml。结果显示扁桃体和肺组织CD317表达阳性，甲状旁腺不表达CD317。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1 CD317单克隆抗体的生产
采用杂交瘤法(由Kohler等，Nature,256:495(1975)首先提出)。用CD317蛋白抗原(购自北京义翘神州公司)免疫雌性BALB/c小鼠(6周龄)，首次免疫使用弗氏完全佐剂进行乳化抗原，第二次免疫开始，使用弗氏不完全佐剂乳化抗原，皮下5～6点注射，每只小鼠注射的抗原量为～100ug。在第3次免疫后10天，对小鼠剪尾采集少量血液进行血清效价ELISA检测，选择抗体滴度高(>1:100000)的小鼠进行加强第4次免疫，通过腹腔注射抗原蛋白，每只小鼠注射100ug。第4次免疫后3～5天，处死小鼠取其脾细胞与SP2/0细胞融合，通过HAT培养基培养获得稳定的杂交瘤细胞。通过ELISA法筛选得到能分泌CD317抗体的杂交瘤细胞，通过有限稀释的方法进行亚克隆，ELISA法筛选得到能分泌CD317抗体的单克隆杂交瘤细胞株1C12/1G12，通过逐级扩大培养，液氮冻存保种。
腹水抗体制备：雌性BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注射弗氏不完全佐剂，每只小鼠注射0.5ml，3～5天后腹腔注射处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只小鼠注射1～5×105个细胞(0.5ml)，注射杂交瘤细胞～11天后处死小鼠，获得腹水。3000rpm，4℃离心10min，去除沉淀，用10倍体积1×PB溶液稀释腹水，混匀后过0.45μm滤膜。通过Protein G(Protein GSepharose 4 Fast Flow,GE Healthcare)亲和纯化腹水，得到纯化的CD317抗体蛋白。
实施例2 CD317单克隆抗体的流式检测应用
1)收集Hela，吹散计数，分装5个离心管，每管3×105个细胞，500g离心5min，去上清，分别加入1ml PBS，500g离心5min，去上清。
2)加入PBS或5ug/ml 1C12/1G12抗体，放入冰上，孵育，30min。
3)各加入1ml PBS+5％FBS，500g离心5min，去上清，各加入100ul DMEM培养液+1ulPE goat anti-mouse lgG(minimal x-reactivity)antibody(biolegend,405307)，冰上孵育20min。
4)各加入1ml PBS+5％FBS，500g离心5min，去上清。
5)每管加入300ul PBS+5％FBS，重悬，使用贝克曼流式细胞仪(Beckman CytoFLEXCM)检测。
1C12/1G12抗体能与Hela细胞(图1)表面的CD317蛋白结合，应用于流式细胞检测。
实施例3 CD317单克隆抗体的ELISA检测应用
酶标板每孔包被100ng CD317蛋白，4℃包被过夜，经封闭洗板后，加入2倍比稀释的1C12/1G12抗体，最高浓度为40ug/ml，最低浓度为19.5ng/ml，每孔100ul，37度孵育1h。PBST洗板5次，加入1:5000稀释的HRP-羊抗小鼠IgG抗体(购自碧云天)，37℃孵育45min。PBST洗板5次，每孔加入100ul TMB，室温避光反应3min，每孔加入50ul终止液终止，酶标仪测OD450。
如图2所示，1C12/1G12能用于ELISA检测应用。
实施例4 CD317单克隆抗体的Western blot检测应用
CD317蛋白加5×loading buffer混合后，煮沸变性6min，跑SDS-PAGE，每孔上样20ul，～50ng蛋白/孔，400mA转膜1h，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加入PBS或2ug/ml 1C12/1G12抗体或稀释10万倍的免疫小鼠血清室温孵育1h，PBST洗3遍后加入1:5000稀释羊抗鼠IgG二抗，室温孵育45min，PBST洗3遍后加入Western HRP底物(密理博，WBLUR0500)显影。
如图3所示，1C12/1G12能用于Western blot检测应用。
实施例5CD317单克隆抗体的免疫组化应用
1.切片常规脱蜡至水。
2.抗原热修复(热引导的抗原决定簇修复，Heat Induced Epitope Retrieval，HIER)：将切片浸泡在pH9.0的抗原修复溶液(10mM Tris,1mM EDTA溶液，0.05％吐温20,pH9.0)中，95,，5min。
3.为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在HydrogenPeroxide Block(Abcam)中孵育10-15分钟。
4.PBST洗5min/2次。
5.加Ultra V Block(Thermo)，在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。
6.PBST洗5min/2次。
7.加1C12/1G12抗体工作液37℃2小时。
8.PBST洗5min/2次。
9.加Primary Antibody Enhancer(Thermo)，在室温下孵育20分钟。
10.PBST洗5min/2次。
11.加HRP Polymer(酶标二抗，购自碧云天)，在室温下孵育30分钟。
12.PBST洗5min/2次。
13.向1ml DAB Plus Substrate(Thermo)中滴加1-2滴DAB Plus Chromogen(Thermo)，混匀后滴加到切片上，孵育15分钟。
14.自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片
结果如图4所示，1C12/1G12能用于免疫组化。
实施例5抗体结合抗原的亲和力检测
利用Octet K2仪器(PALL ForteBio)的生物膜层反射光干涉(bio-layerinterferometry，BLI)原理检测抗体的亲和力(KD值)。用SD缓冲液(1×PBS，0.05％BSA，0.002％吐温20)稀释抗体。上机操作，利用Protein A传感器或亲和素传感器偶联抗体，然后孵育各种浓度的抗原。所有结合数据都在30℃收集。反应程序由四步组成：抗体偶联传感器；基线采集60s；结合抗原，计算Kon值；解离抗原或抗体，计算Koff值。Kon和Koff的比值为抗体的亲和力KD值。
结果显示：1C12/1G12抗体的亲和力KD为9.16×10-11M，比抗CD317单抗6H2H5(KD＝3.83×10-10M，申请号201711314176.4)和抗CD317单抗1C12C6(KD＝5.69×10-9M，申请号201610554612.4)的亲和力更强。

Claims (14)

1.一种分离的特异性结合CD317的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分由保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，具有保藏号CCTCC NO：C2019156的杂交瘤细胞系1C12/1G12产生。
2.一种杂交瘤细胞系，其保藏信息为保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号CCTCC NO：C2019156。
3.一种组合物，包含权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
4.权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分用于制备试剂盒或检测试剂的用途，所述试剂盒或检测试剂用于检测CD317在样品中的存在或其表达水平。
5.根据权利要求4所述的用途，检测CD317在样品中的存在或其表达水平的方法包括ELISA检测方法、Western blot检测方法、流式细胞检测方法、免疫组化检测方法。
6.根据权利要求4所述的用途，所述试剂盒包括ELISA检测试剂盒或Western blot检测试剂盒，所述检测试剂包括流式细胞检测试剂或免疫组化检测试剂。
7.一种试剂盒，包括权利要求1所述的分离的抗CD317单克隆抗体或其抗原结合部分。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其还包含第二抗体，其特异性识别权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒或Western blot检测试剂盒。
11.一种检测试剂，其包括权利要求1所述的分离的抗CD317单克隆抗体或其抗原结合部分。
12.根据权利要求11所述的检测试剂，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。
13.根据权利要求11所述的检测试剂，所述检测试剂还包含第二抗体，其特异性识别权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
14.根据权利要求11所述的检测试剂，所述检测试剂为免疫组化检测试剂或流式细胞检测试剂。
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