WO2009113743A1

WO2009113743A1 - Ｐｅｇ化ラクトフェリン複合体及びその製造方法

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Publication number: WO2009113743A1
Application number: PCT/JP2009/055557
Authority: WO
Inventors: 佐藤淳
Original assignee: よこはまティーエルオー株式会社
Priority date: 2008-03-14
Filing date: 2009-03-13
Publication date: 2009-09-17
Also published as: EP2258721A4; JPWO2009113743A1; CA2717699A1; EP2258721A1; US20110009313A1; JP5427170B2

Abstract

抗原性を低減し、ペプシン耐性を付与し、体内寿命を延ばした、臨床的有用性の高い直鎖型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体及びその製造方法を提供し、さらに、天然ラクトフェリンの生物活性を一定割合保持し、体内寿命が有意に延長されており、臨床的有用性が天然ラクトフェリンよりも優れたラクトフェリン複合体及びその製造方法等を提供する。　本発明の一つの態様は、直鎖型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその修飾物とラクトフェリンとがアミド結合により共有結合されているＰＥＧ化ラクトフェリン複合体の製造方法であって、ラクトフェリンとパラニトロフェニル基を有する直鎖型ＰＥＧ誘導体とを含む反応液を、上記パラニトロフェニル基とラクトフェリンとの間でアミド基が形成される条件下で反応させる工程を含むことを特徴とする方法である。

Description

明細書

P E G化ラクトフリン複合体及びその製造方法

技術分野

本発明は、ラタトフエリンとポリエチレングリコール（P E G) などの非ぺプチド性親水性高分子との生物学的に活性な複合体、その製造方法及びその用途等に関する。背景技術

従来、生体高分子の性質の調節などの目的のため、生体高分子と P E Gなどの非ペプチド性親水性高分子とをコンジュゲート化すること（以下「複合体化」、

P E G又はその類似化合物を用いる場合については「P E G化」ということがある）が行われている。より具体的には、複合体化は、一般に、非ペプチド性親水性高分子の末端に活性基を付けてタンパク質等の分子表面に存在する官能基と反応させることにより行われる。

特に、タンパク質及びペプチドの複合体化は重要であり、非ペプチド性親水性高分子鎖でタンパク質の分子表面を部分的に覆うことにより、ェピトープをシ一ノレドすることによる抗原性■免疫原性の低減、細網内皮系等による取り込みの低減、及びタンパク分解酵素による認識及び分解の防止などが研究されている。また、複合体化された物質について、生体内でのクリアランスが遅延し、体内寿命が延びることが知られている。その一方で、複合体化されたタンパク質などでは、非ペプチド性親水性高分子の存在によって活性部位が影響を受け、生物活性が低減されることも頻繁に観察されている。

例えば、インターフェロンは、 P E G化することによって、体内寿命が約 7 0 倍に延びる一方、抗ウィルス活性のような生物活性が約 1 1 0に低下する。しかし、総合的には P E G化によって治療効果が大幅に改善されることが知られており、これは C型肝炎の治療に役立っている。

タンパク質の複合体化という概念自体は、白血病治療薬としてァスパラギナーゼの P E G化が成功して以来、古い歴史がある。現在までに P E Gなどの複合体化試薬自体の構造（活性基のタイプ、分子の大きさと分布、分岐型の開発など）の改良がなされ、技術的に進歩している。

分岐型の P E Gといくつかのタンパク質との複合体については、直鎖型 P E G を用いた場合と比較して、プロテアーゼ耐性が高くなり、タンパク質によっては pH 及び熱に対する安定性が増大することが知られている（非特許文献 1 ： Monfardini et al. , Bioconjug Chem. 1995 6 (1) : 62-9) 。また、インターフエ口ンについては、分岐型 P E Gとの複合体が他の P E Gとの複合体及びィンターフエロン自体よりも高い抗増殖活性を有することが観察されている（特許文献 1 ：特開平 1 0— 6 7 8 0 0 ) 。

しかし、複合体化による個々のタンパク質の活性の変動は、タンパク質ごとに異なっている。さらに、例えばインターフェロンについては P E G化によってィンビトロの抗ウィルス活性が減少する一方、ヒト腫瘍細胞における抗増殖活性が増加するというように、 P E G化によって、あるタンパク質が有する複数の特性について一律ではない影響が生じうる。したがって、望ましい特性を備えた複合体を得るための最適な条件等については、各タンパク質ごとに充分に検討されなければならなレ、。

また、タンパク質などの複合体化に関しては、非ペプチド性親水性高分子鎖の構造（直鎖型か分岐型か、分子の大きさと分布など) 、反応部位及び反応分子数によって、抗原性、プロテアーゼ抵抗性、体内寿命及び熱安定性などの生化学的 -薬剤学的性質、及び薬効に関わる生物活性への影響が大きく異なることが容易に予想される。したがって、このような複合体を医薬品として開発する場合、一定の品質を保証するため非ぺプチド性親水性高分子鎖の付加が一定の部位であることが求められる。

ラタトフエリン（以下、「L F」と略すことがある）は、主に哺乳動物の乳汁中に存在し、好中球、涙、唾液、鼻汁、胆汁、精液などにも見出されている、分子量約 8 0， 0 0 0の糖タンパク質である。ラタトフエリンは、鉄を結合すること力ら、トランスフェリンファミリーに属する。ラタトフエリンの生理活性としては、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用亢進作用、抗ウィルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用などが知られている。さらに、最近、ラクトフヱリンが脂質代謝改善作用、鎮痛 '抗ストレス作用、アンチエイジング作用を有することも明らかにされている。このように、ラクトフエリンは、多様な機能を示す多機能生理活性タンパク質であり、健康の回復又は増進のため、医薬品や食品などの用途に使用されることが期待されており、ラタトフエリンを含む食品は既に市販されている。

ラタトフエリンは、経口的に摂取した場合、胃液中に存在する酸性プロテア一ゼのペプシンにより加水分解を受け、ペプチドに分解されるため、ラタトフエリン分子としてはほとんど腸管まで到達することができない。しかし、ラクトフエリン受容体は消化管では小腸粘膜に存在することが知られており、最近、ラクトフェリンが腸管から体内に取り込まれて、生物活性を発現していることが明らかにされている。そのため、ラタトフエリンの持つ生物活性を発揮させるには、ラタトフェリンを胃液中でのペプシンによる加水分解を受けない状態で腸管まで到達させることが重要である。

ラタトフエリンに関しても、 P E G化された複合体についての報告がある（非特許文献 2 ： C. 0. Beauchamp et al. Anal. Biochem. 131： 25-33 (1983) ) 。ここで P E G化反応に使用された P E Gは、モノメトキシポリエチレングリコーノレ (m P E G ) の O H基が 1， 1， -カルボ二ルイミダゾールで活性化されたものであった。しかし、この文献には、直鎖型の P E Gと L Fとの複合体が 5 〜 2 0倍延長された体内寿命を有していたことが記載されているだけであり、 P E G 化された L Fの生物活性、 P E G化の程度、均一性などについては何ら記載されていない。

そこで、以前、本発明者らは、鋭意検討した結果、分岐型の非ペプチド性親水性高分子を用いることにより、このような分子をラタトフエリン分子表面の限定された部位に結合させ、天然ラタトフエリンの 3 0 %以上の鉄キレート能を保持した生物学的に活性なラタトフエリン複合体を得ることに成功した（特許文献 2 ) 。しかし、直鎖型のものについては成功していなかった。

特許文献 1 ：特開平 1 0— 6 7 8 0 0号公報特許文献 2 ：特開 2 0 0 7— 7 0 2 7 7号公報

非特許文献 1 ： Monfardini et al. , Bioconjug Chera. 1995 6 (1) : 62 - 9 非特許文献 2 ： C. 0. Beauchamp et al.， Anal. Biochem. 131： 25 - 33 (1983) 発明の開示

発明が解決しようとする課題

本発明は、抗原性を低減し、ペプシン耐性を付与し、体内寿命を延ばした、臨床的有用性の高い直鎖型非ペプチド性親水性高分子とラタトフエリンとの複合体及びその製造方法を提供することを目的とする。さらに、天然ラクトフヱリンの 0 生物活性を一定割合保持し、体内寿命が有意に延長されており、臨床的有用性が天然ラクトフエリンよりも優れたラタトフヱリン複合体及びその製造方法等を提供することを目的とする。

特に、短時間で効率的に上記の特性を有するラタトフエリン複合体を大量調製するのに適した方法を提供することも目的とする。

5 課題を解決するための手段

本発明者は、ラタトフエリンを生物活性が保たれた状態で最も均一に直鎖型 P E Gのような非ぺプチド性親水性高分子と複合体化するための反応条件等を検討し、ラタトフエリン分子表面の限定された部位に特定の構造のこのような高分子を結合させることを可能にした。また、このような複合体の大量調製又は工業的 ) 生産に適した条件及び方法を見出した。さらに、そのようにして製造されたラタトフエリン複合体はペプシンなどのプロテアーゼに対する抵抗性を有し、最も重要な生物活性である鉄キレート能、さらには炎症性サイト力イン産生調節（抑制 ) 能も保存されているという結果を得、本発明を完成した。

即ち、本発明は、

) [ 1 ] 直鎖型ポリエチレングリコール（P E G ) 又はその修飾物とラクトフエリンとがアミド結合により共有結合されている P E G化ラタトフエリン複合体の製造方法であって、ラタトフエリンとパラニトロフエ二ル基を有する直鎖型 P E G誘導体とを含む反応液を、上記パラ-トロフエエル基とラタトフエリンとの間でアミド基が形成される条件下で反応させる工程を含むことを特徴とする方法；〔2〕上記反応工程が、 pH 4〜5 . 5の条件下で行われる、前記〔1〕記載の方法；

〔3〕上記反応工程が、ラタトフヱリン：直鎮型 P E G誘導体のモル比が 1 ： 1〜1 ： 5、ラタトフヱリンの最終濃度が 5 rag/ml〜 1 O mg/ml、反応時間が 2 4 〜4 8時間の条件下で行われる、前記〔1〕又は〔2〕記載の方法；

〔4〕前記〔1〕〜〔3〕のいずれか 1項記載の方法により製造された、直鎖型ポリエチレンダリコール ( P E G ) 又はその修飾物とラタトフエリンとがアミド結合により共有結合されていることを特徴とする P E G化ラクトフエリン複合体；

〔5〕前記〔4〕記載の P E G化ラクトフエリン複合体及び治療上不活性な基剤及び Z又は添加物を含む医薬品組成物；及び、

〔6〕経口投与用である、前記〔5〕記載の医薬品組成物、

を提供する。

発明の効果

本発明の P E G化ラクトフリン複合体の製造方法は、直鎖型の P E G誘導体を用いて、短時間で容易に効率よく、均一に P E G化された目的のラクトフエリン複合体を製造することを可能にする。本発明の製造方法によれば、反応性の高い限定的な部位のみが均一に反応しているものと推定され、その結果、非常に均一な複合体が得られる。

本発明の複合体は、ラタトフヱリンが有する鉄の結合能を保持しており、したがって、少なくとも鉄結合能に基づくラタトフエリンの重要な生物活性が保持されている。また、直鎖型 P E G誘導体の結合によって、ペプシンなどのプロテアーゼに対する抵抗性を有しているため、体内寿命が長く、体内で長時間にわたつて生物活性を発揮することができる。さらに、複合体化によって胃でのペプシンによる消化分解を受けにくくなつているため、さらなる腸溶化のための製剤的な処理を行わなくても、充分に腸内に到達しうる。本発明の複合体は、炎症性サイトカインの産生を調節する活性もまた、充分に保持している。

さらに、本発明の複合体は、特定の位置に一定の数の P E Gが結合するため、品質が均一であり、製造管理 '品質管理の点でも有利である。これらの利点によつて、本発明の複合体は、医薬品成分、特に経口投与用医薬品成分としての使用に特に適している。即ち、本発明にしたがった複合体及び複合体製造方法により、ラタトフエリンを医薬品成分としてさらに有用性の高い形とすることができる。ラクトフリンは、安全性が非常に高く、多様な生物活性を有するので、本発明により、有効な治療薬がない疾患又は症状の治療薬又は予防薬として、さらに有利に適用が可能となる。例えば、生活習慣病（動脈硬化、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧、糖尿病、脂肪肝など）、がん（発がん予防、がんの二次予防、転移抑制、制癌剤の作用増強など）、自己免疫疾患（シエーダレン症候群によるドライアイ及びドライマウス、リウマチ性関節炎、悪性関節リウマチ、膠原病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスなど) 、精神神経疾患（痴呆、ァルツハイマー病、パーキンソン病、テンカン、うつ病、ヒキコモリ、統合失調症、各種ストレス性疾患など）、疼痛緩和（モルヒネ等のォピオイド増強作用、がん性疼痛、神経因性疼痛、ヘルぺス後疼痛、線維筋痛症、術後疼痛、舌痛症、生理痛、歯痛、関節痛など）、肝炎（各種ウィルス性肝炎、非アルコール性肝炎、肝硬変など）、炎症性腸疾患（大腸性潰瘍炎、クローン病など）、過敏性腸症候群、前立腺肥大、頻尿、不眠症、便秘などへ適応を拡大できる。

さらに、本発明の複合体に含まれるラタトフエリンは、抗菌 '抗ウィルス作用及ぴ免疫能賦活作用があるので、本発明の複合体又はそれを含む医薬品組成物は、各種感染症及びそれに基づく炎症、例えば、へリコパクター ' ピロリ菌の胃粘膜感染、歯周病、歯槽膿漏、口臭、口腔カンジダ症、口内炎、口角炎、鼻炎、食道炎、胆嚢炎、尿路感染症、膣感染症、水虫、二キビ、ヘルぺス属ウィルスの感染症、老人性肺炎、術後感染症などへの適用も可能であり、また、抗生物質の作用を増強する作用がある。

一方、ラクトフエリンは免疫的な寛容をもたらす作用もあり、本発明の複合体又はそれを含む医薬品組成物は、花粉症、アトピー性皮膚炎、脂漏症、尊麻疹等のアレルギー性疾患にも適用可能である。注目すべきことは、ラタトフエリンには鉄キレート作用に基づく強い抗酸化ストレス作用があり、本発明の複合体又はそれを含む医薬品組成物は、ウィルソン病、劇症肝炎などや、肌や眼の抗加齢 - 若返り作用、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、粘膜上皮細胞の角化抑制 ·若返り作用などへの適用も可能である。

図面の簡単な説明

図 1は、官能基にパラニトロフエ二ル基を有する直鎖型 PEG誘導体と、 b L Fとの反応の模式図である。パネル Aは反応前の直鎖型 P EG誘導体及び L F、パネル Bは反応後の複合体及び副生成物を表す。

図 2は、 NHSエステルを官能基に有する直鎮型 P EG誘導体と b L Fとの複合体の形成を解析したゲルの写真を示す図である。矢印で示したバンドは未修飾のゥシラタトフエリンを示す。パネル Aは、 Sigma社製 PEG試薬（「Methoxy polyethyleneglycol Succinimidyl succinate] 、 MW= 5 kDa) 、ノヽ不ノレ B fま、曰油株式会社製 P EG試薬（「SUNBRIGHT MEGC- 30TS」、 MW= 30 kDa) 、パネル C は、日油株式会社製 P EG試薬（「SUNBRIGHT ME- 200TR」、 MW= 20kDa) をそれぞれ用いた場合の結果である。

図 3は、異なる pH条件下でのパラニトロフエ二ル基を有する直鎖型 P EG誘導体（「SUNBRIGHT MENP - 50HJ ( 5 kDa) ) と b L Fとの複合体（5 K— PEG -L f ) の形成を解析したゲルの写真を示す図である。

図 4は、異なる pH条件下でのパラエトロフエ二ル基を有する直鎖型 P EG誘導体（「SUNBRIGHT MENP-30TJ ( 3 0 kDa) ) と b L Fとの複合体（30 K- P EG—L f ) の形成を解析したゲルの写真を示す図である。

図 5は、 25 °Cで異なる反応時間条件下での 5 K_ P E G— L f の形成を解析したゲルの写真を示す図である。

図 6は、 25 °Cで異なる反応時間条件下での 3 OK-P EG-L f の形成を解析したゲルの写真を示す図である。

図 7は、 5 K— P EG— L f を、陽イオン交換体で精製した後、 7. 5 % S D S一 P AG Eで解析したゲルの写真を示す図である。

図 8は、 30 K— PEG— L ίを、陽イオン交換体で精製した後、 7. 5 %S D S— PAGEで解析したゲルの写真を示す図である。

図 9は、未修飾ラタトフエリン（b L f ) 、精製 3 O k— P EG_L f を、ぺプシンで消化後、 1 0%SD S— PAGEで解析したゲルの写真を示す図である図 1 0は、ペプシンによる 30 k_PEG— L f の経時的な分解を、未修飾 b L Fの分解と比較した図である。 ♦は b LF、驪は 3◦ k— P EG— L f を表す発明を実施するための最良の形態

本発明の複合体は、直鎖型 PEGとラタトフエリンとの生物学的に活性な複合体である。本発明の複合体においてラタトフエリンと結合される直鎖型 P EG誘導体は、一般に、一方の末端にラタトフエリンの官能基と反応して共有結合を形成しうるパラエトロフエ二ル基を有し、生体に対して適合可能又は薬理学的に不活性であればよい。

3 本発明の複合体は、

式〔 I〕：

[PEG] -CONH- [L F]

(式中、〔PEG〕はポリエチレングリコール（HO— (CH₂-CH₂-0) _n ―) 又はその修飾物の基、 CONHはアミド結合、〔LF〕はラタトフエリンを 5 それぞれ表す）

で示される。

式〔 I〕において〔PEG〕部分は、 PEG又はその修飾物（例えばメトキシ化物）であり、短い分岐やペンダント基を有していてもよいが、特に直鎖状の P EG又はメトキシ P EGであることが好ましい。

) 本発明の複合体において使用される「ラタトフエリン」（LF) は、天然又は天然型のラクトフエリン分子そのもののほか、遺伝子組換え型（一部のアミノ酸が置換された改変型を含む）ラタトフエリン、及びラタトフエリンの活性フラグメントなどのラクトフエリンの機能的等価物であってもよく、鉄イオンの有無又はその含有量、由来する生物種などを問わない。

；天然のラタトフエリンには、 44個（ヒト）〜54個（ゥシ）程度のリジン残基が存在するが、それらの反応性はその存在位置の局所的環境により異なる。本発明の方法によれば、ラタトフヱリンの N末端側の _α—ァミノ基及びリジン残基の _ε —ァミノ基が PEGによって修飾されうる標的となるが、複合体において、 1〜 1 0箇所、好ましくは 1〜 5箇所に、再現性よく非べプチド性親水性高分子が共有結合される。特に、最適条件下で反応工程を行うことにより、 L F 1分子あたり 1箇所程度の非常に均一性の高い選択的な P E G化が達成される。

本発明の複合体に関して「生物学的に活性な」とは、ラタトフエリンの生理薬理活性が保持されていることを意味する。特に、本発明の複合体は、天然ラクトフェリンとほぼ同等の鉄キレート（結合）能及び/又は炎症性サイトカイン産生調節能を有している。

具体的には、後述する実施例の方法で測定して天然ラタトフリンの鉄結合能を 1 0 0 %とした場合に、本発明の複合体は、少なくとも 5 0 %以上（例えば約 5 0 %〜約 1 5 0 %又は約 5 0。/。〜約 1 2 0 %) の鉄結合能を保持しており、好ましい態様においては、本発明の複合体は、天然ラタトフエリンの約 6 0 %〜約 1 0 0 %又はそれ以上（例えば約 6 0 %〜約 1 5 0 %又は約 6 0 %〜約 1 2 0 % ) に相当する鉄結合能を有する。なお、鉄結合能は、実施例に記載した方法又はそれと同等の方法によって測定する場合、 ± 2 0 %程度の誤差がありうる。

また、後述する実施例の方法で測定して天然ラタトフエリンの炎症性サイトカイン産生調節能を 1 0 0 %とした場合に、本発明の複合体は、少なくとも 5 0 % 以上（例えば約 5 0 %〜約 1 5 0 %又は約 5 0 %〜約 1 2 0 % ) の炎症性サイト力イン産生調節能を保持しており、好ましい態様においては、本発明の複合体は、天然ラタトフエリンの約 7 0 %〜約 1 0 0 %又はそれ以上（例えば約 7 0 %〜約 1 5 0 %又は約 7 0 %〜約1 2 0 %) に相当する炎症性サイトカイン産生調節能を有する。なお、サイトカイン産生調節能は、実施例に記載した方法又はそれと同等の方法によって測定する場合、土 2 0 %程度の誤差がありうる。

本発明の複合体は、プロテアーゼ耐性を有する。即ち、本発明の複合体は、少なくともペプシン及び又はトリプシン、キモトリプシンによる消化に対して天然ラクトフヱリンと比較して有意に耐性である。好ましくは、本発明の複合体は、実施例に記載した条件でのペプシンによる 2 0分の消化後において、天然ラタトフエリンの約 1 . 5倍〜約 2倍又はそれ以上（例えば約 2倍〜約 5倍）が未消化で残存する程度のペプシン耐性を有する。

本発明の複合体は、直鎖型 P E G誘導体のパラュトロフエニル基とラタトフエリンの官能基とを反応させることによって共有結合させることにより製造することができる。例えば、直鎖型 PEG誘導体としては、

式〔II〕：

〔PEG〕一〔PNP〕

(式中、〔PEG〕はポリエチレングリコール又はその修飾物、〔PNP〕はパラニトロフエ二ル基をそれぞれ表す）

で示されるものを使用することができる。

官能基にパラニトロフエ二ル基を有する直鎖型 PEG試薬と、ゥシ LF (b L f ) とが反応して本発明の PEG化ラタトフリン複合体が生じる反応の模式図を図 1に示す（反応前：パネル A；反応後：パネル B) 。

このような直鎖型 P EG誘導体は、公知の方法で合成することもできるが、既に各種のものが市販されている。反応に使用される直鎖型 PEG誘導体の分子量 (数平均分子量）としては、一般に約 500〜約 200， 000、好ましくは約 2, 000〜約 1 00， 000、特に好ましくは約 1 0， 000〜約 60， 00 0 (Da) である。

PEG化反応の際、好ましくは、ラタトフエリンと直鎖型 PEG誘導体とが、 1 : 0. 1〜1 ： 1 00のモル比で反応液中に添加される。ラタトフエリン：直鎖型 P EG誘導体の混合モル比は、さらに好ましくは 1 : 0. 1〜1 ： 60、最も好ましくは 1 ： 1〜： L ： 5の範囲内である。

また、反応工程は、一般的に pH4〜5. 5、温度 0〜40°C、時間 1分〜 7 2時間の条件下で行われる。反応液の pHは、特に好ましくは pH5±0. 5、最も好ましくは pH 5付近（即ち pH4. 7 5〜5. 25) である。

反応時間及び反応温度は相互に密接に関連して変化させることができるが、一般に反応温度が高い場合は時間を短く、温度が低い場合は時間を長くすることが好ましい。例えば、ラタトフエリン：直鎖型 PEG誘導体のモル比が 1 ： 1〜1 ： 5の条件下では、 25°Cにおいて約 1〜48時間反応させることにより、特に良好な結果（均一な複合体化など）が得られる。

上記のようにして製造された、試料中に含有される本発明の複合体は、まず陽イオン交換担体（樹脂）に吸着させて濃縮し、続いて、得られた濃縮物を分子篩クロマトグラフィ担体（樹脂）に適用することによって容易に精製することができる。具体的には、例えば最初に複合体を含有する試料を陽イオン交換カラムに適用して複合体を力ラムに吸着させ、高塩濃度の緩衝液で溶出して濃縮された複合体を含有する溶出液を集める。次に、この溶出液を分子篩クロマトグラフィカラムに適用し、脱塩及び所望の緩衝液への置換を行うことができる。必要に応じて、透析、限外ろ過などの公知の方法で溶出液を適宜さらに濃縮することができる。

さらには、本発明の複合体の精製方法は、上記の二段階のカラムクロマトダラフィの代わりに、陽イオン交換体力ラムのみによる一段階の精製であってもよい。例えば、本発明の複合体を含む試料を陽イオン交換カラムに適用し、複合体をカラムに吸着させた後、高塩濃度の緩衝液で溶出するのみでも、充分に未反応ラクトフエリンとの分離が可能である。

このような陽イオン交換体からの溶出において、 P E G化されたラタトフエリンは 0 . 3 M〜0 . 4 5 M) の塩濃度で選択的に溶出されることが見出された。したがって、溶出は、直線的濃度勾配を用いてもステップワイズに溶出してもよい力 S、溶出液としては 0 . 3 M〜0 . 4 5 M の塩濃度を含むような濃度勾配又は溶液を用いる。ステップワイズ塩濃度溶出法は、直線的塩濃度勾配溶出法と比較して簡便であり、大量精製を行う際には極めて有用であると考えられる。したがつて、工業的生産又は大量調製の場合は、ステップワイズ塩濃度溶出法によることが有利である。

本発明の精製法に用いることのできる陽イオン交換体の担体としては、シリカゲルが挙げられる。シリカゲルは、物理的な強度が高い点において工業的生産又は大量調製に好適である。

ラクトフリンは、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用亢進作用、抗ウィルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、杭がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用、脂質代謝改善作用、鎮痛作用、抗ストレス作用などを含む広範な生理活性を有しており、これらの作用によって、生活習慣病（例えば、高コレステロール血症、高脂血症など）、疼痛管理（がん性疼痛、神経因性疼痛など）、膠原病（シェーグレン症候群によるドライアイ及びドライマウス、リウマチ性関節炎など）、歯周病、 C型肝炎などを含む、多くの疾患又は症状の治療（改善を含む）及び予防が可能である。

本発明の複合体は、これらの作用をもたらす鉄結合能、炎症性サイト力イン産生調節能などのラタトフエリンの生物活性を充分に保持しているうえ、細胞毒性を示さないので、治療上不活性な基剤及びノ又は添加物を配合することによって医薬品組成物とすることができる。また、ラクトフエリンは腸管粘膜からとり込まれ、本発明の複合体はペプシン耐性であるので、特に経口投与用の医薬品組成物とすることが有利である。

便宜上、本発明に関して医薬品又は医薬品組成物というときは、投与対象が人の場合のほか、動物である場合（即ち、獣医薬等）も含む。このような医薬品組成物に含有させることができる各種成分及び剤型は当業者には公知である。

本発明の複合体を含む医薬品組成物の有効投与量は、治療又は予防すべき疾患又は症状の種類や程度、投与対象の状態、剤型などによって異なり、公知の有効ラタトフエリン量を目安に適宜選択することができる。一般に、公知の有効ラタトフエリン量と比較して有意に少ない用量（例えばラタトフエリン量換算で 1Z 2〜1/20量）とすることができ、同等の用量で用いるのであれば投与回数を減らすことが可能である。

実施例

1. ゥシラタトフエリン（b LF) の P EG化

1一 1. 試薬

ゥシラタトフエリン (b LF) は、 MG Nutritionals 社製 (オーストラリア）を用いた。 PEG化のターゲットは、 b L Fのリジンの _ε—アミノ基（b L F 1 分子当たり 54個存在する）及び N末端のひ一アミノ基とした。

使用した PEG誘導体は、官能基として N—ヒドロキシサクシンイミド（NH S) 活性化エステルを有する 3種類の直鎖型 P EG誘導体〔以下「PEG— NH S誘導体」という； Sigma 社ヽ「Methoxy polyethvl eneglycol Succinimidy丄 succinate] (MW= 5 kDa) 、日油株式会社、「SUNBRIGHT ME-200TRJ (MW= 20 kDa) 、及ぴ 3油株式会社、「SUNBRIGHT MEGC- 30TS」（匿 = 3 0 kDa) 〕と、官能基にパラ-トロフエ二ル基を有する ²種類の直鎖型 PEG誘導体〔以下「PE G— P N P誘導体」という；日油株式会社、「SUNBRIGHT MENP-50H」（MW= 5 kDa) 及び日油株式会社、「SUNBRIGHT MENP- 30T」（MW= 3 0kDa) 〕とを用いた

1 - 2. P E G— NH S誘導体と b L Fとの反応

δ P B S (pH 7. 4 ) 1 ml に溶解したゥシラタトフエリン（b L f ) 0. 5 mg ( 6. 2 5 M) に対し、以下に示すモル比でタンパク質と P E G— NHS誘導体とを混合し、 2 5 °Cで 1時間カップリング反応を行った。ラタトフエリンの最終濃度は 0. 5mg/ml であり、リジン残基に対する P E G— NH S誘導体のモル比は 1 : 5 ( 1. 6 9mM) 〜： L : l ( 3 3 7. 5 μ Μ) , 及びタンパク質に対す 3 る P E G— NH S誘導体のモル比は 1 : 2 5 ( 1 5 6. 2 5 μΜ) 〜1 : 1 ( 6 . 2 5 μΜ) の範囲で変化させた。カップリング反応の評価は、 S D S— PAG Ε後、クマシ一ブリリアントブルー (CB Β) 染色により行った。

結果を図 2 に示す。パネル Αは、 Sigma 社製 P E G試薬 ·（「 Methoxy polyethyleneglycol Succinimidyl succinate 、 MW= 5 kDa) 、ノネノレ Βίま、曰 5 油株式会社製 P EG試薬（「SUNBRIGHT MEGC- 30TS」、 MW= 3 0 kDa) 、パネル C は、日油株式会社製 P EG試薬（「SUNBRIGHT ME_200TR」、 MW= 2 0 kDa) を用いた場合の、それぞれ結果である。 Sigma 社製「Methoxy polyethyleneglycol Succinimidyl succinate] (パネル A) 及び日油株式会社製「SUNBRIGHT MEGC- 30TS」（パネル B) を用いてカップリング反応を行うと、数個から無数の P EG 〕で修飾されたラタトフエリンが生成する。一方、日油株式会社製「SUNBRIGHT ME-200TR」を用いた場合は、反応性が悪く、クマシ一染色により P EG化ラクトフェリンは確認されなかった（パネル C) 。

したがって、 P EG— NHS誘導体の反応選択性は低く、 NHS活性化エステルを官能基とする直鎖型 P EG試薬では、選択的な P EG化ラタトフエリンの合 5 成は困難であった。

1一 3. P EG— PNP誘導体と b LFとの反応

P EG—PNP誘導体と b L Fとの反応を種々の条件下で検討した。 b L Fの最終濃度を 0. ⁵mg/ml、 b L F： P E G誘導体との混合モル比を 1 ： 5、反応温度を 2 5 °Cとし、反応時間は 1時間又は 24時間、 P E G化反応液の pH を 4 〜9の範囲で変化させて、カップリング反応を行った。使用緩衝液は、 pH4〜5 については酢酸ナトリゥムバッファー、 pH6〜8についてはリン酸バッファー、 pH9はホウ酸バッファ一とした（各緩衝液の最終濃度は 5 OmM とした）。反応後、 7. 5 % S D S— PAGE及び CBB染色により反応生成物を解析した。

P E G試薬として「SUNBRIGHT MENP- 50H」（ 5 kDa) を用いた結果を図 3に、 rSUNBRIGHT MENP- 30T」（ 3 0 kDa) を用いた結果を図 4に、それぞれ示す。反応時間 1時間では、すべての pHでほとんど反応が進んでいないことがわかる。 —方、反応時間 24時間では、「SUNBRIGHT MENP_50H」 ( 5 kDa) 、「SUNBRIGHT MENP-30T」（30kDa) 共に、 pH5の反応において、特に選択的かつ収量の高い PEG化反応が確認された。

なお、以下、「SUNBRIGHT MENP_50H」（ 5 kDa) で P E G化したラタトフエリンを「5 k— P EG—L f 」、「SUNBRIGHT MENP- 30T」（ 30 kDa) で Ρ Ε G化したラタトフエリンを「30 k— PEG— L f 」と呼ぶ。

2. b L Fと P E G試薬との混合モル比、反応時間の検討

5 上記 1一 3. における PEG化反応の最適 pH が 5であることが明らかとなつたので、次に、反応時における b LF ： P EG— PNP誘導体のモル比を 1 ： 1 、 1 : 3、 1 ： 5とし、 ) 1^ の最終濃度を0. 5mg/ml、 5 rag/ml, 1 0 mg/ml とし、さらに反応時間を 24時間、 48時間、 72時間として、 PEG化の最適化条件の検討を行った。なお、「SUNBRIGHT MENP- ⁵0H」（ 5 kDa) を用いた実験

) では 5 OmM 酢酸ナトリウムバッファ一（pH5. 0) 、「SUNBRIGHT MENP-30TJ ( 30 kDa) を用いた実験では 1 OmM酢酸ナトリウムバッファー（pH 5. 0) を、反応液としてそれぞれ使用した。

「SUNBRIGHT MENP- 50H」（ 5 kDa) の結果を図 5、「SUNBRIGHT MENP- 30T」（ 30 kDa) の結果を図 6にそれぞれ示す。 b L Fの最終濃度の検討では、 0. 5

； mg/ml と比較して、 5mg/ml、 10 mg/tnlで収量の高い P E G化産物が得られた。

また、いずれの試薬についても、反応時間 24時間と比較して、 48時間、 7 2 時間で更なる反応の進行が確認できる。しかし、 48時間と 7 2時間とで反応産物を比較すると、反応産物であるバンドの濃さはほぼ同じであることから、 PE G化反応は 48時間までに完了していることが推察された。以上の結果から、最適な P EG化反応の pH以外の条件は、「SUNBRIGHT MENP - 50H」（5kDa) 、「SUNBRIGHT MENP-30TJ ( 30 kDa) ともに、 b LF : P EG 誘導体のモル比が 1 ： 1~1 ： 5、 b LFの最終濃度が 5mg/ml〜： L Omg/ml、反応時間は 24~48時間と考えられる。

3. 5 k— PEG—： L f の精製

陽イオン交換カラム担体（「MacroCap SP」（GEヘルスケア社製））を用いて、 P EG化 b LF反応液中の P EG化ラタトフエリン（5 k— PEG— L f ) を精製した。

b LF 1 5 Orag及び PEG化試薬（SUNBRIGHT MENP-50H) 46. 9mg を、 3 Oral の 5 OmM酢酸ナトリウムバッファー（pH5. 0) 中で 25°C、 48時間反応させた（タンパク質濃度は 5mg/ml、タンパク質と PEG化試薬とのモル比は 1 ： 5) 。この反応液を、 3 ml の MacroCap SP に吸着させて精製した。緩衝液としては 1 0 mM リン酸ナトリゥム緩衝液（pH 7. 6) を使用し、力ラム担体への吸着物の溶出は、 0. 3M、 0. 4M、 0. 45M、 1. 0M N a C 1を含む上記緩衝液を用いた段階的塩濃度勾配溶出法で行った。分取した画分を、 7. 5 % SDS— PAGE後、 C B B染色により確認した。

結果を図 7に示す。 0. 3M、 0. 4M、 0. 4 5M N a C l溶出画分にはP EG化ラタトフエリンのみが精製されたことが確認された。

4. 30 k_P EG— L f の精製

陽イオン交換カラム担体（「MacroCap SPJ (GEヘルスケア社製））を用いて、 P EG化 b L F反応液中の P EG化ラタトフエリン（30 k— PEG— L f ) を精製した。

b L F 200mg 及び PE G化試薬（SUNBRIGHT MENP-30T) 37 5. 2 mg を、 40 ml の 50 mM 酢酸ナトリウムバッファー（pH 5. 0 ) 中で 2 5 °C、 48時間反応させた（タンパク質濃度は 5mg/ml、タンパク質と PEG化試薬とのモル比は 1 ： 5) 。この反応液を、 3 ml の「MacroCap SPJ に吸着させて精製した。緩衝液としては 1 0 mM リン酸ナトリウム緩衝液（_PH7. 6) を使用し、カラム担体への吸着物の溶出は、 0. 4M、 0. 45 M、 1. 0M N a C 1を含む上記緩衝液を用いた段階的塩濃度勾配溶出法で行った。分取した画分を、 7. 5%S DS— PAGE後、 CB B染色により確認した。

結果を図 8に示す。 0. 4M N a C 1溶出画分には P EG化ラタトフエリンのみが精製されたことが確認された。

5. 5 k— PEG— L f 、 30 k— PEG— L f の抗炎症活性（I L一 6産生抑制活性）

b L Fの生理活性の一つに抗炎症作用がある。 b LFは、ヒト単球細胞（TH P— 1) 培養系においてリポポリサッカライド（LP S) のエンドトキシンショックにより産生される I L— 6量を抑制することが報告されている（Mattsby- Baltzer I et al. , Pediatr Res, 40, 257-262 (1996)， Haversen L et al. , Cell Immunol, 220, 83-95 (2002)) 。そこで、上記 3. 及び 4. において作製、精製した 5 K— PEG— L f 及び 30 k-PEG-L f の抗炎症活性を検討した。

R PM I 1 640培地（ 1 0 % F B S、 2 mM グルタマックス（商品名；ィンビトロジェン社製）を添加したもの；以下「培地」と記す）で継代培養を続けている THP— 1細胞を、 5 X 1 0⁴個/ ml の細胞濃度で継代し、 24時間培養した後、ヒト I FN— γ (4 Ong/ml) 及びカルシトリオール ( 20 ng/ml) を添加し、その後さらに 3 7°C、 5 °/₀CO₂で 4 8時間培養した。培養後の細胞を遠心分離で集め、培地で洗浄後、細胞を新鮮な培地に懸濁して 1 X 10⁶細胞 /ml の細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を 24ゥエルプレートに 400 1/well で播き、 3 7°C、 5 %C〇₂下で 1時間静置後、各ゥエルに L P Sのみ（ 1 00 ng/ml) 、 L P S ( 1 00 ng/ml) + b L F ( l 0 0 g/ml) 、 L P S ( 1 00 ng/ml) + 5 K-PEG-L f ( l 0 0 u g/ml) 、 LP S ( 100 ng/ml) + 30 k-P EG-L f ( 1 0 0 u g/ml) のいずれかを添加し、 24時間後に培養上清を回収した。

培養上清中の I L— 6量を、ヒト I L一 6 E L I SA測定キット（縑倉テクノサイエンス（株））をキットの指示書のとおりに用いて測定した。 I L一 6の産生抑制活性は、 L P Sのみを添加した場合に産生される I L一 6量と、 L P S 及び b L F又は P EG化された L Fの共存下で産生された I L一 6量とを比較し、産生が抑制された I L _ 6量から算出した。 b LFの抑制活性を 1 00 %として、 5 K—PEG— L f 及び 3 O k— PEG— L f の相対活性を算出した。

その結果、 5 ー？£0—1^ £は76. 8 ±6. 0% (平均士 SE、 n = 8) 、 30 k— PEG_L f は 1 1 5. 3 ± 3. 2 % (平均土 S E、 n = 6 ) の残存活性を示した。

6. 5 k— PEG— L f 、 30 k _P EG— L f の鉄結合能の測定

ラタトフエリンは分子量 8万の非ヘム性の鉄結合性糖タンパク質で、 Nローブ、 Cローブと呼ばれる二つの領域からなり、炭酸イオン（co₃ ²一）の存在下でタンパク質 1分子当たり 2個の鉄イオン（F e ^{3 +} ) を可逆的にキレート結合する能力を有する〔Anderson， et al. , Nature, 344, 784-78 (1990)〕。ラクトフ ) ェリンの鉄結合能の測定は、以下のように行った。

h o 1 o型ラタトフエリンから鉄イオン（F e ³⁺) を遊離させ、 a p o型ラタトフェリンを調製した。次いで炭酸イオン（C0₃ ²一）存在下で鉄イオン（F e ³⁺) を付加させた鉄再結合ラタトフエリンを調製した。 a p o型及び鉄再結合ラタトフエリンの鉄含量及びタンパク質濃度を測定し、鉄結合量の測定を行つ • た。詳細には、 a p o型ラクトフエリンは、 b L f 、 5∑^—？ £0_ 及び3 O k— PEG— L f を 0. 1M クェン酸緩衝液（pH2. 1) で 24時間、さらに蒸留水で 24時間透析を行うことにより調製した。鉄再結合型ラタトフエリンの調製は、 a p o型ラタトフエリンを、 0. 001 %クェン酸鉄アンモニゥム、 5 0 mM 炭酸ナトリウム及び 50 mM 塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（pH 7. 5 ) で 24時間透析を行った後、過剰の鉄イオンを除去するため、蒸留水、次いで 5 0 mM 塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（pH 7. 5) に対し 24時間透析を行うことにより調製した。

タンパク質に結合している鉄ィォンを比色法で測定するため、血清鉄測定キット「F e C—テストヮコ一」（和光純薬）を用いた。鉄の結合能は Bradford 法で定量したタンパク質 lmg 当たりに結合している鉄の結合量として算出し、未修飾 b L Fの鉄の結合活性を 1 00 %とした場合の相対活性（％) で示した。その結果、 PEG修飾を行った 5 K— PEG—L f の鉄結合活性は 78. 5土 4. 9 % (平均土 SE、 n = 5) 、 30 k— P E G— L f では 6 5. 6 ± 2. 7 % (平均土 S E、 n = 6 ) であった。 7. ペプシン消化に対する耐性の評価

上記 4. の実験で得られた精製 30 k— PEG— L ίを、以下の条件によりぺプシンで消化して、未修飾 b LFの消化と比較検討した。

ペプシン消化は、精製した 50 tg 分の未修飾 b LF、 30 k— PEG— L f の各々に、最終濃度 2 0ng/ml になるようにペプシン（ブタ胃由来、 code No.165- 18713、和光純薬工業（株）製）を加えて、 1 0 mM HC 1中、 3 7°Cで反応させることにより行った。反応開始から 5、 1 0、 1 5、 20、 40、 60 、 100分後に、各タンパク質 5 μ_β 分をピペットでサンプリングして、等量の氷冷した 2 Xサンプルバッファー（100 mM T r i s—HC l (pH 6. 8) 、 4%SDS、 20%グリセロール、色素（B PB) ) と混ぜて酵素反応を停止させた。

結果を図 9及び図 1 0に示す。図 9は、各サンプルを 1 0%SD S— PAGE (非還元）で泳動後、 CBB染色したゲルの写真である。ペプシンでの消化に対して、未修飾 b LFは速やかに低分子化されたのに対して、 30 k— PEG— L f の消化は限定的であった。このことより、 PEG化された LFは、未修飾の b L Fと比較して、ペプシンの作用を受けにくいことが分かる。

図 1 0は、インタタトな 30 k— PEG— L f の経時的な分解を半定量的に示すために、図 9で示した泳動像をスキャナーで取り込み、バンドの濃さを「NIH imagej ソフトウェアで解析した結果である。縦軸は、各時間におけるバンドの濃さを示しており、時間 0分時の濃さを 1 00%とする相対値である。横軸は、各酵素での処理時間である。ペプシンによる 30 k— PEG— L f の分解は未修飾 b L Fの分解と比較して緩やかな傾向を示した。以上の結果から、 3 0 k— P £0— £は、未修飾の b L Fと比較して、ペプシンの作用を受けにくくなつていることが分かる。

この出願は、平成 20年 3月 1 4日出願の曰本特許出願、特願 200 8— 06 662 6に基づくものであり、特願 2008— 066 626の明細書及ぴ特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。

Claims

請求の範囲

1. 直鎖型ポリエチレングリコール（PEG) 又はその修飾物とラクトフエリンとがアミド結合により共有結合されている PEG化ラタトフエリン複合体の製造方法であって、ラタトフエリンとパラニトロフエ二ル基を有する直鎖型 PEG誘導体とを含む反応液を、上記パラ-トロフエニル基とラタトフエリンとの間でァミド基が形成される条件下で反応させる工程を含むことを特徴とする方法。

2. 上記反応工程が、 pH4〜5. 5の条件下で行われる、請求項 1記載の方法。

3. 上記反応工程が、ラタトフエリン：直鎮型 P EG誘導体のモル比が 1 ： 1〜 ) 1 : 5、ラタトフエリンの最終濃度が 5mg/ml〜 1 Otng/tnl、反応時間が 24〜 4

8時間の条件下で行われる、請求項 1又は 2記載の方法。

4. 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の方法により製造された、直鎮型ポリェチレンダリコール（P EG) 又はその修飾物とラタトフエリンとがアミド結合により共有結合されていることを特徴とする PEG化ラクトフエリン複合体。

5. 請求項 4記載の PEG化ラタトフエリン複合体及び治療上不活性な基剤及び

/又は添加物を含む医薬品組成物。

6. 経口投与用である、請求項 5記載の医薬品組成物。