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CN115845079B - 一种重组人血清白蛋白与重组人生长激素的偶联物及其制备方法 - Google Patents

一种重组人血清白蛋白与重组人生长激素的偶联物及其制备方法 Download PDF

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CN115845079B CN202211496441.6A CN202211496441A CN115845079B CN 115845079 B CN115845079 B CN 115845079B CN 202211496441 A CN202211496441 A CN 202211496441A CN 115845079 B CN115845079 B CN 115845079B
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serum albumin
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Wuhan Healthgen Biotechnology Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种以重组人血清白蛋白和重组人生长激素为原料，通过连接基团偶联形成稳定的长效生长激素，本发明也提供制备方法，分离纯化后获得纯度不低于95％的rHSA‑rhGH偶联物。

Description

一种重组人血清白蛋白与重组人生长激素的偶联物及其制备 方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及重组人血清白蛋白与重组人生长激素形成的偶联物和其制备方法。
背景技术
天然人生长激素是由人脑下垂体分泌的蛋白质，由191个氨基酸残基组成的单链肽，分子量为22kDa。临床上主要应用于治疗儿童生长迟缓、成年人生长激素不足及促进创面愈合等。重组人生长激素(rhGH)是利用基因工程方法将人类生长激素基因重组到表达载体上，并用不同的体系进行重组蛋白的表达。rhGH的氨基酸序列和空间构象与人生长激素完全相同，具有与人体内源性生长激素相同的生物学作用。但是直接注射rhGH会由于身体的高清除率而导致其半衰期短，需达到一定血药浓度才能发挥疗效。为保证药效以及模仿生长激素在人体内的分泌节律，患者需每天接受注射给药，同时生长激素的适应症大多为需要长期用药的疾病，这就极大影响了患者用药的顺应性，增加了医护成本。为解决这一问题，近年来长效制剂成为了其研究热点。
全球范围内，目前已获批上市的长效生长激素产品共有3款，分别是2014年获批的金赛药业的聚乙二醇重组人生长激素注射液(商品名为金赛增)，也是目前国内唯一上市的长效生长激素制剂，2020年在美国获批的诺和诺德研发的Somapacitan，以及2021年在美国获批的Ascendis Pharma研发的Skytrofa，2022年5月23日，维昇药业(VISENPharmaceuticals)宣布，其引进的长效生长激素——隆培促生长素(Lonapegsomatropin，注射用TransCon hGH，Skytrofa)国内3期关键临床试验达到主要终点。
6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(EMCS)是一种胺对巯基交联剂，含有NHS酯和马来酰亚胺反应性基团，位于中等长度间隔臂(9.4埃)的相对两端。NHS酯末端在pH值7-9条件下与伯胺偶联，形成稳定酰胺键；马来酰亚胺在pH值6.5-7.5条件下与-SH基团反应，形成稳定硫醚键。依据这一原理，利用DMSO活化的EMCS其NHS酯末端与rhGH的伯胺发生偶联反应后，其马来酰亚胺与rHSA游离的-SH基团发生反应，形成稳定的rhHSA-rhGH偶联产物。
至今只有rHSA与rhGH融合表达的相关研究，并未见有关rHSA与rhGH体外偶联的相关专利或文献报道。本发明利用rHSA与rhGH进行体外偶联，克服了HSA融合蛋白的易降解，表达水平低，生物活性降低等缺点，具有易规模化生产，成本低，稳定性好，具有较好的生物活性和可控性等特点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种利用重组人血清白蛋白(rHSA)和重组人生长激素(rhGH)为原料，通过连接基团偶联后经过分离纯化，获得高纯度稳定的长效生长激素(人血清白蛋白与人生长激素的偶联物(rHSA-rhGH))。
本发明的另外一个目的是提供一种上述偶联物(rHSA-rhGH)的制备方法方法。
本发明的再一个目的是提供含有上述偶联物的药物组合物。
根据本发明的一方面，一种人血清白蛋白与人生长激素的偶联物，是以重组人血清白蛋白(rHSA)和重组人生长激素(rhGH)为原料，通过连接基团偶联形成，所述连接基团为6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(EMCS)。
优选地，所述重组人血清白蛋白为植物源重组人血清白蛋白(OsrHSA)，所述重组人生长激素为植物源重组人生长激素(OsrhGH)。
根据本发明的另一方面，为实现重组人血清白蛋白和重组人生长激素偶联形成稳定的偶联物，本发明提供制备所述人血清白蛋白与人生长激素的偶联物的方法，依次包括下述步骤：
1)将重组人生长激素与活化的6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯混合，使重组人生长激素的氨基与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的氨基反应活性基团连接，得到重组人生长激素-EMCS中间偶联产物；
2)将步骤1)的得到重组人生长激素-EMCS中间偶联产物与重组人血清白蛋白混合，得到人血清白蛋白与人生长激素的终极偶联产物；
3)对获得的终极偶联产物纯化得到所述人血清白蛋白与人生长激素的偶联物。
优选地，所述的方法，包括以下步骤：
a)将重组人生长激素与活化的6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯混合进行偶联反应，使重组人生长激素的氨基与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的氨基反应活性基团连接，偶联完成后加入终止液终止偶联反应；其中
所述的重组人生长激素浓度为2～10mg/ml，
所述6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯浓度为50～150mmol/L，
重组人生长激素与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯摩尔比为1：1～1：10，
所述偶联反应的缓冲液为pH6.8～7.4的磷酸盐缓冲液，
所述终止液含非半胱氨酸的氨基酸；
b)将步骤a)得到的反应产物，经过葡聚糖凝胶层析柱脱盐，得到rhGH-EMCS中间偶联产物；其中
所述葡聚糖凝胶层析柱选自Bestdex G-25C(粗)，Bestdex G-25M(中)，BestdexG-25F(细)和Bestdex G-25SF(超细)；
层析柱平衡液为含1.0～5.0mM EDTA的pH6.8～7.4磷酸盐缓冲液；
c)将步骤b)得到的中间偶联产物，与重组人血清白蛋白混合，得到rHSA-rhGH终极偶联产物；其中
rhGH-EMCS中间偶联产物与重组人血清白蛋白的摩尔比为1：2～2：1；
所述的重组人血清白蛋白反应终浓度为0.5～10mg/ml；
偶联条件为室温偶连1h～2h或2～8℃偶联3h～4h；
d)将步骤c)得到的终极偶联产物，经过疏水层析，获得rHSA-rhGH中间纯化产物；其中
所述的疏水层析介质选自Phenyl Bestrose FF，Phenyl Bestrose HP，ButylBestrose FF，Octyl Bestrose 4FF，UniHR Phenyl 30L和UniHR Butyl 30L；
f)将步骤d)得到的中间纯化产物，经过阴离子层析，获得rHSA-rhGH终极纯化产物；其中
所述的阴离子层析介质选自Unigel 80Q和Nanogel 50Q。
更优选的是，本发明所述方法包括下述步骤：
a)将4～5mg/ml重组人生长激素与100mmol/L溶于DMSO中的活化的6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯混合进行偶联反应，其中重组生长激素与EMCS摩尔比为1：5，偶联反应使重组人生长激素的氨基与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的氨基反应活性基团连接，偶联反应缓冲液为pH7.2的磷酸盐缓冲液，偶联反应条件为室温偶联30min～1h，偶联反应完成后加入甘氨酸终止偶联；
b)将步骤a)得到的反应产物，经过Bestdex G-25M葡聚糖凝胶层析柱脱盐,平衡液为含2.0mM EDTA的pH7.2磷酸盐缓冲液，得到rhGH-EMCS中间偶联产物；
c)将步骤b)得到的中间偶联产物，与重组人血清白蛋白混合，rhGH-EMCS与重组人血清白蛋白的摩尔比为1：1,重组人血清白蛋白反应终浓度为0.8～1.2mg/ml，反应条件为2～8℃偶联3h～4h，得到rHSA-rhGH终极偶联产物；
d)将步骤c)得到的rHSA-rhGH终极偶联产物，经过Phenyl Bestrose HP疏水层析，获得rHSA-rhGH中间纯化产物；包括下述步骤：
d1)采用3～5CV的pH6.5，10mM磷酸缓冲液和0.5M硫酸铵，以120～150cm/h的流速平衡Phenyl Bestrose HP层析柱；
d2)用3M硫酸铵调节rHSA-rhGH偶联产物的电导，上样电导为75～78mS/cm，pH调整为6.5，以120～150cm/h的流速全部上样；
d3)采用pH6.5，含1～2％异丙醇的10mM磷酸缓冲液和0.3M硫酸铵，以120～150cm/h的流速进行7CV杂质蛋白洗脱，洗杂缓冲液电导为48～52mS/cm；
d4)采用pH7.2，10mM磷酸缓冲液和0.025M硫酸铵，以120～150cm/h的流速进行5CV洗脱，洗脱缓冲液电导为6～8mS/cm，收集富含rHSA-rhGH的洗脱液，获得rHSA-rhGH中间纯化产物；
e)将步骤d)得到的中间纯化产物，经过Nanogel 50Q阴离子层析，获得rHSA-rhGH终极纯化产物；包括下述步骤：
e1)采用5～10CV的pH7.0，10mM磷酸缓冲液和120mM氯化钠，以340～360cm/h的流速平衡Nanogel 50Q层析柱；
e2)将中间纯化产物用pH7.0，10mM磷酸缓冲液和120mM氯化钠透析4～5次后，调整pH为7.0，0.22um滤膜过滤后作为上样液，以340～360cm/h的流速全部上样；
e3)采用pH6.7，20mM磷酸缓冲液和160mM氯化钠，以340～360cm/h的流速进行5CV目的蛋白洗脱，洗脱缓冲液电导为17～19mS/cm，收集富含rHSA-rhGH的洗脱液，获得rHSA-rhGH的终极纯化产物，即为人血清白蛋白与人生长激素的偶联物。
根据本发明的再一方面，一种药物组合物，其含有本发明所述的人血清白蛋白与人生长激素的偶联物。
将本发明所述的偶联物与药学上或生理学上可接受的各种辅料、赋形剂等组成药物组合物，所述药物组合物具有长效生长激素的治疗效果。
本发明提供了重组人血清白蛋白与重组人生长激素形成的偶联物，所述偶联物具有稳定的长效生长激素效果，本发明也提供了其制备方法，经本发明方法制备和分离纯化后可以获得纯度不低于95％的rHSA-rhGH偶联物。
附图说明
图1为rhGH-EMCS偶联条件摸索。其中其中M为蛋白标准分子量Marker，0.5～8mg/ml代表rhGH偶联浓度。
图2为rhGH-EMCS与rHSA偶联条件摸索。其中其中M为蛋白标准分子量Marker，0.5：1，1：1，1：2代表rhGH与rHSA摩尔比。
图3为初级纯化层析介质筛选。其中M为蛋白标准分子量Marker，load为上样，FT为穿透，W为洗杂，CIP为再生。A为Phenyl Bestrose FF层析结果；B为Phenyl Bestrose HP层析结果。
图4为初级纯化层析条件确认。其中M为蛋白标准分子量Marker，L为上样，FT为穿透，W为洗杂，E为洗脱，CIP为再生。
图5为末级纯化层析介质筛选。其中M为蛋白标准分子量Marker，load为上样，FT为穿透，W为洗杂，Elu为洗脱。A为Unigel 80Q层析结果；B为Nanogel 50SP层析结果。
图6为3批小试工艺层析图谱；
图7为去垂体大鼠给药后体重，尾长，肝体指数和胫骨骨骺板宽度变化。与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与rhGH标准品组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与OsrhGH阳性药组相比，&P<0.05，&&P<0.01，&&&P<0.001；
图8为OsrHSA和HSA与OsrhGH偶联产物电泳检测结果(A)及目标产物条带相对灰度值(B)(**表示与HSA相比，p＜0.01)；
图9相同浓度(50mg/ml，752μmol/L)的OsrHSA和HSA，游离巯基含量测定结果(A)及巯基游离度(游离巯基摩尔浓度/蛋白质的摩尔浓度)(B)(**表示与HSA相比，p＜0.01)。
具体实施方式
以下将通过实施例和附图以详细说明本发明的技术方案，从而更好地阐述本发明的特点和优势。所提供的实施例应被解释为对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的技术方案。
材料来源：
人血清白蛋白(pHSA或HSA)：商购，Grifols，批号A3AFE01332；
水稻种子表达的重组人血清白蛋白(OsrHSA)：根据专利CN100540667C及CN103880947A制备；
重组人生长激素(OsrhGH，分子量22kDa)：根据专利CN111057138A制备；
使用的其他试剂和仪器，除特殊说明以外，均为普通市售。
【实施例1】rHSA-rhGH偶联条件确认
1.rhGH-EMCS偶联条件确认
取8mg/ml，4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml和0.5mg/ml的OsrhGH溶液各12ml，加入0.3ml的DMSO(～2.5％)，然后按照OsrhGH与EMCS(100mmol/L)分子摩尔比1:5的比例，缓慢分别滴加218μl，109μl，55μl，28μl和14μl的EMCS溶液，室温下搅拌反应30min，然后对应加入10倍EMCS摩尔量的1M Glycine溶液。反应结束后，立即采用Bestdex G-25脱盐柱去除过量的EMCS。将脱盐后的OsrhGH-EMCS，按照OsrHSA与OsrhGH-EMCS分子摩尔比1:1的比例，对应加入1310μl，655μl，328μl，162μl和82μl的OsrHSA(3mmol/L)，室温反应30min，1h，2h和过夜，取样检测偶联情况(图1)。
结果显示：不同浓度的OsrhGH进行偶联时，固定OsrhGH与EMCS的摩尔比为1：5，偶联EMCS后的OsrhGH与OsrHSA的摩尔比为1：1，OsrhGH的浓度越高，OsrhGH-OsrHSA成功偶联占比也明显增加，且OsrhGH的浓度在0.5mg/ml～2mg/ml的偶联成功率有线性增加趋势；当OsrhGH的浓度高于2mg/ml时，偶联成功率在增加(非线性)，但是聚体含量也增加，且随着反应时间加长，偶联成功占比增加，聚体含量也在增加，考虑到OsrhGH的不稳定性，因此，确定最优的OsrhGH偶联浓度为4～5mg/ml，偶联时间30min～1h。
2.rhGH-EMCS与rHSA(重组人血清白蛋白)偶联条件确认
取3份3.4mg/ml的OsrhGH溶液各14ml，加入0.35ml的DMSO(～2.5％)，然后按照OsrhGH与EMCS分子摩尔比1:5的比例，缓慢滴加109μl的EMCS溶液，室温下搅拌反应30min，然后对应加入10倍EMCS摩尔量的1M Glycine溶液109μl。反应结束后，立即采用Bestdex G-25脱盐柱去除过量的EMCS。将脱盐后的OsrhGH-EMCS，按照OsrHSA与OsrhGH-EMCS分子摩尔比0.5:1，1:1和1:2的比例，对应加入109μl，217μl和434μl的OsrHSA(3mmol/L)，室温反应1h，取样检测偶联情况(图2)。
结果显示：OsrHSA与OsrhGH偶联摩尔比为0.5:1时，OsrhGH-OsrHSA偶联成功占比最高，同时聚体含量最低，但是OsrhGH损失较大，综合考虑，OsrHSA与OsrhGH偶联时摩尔比优选1:1。
【实施例2】rHSA-rhGH偶联产物初级纯化
1.偶联产物初级纯化层析介质的选择
根据实施例1确定的最优偶联条件，将5ml Phenyl FF层析柱利用pH7.2 10mM磷酸缓冲液，0.15M硫酸铵进行3～5CV平衡，利用3M硫酸铵将OsrhGH-OsrHSA偶联产物电导调整与平衡液相同，进行上样，依次用pH7.2 10mM磷酸缓冲液含50mM和10mM硫酸铵洗杂液进行洗杂，最后用5mM磷酸缓冲液洗脱(图3A)。结果显示：OsrHSA-OsrhGH偶联产物通过PhenylFF层析，上样时，OsrHSA穿透的同时，也有部分偶联产物同时穿透。
根据实施例1确定的最优偶联条件，将5ml Phenyl Bestrose HP层析柱利用pH7.210mM磷酸缓冲液，0.5M硫酸铵进行3～5CV平衡，利用3M硫酸铵将OsrhGH-OsrHSA偶联产物电导调整与平衡液相同，进行上样，依次用pH7.2 10mM磷酸缓冲液含0.3M和0.2M硫酸铵洗杂液进行洗杂，最后用10mM磷酸缓冲液洗脱(图3B)。
结果显示：通过Phenyl Bestrose HP穿透可以去除95％的OsrHSA，可以优选作为初级纯化层析介质。
2.偶联产物初级纯化条件确认
根据实施例1确定的最优偶联条件，将5ml Phenyl Bestrose HP层析柱利用pH6.510mM磷酸缓冲液，0.5M硫酸铵进行3～5CV平衡，利用3M硫酸铵将OsrhGH-OsrHSA偶联产物电导调整与平衡液相同，进行上样；分别用pH6.5，含1％，2％和5％异丙醇，10mM磷酸缓冲液，0.22M硫酸铵洗杂液进行洗杂，最后用10mM磷酸缓冲液，0.05M硫酸铵洗脱(图4)。
结果显示：通过增加洗杂液中异丙醇浓度至1％和2％时，最终洗脱液中未偶联白蛋白含量明显降低；5％异丙醇洗杂时，目的蛋白被洗脱，洗杂能力较强，初步确定异丙醇的添加浓度为1～2％。
【实施例3】rHSA-rhGH偶联产物末级纯化
1.偶联产物末级纯化层析介质的选择
根据实施例1～2确定的最优偶联条件，初级纯化条件，进行末级纯化层析介质筛选。5ml Unigel 80Q层析柱利用pH7.2，10mM磷酸缓冲液，0.12M氯化钠进行5～10CV平衡，OsrhGH-OsrHSA初级纯化产物利用pH7.2，10mM磷酸缓冲液，0.12M氯化钠进行透析3～5次，直接上样；依次用pH7.2，10mM磷酸缓冲液，0.15M氯化钠和0.2M氯化钠进行洗杂，最后用pH7.2，10mM磷酸缓冲液，1M氯化钠洗脱(图5A)。5ml Nanogel 50Q层析柱利用pH7.2，10mM磷酸缓冲液，0.12M氯化钠进行5～10CV平衡，OsrhGH-OsrHSA初级纯化产物利用pH7.2，10mM磷酸缓冲液，0.12M氯化钠进行透析3～5次，直接上样；依次用pH7.2，10mM磷酸缓冲液，0.15M氯化钠，0.2M氯化钠和0.3M氯化钠进行洗杂，最后用pH7.2，10mM磷酸缓冲液，1M氯化钠洗脱(图5B)。
结果显示：在同样条件下，Nanogel 50Q对盐的耐受能力高一些，分离度较好，后续选择Nanogel 50Q作为末级纯化层析介质。
2.偶联产物末级纯化条件确认
取16ml 4.8mg/ml的OsrhGH溶液，然后按照OsrhGH与EMCS分子摩尔比1:5的比例，缓慢滴加175μl的EMCS溶液，室温下搅拌反应30min，然后对应加入10倍EMCS摩尔量的1MGlycine溶液。反应结束后，立即采用Bestdex G-25脱盐柱去除过量的EMCS。将脱盐后的OsrhGH-EMCS共45ml，分成3份，15ml/份，每份补加30mlPBS-EDTA pH7.2，反应体积45ml，2份4℃预冷1h后，按照OsrHSA与OsrhGH-EMCS分子摩尔比1:1的比例，各加入364μl的OsrHSA，001批室温反应1h，002批4度反应1h，003批4度反应4h。根据实施例2确定的初级纯化条件进行层析，获得初级纯化产物。Nanogel 50Q层析柱利用pH7.0，10mM磷酸缓冲液，0.12M氯化钠进行5～10CV平衡，OsrhGH-OsrHSA初级纯化产物利用pH7.0，10mM磷酸缓冲液，0.12M氯化钠进行透析3～5次，直接上样；最后利用pH6.7，20mM磷酸缓冲液，0.16M氯化钠进行洗脱。
SEC-HPLC检测纯度如下：
Lot. 单体(％) 二聚体(％) 多聚体(％) 单体+二聚体(％)
001批次-B Elu 93.45 3.69 2.86 97.14
002批次-B Elu 92.89 4.33 2.79 97.22
003批次-B Elu 93.73 4.24 2.04 97.97
结果显示：rhGH-EMCS与rHSA偶联，通过降低偶联温度至2～8℃，延长偶联时间，室温，2～8℃偶联1h和2～8℃偶联4h，SEC-HPLC显示最终洗脱样品纯度相差不大(单体纯度在92％～93％，单体+二聚体在97％左右)，而SDS-PAGE结果显示2～8℃偶联4h纯度最高，得率2～8℃偶联4h明显提高，由14％提高至18％左右，因此，优选rhGH-EMCS与rHSA偶联温度为2～8℃，偶联时间为3～4h。
【实施例4】rHSA-rhGH 3批小试偶联和层析工艺验证
根据实施例1～3确定的最优偶联条件、初级纯化工艺及末级纯化工艺，进行3批小试工艺验证，验证过程及验证结果如下所述。
1.偶联工艺
取4.5mg/ml的OsrhGH溶液，然后按照OsrhGH与EMCS分子摩尔比1:5的比例，缓慢滴加EMCS溶液，室温下搅拌反应30min，然后对应加入10倍EMCS摩尔量的1M Glycine溶液。反应结束后，立即采用Bestdex G-25脱盐柱去除过量的EMCS。将脱盐后的OsrhGH-EMCS补加PBS-EDTA pH7.2至原体积10倍，按照OsrHSA与OsrhGH-EMCS分子摩尔比1:1的比例，加入OsrHSA，4度反应3～4h。
2.层析工艺
采用3～5CV的pH6.5，10mM磷酸缓冲液和0.5M硫酸铵，以120～150cm/h的流速平衡Phenyl Bestrose HP层析柱；用3M硫酸铵调节rHSA-rhGH偶联产物的电导，最佳上样电导为75～78mS/cm，pH调整为6.5，以120～150cm/h的流速全部上样；采用pH6.5，含1～2％异丙醇的10mM磷酸缓冲液和0.3M硫酸铵，以120～150cm/h的流速进行杂质蛋白洗脱；采用pH7.2，10mM磷酸缓冲液和0.025M硫酸铵，以120～150cm/h的流速进行洗脱，收集富含rHSA-rhGH的洗脱液，获得rHSA-rhGH的中级纯化产物。
采用5～10CV的pH7.0，10mM磷酸缓冲液和120mM氯化钠，以340～360cm/h的流速平衡Nanogel 50Q层析柱；将中间纯化产物用pH7.0，10mM磷酸缓冲液和120mM氯化钠透析4～5次后，调整pH为7.0，0.22um滤膜过滤后作为上样液，以340～360cm/h的流速全部上样；采用pH6.7，20mM磷酸缓冲液和160mM氯化钠，以340～360cm/h的流速进行目的蛋白洗脱，收集富含rHSA-rhGH的洗脱液，获得rHSA-rhGH的终极纯化产物(图6)。
SEC-HPLC检测纯度如下：
结果显示：3批小试验证平均收率为15.5％，RSD为11.1％，样品纯度SEC-HPLC大于95％，3批验证合格。
【实施例5】rHSA-rhGH体内动物药效确认
根据实施例1～3确定的最优偶联条件、初级纯化工艺及末级纯化工艺，进行药效样品制备，利用去垂体幼年SD大鼠促生长作用评估重组人血清白蛋白偶联重组人生长激素长效作用，并与短效OsrhGH和重组人生长激素(rhGH)国家标准品进行比较。试验前2～3周在清洁条件下手术摘除幼龄大鼠脑垂体，选择给药实验前大鼠体重变化小于手术后第2周的第一天体重±10％的合格健康去垂体大鼠，按体重均匀随机分组，8只/组，共6组，包括供试品高、中、低剂量组、rhGH标准品组、OsrhGH阳性药组、模型组。rhGH标准品组和阳性对照OsrhGH给药剂量皆为420μg(1.26IU)/kg/次/d，连续给药14d，总剂量5.88mg/kg/14d；供试品OsrHSA-OsrhGH高、中、低剂量分别为23.5mg/kg/14d、5.875mg/kg/14d、1.47mg/kg/14d共给药2次，即d1、d8给药；模型组只给予溶媒，给药频率和体积与供试品一致。d15处死大鼠后，检测各生长指标，包括体重、尾长、肝重、胫骨骨骺板宽度等。结果显示：15天内供试品OsrHSA-OsrhGH各组与OsrhGH阳性对照组和短效rhGH标准品组药效一致，对去垂体大鼠各生长指标显著增加(图7)；与模型组相比，供试品OsrHSA-OsrhGH高、中、低各剂量组使去脑垂体大鼠体重显著增加(P<0.01)，具有良好的生长曲线，尾长、肝重显著增加(P<0.01)，肝体指数除低剂量外其它组显著增加(P<0.01)；胫骨骨骺板宽度，与模型组相比，供试品OsrHSA-OsrhGH高、中剂量组明显增宽(P<0.01)。供试品OsrHSA-OsrhGH每周给药1次，其高剂量在与短效rhGH和OsrhGH总剂量相当的情况下，具有与每天给药一次，连续14d替代治疗的常规人生长激素一样的药效作用，显示具有长效作用。结论：本供试品OsrHSA-OsrhGH具有增加机体生长的药效作用，并且相比每天给药的常规人生长激素具有明显长效作用。
【实施例6】植物源重组人血清白蛋白(OsrHSA)和血源血清白蛋白(HSA)与重组人生长激素偶联效率的比较
将重组人生长激素(OsrhGH，分子量22kDa)(根据专利CN111057138A制备)溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后按照OsrhGH与EMCS分子摩尔比1:5的比例，缓慢滴加EMCS溶液(100mmol/L)，室温下搅拌反应30min，然后加入5倍EMCS摩尔量的Glycine溶液(1mol/L)终止反应。
反应结束后，采用Bestdex G-25M脱盐柱去除过量的EMCS。将脱盐后获得OsrhGH-EMCS分为2份，按照分子摩尔比1:1的比例分别加入OsrHSA注射液和HSA注射液，室温下反应1h。然后在相同点样量的情况下，采用4-20％SDS-PAGE分析不同来源白蛋白与OsrhGH的偶联效率。从电泳结果看，OsrHSA反应液中的偶联产物(目标产物)的条带灰度明显高于HSA反应液，经Image J灰度扫描计算，OsrHSA反应液中目标产物的含量约是HSA反应液中目标产物含量的1.66倍(图8)。
【实施例7】OsrHSA和HSA游离巯基含量测定
为了阐明OsrHSA的偶联效率高于HSA的机制，我们采用DTNB法，以半胱氨酸为标曲测定OsrHSA和HSA中游离巯基的含量。将OsrHSA或者HSA采用反应缓冲液(100mmol/L磷酸钠，1mmol/L EDTA，pH8.0)稀释至50mg/ml(752μmol/L)待测。取5ml反应管，预先加入2.5ml反应缓冲液和50μl的DTNB反应液(4mg/ml)，然后分别加入250μl的半胱氨酸标准溶液(0.25～1.5mmol/L)或待测样品，室温反应15min后采用分光光度计测量其在412nm处的吸光度值，根据半胱氨酸标准溶液的吸光度值绘制标准曲线，然后计算待测样品的巯基含量。根据标曲计算，OsrHSA(752μmol/L)中其游离巯基含量541μmol/L(巯基游离度为72％)，而HSA(752μmol/L)中游离巯基含量为183μmol/L(巯基游离度为24％)。从检测结果可以看出，OsrHSA中游离巯基的含量约是HSA的3倍(图9)。

Claims (7)

1.一种人血清白蛋白与人生长激素的偶联物，其特征在于所述偶联物是以重组人血清白蛋白rhHSA和重组人生长激素rhGH为原料，通过连接基团偶联形成，所述连接基团为6-（马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯EMCS，所述重组人血清白蛋白为植物源重组人血清白蛋白; 其中活化的EMCS的NHS 酯末端与rhGH的伯胺发生偶联反应后，EMCS的马来酰亚胺与rhHSA游离的巯基发生反应，形成稳定的rhHSA-rhGH偶联产物。
2.根据权利要求1所述的偶联物，其中所述重组人生长激素为植物源重组人生长激素。
3.制备权利要求1所述的人血清白蛋白与人生长激素的偶联物的方法，依次包括下述步骤：
1）将重组人生长激素与活化的6-（马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯混合，使重组人生长激素的氨基与6-（马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯的氨基反应活性基团连接，得到重组人生长激素-EMCS中间偶联产物；
2）将步骤1）的得到重组人生长激素-EMCS中间偶联产物与植物源重组人血清白蛋白混合，得到人血清白蛋白与人生长激素的终极偶联产物；
3）对获得的终极偶联产物纯化得到所述人血清白蛋白与人生长激素的偶联物。
4.根据权利要求3所述的方法，包括以下步骤：
4a）将重组人生长激素与活化的6-（马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯混合进行偶联反应，使重组人生长激素的氨基与6-（马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯的氨基反应活性基团连接，偶联完成后加入终止液终止偶联反应；其中
所述的重组人生长激素浓度为2~10mg/ml，
所述6-（马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯浓度为50~150mmol/L，
重组人生长激素与6-（马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯摩尔比为1：1~1：10，所述偶联反应的缓冲液为pH6.8~7.4的磷酸盐缓冲液，所述终止液含非半胱氨酸的氨基酸；
4b）将步骤4a）得到的反应产物，经过葡聚糖凝胶层析柱脱盐，得到rhGH-EMCS中间偶联产物；其中
所述葡聚糖凝胶层析柱选自Bestdex G-25 C，Bestdex G-25 M，Bestdex G-25 F和Bestdex G-25 SF；
层析柱平衡液为含1.0~5.0mM EDTA的pH6.8~7.4磷酸盐缓冲液；
4c）将步骤4b）得到的中间偶联产物，与植物源重组人血清白蛋白混合，得到rHSA-rhGH终极偶联产物；其中
rhGH-EMCS中间偶联产物与植物源重组人血清白蛋白的摩尔比为1：2~2：1；
所述的植物源重组人血清白蛋白反应终浓度为0.5~10mg/ml；
偶联条件为室温偶联1h~2h或2~8℃偶联3h~4h；
4d）将步骤4c）得到的终极偶联产物，经过疏水层析，获得rHSA-rhGH中间纯化产物；其中
所述的疏水层析介质选自Phenyl Bestrose FF，Phenyl Bestrose HP，ButylBestrose FF，Octyl Bestrose 4FF，UniHR Phenyl 30L和 UniHR Butyl 30L；
4f）将步骤4d）得到的中间纯化产物，经过阴离子层析，获得rHSA-rhGH终极纯化产物；其中
所述的阴离子层析介质选自Unigel 80Q和Nanogel 50Q。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
5a）将4~5mg/ml重组人生长激素与100mmol/L溶于DMSO中的活化的6-（马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯混合进行偶联反应，其中重组生长激素与EMCS摩尔比为1：5，偶联反应使重组人生长激素的氨基与6-（马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯的氨基反应活性基团连接，偶联反应缓冲液为pH7.2的磷酸盐缓冲液，偶联反应条件为室温偶联30min~1h，偶联反应完成后加入甘氨酸终止偶联；
5b）将步骤5a）得到的反应产物，经过Bestdex G-25 M葡聚糖凝胶层析柱脱盐, 平衡液为含2.0mM EDTA的pH7.2磷酸盐缓冲液，得到rhGH-EMCS中间偶联产物；
5c）将步骤5b）得到的中间偶联产物，与植物源重组人血清白蛋白混合， rhGH-EMCS与植物源重组人血清白蛋白的摩尔比为1：1，植物源重组人血清白蛋白反应终浓度为0.8~1.2mg/ml，反应条件为2~8℃偶联3h~4h，得到rHSA-rhGH终极偶联产物；
5d）将步骤5c）得到的rHSA-rhGH终极偶联产物，经过Phenyl Bestrose HP疏水层析，获得rHSA-rhGH中间纯化产物；包括下述步骤：
d1）采用3~5CV的pH6.5，10mM 磷酸缓冲液和0.5M硫酸铵，以120~150cm/h的流速平衡Phenyl Bestrose HP层析柱；
d2）用3M 硫酸铵调节rHSA-rhGH偶联产物的电导，上样电导为75~78mS/cm，pH调整为6.5，以120~150cm/h的流速全部上样；
d3）采用pH6.5，含1~2%异丙醇的10mM 磷酸缓冲液和0.3M硫酸铵，以120~150cm/h的流速进行7CV杂质蛋白洗脱，洗杂缓冲液电导为48~52mS/cm；
d4）采用pH7.2，10mM 磷酸缓冲液和0.025M硫酸铵，以120~150cm/h的流速进行5CV洗脱，洗脱缓冲液电导为6~8mS/cm，收集富含rHSA-rhGH的洗脱液，获得rHSA-rhGH中间纯化产物；
5e）将步骤5d）得到的中间纯化产物，经过Nanogel 50Q阴离子层析，获得rHSA-rhGH终极纯化产物；包括下述步骤：
e1）采用5~10CV的pH7.0，10mM 磷酸缓冲液和120mM 氯化钠，以340~360cm/h的流速平衡Nanogel 50Q层析柱；
e2）将中间纯化产物用pH7.0，10mM 磷酸缓冲液和120mM 氯化钠透析4~5次后，调整pH为7.0，0.22um滤膜过滤后作为上样液，以340~360cm/h的流速全部上样；
e3）采用pH6.7，20mM 磷酸缓冲液和160mM 氯化钠，以340~360cm/h的流速进行5CV目的蛋白洗脱，洗脱缓冲液电导为17~19mS/cm，收集富含rHSA-rhGH的洗脱液，获得rHSA-rhGH的终极纯化产物，即为人血清白蛋白与人生长激素的偶联物。
6.根据权利要求3~5任一项所述的方法，其中所述重组人生长激素为植物源重组人生长激素。
7.一种药物组合物，其特征在于含有权利要求1所述的人血清白蛋白与人生长激素的偶联物。
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