CN105820232B

CN105820232B - 单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及其制品和应用

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Publication number: CN105820232B
Application number: CN201610218582.XA
Authority: CN
Inventors: 刘海峰; 胥国立; 庞甲佩; 周祥山; 解福生; 田守生; 马立平; 王扬; 张建岭; 史兆松
Original assignee: Angde Biopharmaceutical Co Ltd; Dong E E Jiao Co Ltd
Current assignee: Huarun Onde Biopharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2019-05-17
Anticipated expiration: 2036-04-08
Also published as: CN105820232A

Abstract

本发明公开了一种单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及其制品和应用。本发明对具有正常体内活性的重组人促红素蛋白进行聚乙二醇化学修饰，获得具有促进红细胞生成作用以及长效体内活性的单修饰聚乙二醇重组人促红素。本发明通过对修饰反应的缓冲体系pH值、重组人促红素蛋白浓度，以及重组人促红素蛋白和聚乙二醇的原料比等进行优化，使所制备的单修饰聚乙二醇重组人促红素的得率高，而多修饰比例低，利于纯化。与修饰前的重组人促红素蛋白相比，本发明所制备的单修饰聚乙二醇重组人促红素体内生物比活性高，半衰期有明显延长，能够应用于制备治疗贫血性疾病，尤其是肾性贫血的药物。

Description

单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及其制品和应用

技术领域

本发明涉及重组人促红素蛋白的聚乙二醇修饰物的制备，尤其涉及单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及所制备的单修饰聚乙二醇重组人促红素，本发明还涉及所述单修饰聚乙二醇重组人促红素在制备治疗贫血性疾病，尤其是肾性贫血的药物中的应用，属于聚乙二醇重组人促红素的制备及应用领域。

背景技术

肾性疾病是比较严重的慢性疾病，不易完全治愈。中国慢性肾炎的年发病率约为0.25％，其中有相当部分患者最终会转为肾衰。贫血是肾衰患者的主要并发症，据统计接受透析治疗的肾衰患者97％会发生贫血。

由于肾性贫血是一种慢性疾病，迁延时间较长，不易完全治愈，因此需要长期使用治疗贫血药物。重组人促红素类药物是治疗肾性贫血的显著有效药物，无其他药物可以代替，市场容量非常大。重组EPO是应用基因工程技术从CHO细胞中表达出与天然EPO相近的基因工程药物，1989年由美国安进公司开发成功。重组EPO成为治疗肾性贫血和外科围手术期红细胞动员的有效药物，但需要长期使用。

在不显著影响药物体内活性的前提下，开发新型EPO类药物主要是通过蛋白改构或人工修饰的方式来提高EPO蛋白质的稳定性和延长半衰期，从而减少注射频率和病人痛苦，提高产品的竞争力和更新换代的水平。蛋白修饰以PEG类修饰剂应用最多。

聚乙二醇(PEG)是由乙二醇单体聚合而成的以羟基结尾的线性或分支状聚醚高分子化合物，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性，能改变药物在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快被消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别。PEG是经美国食品药品管理局(FDA)批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。PEG修饰蛋白技术由Davis在20世纪70年代首先进行了开拓性研究。1991年，第1种用聚乙二醇修饰的蛋白药物PEG-腺苷脱氨酶获得FDA批准上市，用于治疗儿童免疫缺陷症，目前已经有多种PEG修饰蛋白药物上市。

现有的利用PEG对重组人促红素蛋白(EPO)进行化学修饰的方法，不同程度的存在单取代率低，多取代率高，纯化困难等缺陷，因此亟待开发一种新的单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法，以达到提高单取代率的同时降低多取代率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法，该方法利用聚乙二醇对具有正常体内活性的重组人促红素蛋白(EPO)进行修饰，从而获得具有促进红细胞生成作用及长效体内活性的单修饰聚乙二醇重组人促红素(PEG-EPO)，而且该方法PEG-EPO的得率高，多修饰比例低，利于纯化；

本发明所要解决的另一个技术问题是提供所制备的单修饰聚乙二醇重组人促红素在制备治疗贫血性疾病，尤其是肾性贫血的药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法，包括以下步骤：向含有重组人促红素蛋白(EPO)的缓冲体系中加入聚乙二醇修饰物，进行聚乙二醇修饰反应；终止反应，纯化，即得；其中，重组人促红素蛋白与聚乙二醇修饰物的摩尔比为1：1-5；优选的，所述重组人促红素蛋白与聚乙二醇修饰物的摩尔比为1：2-4，更优选为1：2-3。

本发明所述聚乙二醇修饰物为甲氧基聚乙二醇丁酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SBA)。所述聚乙二醇修饰反应的PEG修饰反应位点主要位于重组人促红素蛋白的N末端α氨基，45位或52位赖氨酸ε氨基中的任意一个位点。

本发明制备方法中，所述缓冲体系为100-150mM K₂HPO₄，pH值为6.0-9.0；优选的，所述缓冲体系为150mM K₂HPO₄，pH值为7.5。所述缓冲体系中，重组人促红素蛋白的浓度为1-5mg/ml，优选为2-4mg/ml，最优选为3mg/ml。所述聚乙二醇修饰反应的条件包括：20-25℃搅拌2-4小时；优选为，20-25℃搅拌2小时；其中，对搅拌的转速没有特殊限制，作为参考，搅拌转速为80-130rpm。

本发明所述重组人促红素蛋白为人促红素基因经真核细胞表达系统表达获得的；优选为，人促红素基因经CHO-dhfr-细胞(即：二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞))表达获得的。具体的包括，采用重组DNA技术，将带有人促红素基因的重组质粒转染CHO-dhfr-细胞系，经过细胞培养、分离和高度纯化后制得。重组人促红素蛋白(EPO)的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。重组人促红素蛋白的制备方法为本领域所熟知，例如可参考“张静等.长效红细胞生成素的研究进展和临床应用.中国血液净化,2012,第11卷第9期.519-521.”。

本发明单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法中，所述终止反应为调整反应液的pH值为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，更优选为3.5-4.0，最优选为4.0；其中，用乙酸调整反应液的pH值。所述纯化采用离子交换层析，所述离子交换层析的填料为SP Sepharose F.F.或MacroCap SP中的任意一种，优选为MacroCap SP；所述离子交换层析的步骤包括：依次用平衡液进行平衡、上样，上样结束后再平衡，用洗涤液进行洗涤，用洗脱液进行洗脱，收集洗脱产物，即得；其中，所述平衡液为30mM NaAc，pH值为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，更优选为3.5-4.0，最优选为4.0；所述洗涤液为100mM NaCl，30mM NaAc，pH值为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，更优选为3.5-4.0，最优选为4.0；所述洗脱液为175mM NaCl，30mM NaAc，pH值为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，更优选为3.5-4.0，最优选为4.0；所述再生液为750mM NaCl，30mM NaAc，pH值为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，更优选为3.5-4.0，最优选为4.0。

本发明单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法，还包括：将纯化后的产物进行浓缩、换相；其中，所述浓缩为用10KDa超滤器进行超滤浓缩；所述换相的换相液包括：10-20mM磷酸钠，40-50mM硫酸钠，pH值为5.5-7.5，优选为5.8-7.0，更优选为6.0-6.5；优选的，所述换相液为10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露醇，pH值为6.2。

本发明对单修饰聚乙二醇重组人促红素制备方法中的缓冲体系pH值进行了优化，结果表明在pH6.0-9.0范围内，pH7.5和pH9.0反应条件下，制备的单修饰PEG-EPO组分比例基本相同，分别为48.85％和51.20％，而在pH6.0反应条件下，单修饰PEG-EPO组分比例明显偏低，仅为40.28％。尽管pH9.0的反应条件下单修饰PEG-EPO组分比例稍高于pH7.5，但pH9.0为碱性条件，不利于蛋白质稳定。因此，本发明选择pH7.5为最佳修饰反应pH值。

本发明进一步对聚乙二醇修饰反应的原料比进行了优化，结果表明EPO：PEG(mPEG-SBA)摩尔比1：4的反应条件下，多修饰PEG-EPO组分比例较大，达43％，目的产物比例偏低，仅为44.38％，且不利于后期纯化。而EPO：PEG摩尔比1：2、1：3的反应条件下，目的产物单修饰PEG-EPO组分的比例最大，分别为47.01％和51.37％，无明显差异。因此，本发明选择EPO：PEG(mPEG-SBA)摩尔比1：2-1：3(质量比1：3.5-1：5)为最佳修饰反应原料比。

本发明还对单修饰聚乙二醇重组人促红素制备方法中重组人促红素蛋白(EPO)的蛋白浓度进行了优化，结果表明在EPO浓度5.68mg/ml，EPO：PEG摩尔比1：2的反应条件下，目的产物单修饰PEG-EPO组分比例为49.35％；在EPO浓度3mg/ml，EPO：PEG摩尔比1：2的反应条件下，目的产物单修饰PEG-EPO组分比例为47.89％。两者相比，前者的目的产物单修饰PEG-EPO组分比例稍高，但差异不明显，而且前者的多修饰PEG-EPO组分比例也相对较高，达24.11％。考虑到EPO原液生产的浓度一般在3mg/ml左右，并且多修饰PEG-EPO组分的去除难度较大，因此本发明选择EPO浓度为2-4mg/ml。

综上，本发明在EPO浓度为2-4mg/ml，EPO：PEG(mPEG-SBA)摩尔比1：2-1：3，缓冲体系pH值7.5的反应条件下，制得的目的产物单修饰PEG-EPO组分的比例最大，达42.91％-51.37％，且多修饰PEG-EPO组分的比例低，在24.99％以下。反应产物经SP阳离子交换层析纯化后，电泳鉴定单修饰PEG-EPO的纯度大于95％，采用SEC-HPLC法进行纯度鉴定，纯度为98.82％。

本发明采用的PEG修饰反应条件温和，易使蛋白质性质趋于稳定；修饰物mPEG-SBA的质量符合药品原料要求。本发明单修饰聚乙二醇重组人促红素(PEG-EPO)的纯化采用一步SP阳离子交换层析，工艺简单，放大容易，回收率高；PEG-EPO经纯化后，终产品中PEG残留小于或等于50μg/mg蛋白，内毒素热原小于或等于10EU/mg；对杂质、热源能够进行有效控制。纯化后的PEG-EPO换相至所述换相液，可直接进行制剂配液、分装，无需再更换缓冲体系。

本发明方法制备得到的单修饰聚乙二醇重组人促红素具有促进红细胞生成作用，与修饰前的EPO相比，体内生物比活性高，比活性为10105.8U/mg，与标准品比活相当，半衰期有明显延长，能够应用于制备治疗贫血性疾病，尤其是肾性贫血的药物。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明利用聚乙二醇修饰物(mPEG-SBA)对具有正常体内活性的重组人促红素蛋白(EPO)进行修饰，制备单修饰聚乙二醇重组人促红素(PEG-EPO)。本发明通过对修饰反应的缓冲体系pH值、EPO浓度，以及PEG与EPO原料比进行优化，使所制备的PEG-EPO得率高，多修饰PEG-EPO的比例低，利于纯化。与修饰前的EPO相比，本发明所制备的PEG-EPO体内生物比活性高，半衰期有明显延长，能够应用于制备治疗贫血性疾病，尤其是肾性贫血的药物。

附图说明

图1为重组人促红素蛋白(EPO)的结构示意图；

图2为甲氧基聚乙二醇丁酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SBA)分子结构式；

图3为HPLC检测本发明PEG修饰反应产物比例；

图4为PEG-EPO的结构式；

图5为PEG-EPO原液反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析结果；

图6为PEG-EPO原液凝胶高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析结果；

图7为PEG-EPO原液电泳分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、材料

EPO原液(浓度为2.84mg/ml，缓冲为10mM PB，pH7.0，由山东阿华生物药业有限公司生产)；

mPEG-SBA(甲氧基聚乙二醇丁酸琥珀酰亚胺酯)(北京键凯公司，纯度>95％，分子量为30kD)；

乙酸(分析纯，国药集团)；磷酸氢二钾(分析纯，国药集团)。

预备实施例1 重组人促红素蛋白(EPO)原液的制备

EPO原液是采用重组DNA技术，将带有人促红素基因的重组质粒转染CHO-dhfr-(二氢叶酸还原酶基因缺陷型细胞)细胞系，经过细胞培养、分离和高度纯化后制成。具体如下：

1、原料及辅料的基本要求

生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合现行版《中国药典》三部“凡例”的有关要求。

2、EPO原液的制备

2.1工程细胞

2.1.1名称及来源

聚乙二醇重组人促红素工程细胞系为带有人促红素基因的重组质粒转染的CHO-dhfr-(二氢叶酸还原酶基因缺陷型细胞)细胞系。

2.1.2细胞库建立、传代及保存

由原始细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库，主细胞库最多不得超过2个细胞代次；从主细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库，工作细胞库必须限定为1个细胞代次。细胞冻存于液氮中，检定合格后方可用于生产。

2.1.3主细胞库及工作细胞库细胞的检定

应符合《中国药典》三部“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。

2.1.3.1细胞鉴别实验

应用细胞学方法，在光学显微镜下进行鉴别，应为典型CHO细胞。

2.1.3.2无菌检查

取细胞培养上清液样品，进行细菌和真菌检查，应为阴性。

2.1.3.3支原体和内外源病毒因子检查

取细胞培养上清液样品，进行支原体和内外源病毒因子检查，应为阴性。

2.1.3.4人促红素表达量检测

在生长培养基中，细胞瓶培养表达量体外活性检测应不低于4000IU/ml。

2.1.3.5目的基因核苷酸序列检查(工作细胞库免做)

目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。

2.2EPO原液制备

2.2.1细胞培养

2.2.1.1细胞瓶培养

将种子细胞从工作细胞库取出，立即在39℃温水中融化。无菌移入培养瓶中，加入生长培养基后在37℃、CO₂培养箱中培养。复苏的细胞在生长培养基中进行传代、扩增，供细胞培养罐接种用，接种密度不低于5.0×10⁵cells/ml。生长培养基中含灭活牛血清。

2.2.1.2细胞罐培养

2.2.1.2.1生长期

生长期使用生长培养基。接种后测定罐内培养液葡萄糖浓度，当糖浓度降至1～2g/L时，开始灌注培养，维持葡萄糖浓度不高于1.5g/L。

2.2.1.2.2生产期

生产期使用生产培养基，不含牛血清和任何抗生素。由生长期转为生产期时，用细胞洗涤液洗涤后更换为生产培养基。测定罐内葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度降至1.5～2.5g/L时，开始用生产培养基灌注培养，维持葡萄糖浓度不高于3g/L，收集培养液。收获液需2～8℃冷藏保存并及时处理，不宜超过2周。

2.2.1.2.3罐培养控制参数

罐培养过程中，温度控制为37℃，搅拌速度控制为150～200rpm，pH值控制为7.0±0.2，溶氧为不低于38％。

2.2.2分离纯化

2.2.2.1亲和层析

使用亲和介质，介质用平衡液平衡，上样收获液，用平衡液平衡，用含氯化钠的洗脱液洗脱，收集洗脱峰，并脱盐。

2.2.2.2离子交换层析

使用阴离子交换介质，介质用平衡液平衡。脱盐收集液先预纯化，即上样后用平衡液平衡，用含氯化钠的洗脱液洗脱。洗脱收集液稀释后再上样，用平衡液平衡，用乙酸缓冲液洗涤，用再平衡液平衡，用洗脱液洗脱，收集洗脱峰。

2.2.2.3反相层析

使用反相介质，介质用平衡液平衡。上样上步洗脱收集液，用平衡液平衡。用平衡液和无水乙醇的连续梯度洗脱，收集洗脱主峰。收集液用平衡液稀释，上样阴离子交换介质，并洗脱，收集洗脱峰。

2.2.2.4凝胶层析

使用凝胶分离介质，介质用平衡液平衡，上样上步洗脱收集液，用平衡液平衡，收集蛋白质峰。无菌过滤后，即为重组人促红素原液，冻存或用于下一步修饰反应。

3、EPO的肽链序列、EPO结构示意图

EPO肽链的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示：

ALA PRO PRO ARG LEU ILE CYS ASP SER ARG VAL LEU GLU ARG TYR LEU LEUGLU ALA LYS GLU ALA GLU ASN*ILE THR THR GLY CYS ALA GLU HIS CYS SER LEU ASNGLU ASN*ILE THR VAL PRO ASP THR LYS VAL ASN PHE TYR ALA TRP LYS ARG MET GLUVAL GLY GLN GLN ALA VAL GLU VAL TRP GLN GLY LEU ALA LEU LEU SER GLU ALA VALLEU ARG GLY GLN ALA LEU LEU VAL ASN*SER SER GLN PRO TRP GLU PRO LEU GLN LEUHIS VAL ASP LYS ALA VAL SER GLY LEU ARG SER LEU THR THR LEU LEU ARG ALA LEUGLY ALA GLN LYS GLU ALA ILE SER PRO PRO ASP ALA ALA SER**ALA ALA PRO LEU ARGTHR ILE THR ALA ASP THR PHE ARG LYS LEU PHE ARG VAL TYR SER ASN PHE LEU ARGGLY LYS LEU LYS LEU TYR THR GLY GLU ALA CYS ARG THR GLY ASP ARG；

EPO的结构示意图见图1。

实施例1 单修饰聚乙二醇重组人促红素(PEG-EPO)的制备—PEG修饰反应

取检定合格的EPO原液，调整缓冲体系为150mM K₂HPO₄，pH7.5，EPO浓度为2.84mg/ml。

按EPO：PEG摩尔比为1：3(质量比为1：5)的比例，称量mPEG-SBA(甲氧基聚乙二醇丁酸琥珀酰亚胺酯，直链，30KDa，分子结构式见图2)，加入到调整后的EPO原液中，缓慢搅动溶解，在室温(20-25℃)使用电动搅拌器进行均速搅拌(80-130rpm)，反应2小时。反应结束后稀释5倍并用冰乙酸调pH 4.0，置于2～8℃冰箱内冷藏储存，时间不能超过3天；如超过3天，需要进行-20℃冰箱内冷冻储存。

实施例2 单修饰聚乙二醇重组人促红素的鉴定—PEG修饰反应

采用反相-高效液相色谱法对实施例1制备的单修饰聚乙二醇重组人促红素的PEG修饰比例进行鉴定。流动相A为三氟乙酸水溶液(0.3％TFA)；流动相B为三氟乙酸和乙腈水溶液(0.2％TFA，84％乙腈)；流速为1ml/min；检测波长为220nm；柱温为60℃；进样量为5-20μg。色谱柱采用Agilent Poroshell 300SB C8(5μm，300A，2.1x75mm)。

洗脱梯度：

PEG修饰比例的鉴定结果见图3和表1，目的产物单修饰PEG-EPO(结构式见图4)的比例为42.91％。

表1 PEG修饰比例的色谱峰结果

实施例3 单修饰聚乙二醇重组人促红素的鉴定—PEG-EPO纯化

对实施例1制备的单修饰聚乙二醇重组人促红素进行纯化。装配离子交换层析柱，填料选择强阳离子介质MacroCap SP，柱高在15cm左右，柱后连接在线紫外检测器，在2～8℃环境中进行层析纯化。

用30mM NaAc(乙酸钠)，pH4.0缓冲液平衡不少于5个柱体积。上样实施例1制备的修饰反应溶液，上样量不超过2mg蛋白/ml介质(最优为1mg蛋白/ml介质左右)。上样结束后用30mM NaAc，pH4.0的缓冲液平衡不少于5个柱体积。

用100mM NaCl，30mM NaAc，pH4.0洗涤3～4个柱体积；用175mM NaCl，30mM NaAc，pH4.0洗脱3个柱体积，收集洗脱峰；再用750mM NaCl，30mM NaAc，pH4.0再生。

使用10KDa超滤器超滤浓缩洗脱收集液，并换相至10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露醇，pH6.2的溶液中，无菌过滤后即为单修饰聚乙二醇重组人促红素(PEG-EPO)原液。

使用反相-高效液相色谱法对PEG-EPO进行纯度检测，纯度为98.52％(图5)。

实施例4 单修饰聚乙二醇重组人促红素的鉴定—PEG-EPO的纯度鉴定

采用SEC-HPLC法对实施例3纯化的PEG-EPO的纯度进行鉴定。流动相：5mM磷酸氢二钠/500mM氯化钠/1.5mM磷酸二氢钾，pH7.3。色谱柱：Tosohaas TSK凝胶G3000SWxl(7.8mm x30cm，5μm)。

色谱条件为：流速0.6ml/分钟(等度)，上样量：根据蛋白含量进适当体积(5～20μg)，柱温为室温，样品池温度为8℃±1℃，环境温度为室温，检测波长为220nm。

结果见图6，纯度为98.82％。

实施例5 单修饰聚乙二醇重组人促红素的鉴定—电泳纯度鉴定

对实施例3纯化的PEG-EPO进行电泳纯度鉴定。

1、溶液配制：A液：1.5M Tris-HCl(pH8.8)(100ml)：称取Tris 18.15g，用水溶解，浓盐酸调pH至8.8，用水定容至100ml。B液：0.5M Tris-HCl(pH6.8)(100ml)：称取Tris6.05g，用水溶解，浓盐酸调pH至6.8，用水定容至100ml。C液：丙烯酰胺和N.N’－甲叉双丙烯酰胺贮液(100ml)：丙烯酰胺29.2克，N.N’-甲叉丙烯酰胺0.8克，用水溶解，并定容至100ml过滤(置棕色试剂瓶内，避光保存)。D液：10％SDS(100ml)：称取SDS 10克，用水溶解，并定容至100ml。E液：10％APS溶液，临用前配制。F液：TEMED。样品处理液：称取Tris 0.303g、溴酚蓝2mg、SDS 0.8g、量取浓盐酸0.189ml、甘油4ml混匀加水溶解并稀释至10ml。电极缓冲液(1000ml)：甘氨酸14.4g，Tris 3.0g，SDS 1.0g，用水溶解至900ml，调pH至8.3，用水定容至1000ml。

2、样品处理：样品与标准蛋白上样前，在100℃水浴中加热3～5分钟。

3、制胶：分离胶(10％)组成：4.1ml水，2.1ml A液，3.3ml C液，100ul D液，100ul E液，10ul F液。浓缩胶(4.5％)组成：2.9ml水，1.25ml A液，0.75ml C液，50ul D液，50ul E液，5ul F液。将分离胶溶液灌入模具内至同一高度，用水封顶，待胶聚合后，倾去水，以水洗，滤纸吸干水份，倒入浓缩胶，插入梳子，注意避免出现气泡。聚合后取出梳子，上下槽倒入电极缓冲液。

4、电泳：按照样品处理量上样2ug-5ug，显著性标准、灵敏性标准分别按样品上样量的5％、1％进行上样。150V进行浓缩，进入分离胶后，电压升高至200V，溴酚蓝到达底时，结束电泳。

5、染色：固定：用50％甲醇，12％的醋酸，100μl甲醛，用注射用水定容至100ml，室温摇床内固定电泳胶1小时。漂洗：用50％甲醇注射用水溶液100ml漂洗，共漂洗3次，每次5分钟。敏化：用0.02％的Na₂S₂O₃注射用水溶液100ml敏化1分钟。清洗：用注射用水清洗3次，每次0.5分钟。银染：称0.2g硝酸银、75μl甲醛，用注射用水溶解成100ml，染色20分钟。水洗：用注射用水清洗2次，每次0.5分钟。显色：称12g无水碳酸钠、100μl甲醛、20μl 2％的Na₂S₂O₃溶液，用注射用水定容至200ml混匀为显色液，用100ml显色液显色0.5分钟后，倒掉显色液，再加入100ml显色液，显色至蛋白条带清晰。终止显色：用50％甲醇、12％的醋酸100ml终止显色。保存：终止显色后凝胶用注射用水清洗后应保存在水溶液中或干燥保存。

结果见图7，纯度大于95％。

实施例6 单修饰聚乙二醇重组人促红素(PEG-EPO)的制备—PEG修饰反应

取检定合格的EPO原液，调整缓冲体系为150mM K₂HPO₄，pH7.5，EPO浓度为3mg/ml。按EPO：PEG摩尔比为1：3(质量比为1：5)的比例，称量mPEG-SBA(甲氧基聚乙二醇丁酸琥珀酰亚胺酯，直链，30KDa)，加入到调整后的EPO原液中，缓慢搅动溶解，在室温(20-25℃)使用电动搅拌器进行均速搅拌(80-130rpm)，反应2小时。反应结束后稀释5倍并用冰乙酸调pH4.0，置于2～8℃冰箱内冷藏储存，时间不能超过3天；如超过3天，需要进行-20℃冰箱内冷冻储存。采用反相-高效液相色谱法对所制备的单修饰聚乙二醇重组人促红素的PEG修饰比例进行鉴定，目的产物单修饰PEG-EPO的比例为51.30％。

实施例7 单修饰聚乙二醇重组人促红素的鉴定—体内生物学比活性检测

1、实验材料

1.1实验原料

PEG-EPO原液标准品(对照品)PE20120101BZ(由山东阿华生物药业有限公司生产)；

EPO原液(供试品) E201001(由山东阿华生物药业有限公司生产)；

PEG-EPO样品(供试品) 20120101(所用PEG-EPO样品为本发明实施例3纯化后的PEG-EPO)。

1.2实验仪器

血液分析仪

1.3试剂

稀释液：0.1％牛血清白蛋白生理盐水；

乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝剂：100mg EDTA-K2溶解于10ml生理盐水中，混合均匀，向每支干净试管中加入200μl，备用。

1.4实验动物

清洁级雌性BALB/C小鼠，6～8周龄。

2、实验方法

2.1标准品及样品稀释

用稀释液将对照品及样品稀释成等单位浓度。按低、中、高3个剂量组(例：12.5，25.0，50.0ng/只小鼠)分别皮下注射小鼠(相邻高低剂量组的比值要相等)。每剂量组注射4只小鼠。

2.2试验过程

正常检测在注射的第5天(96h)眼眶采血，用EDTA-K2抗凝管抗凝。取上述抗凝血，用全自动网织红细胞测定分析仪计数每只小鼠的网织红细胞数对红细胞总数的比值(Ret％)。

2.3计算

按注射剂量(ng)对Ret％值的量反应平行线法计算待检样品的效价(U/ml)。计算方法详见2010年版中国药典(三部)附录ⅩⅣ。

2.4注意事项

按统计学判定方法对实验结果进行判定。若判定该次实验不成立，应重做。

3、实验结果

用稀释液将PEG-EPO标准品PE20120101BZ稀释成等单位浓度125ng/ml。共作5个组，每组注射4只小鼠，按中剂量组(25.0ng/只小鼠)分别皮下注射小鼠0.2ml。分别在注射的第3天(48h)、第4天(72h)、第5天(96h)、第6天(120h)、第7天(144h)分别取一组眼眶采血，用EDTA-K2抗凝管抗凝。取上述抗凝血，用全自动网织红细胞测定分析仪计数每只小鼠的网织红细胞数对红细胞总数的比值(Ret％)，具体结果见表2，96h时间Ret％达到最高值。

表2 PEG-EPO各组Ret％试验结果

用稀释液将EPO原液稀释成等单位浓度250ng/ml。共作5个组，每组注射4只小鼠，按中剂量组(50.0ng/只小鼠)分别皮下注射小鼠0.2ml。分别在注射的第3天(48h)、第4天(72h)、第5天(96h)、第6天(120h)、第7天(144h)分别取1组眼眶采血，用EDTA-K2抗凝管抗凝。取上述抗凝血，用全自动网织红细胞测定分析仪计数每只小鼠的网织红细胞数对红细胞总数的比值(Ret％)如表3所示，72h时间Ret％达到最高值。

表3 EPO各组不同时间点Ret％试验结果

在表2中可以得出PEG-EPO的最佳采血时间为第5天(96h)。因此，以PE20120101BZ批PEG-EPO标准品为对照品，以20120101批PEG-EPO样品为供试品进行活性检测，在第5天采血。(注：PE20120101BZ批PEG-EPO标准品、20120101批PEG-EPO样品均为实施例3纯化的PEG-EPO)。用稀释液将PEG-EPO对照品及样品均稀释成等单位浓度125ng/ml。各共作5个组，每组注射4只小鼠，按中剂量组(25.0ng/只小鼠)分别皮下注射小鼠0.2ml。实验操作及结果计算与2010年版中国药典(三部)附录ⅩⅣ要求一致，根据小鼠药代和Ret％数值特点，选择2-8周小鼠进行注射，第5天采血。所测供试品比活性为10105.8U/mg，与标准品比活相当，不低于8.0×10³U/mg。

试验例1 PEG修饰反应pH值的优化

1、实验方法

取3份检定合格的EPO原液，各加入K₂HPO₄至终浓度为150mM K₂HPO₄，EPO浓度为2～4mg/ml，调整缓冲体系pH值分别为pH6.0、pH7.5、pH9.0。按EPO：PEG摩尔比1：3(质量比1：5)的比例加入mPEG-SBA，溶解，在室温(20-25℃)环境下搅拌(80-130rpm)反应2小时。反应结束后，用乙酸调pH4.0终止反应，取样进行SEC-HPLC检测，以单PEG-EPO组分比例最大的pH值作为PEG修饰反应的最佳条件。

2、实验结果

在不同pH条件下，SEC-HPLC检测结果见表4。

表4 不同pH条件SEC-HPLC检测结果

在pH7.5和pH9.0的反应条件下，反应2小时结束后，单修饰PEG-EPO组分比例基本相同，而在pH6.0反应2小时后，单修饰PEG-EPO组分比例明显偏低。因此，可以选用pH7.5和pH9.0两种反应条件。尽管pH9.0的反应条件下，单修饰PEG-EPO组分比例稍高，但pH9.0为碱性条件，不利于蛋白质稳定，所以选择pH7.5为最佳修饰反应pH值。

试验例2 修饰反应EPO与PEG的比例优化

1、实验方法

取3份检定合格的EPO原液，调整缓冲体系为150mM K₂HPO₄，pH7.5，EPO浓度为2～4mg/ml。按EPO：PEG摩尔比1：2、1：3、1：4的比例加入mPEG-SBA，溶解，在室温(20-25℃)环境下搅拌(80-130rpm)反应2小时。反应结束后，用乙酸调pH4.0终止反应，取样进行SEC-HPLC检测，以单PEG-EPO组分比例最大的原料比作为PEG修饰反应的最佳条件。

2、实验结果

在不同修饰反应EPO：PEG的用量比例下，SEC-HPLC检测结果见表5。

表5 修饰反应不同原料比SEC-HPLC检测结果

反应2小时结束后，EPO：PEG摩尔比1：4的反应条件，多修饰PEG-EPO组分比例较大，目的产物比例偏低，且不利于后期纯化。EPO：PEG摩尔比1：2、1：3的反应条件，目的产物单修饰PEG-EPO组分比例最大，且无明显差异，因此选择EPO：PEG摩尔比1：2～1：3(质量比1：3.5～1：5)条件为最佳修饰反应原料比。

试验例3 修饰反应EPO蛋白浓度优化

1、实验方法

取检定合格的EPO原液，经10kD超滤离心管适当浓缩，调整缓冲体系为150mMK₂HPO₄，pH7.5，EPO浓度为2.84mg/ml。取一份调整后的原液，用150mM K₂HPO₄，pH7.5缓冲液稀释一倍至1.42mg/ml，并平均分成两份；另取一份调整后的原液，用10kD超滤离心管浓缩一倍至5.68mg/ml，同样平均分成两份；剩余调整后的原液同样平均分成两份。再将各组样品分成相同的两组，分别按EPO：PEG摩尔比1：2和1：3(质量比1：3.5和1：5)的比例加入mPEG-SBA，搅拌溶解。在室温下继续搅拌(80-130rpm)反应2小时。反应结束后分别用乙酸调pH4.0终止反应，取样进行SEC-HPLC检测，以单PEG-EPO组分比例最大的EPO蛋白浓度作为PEG修饰反应的最佳条件。

2、实验结果

在不同修饰反应EPO蛋白浓度下，SEC-HPLC检测结果见表6。

表6 不同修饰反应EPO蛋白浓度SEC-HPLC检测结果

从表6可见，在EPO浓度5.68mg/ml，摩尔比1：2的反应条件下，目的产物单修饰PEG-EPO组分比例为49.35％。在EPO浓度2.84mg/ml，摩尔比1：2的反应条件下，目的产物单修饰PEG-EPO组分比例为47.89％。两者相比，前者的目的产物单修饰PEG-EPO组分比例稍高，但差异不明显，而且前者的多修饰PEG-EPO组分比例也相对较高。考虑到EPO原液生产的浓度一般在3mg/ml左右，并且多修饰PEG-EPO组分的去除难度较大，因此本发明不采用EPO浓度5.68mg/ml，摩尔比1：2的反应条件。

综合考虑，在EPO浓度为2～4mg/ml，EPO：PEG摩尔比1：2～1：3(质量比1：3.5～1：5)的反应条件下，目的产物单修饰PEG-EPO组分比例最大，因此本发明选择此条件为最佳修饰反应条件。

试验例4 换相液成份的优化

1、pH对热稳定性的影响

各种换相液配方中PEG-EPO的热稳定性，可通过差示扫描量热法(DSC)分析。一般认为差示扫描量热法测定的热变性转变温度是蛋白质热稳定性的有效指标。转变温度的提高表明蛋白质的热稳定性增强。

为了确定最佳pH，研究了pH 4～9范围内PEG-EPO(实施例3纯化)热变性温度，在30mM Na₂HPO₄，30mM柠檬酸钠，30mM硼酸盐中分析蛋白质样品的热稳定性。结果表明，最大转变温度在pH 6～9范围内，且pH低于5.5转变温度急剧下降。因此，最佳pH应高于5.5。

2、缓冲剂的选取

通过差示扫描量热法(DSC)研究了缓冲物质对蛋白热稳定性的影响。结果表明高热稳定性最合适的缓冲剂为硫酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐。

3、硫酸根缓冲剂对蛋白稳定性影响

pH6.2时，在盐浓度的总摩尔数分别为50mM和150mM的情况下，将部分的磷酸盐换成相应摩尔数的硫酸钠，蛋白转变温度明显升高，所以，pH6.2时硫酸盐是合适缓冲剂。

另外，盐浓度的总摩尔数分别为50mM和150mM时，蛋白转变温度差别不大，低浓度的盐更适宜用作换相液。

4、不同制剂处方中的蛋白稳定性

分别配制制剂溶液进行PEG-EPO稳定性考察。制剂A(10mM磷酸钠，100mM氯化钠，pH7.5)；制剂B(10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露醇，pH6.2)；制剂C(10mM磷酸钠，100mM氯化钠，pH7.0)；制剂D(10mM磷酸钠，120mM硫酸钠，pH6.2)；制剂E(40mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％(w/v)甘露醇，1mM CaCl₂，pH6.2)。

将上述五种组分样品，分别在4℃、25℃、30℃、40℃储存，6个月之后，取样进行反相高效液相色谱，排阻层析和SDS-PAGE检测，计算蛋白回收率，评价样品稳定性。

结果表明，在相同的存放条件下，制剂B蛋白回收率显著高于其他组，说明制剂B配方较为稳定。因此，本发明选择制剂B为换相液。

Claims

1.一种单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法，包括以下步骤：向含有重组人促红素蛋白的缓冲体系中加入聚乙二醇修饰物，进行聚乙二醇修饰反应；终止反应，纯化，即得；其特征在于：所述重组人促红素蛋白与聚乙二醇修饰物的摩尔比为1：2-3；

所述聚乙二醇修饰物为甲氧基聚乙二醇丁酸琥珀酰亚胺酯；

所述缓冲体系为150mM K₂HPO₄，pH值为7.5；

所述缓冲体系中，重组人促红素蛋白的浓度为2-4mg/ml；

所述终止反应为调整反应液的pH值为4.0。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲体系中，重组人促红素蛋白的浓度为3mg/ml。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇修饰反应的条件包括：20-25℃搅拌2-4小时；

所述重组人促红素蛋白为人促红素基因经真核细胞表达系统表达获得的；

用乙酸调整终止反应的反应液的pH值。

4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇修饰反应的条件包括：20-25℃搅拌2小时；

所述重组人促红素蛋白为人促红素基因经二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞表达获得的。

5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化采用离子交换层析，所述离子交换层析的填料为SP Sepharose F.F.或MacroCap SP中的任意一种；所述离子交换层析的步骤包括：依次用平衡液进行平衡、上样，上样结束后再平衡，用洗涤液进行洗涤，用洗脱液进行洗脱，收集洗脱产物；

其中，所述平衡液为30mM NaAc，pH值为3.0-4.0；

所述洗涤液为100mM NaCl，30mM NaAc，pH值为3.0-4.0；

所述洗脱液为175mM NaCl，30mM NaAc，pH值为3.0-4.0。

6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述离子交换层析的填料为MacroCapSP；

所述平衡液为30mM NaAc，pH值为3.5-4.0；

所述洗涤液为100mM NaCl，30mM NaAc，pH值为3.5-4.0；

所述洗脱液为175mM NaCl，30mM NaAc，pH值为3.5-4.0。

7.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述平衡液为30mM NaAc，pH值为4.0；

所述洗涤液为100mM NaCl，30mM NaAc，pH值为4.0；

所述洗脱液为175mM NaCl，30mM NaAc，pH值为4.0。

8.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括：将纯化后的产物进行浓缩、换相；

其中，所述浓缩为用10KDa超滤器进行超滤浓缩；

所述换相的换相液为10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露醇，pH值为6.2。