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CN104487095B - 用于肟键联的亲核性催化剂 - Google Patents

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CN104487095B CN201380037823.5A CN201380037823A CN104487095B CN 104487095 B CN104487095 B CN 104487095B CN 201380037823 A CN201380037823 A CN 201380037823A CN 104487095 B CN104487095 B CN 104487095B
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Abstract

本发明涉及用于使水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分缀合的材料和方法，所述方法包括在允许缀合的条件下使所述氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物接触。更具体地说，本发明涉及上述材料和方法，其中所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟或腙键联，并且其中所述缀合在亲核性催化剂存在下进行。

Description

用于肟键联的亲核性催化剂
发明领域
本发明涉及用于使水溶性聚合物与蛋白质缀合的材料和方法。
发明背景
通过在水溶性聚合物与治疗性蛋白质之间形成共价键联来制备缀合物可通过多种化学方法进行。多肽药物的聚乙二醇化在循环中对其进行保护并且改良其药效学和药物动力学特征(Harris和Chess，Nat Rev Drug Discov.2003；2：214-21)。聚乙二醇化过程将乙二醇的重复单元(聚乙二醇(PEG))连接至多肽药物。PEG分子具有大的流体动力学体积(为球状蛋白质大小的5-10倍)，水溶性高并且可被水合，无毒，非免疫原性并且自身体快速清除。分子的聚乙二醇化可使得药物对酶降解的抗性增加，体内半衰期延长，给药频率降低，免疫原性降低，物理和热稳定性增加，溶解性增加，液体稳定性增加和聚集减少。第一个聚乙二醇化药物由FDA在二十世纪九十年代早期批准。自此以后，FDA已批准若干种聚乙二醇化药物用于口服、注射和局部施用。
聚唾液酸(PSA)也称为聚乙酰神经氨酸(colominic acid，CA)，为天然产生的多糖。其为具有α(2→8)酮苷键的N-乙酰基神经氨酸的均聚物，并且在其非还原末端含有邻位二醇基。其带负电荷并且为人体的天然成分。其可以容易地由细菌大量地以预定物理特征产生(美国专利号5,846,951)。因为细菌产生的PSA在化学上和在免疫学上与在人体中产生的PSA相同，因此细菌PSA不具免疫原性，甚至在偶合至蛋白质时也是如此。不同于一些聚合物，PSA酸可生物降解。聚乙酰神经氨酸与过氧化氢酶(catalase)和天冬酰胺酶(asparaginase)的共价偶合已显示会增强在蛋白水解酶或血浆存在下的酶稳定性。与聚唾液酸化和未修饰天冬酰胺酶的体内比较研究揭示，聚唾液酸化增加酶的半衰期(Fernandes和Gregoriadis，Int J Pharm.2001；217：215-24)。
PEG-衍生物与肽或蛋白质的偶合由Roberts等(Adv Drug Deliv Rev 2002；54：459-76)综述。一种用于偶合水溶性聚合物与治疗性蛋白质的方法为通过蛋白质的碳水化合物部分来缀合聚合物。蛋白质中碳水化合物的邻位羟基(OH)可容易地用高碘酸钠(NaIO4)氧化形成活性醛基(Rothfus et Smith，J Biol Chem 1963；238：1402-10；vanLenten et Ashwell，J Biol Chem 1971；246：1889-94)。随后可以通过使用含有例如活性酰肼基的试剂将聚合物偶合至碳水化合物的醛基(Wilchek M和Bayer EA，MethodsEnzymol 1987；138：429-42)。最近的技术为使用含有氨氧基的试剂，所述氨氧基与醛反应形成肟键联(WO 96/40662、WO2008/025856)。
描述水溶性聚合物与治疗性蛋白质的缀合的其它实例描述于以下文献中：WO 06/071801，其教导氧化冯威里氏因子(Von Willebrand factor)中的碳水化合物部分并随后使用酰肼化学反应与PEG偶合；美国公布号2009/0076237，其教导氧化rFVIII并随后使用酰肼化学反应与PEG和其它水溶性聚合物(例如PSA、HES、葡聚糖)偶合；WO 2008/025856，其教导氧化不同凝血因子(例如rFIX、FVIII和FVIIa)并随后使用氨氧基化学反应通过形成肟键联而与例如PEG偶合；和美国专利号5,621,039，其教导氧化FIX并随后使用酰肼化学反应与PEG偶合。
最近描述了一种改进的方法，其包括唾液酸的温和高碘酸盐氧化以生成醛，随后在催化量苯胺的存在下与含有氨氧基的试剂反应(Dirksen A.和Dawson PE，BioconjugateChem.2008；19，2543-8；和Zeng Y等，Nature Methods 2009；6：207-9)。苯胺催化显著加速肟连接，从而允许使用极低浓度的试剂。亲核性催化剂的使用还描述于以下文献中：Dirksen，A.等，J Am Chem Soc.，128：15602-3(2006)；Dirksen，A.等，Angew chem.国际版，45：7581-4(2006)；Kohler，J.J.，ChemBioChem.，10：2147-50(2009)；Giuseppone，N.等，JAm Chem Soc.，127：5528-39(2005)；和Thygesen，M.B.等，J Org Chem.，75：1752-5(2010)。
尽管苯胺催化可加速肟连接，从而允许短反应时间和使用低浓度的氨氧基试剂，但苯胺具有毒性，当例如缀合的治疗性蛋白质形成药物基础时，此必须加以考虑。例如，已显示苯胺诱发高铁血红蛋白血症(Harrison，J.H..和Jollow，D.J.，MolecularPharmacology，32(3)423-431，1987)。已显示对大鼠进行长期膳食处理会诱发脾肿瘤(Goodman，DG.等，J Natl Cancer Inst.，73(1)：265-73，1984)。体外研究还已显示苯胺具有诱发染色体突变的可能性并且具有可能的基因毒性活性(Bombhard E.M.et Herbold B，Critical Reviews in Toxicology35，783-835，2005)。
仍然存在对用于将水溶性聚合物与蛋白质缀合的材料和方法的需要，所述缀合改善所述蛋白质的药效学和/或药物动力学性质，同时最小化与各种试剂相关的成本并且最小化对人类接受者的健康风险。
发明概述
本发明提供用于使聚合物与蛋白质缀合的材料和方法，其改进所述蛋白质的药效学和/或药物动力学性质，同时使与各种试剂相关的成本和当由亲核性催化剂催化缀合反应时患者接受者的健康风险降至最小。在本发明的各种实施方案中，提供取代苯胺的替代性催化剂。
本公开还提供用于制备各种水溶性聚合物-氨氧基接头试剂的优化程序，所述接头试剂可用于缀合如本文所述的治疗性蛋白质。最近的NMR研究显示如果在室温下进行PSA-氨氧基试剂的制备，则可能在PSA的还原端发生副反应。因此，在本公开的各种实施方案中，在2℃-8℃之间的温度下进行新的方法。在一个实施方案中，根据本发明的方法在4℃下制备PSA-氨氧基试剂。此外，本发明还涵盖在2℃-8℃之间的温度下使用色谱纯化步骤(例如IEX)对所述试剂的纯化。当在2℃-8℃之间的温度下进行整个方法(化学反应和通过IEX对缀合物的纯化)时，在PSA的还原端处的不想要副反应得到实质性减少。
在根据本公开的一个实施方案中，提供了将水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分缀合的方法，其包括使氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物在允许缀合的条件下接触；所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、支链PEG、(Warwick Effect Polymers；Coventry，UK)、聚唾液酸(PSA)、淀粉、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基磷酸铵(MPC)；其中含有活性氨氧基的水溶性聚合物通过包括以下的方法制备：a)在允许在氧化型水溶性聚合物与活化的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含氧化型水溶性聚合物的溶液与包含活性氨氧基的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含介于约1分钟与约24小时之间的时段；介于约2℃与约8℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；从而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和b)在介于约2℃与约8℃之间的温度下，通过选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组的方法来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；所述碳水化合物部分通过与包含选自由以下组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而氧化：高碘酸钠(NaIO4)、四乙酸铅(Pb(OAc)4)和高钌酸钾(KRuO4)；其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟键联；并且其中所述肟键联形成由选自由以下组成的组的亲核性催化剂催化：邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含氧化型水溶性聚合物的溶液和包含活性氨氧基的氨氧基接头在4℃下孵育1小时。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中通过在4℃温度下的阴离子交换色谱来纯化含有活性氨氧基的水溶性聚合物。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中氧化型水溶性聚合物为PSA并且通过与NaIO4一起孵育进行氧化。
在本公开的另一个实施方案中，提供了将水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分缀合的方法，其包括使氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物在允许缀合的条件下接触；所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、支链PEG、(Warwick Effect Polymers；Coventry，UK)、聚唾液酸(PSA)、淀粉、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基磷酸铵(MPC)；其中含有活性氨氧基的水溶性聚合物通过包括以下的方法制备：a)在允许在水溶性聚合物与活化的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含水溶性聚合物的溶液与包含活性氨氧基的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含介于约1分钟与约24小时之间的时段；介于约22℃与约37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；从而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和b)通过选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组的方法来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；所述碳水化合物部分通过与包含选自由以下组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而氧化：高碘酸钠(NaIO4)、四乙酸铅(Pb(OAc)4)和高钌酸钾(KRuO4)；其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟键联；并且其中所述肟键联形成由选自由以下组成的组的亲核性催化剂催化：邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含水溶性聚合物的溶液和包含活性氨氧基的氨氧基接头在22℃下孵育2小时。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含水溶性聚合物的溶液和包含活性氨氧基的氨氧基接头在22℃下孵育2小时；所述方法还包括将溶液的温度增加到介于约32℃与约37℃之间的温度并孵育另外12-24小时的步骤。在另一个实施方案中，提供上述方法，其包括就在增加温度之前添加另外量的包含活性氨氧基的氨氧基接头的另外步骤。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中在22℃温度下通过选自由透析、超滤/渗滤(UF/DF)和色谱组成的组的方法纯化含有活性氨氧基的水溶性聚合物。在另一个实施方案中，提供上述方法，其进一步包括在4℃下通过选自由透析、UF/DF或色谱组成的组的方法纯化含有活性氨氧基的水溶性聚合物的步骤。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗性蛋白质是选自由以下组成的组：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干扰素-α(IFN-α)、复合干扰素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管生成素样多肽1(ANGPTL1)、血管生成素样多肽2(ANGPTL2)、血管生成素样多肽3(ANGPTL3)、血管生成素样多肽4(ANGPTL4)、血管生成素样多肽5(ANGPTL5)、血管生成素样多肽6(ANGPTL6)、血管生成素样多肽7(ANGPTL7)、玻粘蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型态发生蛋白-1、骨型态发生蛋白-2、骨型态发生蛋白-3、骨型态发生蛋白-4、骨型态发生蛋白-5、骨型态发生蛋白-6、骨型态发生蛋白-7、骨型态发生蛋白-8、骨型态发生蛋白-9、骨型态发生蛋白-10、骨型态发生蛋白-11、骨型态发生蛋白-12、骨型态发生蛋白-13、骨型态发生蛋白-14、骨型态发生蛋白-15、骨型态发生蛋白受体IA、骨型态发生蛋白受体IB、骨型态发生蛋白受体II、脑源性神经营养因子、心脏营养素-1、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、畸胎癌源性生长因子、潜伏蛋白、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、表皮素、表皮调节素、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、肝细胞瘤源性生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生成素、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子受体α、血小板源性生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子(SCF)、干细胞因子受体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜伏转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰岛素、植物凝集素蓖麻毒素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲状腺素、组织纤溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黄体化激素、雌激素、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、修美乐(Humira)(阿达木单抗(adalimumab))、普罗利亚(Prolia)(迪诺赛单抗(denosumab))、恩利(Enbrel)(依那西普(etanercept))、表1中的蛋白质、或其生物活性片段、衍生物或变体。
在又一实施方案中，提供上述方法，其中在与活化的水溶性聚合物接触之前，包含初始浓度介于约0.3mg/ml与约3.0mg/ml之间的治疗性蛋白质的溶液被调整至介于约5.0与约8.0之间的pH值。在一个实施方案中，治疗性蛋白质的初始浓度为约1.0mg/ml并且pH为约6.0。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗性蛋白质接触期望的过量浓度的活化的水溶性聚合物，其中所述过量浓度介于约1摩尔浓度与约300摩尔浓度过量之间。在一个实施方案中，过量浓度为约50倍摩尔浓度过量。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗性蛋白质在包含以下的条件下与活化的水溶性聚合物一起孵育：介于约0.5小时与约24小时之间的时段；介于约2℃与约37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。在一个实施方案中，所述条件包含约120分钟的时段、约22℃的温度、不存在光；和在搅拌下。
在另一个实施方案中，提供一种上述方法，其中亲核性催化剂在包含以下的条件下以使得亲核性催化剂的最终浓度介于约1.0mM与约50mM之间的量添加：介于约0.1分钟与约30分钟之间的时段；介于约2℃与约37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。在一个实施方案中，亲核性催化剂的最终浓度为约10mM，并且所述条件包含至多约15分钟的时段、约22℃的温度、不存在光；和在搅拌下。
在又一实施方案中，提供上述方法，其中氧化剂在包含以下的条件下以使得氧化剂的最终浓度介于约50μM与约1000μM之间的量添加：介于约0.1分钟与120分钟之间的时段；介于约2℃与约37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。在一个实施方案中，氧化剂的最终浓度为约400μM，并且所述条件包含约10分钟的时段、约22℃的温度、不存在光和在搅拌下。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分的缀合通过添加选自由以下组成的组的淬灭剂而终止：L-半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、偏亚硫酸氢钠(Na2S2O5)、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或其衍生物、甲酚、咪唑和其组合；其中所述淬灭剂在包含以下的条件下以使得淬灭剂的最终浓度介于约1mM与约100mM之间的量添加：介于约5分钟与约120分钟之间的时段；介于约2℃与约37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。在一个实施方案中，淬灭剂为L-半胱氨酸。在又一实施方案中，L-半胱氨酸添加成使得最终浓度为约10mM并且所述条件包含约60分钟的时段、约22℃的温度、不存在光和在搅拌下。
在另一个实施方案中，提供一种上述方法，其包括：a)第一步骤，其包括将包含治疗性蛋白质的溶液的pH值调整至介于约5.0与约8.0之间的pH值，其中治疗性蛋白质浓度介于约0.3mg/ml与约3.0mg/ml之间；b)第二步骤，其包括氧化治疗性蛋白质上的一个或多个碳水化合物，其中氧化剂在包含以下的条件下添加至所述第一步骤中的溶液中以使得最终浓度介于约50μM与约1000μM之间：介于约0.1分钟与约120分钟之间的时段；介于约2℃与约37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；c)第三步骤，其包括在包含以下的条件下使治疗性蛋白质与期望的过量浓度的活化的水溶性聚合物接触，其中所述过量浓度介于约1摩尔浓度过量与约300摩尔浓度过量之间：介于约0.5小时与约24小时之间的时段；介于约2℃与约37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；d)第四步骤，其包括将亲核性催化剂添加至所述第三步骤的溶液中，其中所述亲核性催化剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度介于约1mM与约50mM之间：介于约0.1分钟与约30分钟之间的时段；介于约2℃与约37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；e)第五步骤，其中治疗性蛋白质在允许活化的水溶性聚合物与治疗性蛋白质上的一个或多个氧化型碳水化合物缀合的条件下与活化的水溶性聚合物和亲核性催化剂一起孵育，所述条件包含介于约0.5小时与约24小时之间的时段、介于约2℃与约37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；和f)第六步骤，其中所述第五步骤中水溶性聚合物与治疗性蛋白质的一个或多个氧化型碳水化合物的缀合通过添加选自由以下组成的组的淬灭剂而终止：L-半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、Na2S2O5(偏亚硫酸氢钠)、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或其衍生物、甲酚、咪唑和其组合；其中所述淬灭剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度为约1mM和约100mM：介于约5分钟与约120分钟之间的时段；介于约2℃与约37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。在另一个实施方案中，第一步骤中治疗性蛋白质的初始浓度为约1mg/ml并且pH为约6.0；其中第二步骤中氧化剂的最终浓度为约400μM，并且第五步骤中的条件包含约10分钟的时段、约22℃的温度、不存在光和在搅拌下；其中第三步骤中的过量浓度为约50摩尔浓度过量；其中第三步骤中的条件包含约15分钟的时段、约22℃的温度、不存在光和在搅拌下；其中第四步骤中亲核性催化剂的最终浓度为约10mM，并且第四步骤中的条件包含约15分钟的时段、约22℃的温度、不存在光和在搅拌下；其中第五步骤中将治疗性蛋白质与活化的水溶性聚合物和亲核性催化剂一起孵育的条件包含约2小时的时段；约22℃的温度；不存在光；和在搅拌下；并且其中第六步骤中的淬灭剂为L-半胱氨酸；并且其中L-半胱氨酸添加成使得最终浓度为约10mM并且第六步骤中的条件包含约60分钟的时段、约22℃的温度、不存在光和在搅拌下。在又一实施方案中，水溶性聚合物为PSA。在一个实施方案中，水溶性聚合物为PEG。在另一个实施方案中，水溶性聚合物为HES。在又一实施方案中，水溶性聚合物为HAS。在另一个实施方案中，PSA由约10-300个唾液酸单元构成。在另一个实施方案中，治疗性蛋白质为FIX。在另一个实施方案中，治疗性蛋白质为FVIIa。在另一个实施方案中，治疗性蛋白质为FVIII。
在另一个实施方案中，提供一种上述方法，其中氧化剂为高碘酸钠(NaIO4)。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分位于凝血蛋白的活化肽中。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中PSA包含选自由以下组成的组的活化的氨氧基接头：a)下式的3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺接头：
b)下式的3，6，9-三氧杂-十一烷-1，11-二氧基胺接头：
以及
c)下式的3，6，9，12，15-五氧杂-十七烷-1，17-二氧基胺接头：
其中所述PSA通过与氧化剂一起孵育而氧化以在所述PSA的非还原端形成末端醛基。
在另一个实施方案中，氨氧基接头为3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中所述亲核性催化剂以介于约1mM与约50mM之间的浓度提供。在另一个实施方案中，亲核性催化剂为间甲苯胺。在又一实施方案中，间甲苯胺以约10mM的浓度存在于缀合反应中。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其还包括纯化缀合的治疗性蛋白质的步骤。在一个实施方案中，缀合的治疗性蛋白质通过选自由色谱、过滤和沉淀组成的组的方法来纯化。在另一个实施方案中，所述色谱选自由以下组成的组：疏水性相互作用色谱(Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC)、离子交换色谱(Ion Exchangechromatography，IEC)、尺寸排阻色谱(Size exclusion chromatography，SEC)、亲和色谱和反相色谱。在一个实施方案中，于色谱加载步骤和色谱洗涤步骤中使用抗离液盐。在另一个实施方案中，所述色谱在柱中进行。在一个实施方案中，柱包含选自由苯基-琼脂糖FF和丁基-琼脂糖FF组成的组的色谱树脂。在另一个实施方案中，所述树脂以介于约5cm与约20cm之间的床高度存在于柱中。
在另一个实施方案中，床高度为约10cm。在另一个实施方案中，提供一种上述方法，其包括一个或多个洗涤步骤，其中流动方向设定为向上流动并且其中流速介于约0.2cm/min与约6.7cm/min之间。在一个实施方案中，流速为约2cm/min。在另一个实施方案中，提供上述方法，其包括一个或多个洗脱步骤，其中流动方向设定为向下流动并且其中流速介于约0.1cm/min与约6.7cm/min之间。在一个实施方案中，流速为约1cm/min。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其还包括通过超滤/渗滤(UF/DF)浓缩缀合的治疗性蛋白质。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗性蛋白质的最终浓度介于约0.5mg/ml与约3mg/ml之间。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗性蛋白质包含约5个至约11个水溶性聚合物部分。
在又一实施方案中，提供上述方法，其中缀合的治疗性蛋白质使用色谱纯化；其中于加载步骤和洗涤步骤使用抗离液盐；所述方法包括一个或多个洗涤步骤，其中流动方向设定为向上流动并且其中流速介于约0.2cm/min与约6.7cm/min之间；和一个或多个洗脱步骤，其中流动方向设定为向下流动并且其中流速介于约0.2cm/min与约6.7cm/min之间；所述方法还包括通过超滤/渗滤(UF/DF)浓缩缀合的治疗性蛋白质。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中所述色谱为疏水性相互作用色谱(HIC)；其中所述一个或多个洗涤步骤流速为约2cm/min；并且其中所述一个或多个洗脱步骤流速为约1cm/min。
本公开还提供通过一种上述方法产生的修饰的治疗性蛋白质。
在本公开的一个实施方案中，提供一种制备含有活性氨氧基的水溶性聚合物的方法，其包括：a)在允许在氧化型水溶性聚合物与活化的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含氧化型水溶性聚合物的溶液与包含活性氨氧基的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含介于约1分钟与约24小时之间的时段；介于约2℃与约8℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；从而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和b)在介于约2℃与约8℃之间的温度下，通过选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组的方法来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；所述水溶性聚合物选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、支链PEG、(Warwick Effect Polymers；Coventry，UK)、聚唾液酸(PSA)、淀粉、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基磷酸铵(MPC)；从而在水溶性聚合物与氨氧基接头之间形成肟键联。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中通过亲核性催化剂催化肟键联的形成，所述亲核性催化剂选自由以下组成的组：邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中水溶性聚合物为PSA。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中水溶性聚合物为PEG。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含氧化型水溶性聚合物的溶液和包含活性氨氧基的氨氧基接头在4℃下孵育1小时。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中通过在4℃温度下的阴离子交换色谱来纯化含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
在本公开的又一个实施方案中，提供一种制备含有活性氨氧基的水溶性聚合物的方法，其包括：a)在允许在水溶性聚合物与活化的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含水溶性聚合物的溶液与包含活性氨氧基的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含介于约1分钟与约24小时之间的时段；介于约22℃与约37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；从而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和b)通过选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组的方法来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物，从而在水溶性聚合物与氨氧基接头之间形成肟键联。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中通过亲核性催化剂催化所述肟键联的形成，所述亲核性催化剂选自由以下组成的组：邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含水溶性聚合物的溶液和包含活性氨氧基的氨氧基接头在22℃下孵育2小时。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含水溶性聚合物的溶液和包含活性氨氧基的氨氧基接头在22℃下孵育2小时；所述方法还包括将溶液的温度增加到介于约32℃与约37℃之间的温度并孵育另外12-24小时的步骤。在另一个实施方案中，提供上述方法，其包括就在增加温度之前添加另外量的包含活性氨氧基的氨氧基接头的另外步骤。
在另一个实施方案中，提供上述方法，其中在22℃温度下通过选自由透析、超滤/渗滤(UF/DF)和色谱组成的组的方法纯化含有活性氨氧基的水溶性聚合物。在另一个实施方案中，提供上述方法，其还包括在4℃下通过选自由透析、UF/DF或色谱组成的组的方法纯化含有活性氨氧基的水溶性聚合物的步骤。
在本公开的又一个实施方案中，提供一种制备PSA-氨氧基试剂氨氧基的方法，其包括：a)在允许在氧化型PSA与活化的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含氧化型PSA的溶液与包含活性氨氧基的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含1小时的时段；4℃的温度；在光不存在下，和在搅拌下；从而形成含有活性氨氧基的PSA；和b)在4℃的温度下通过阴离子交换色谱纯化所述含有活性氨氧基的PSA；所述活化的氨氧基接头为下式的3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺接头：
从而在PSA与氨氧基接头之间形成肟键联。
在本公开的又一个实施方案中，提供一种制备PSA-氨氧基试剂氨氧基的方法，其包括：a)在允许在非氧化型PSA与活化的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含非氧化型PSA的溶液与包含活性氨氧基的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含2小时的时段；22℃的温度；在光不存在下，和在搅拌下；从而形成含有活性氨氧基的PSA；和b)在22℃的温度下通过透析纯化所述含有活性氨氧基的PSA；所述活化的氨氧基接头为下式的3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺接头：
从而在非氧化型PSA与氨氧基接头之间形成肟键联。
在本公开的又一个实施方案中，提供一种将水溶性聚合物与凝血蛋白的氧化型碳水化合物部分缀合的方法，其包括在允许缀合的条件下使所述氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物接触；所述凝血蛋白选自由以下组成的组：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)和ADAMTS 13蛋白酶或其生物活性片段、衍生物或变体；所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、支链PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、普鲁兰糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基磷酸铵(MPC)；并且所述碳水化合物部分通过与包含选自由以下组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而氧化：高碘酸钠(NaIO4)、四乙酸铅(Pb(OAc)4)和高钌酸钾(KRuO4)；其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟键联。
附图
图1示出凝血因子IX(SEQ ID NO：1)的一级结构。
图2示出氧化型rFIX与氨氧基-PSA的偶合。
图3示出水溶性二氨氧基接头3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺和3，6，9-三氧杂-十一烷-1，11-二氧基胺的合成。
图4示出氨氧基-PSA的制备。
图5示出通过SDS PAGE观测在不同催化剂存在下制备的PSA-FIX缀合物。a)使用不同浓度比较苯胺与间甲苯胺；b)比较苯胺与邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯甲酰胺和对氨基苯磺酸；c)比较苯胺和间甲苯胺与邻茴香胺和间茴香胺。
图6示出使用各种亲核性催化剂达成的聚唾液酸化的百分比。
发明详述
治疗性蛋白质的药理学和免疫学性质可通过化学修饰和与诸如以下等聚合化合物缀合来改进：聚乙二醇(PEG)、支链PEG、聚唾液酸(PSA)、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基磷酸铵(MPC)。所得缀合物的性质一般高度取决于聚合物的结构和大小。因此，具有规定的狭窄大小分布的聚合物通常在所属领域中为优选的。如PEG等合成聚合物可被容易地制造成具有狭窄的大小分布，而PSA可以产生具有狭窄的大小分布的最终PSA制剂的方式纯化。另外，具有规定聚合物链和狭窄的大小分布的聚乙二醇化试剂可在市场上以合理价格商购获得。
添加可溶性聚合物(诸如经由聚唾液酸化)为一种改进治疗性蛋白质的性质的方法，所述治疗性蛋白质诸如凝血蛋白FIX以及其它凝血蛋白(例如VWF、FVIIa(参见例如US2008/0221032A1，所述文献以引用的方式并入本文)和FVIII)。
治疗性蛋白质
在本发明的某些实施方案中，前述多肽和多核苷酸由以下治疗性蛋白质示例：酶、抗原、抗体、受体、凝血蛋白、生长因子、激素和配体。在某些实施方案中，治疗性蛋白质为凝血蛋白，诸如因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)或ADAMTS 13蛋白酶。在一个实施方案中，本发明的治疗性蛋白质为糖蛋白，或在各种实施方案中为未在体内天然糖基化的蛋白质(即不含天然糖基化位点的蛋白质或在纯化之前未在宿主细胞中糖基化的蛋白质)。
在某些实施方案中，治疗性蛋白质为免疫球蛋白、细胞因子，如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干扰素-α(IFN-α)、复合干扰素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、血管生成素，例如Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、人血管生成素样多肽ANGPTL1至7、玻粘蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型态发生蛋白-1、骨型态发生蛋白-2、骨型态发生蛋白-3、骨型态发生蛋白-4、骨型态发生蛋白-5、骨型态发生蛋白-6、骨型态发生蛋白-7、骨型态发生蛋白-8、骨型态发生蛋白-9、骨型态发生蛋白-10、骨型态发生蛋白-11、骨型态发生蛋白-12、骨型态发生蛋白-13、骨型态发生蛋白-14、骨型态发生蛋白-15、骨型态发生蛋白受体IA、骨型态发生蛋白受体IB、骨型态发生蛋白受体II、脑源性神经营养因子、心脏营养素-1、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、畸胎癌源性生长因子、潜伏蛋白、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、表皮素、表皮调节素、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、肝细胞瘤源性生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生成素、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子受体α、血小板源性生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子(SCF)、干细胞因子受体、TNF(包括TNF0、TNF1、TNF2)、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜伏转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体、血管内皮生长因子和嵌合蛋白和其生物活性或免疫学活性片段。
在某些实施方案中，治疗性蛋白质为α-干扰素、β-干扰素和γ-干扰素、集落刺激因子(包括粒细胞集落刺激因子)、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰岛素、植物蛋白质(诸如凝集素和蓖麻毒素)、肿瘤坏死因子和相关等位基因、可溶形式的肿瘤坏死因子受体、白细胞介素受体和可溶形式的白细胞介素受体、生长因子(诸如组织生长因子，诸如TGFα或TGFβ和表皮生长因子)、激素、促生长因子、色素激素、下视丘释放因子、抗利尿素、泌乳素、绒毛膜促性腺素、卵泡刺激素、甲状腺刺激素、组织纤溶酶原活化因子和免疫球蛋白(诸如IgG、IgE、IgM、IgA和IgD)、半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黄体生成激素、雌激素、皮质类固醇、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、DNA酶、整合素、凝血酶、造血生长因子、瘦素、糖苷酶、修美乐(阿达木单抗)、普罗利亚(地诺单抗)、恩利(依那西普)和其片段，或包含任何以上所述的蛋白质或其片段的任何融合蛋白。除前述蛋白质外，下表1也提供本发明所涵盖的治疗性蛋白质：
本文提供的治疗性蛋白质不应视为排外的。相反，如自本文所提供的公开内容显而易见，本发明的方法适用于根据本发明希望连接水溶性聚合物的任何蛋白质。例如，治疗性蛋白质描述于US 2007/0026485中，所述文献以引用的方式整体并入本文。
凝血蛋白
在一个方面中，本发明的起始材料为凝血蛋白，其可以来源于人血浆，或通过重组工程改造技术产生，如以下专利中所述：美国专利号4,757,006；美国专利号5,733,873；美国专利号5,198,349；美国专利号5,250,421；美国专利号5,919,766；和EP 306 968。
诸如包括以下的凝血蛋白等治疗性多肽由蛋白水解酶快速降解并且被抗体中和：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)和ADAMTS 13蛋白酶。这种现象缩短其半衰期和循环时间，由此限制其治疗效果。相对较高的剂量和频繁施用为达到和维持这些治疗凝血蛋白的所要治疗或预防作用所必需。因此，难以获得充分的剂量调节并且需要频繁静脉内施用对患者的生活方式造成限制。
如本文所述，本发明涵盖包括(但不限于)以下的凝血蛋白：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)和ADAMTS 13蛋白酶。如本文中所使用，术语“凝血蛋白(blood coagulation protein)”指任何因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)和ADAMTS 13蛋白酶，其展现与特定天然凝血蛋白相关的生物活性。
凝血级联分为三个不同区段：内源性、外源性和共同途径(Schenone等，Curr OpinHematol.2004；11：272-7)。所述级联涉及一系列丝氨酸蛋白酶(酶原)和蛋白质辅因子。需要时，非活性酶原前驱体转化为活性形式，其随后转化级联中的下一个酶。
内源性途径需要凝血因子VIII、IX、X、XI和XII。内源性途径的起始发生于前激肽释放素、高分子量激肽原、因子XI(FXI)和因子XII(FXII)暴露于带负电荷的表面时。也需要由血小板分泌的钙离子和磷脂。
外源性途径在血管的血管内腔受到损伤时起始。膜糖蛋白组织因子暴露并且接着结合于循环的因子VII(FVII)和少量已经存在的其活化形式FVIIa。此结合促进FVII完全转化为FVIIa并且随后在钙和磷脂存在下促进因子IX(FIX)转化为因子IXa(FIXa)和因子X(FX)转化为因子Xa(FXa)。FVIIa与组织因子的缔合通过使FVII的底物(FIX和FX)结合位点更接近和通过诱导构象变化而增强蛋白水解活性，所述构象变化增强FVIIa的酶促活性。
FX的活化为所述两条途径的共同点。因子Va(FVa)和Xa与磷脂和钙一起将凝血酶原转化为凝血酶(凝血酶原酶复合物)，凝血酶接着裂解纤维蛋白原形成纤维蛋白单体。所述单体聚合形成纤维蛋白股束。因子XIIIa(FXIIIa)使这些股束彼此共价键结形成刚性网状物。
FVII转化为FVIIa也由多种蛋白酶催化，所述蛋白酶包括凝血酶、FIXa、FXa、因子XIa(FXIa)和因子XIIa(FXIIa)。为抑制所述级联的早期，组织因子途径抑制剂靶向FVIIa/组织因子/FXa产物复合物。
因子VIIa
FVII(也称为稳定因子或前转化素(proconVertin))为维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶糖蛋白，其在止血和凝血中具有关键作用(Eigenbrot，Curr Protein Pept Sci.2002；3：287-99)。
FVII在肝脏中合成并且分泌为48kD单链糖蛋白。FVII与所有维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶糖蛋白共享由以下组成的类似蛋白质结构域结构：负责蛋白质与脂质膜相互作用的具有9-12个残基的氨基端γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域、羧基端丝氨酸蛋白酶结构域(催化结构域)和两个含有介导与组织因子的相互作用的钙离子结合位点的表皮生长因子样结构域。γ-谷氨酰基羧化酶催化分子的氨基端部分中Gla残基的羧化。羧化酶依赖于维生素K的还原形式以便发挥其作用，维生素K被氧化为环氧化物形式。需要维生素K环氧化物还原酶来将维生素K的环氧化物形式再转化为还原形式。
大部分FVII在血浆中以酶原形式循环并且此形式的活化导致精氨酸152与异亮氨酸153之间的肽键裂解。所产生的活化型FVIIa由NH2来源的轻链(20kD)与COOH端来源的重链(30kD)通过单个二硫键(Cys 135至Cys 262)连接而组成。轻链含有膜结合Gla结构域，而重链含有催化结构域。
FVII的血浆浓度由遗传和环境因素决定，为约0.5mg/mL(Pinotti等，Blood.2000；95：3423-8)。不同FVII基因型可以导致平均FVII水平产生若干倍的差异。血浆FVII水平在健康女性中在怀孕期间升高，并且也随年龄而增加，并且在女性和患有高甘油三酯血症的人中较高。在所有促凝血因子中FVII具有最短的半衰期(3-6小时)。FVIIa的平均血浆浓度在健康个体中为3.6ng/mL，并且FVIIa的循环半衰期与其它凝血因子相比相对较长(2.5小时)。
遗传性FVII缺乏为一种罕见的常染色体隐性出血性病症，发病率据估计在普通人群中为每500,000人1例(Acharya等，J Thromb Haemost.2004；2248-56)。因抑制剂造成的后天性FVII缺乏也极罕见。也已报导缺乏的发生与如头孢菌素(cephalosporins)、青霉素(penicillins)和口服抗凝血剂等药物有关的病例。此外，已报导自发发生或与其它病状(如骨髓瘤、败血症、再生障碍性贫血)、白细胞介素-2和抗胸腺细胞球蛋白疗法伴随发生的后天性FVII缺乏。
参考多核苷酸和多肽序列包括例如用于基因组序列的GenBank保藏编号J02933、用于cDNA的M13232(Hagen等PNAS 1986；83：2412-6)，以及用于多肽序列的P08709(参考文献以其全部内容并入本文)。已经描述了FVII的多种多态性，例如参见Sabater-Lleal等(Hum Genet.2006；118：741-51)(参考文献以其全部内容并入本文)。
因子IX
FIX为一种维生素K依赖性血浆蛋白，其通过在钙离子、磷脂和FVIIIa存在下将FX转化为其活性形式而参与内源性凝血途径。FIX的主要催化能力是作为对FX内的特定精氨酸-异亮氨酸键具有特异性的丝氨酸蛋白酶。FIX由FXIa活化，FXIa使活化肽从FIX切除从而产生包含由一个或多个二硫键保持的两条链的活化型FIX分子。FIX缺乏为隐性X-连锁血友病B的原因。
血友病A和B为特征分别在于FVIII和FIX多肽缺乏的遗传性疾病。缺乏的根本原因常为FVIII和FIX基因突变的结果，所述两个基因均位于X染色体上。血友病的传统疗法通常涉及静脉内施用自正常个体汇集的血浆或半纯化的凝血蛋白。所述制剂可能受致病性病原体或病毒污染，如感染性朊病毒、HIV、细小病毒、A型肝炎和C型肝炎。因此，对不需要使用人血清的治疗剂存在迫切需要。
FIX活性降低的程度与血友病B的严重程度成正比。血友病B的当前治疗由以血浆来源或重组的FIX替代缺失的蛋白质(也称为FIX取代或替代治疗或疗法)。
FIX的多核苷酸和多肽序列可例如见于UniProtKB/Swiss-Prot保藏编号P00740、美国专利号6,531,298和图1(SEQ ID NO：1)中。
因子VIII
凝血因子VIII(FVIII)在血浆中以极低浓度循环并且非共价结合于冯威里氏因子(VWF)。在止血时，FVIII与VWF分离并且通过增强在钙和磷脂或细胞膜存在下活化的速率而充当活化型因子IX(FIXa)介导的FX活化的辅因子。
FVIII合成为具有结构域结构A1-A2-B-A3-C1-C2的约270-330kD的单链前驱体。当从血浆纯化时(例如“血浆来源”或“血浆”)，FVIII由重链(A1-A2-B)和轻链(A3-C1-C2)构成。轻链的分子质量为80kD，而由于B结构域内的蛋白水解，重链在90-220kD的范围内。
FVIII也合成为重组蛋白以供在治疗上用于出血病症。已设计各种体外测定来测定重组FVIII(rFVIII)作为治疗药物的潜在功效。这些测定模拟内源性FVIII的体内作用。FVIII的体外凝血酶处理导致其促凝血活性快速增强并随后降低，如通过体外测定所测量。这种活化和失活与重链和轻链中特定的限制性蛋白水解一致，其改变FVIII中不同结合表位的可用性，例如允许FVIII从VWF解离并结合至磷脂表面，或改变与某些单克隆抗体的结合能力。
FVIII缺乏或功能异常与最常出现的出血病症血友病A有关。选择用于管理血友病A的治疗为利用血浆来源或rFVIII浓缩物的替代疗法。FVIII水平低于1％的重度A型血友病患者一般使用预防性疗法以使在各次给药之间保持FVIII高于1％。考虑到循环中各种FVIII产物的平均半衰期，此结果通常可以通过每周给予FVIII两至三次来达成。
参考多核苷酸和多肽序列包括例如UniProtKB/Swiss-Prot P00451(FA8_HUMAN)；Gitschier J等，Characterization of the human Factor VIII gene，Nature，312(5992)：326-30(1984)；Vehar GH等，Structure of human Factor VIII，Nature，312(5992)：337-42(1984)；Thompson AR.Structure and Function of the Factor VIIIgene and protein，Semin Thromb Hemost，2003：29；11-29(2002)。
冯威勒布兰德因子
冯威勒布兰德因子(VWF)为在血浆中以大小在约500至20,000kD范围内的一系列多聚体形式循环的糖蛋白。VWF的多聚体形式由250kD多肽亚基通过二硫键连接在一起构成。VWF介导血小板与受损血管壁的内皮下层的最初粘着。仅较大多聚体显示止血活性。推测内皮细胞分泌VWF的较大聚合形式而VWF的具有低分子量的形式(低分子量VWF)由蛋白水解裂解产生。具有较大分子质量的多聚体储存于内皮细胞的Weibel-Pallade体中并且在受刺激时释放。
VWF由内皮细胞和巨核细胞合成为在很大程度上由重复结构域组成的前VWF原。信号肽裂解时，前VWF通过位于其C端区域中的二硫键二聚化。二聚体用作多聚化的原体，其中多聚化受制于游离末端之间的二硫键。组装成多聚体后，前肽序列被蛋白水解移除(Leyte等，Biochem.J.274(1991)，257-261)。
根据VWF的所克隆cDNA预测的初级翻译产物为2813个残基的前驱多肽(前VWF原)。前VWF原由22个氨基酸的信号肽和741个氨基酸的前肽组成，其中成熟VWF包含2050个氨基酸(Ruggeri Z.A.，和Ware，J.，FASEB J.，308-316(1993)。
VWF缺乏导致冯威里氏病(Von Willebrand disease，VWD)，其特征为不同程度的显著出血表型。3型VWD为最严重形式，其中VWF完全损失，并且1型VWD与VWF的定量损失有关并且其表型可为极轻的。2型VWD涉及VWF的明显缺乏并且可如同3型VWD一样严重。2型VWD具有许多亚型，其中一些与高分子量多聚体的缺失或减少有关。2a型冯威勒布兰德病(VWD-2A)的特征在于中等和较大多聚体均缺失。VWD-2B的特征在于最高分子量的多聚体缺失。与VWF有关的其它疾病和病症在本领域中为已知的。
前VWF原的多核苷酸和氨基酸序列可分别以GenBank保藏编号NM_000552和NP_000543获得。
本发明的其它凝血蛋白描述于本领域中，例如Mann KG，Thromb Haemost，1999；82：165-74。
A.多肽
在一个方面中，本发明的起始材料为蛋白质或多肽。如本文所述，术语治疗性蛋白质是指显示出与治疗性蛋白质有关的生物活性的任何治疗性蛋白质分子。在本发明的一个实施方案中，治疗性蛋白质分子为全长蛋白质。
所涵盖的治疗性蛋白质分子包括全长蛋白质、全长蛋白质的前体、全长蛋白质的生物活性亚基或片段，以及任何这些形式的治疗性蛋白质的生物活性衍生物和变体。因此，治疗性蛋白质包括具有以下特征者：(1)具有与由参考核酸编码的多肽或本文所述的氨基酸序列在至少约25个、约50个、约100个、约200个、约300个、约400个或更多个氨基酸的区域上的氨基酸序列同一性大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％或更高的氨基酸序列；和/或(2)特异性结合针对包含如本文所述的参考氨基酸序列的免疫原或其免疫原性片段和/或其保守性修饰变体产生的抗体，例如多克隆抗体或单克隆抗体。
根据本发明，术语“重组治疗性蛋白质”包括通过重组DNA技术获得的任何治疗性蛋白质。在某些实施方案中，所述术语涵盖如本文所述的蛋白质。
如本文所用，“内源性治疗性蛋白质”包括来源于意欲接受治疗的哺乳动物的治疗性蛋白质。所述术语也包括由存在于所述哺乳动物中的转基因或任何其它外来DNA转录的治疗性蛋白质。如本文所用，“外源性治疗性蛋白质”包括并非来源于意欲接受治疗的哺乳动物的凝血蛋白。
如本文所用，“血浆来源的凝血蛋白”或“血浆”包括在获自哺乳动物的血液中发现的具有参与凝血途径的性质的蛋白质的任何形式。
如本文所用，“生物活性衍生物”或“生物活性变体”包括分子的具有与所述分子大致上相同的功能和/或生物性质(如结合性质)和/或相同结构基础(如肽主链或基本聚合单元)的任何衍生物或变体。
诸如“变体(variant)”或“衍生物(derivative)”等“类似物(analog)”为与天然存在的分子在结构上大致上类似并且具有相同生物活性(尽管在某些情况下程度不同)的化合物。例如，多肽变体是指与参考多肽共享大致上类似的结构并且具有相同生物活性的多肽。变体或类似物与所述类似物所来源的天然产生的多肽相比基于涉及以下方面的一个或多个突变在其氨基酸序列组成方面有所不同：(i)多肽的一个或多个末端和/或天然产生的多肽序列(例如片段)的一个或多个内部区域的一个或多个氨基酸残基缺失，(ii)在多肽的一个或多个末端(通常为“添加”或“融合”)和/或天然产生的多肽序列的一个或多个内部区域(通常为“插入”)插入或添加一个或多个氨基酸，或(iii)一个或多个氨基酸取代天然产生的多肽序列中的其它氨基酸。例如，“衍生物”为一种类型的类似物并且指与已例如以化学方法修饰的参考多肽共享相同或大致上类似的结构的多肽。
变异多肽为一种类型的类似物多肽并且包括插入变体，其中一个或多个氨基酸残基添加至本发明的治疗性蛋白质氨基酸序列中。插入可位于蛋白质的任一个或两个末端，和/或可位于治疗性蛋白质氨基酸序列的内部区域中。在任一个或两个末端具有另外的残基的插入变体包括例如融合蛋白和包括氨基酸标签或其它氨基酸标记的蛋白质。在一个方面中，凝血蛋白分子任选地含有N-端Met，尤其在分子在如大肠杆菌(E.coli)等细菌细胞中重组表达时。
在缺失变体中，如本文所述的治疗性蛋白质多肽中的一个或多个氨基酸残基被移除。缺失可以在治疗性蛋白质多肽的一个或两个末端实现，和/或通过移除治疗性蛋白质氨基酸序列内部的一个或多个残基来实现。因此，缺失变体包括治疗性蛋白质多肽序列的片段。
在取代变体中，治疗性蛋白质多肽的一个或多个氨基酸残基被移除并且被替代残基置换。在一个方面中，取代在性质上是保守的并且这种保守性取代是本领域中所熟知的。或者，本发明涵盖另外为非保守性的取代。示例性保守性取代描述于Lehninger，[Biochemistry，第2版；Worth Publishers，Inc.，New York(1975)，第71-77页]中并且紧接着在下文进行阐述。
保守性取代
或者，示例性保守性取代紧接着在下文进行阐述。
保守性取代II
B.多核苷酸
编码本发明治疗性蛋白质的核酸包括例如并且不限于基因、前mRNA、mRNA、cDNA、多态变体、等位基因、合成和天然产生的突变体。
编码本发明治疗性蛋白质的多核苷酸也包括(但不限于)具有以下特征者：(1)在严格杂交条件下与编码如本文所述的参考氨基酸序列的核酸和其保守性修饰变体特异性杂交；(2)具有与如本文所述的参考核酸序列在至少约25个、约50个、约100个、约150个、约200个、约250个、约500个、约1000或更多个核苷酸(至多成熟蛋白质的1218个核苷酸的全长序列)的区域上的核苷酸序列同一性大于约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的核酸序列。示例性“严格杂交”条件包括在42℃下于50％甲酰胺、5XSSC、20mM Na·PO4(pH6.8)中杂交；和在55℃下于1XSSC中洗涤30分钟。应了解，这些示例性条件可以基于欲杂交序列的长度和GC核苷酸含量进行变化。本领域的标准公式适于确定适当杂交条件。参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)§§9.47-9.51。
“天然存在”的多核苷酸或多肽序列通常来源于哺乳动物，包括(但不限于)灵长类动物，例如人；啮齿动物，例如大鼠、小鼠、仓鼠；母牛、猪、马、绵羊或任何哺乳动物。本发明的核酸和蛋白质可以是重组分子(例如异源分子和编码野生型序列或其变体的分子，或天然产生的分子)。
C.治疗性蛋白质的产生
治疗性蛋白质的产生包括本领域中已知用于进行以下的任何方法：(i)通过遗传工程改造产生重组DNA，(ii)通过例如但不限于转染、电穿孔或显微注射将重组DNA引入原核或真核细胞中，(iii)培养所述经过转化的细胞，(iv)表达治疗性蛋白质，例如组成性表达或诱导后表达，和(v)分离所述凝血蛋白，例如从培养基或通过收集转化细胞进行分离，以便获得纯治疗性蛋白质。
在其它方面中，治疗性蛋白质通过在特征在于产生药理学上可接受的凝血蛋白分子的适合原核或真核宿主系统中表达来产生。真核细胞的实例为哺乳动物细胞，如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep和HepG2。
多种载体用于制备治疗性蛋白质并且选自真核和原核表达载体。用于原核表达的载体的实例包括质粒，如(但不限于)pRSET、pET和pBAD，其中原核表达载体中所用的启动子包括(但不限于)lac、trc、trp、recA或araBAD中的一者或多者。用于真核表达的载体的实例包括：(i)用于在酵母中表达的载体，如(但不限于)pAO、pPIC、pYES或pMET，所用的启动子如(但不限于)AOX1、GAP、GAL1或AUG1；(ii)用于在昆虫细胞中表达的载体，如(但不限于)pMT、pAc5、pIB、pMIB或pBAC，所用的启动子如(但不限于)PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64或polh；和(iii)用于在哺乳动物中表达的载体，如(但不限于)pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3或pBPV，并且在一个方面中载体来源于病毒系统，如(但不限于)痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或逆转录病毒，所用的启动子如(但不限于)CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌动蛋白。
D.施用
在一个实施方案中，本发明的缀合治疗性蛋白质可以通过注射，如静脉内、肌内或腹膜内注射进行施用。
为向人或测试动物施用包含本发明的缀合治疗性蛋白质的组合物，在一个方面中，组合物包含一种或多种药学上可接受的载体。术语“药学上”或“药理学上可接受”是指分子实体和组合物在使用如下文所述在本领域中熟知的路径施用时稳定、抑制蛋白质降解(如聚集和裂解产物)，并且此外不产生过敏反应或其它不良反应。“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床上适用的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等，包括上文公开的药剂。
如本文所用，“有效量”包括适于治疗疾病或病症或缓解疾病或病症的症状的剂量。在一个实施方案中，“有效量”包括适于治疗患有如本文所述的出血病症的哺乳动物的剂量。
组合物可以口服、局部、透皮、肠胃外、通过吸入喷雾、阴道、直肠或通过颅内注射来施用。如本文所用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、脑池内注射或输注技术。也涵盖通过静脉内、皮内、肌内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射和或在特定部位手术植入进行施用。一般来说，组合物基本上不含热原质以及可能会对接受者有害的其它杂质。
组合物的单次或多次施用可以采用由主治医师选择的剂量水平和模式进行。为预防或治疗疾病，适当剂量将取决于如上文所述欲治疗疾病的类型、疾病的严重性和病程、药物是出于预防还是治疗的目的施用、先前疗法、患者的病史和对药物的反应，以及主治医师的判断。
本发明也涉及包含有效量的如本文所定义的缀合治疗性蛋白质的药物组合物。药物组合物可以还包含药学上可接受的载体、稀释剂、盐、缓冲剂或赋形剂。药物组合物可用于治疗上文定义的出血病症。本发明的药物组合物可为溶液或冻干产品。药物组合物的溶液可以经受任何适合冻干过程。
作为另一方面，本发明包括包含本发明的组合物以有利于用于施用至受试者的方式封装的试剂盒。在一个实施方案中，这种试剂盒包括封装于如密封瓶或器皿等容器中的本文所述的化合物或组合物(例如包含缀合治疗性蛋白质的组合物)，其中描述所述化合物或组合物在实施方法时的使用的标签粘附于容器上或包括于包装中。在一个实施方案中，试剂盒含有具有包含缀合治疗性蛋白质的组合物的第一容器和具有用于第一容器中的组合物的生理学上可接受的复原溶液的第二容器。一方面，化合物或组合物以单位剂型包装。试剂盒可还包括适于根据特定施药途径施用组合物的装置。试剂盒优选含有描述治疗性蛋白质或肽组合物的使用的标签。
水溶性聚合物
在一个方面，所提供的治疗性蛋白质衍生物(即缀合的治疗性蛋白质)分子结合于水溶性聚合物，包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、支链PEG、聚唾液酸(PSA)、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基磷酸铵(MPC)。在本发明的一个实施方案中，水溶性聚合物由具有以下分子量范围的唾液酸分子组成：350至120,000Da、500至100,000Da、1000至80,000Da、1500至60,000Da、2,000至45,000Da、3,000至35,000Da和5,000至25,000Da。水溶性聚合物的偶合可通过直接或经由连接分子与蛋白质偶合来进行。化学接头的一个实例为含有碳水化合物选择性酰肼和巯基反应性马来酰亚胺基的MBPH(4-[4-N-马来酰亚胺基苯基]丁酸肼)(Chamow等，J Biol Chem 1992；267：15916-22)。下文描述其它示例性和优选接头。
在一个实施方案中，衍生物保留天然治疗性蛋白质产物的完整功能活性，并且与天然治疗性蛋白质产物相比，提供延长的体内半衰期。在另一个实施方案中，相对于天然凝血蛋白，衍生物保留至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140或150百分比(％)生物活性。在一个相关方面，通过产色活性与凝血因子抗原值的比率(凝血因子：Chr∶凝血因子：Ag)来测定衍生物和天然凝血蛋白的生物活性。在本发明的又一实施方案中，相对于天然治疗性蛋白质的体内半衰期，构建体的半衰期缩短或延长0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
A.唾液酸和PSA
PSA由N-乙酰神经氨酸的聚合物(一般为均聚物)组成。仲氨基通常带有乙酰基，但其可改为带有乙醇酰基。羟基上的可能取代基包括乙酰基、乳酰基、乙基、硫酸酯基和磷酸酯基。
唾液酸(N-乙酰神经氨酸)的结构
PSA和mPSA一般包含基本上由以2，8-糖苷键联或2，9-糖苷键联或这些糖苷键联的组合(例如交替2，8-键联和2，9-键联)连接的N-乙酰神经氨酸部分组成的线性聚合物。在特别优选的PSA和mPSA中，糖苷键联为α-2，8。所述PSA和mPSA宜来源于聚乙酰神经氨酸，并且在本文中称为“CA”和“mCA”。典型PSA和mPSA包含至少2个、优选至少5个、更优选至少10个和最优选至少20个N-乙酰神经氨酸部分。因此，其可包含2至300个N-乙酰神经氨酸部分、优选5至200个N-乙酰神经氨酸部分或最优选10至100个N-乙酰神经氨酸部分。除N-乙酰神经氨酸外，PSA和CA优选基本上不含糖部分。因此，PSA和CA优选包含至少90％、更优选至少95％和最优选至少98％N-乙酰神经氨酸部分。
当PSA和CA包含除N-乙酰神经氨酸外的部分时(例如mPSAS和mCA中)，这些部分优选位于聚合物链的一端或两端。所述“其它”部分可例如为通过氧化或还原而衍生自末端N-乙酰神经氨酸部分的部分。
例如，WO-A-0187922描述如下mPSA和mCA，其中非还原末端N-乙酰神经氨酸单元通过与高碘酸钠反应而转化为醛基。另外，WO 2005/016974描述如下mPSA和mCA，其中还原末端N-乙酰神经氨酸单元经受还原以在还原末端N-乙酰神经氨酸单元处还原性开环，由此形成邻二醇基团，随后氧化以使所述邻二醇基团转化为醛基。
富含唾液酸的糖蛋白结合人和其它生物体中的选择素。其在人流感感染中起重要作用。例如，唾液酸可掩蔽宿主细胞或细菌的表面上的甘露糖抗原以免受甘露糖结合凝集素影响。此可防止补体活化。唾液酸还掩蔽次末端半乳糖残基，由此防止糖蛋白由肝实质细胞上的半乳糖受体快速清除。
聚乙酰神经氨酸(N-乙酰神经氨酸的均聚物)的结构
聚乙酰神经氨酸(PSA的亚类)为具有α(2→8)酮苷键联的N-乙酰神经氨酸(NANA)的均聚物，并且由具有K1抗原的大肠杆菌的特定菌株产生。聚乙酰神经氨酸具有许多生理功能。其作为药物和化妆品的原料很重要。
使用聚唾液酸化和未修饰的天冬酰胺酶的体内比较研究揭露聚唾液酸化延长酶的半衰期(Fernandes和Gregoriadis，Biochimica Biophysica Acta 1341：26-34，1997)。
如本文中所使用，“唾液酸部分(sialic acid moieties)”包括唾液酸单体或聚合物(“多糖(polysaccharides)”)，其可溶于水溶液或水性悬浮液中并且在施用药物有效量的PSA-凝血蛋白缀合物后对哺乳动物具有极小或无负面影响，诸如副作用。在一个方面，聚合物的特征为具有1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500个唾液酸单元。在某些方面，不同唾液酸单元组合于一条链中。
在本发明的一个实施方案中，多糖化合物的唾液酸部分具有高亲水性，并且在另一个实施方案中，整个化合物具有高亲水性。亲水性主要由唾液酸单元的侧位羧基以及羟基赋予。糖单元可含有其它官能团，诸如胺、羟基或硫酸酯基或其组合。这些基团可存在于天然存在的糖化合物上，或引入衍生物多糖化合物中。
天然存在的聚合物PSA可以多分散制剂形式得到，其显示宽的大小分布(例如Sigma C-5762)和高多分散性(PD)。因为多糖通常在带有共纯化内毒素的固有风险的细菌中产生，所以长唾液酸聚合物链的纯化可能提高增加内毒素含量的可能性。具有1-4个唾液酸单元的短PSA分子也可以合成方法制备(Kang SH等，Chem Commun.2000；227-8；Ress DK和Linhardt RJ，Current Organic Synthesis.2004；1：31-46)，由此最小化高内毒素水平的风险。然而，现可制造具有窄的大小分布和低多分散性的PSA制剂，其也不含内毒素。在一个方面，特别用于本发明的多糖化合物为细菌产生的多糖化合物。这些天然存在的多糖中的一些称为糖脂。在一个实施方案中，多糖化合物大致上不含末端半乳糖单元。
B.聚乙二醇(PEG)和聚乙二醇化
在某些方面，通过多种化学方法中的任一者使治疗性蛋白质与水溶性聚合物缀合(Roberts JM等，Advan Drug Delivery Rev2002；54：459-76)。例如，在一个实施方案中，通过使用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)酯使PEG与治疗性蛋白质的游离氨基缀合来修饰所述蛋白质。在另一个实施方案中，使用马来酰亚胺化学反应或在先前氧化后使PEG酰肼或PEG胺与治疗性蛋白质的碳水化合物部分偶合，使水溶性聚合物(例如PEG)与游离SH基团偶合。
在一个方面，通过经由形成稳定键使水溶性聚合物与治疗性蛋白质直接偶合(或经由接头系统偶合)来进行缀合。另外，在本发明的某些方面中使用可降解的、可释放的或可水解的接头系统(Tsubery等J Biol Chem 2004；279：38118-24/Greenwald等，J MedChem 1999；42：3657-67/Zhao等，Bioconj Chem 2006；17：341-51/WO2006/138572A2/US7259224B2/US7060259B2)。
在本发明的一个实施方案中，通过使用含有活性N-羟基丁二酰亚胺酯(NHS)(诸如丁二酸丁二酰亚胺酯、戊二酸丁二酰亚胺酯或丙酸丁二酰亚胺酯)的聚乙二醇衍生物，经由赖氨酸残基修饰治疗性蛋白质。这些衍生物在温和条件下通过形成稳定酰胺键而与治疗性蛋白质的赖氨酸残基反应。在本发明的一个实施方案中，PEG衍生物的链长度为5,000Da。链长度为500至2,000Da、2,000至5,000Da、大于5,000至10,000Da或大于10,000至20,000Da或大于20,000至150,000Da的其它PEG衍生物用于各种实施方案中，包括线性和支链结构。
氨基的聚乙二醇化的替代性方法为(但不限于)通过形成氨基甲酸酯键而与PEG碳酸酯化学缀合，或通过形成仲酰胺键的还原胺化而与醛或酮反应。
在本发明的一个实施方案中，治疗性蛋白质分子使用可商购获得的PEG衍生物进行化学修饰。在替代性方面，这些PEG衍生物具有线性或支链结构。下文列举含有NHS基团的PEG-衍生物的实例。
以下PEG衍生物为自Nektar Therapeutics商购获得的那些PEG衍生物的非限制性实例(Huntsville，Ala.；参见www.nektar.com/PEG试剂目录；Nektar AdvancedPEGylation，价格表2005-2006)：
mPEG-丙酸丁二酰亚胺酯(mPEG-SPA)
mPEG-α-甲基丁酸丁二酰亚胺酯(mPEG-SMB)
mPEG-CM-HBA-NHS(CM＝羧甲基；HBA＝羟基丁酸)
支链PEG-衍生物(Nektar Therapeutics)的结构：
支链PEG N-羟基丁二酰亚胺(mPEG2-NHS)
这种具有支链结构的试剂由Kozlowski等(BioDrugs2001；5：419-29)更详细地描述。
PEG衍生物的其它非限制性实例自NOF公司商购获得(Tokyo，Japan；参见www.nof.co.jp/english：目录2005)。
线性PEG-衍生物(NOF公司)的通用结构：
X＝羧甲基
X＝羧戊基
x＝丁二酸酯基
x＝戊二酸酯基
支链PEG-衍生物(NOF公司)的结构：2，3-双(甲基聚氧亚乙基-氧基)-1-(1，5-二氧代-5-丁二酰亚胺基氧基，戊氧基)丙烷
2，3-双(甲基聚氧亚乙基-氧基)-1-(丁二酰亚胺基羧戊基氧基)丙烷
这些丙烷衍生物显示具有1，2取代型态的甘油主链。在本发明中，还涵盖基于具有1，3取代的甘油结构或US2003/0143596A1中所述的其它支链结构的支链PEG衍生物。
还涵盖由Tsubery等(J Biol Chem 2004；279：38118-24)和Shechter等(WO04089280A3)描述的具有可降解(例如可水解)接头的PEG衍生物。
令人惊讶的是，本发明的聚乙二醇化治疗性蛋白质展现功能活性与延长的体内半衰期的组合。另外，聚乙二醇化rFVIII、FVIIa、FIX或其它凝血因子似乎针对凝血酶失活的抗性更大。
C.羟烷基淀粉(HAS)和羟乙基淀粉(HES)
在本发明的各种实施方案中，治疗性蛋白质分子使用羟烷基淀粉(HAS)或羟乙基淀粉(HES)或其衍生物进行化学修饰。
HES为天然存在的支链淀粉的衍生物并且在体内由α-淀粉酶降解。HES为碳水化合物聚合物支链淀粉的取代的衍生物，其以至多95重量％的浓度存在于玉米淀粉中。HES展现有利的生物性质并且用作血容量替代药剂和用于临床血稀释疗法中(Sommermeyer等，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；和Weidler等，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.g 419494-498)。
支链淀粉由葡萄糖部分组成，其中α-1，4-糖苷键存在于主链中并且α-1，6-糖苷键见于分支位点。此分子的物理化学性质主要由糖苷键的类型决定。由于切口α-1，4-糖苷键，产生每个转角具有约6个葡萄糖单体的螺旋结构。聚合物的物理化学以及生物化学性质可经由取代加以修饰。羟乙基的引入可经由碱性羟乙基化达成。关于羟乙基化，通过修改反应条件，有可能利用未取代的葡萄糖单体中各别羟基的不同反应性。由于此事实，本领域的技术人员能够在有限程度上影响取代型态。
HAS指被至少一个羟烷基取代的淀粉衍生物。因此，术语羟烷基淀粉(hydroxyalkyl starch)并不限于末端碳水化合物部分包含羟烷基R1、R2和/或R3的化合物，而且还指无论何处(末端碳水化合物部分和/或淀粉分子(HAS′)的其余部分中)存在的至少一个羟基被羟烷基R1、R2或R3取代的化合物。
烷基可为可适当取代的直链或支链烷基。优选地，羟烷基含有1至10个碳原子、更优选1至6个碳原子、更优选1至4个碳原子和甚至更优选2-4个碳原子。因此，“羟烷基淀粉”优选包含羟乙基淀粉、羟丙基淀粉和羟丁基淀粉，其中羟乙基淀粉和羟丙基淀粉尤为优选。
包含两个或更多个不同羟烷基的羟烷基淀粉也包含于本发明中。HAS中所包含的至少一个羟烷基可含有两个或更多个羟基。根据一个实施方案，包含至少一个羟烷基的HAS含有一个羟基。
术语HAS还包括烷基被单取代或多取代的衍生物。在一个实施方案中，烷基被卤素、尤其氟取代，或被芳基取代，条件为HAS仍可溶于水。此外，羟烷基的末端羟基可被酯化或醚化。HAS衍生物描述于WO/2004/024776中，所述文献以全文引用的方式并入本文。
D.连接方法
可通过所属领域的技术人员所已知的各种技术中的任一种将治疗性蛋白质共价连接至多糖化合物。在本发明的各种方面，例如通过美国专利号4,356,170(以引用的方式并入本文)中所述的方法，将唾液酸部分结合至治疗性蛋白质，例如FIX、FVIII、FVIIa或VWF。
用于使PSA与多肽偶合的其它技术也为已知的并且由本发明涵盖。例如，美国公布号2007/0282096描述使例如PSA的胺或酰肼衍生物与蛋白质缀合。另外，美国公布号2007/0191597描述在还原端含有用于与底物(例如蛋白质)反应的醛基的PSA衍生物。这些参考文献以全文引用的方式并入本文。
多种方法公开于美国专利号5,846,951(以全文引用的方式并入本文)的第7栏第15行至第8栏第5行中。示例性技术包括经由凝血蛋白或多糖中的任一者上的羧基与凝血蛋白或多糖的氨基之间的肽键，或凝血蛋白或多糖的羧基与治疗性蛋白质或多糖的羟基之间的酯键联来连接。使治疗性蛋白质共价键合至多糖化合物的另一键联是经由席夫碱，在凝血蛋白上的游离氨基与多糖的非还原端处形成的醛基之间通过高碘酸盐氧化进行反应。(Jennings HJ和Lugowski C，J Immunol.1981；127：1011-8；Fernandes AI和GregoriadisG，Biochim Biophys Acta.1997；1341；26-34)。在一个方面中，所产生的席夫碱通过利用NaCNBH3特异性还原形成仲胺来稳定化。替代性方法为通过在先前氧化之后用NH4Cl还原胺化而在PSA中产生末端游离氨基。可以使用双官能试剂来连接两个氨基或两个羟基。例如，使用如BS3(辛二酸双(磺酸基丁二酰亚胺基)酯/Pierce，Rockford，IL)等试剂使含有氨基的PSA与蛋白质的氨基偶合。另外，例如使用如Sulfo-EMCS(N-ε-马来酰亚胺基己酰氧基)磺酸基丁二酰亚胺酯/Pierce)等杂双官能交联剂连接胺和硫醇基。
在另一方法中，制备PSA酰肼并且在先前氧化和产生醛官能团之后使其与蛋白质的碳水化合物部分偶合。
如上文所述，治疗性蛋白质的游离氨基与唾液酸残基的1-羧基反应形成肽基键，或在1-羧酸基与凝血蛋白上的羟基或其它适合的活性基团之间形成酯键联。或者，羧基与脱乙酰化5-氨基形成肽键联，或治疗性蛋白质分子的醛基与唾液酸残基的N-脱乙酰化5-氨基形成席夫碱。
或者，多糖化合物以非共价方式与治疗性蛋白质缔合。例如，在一个方面，多糖化合物和药物活性化合物经由疏水性相互作用连接。其它非共价缔合包括静电相互作用，其中带相反电荷的离子彼此吸引。
在各种实施方案中，治疗性蛋白质以化学计算量(例如1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶7、1∶8、1∶9或1∶10等)与多糖化合物连接或缔合。在各种实施方案中，1-6个、7-12个或13-20个多糖与凝血蛋白连接。在其它实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个多糖与凝血蛋白连接。
在各种实施方案中，对治疗性蛋白质进行修饰以引入糖基化位点(即除天然糖基化位点以外的位点)。所述修饰可使用所属领域中已知的标准分子生物学技术来实现。另外，治疗性蛋白质在经由一个或多个碳水化合物部分与水溶性聚合物缀合之前可在体内或体外被糖基化。这些糖基化位点可用作蛋白质与水溶性聚合物缀合的靶标(美国专利申请号20090028822、美国专利申请号2009/0093399、美国专利申请号2009/0081188、美国专利申请号2007/0254836、美国专利申请号2006/0111279和DeFrees S.等，Glycobiology，2006，16，9，833-43)。例如，未在体内发生天然糖基化的蛋白质(例如不为糖蛋白的蛋白质)可如上文所述加以修饰。
E.氨氧基键联
在本发明的一个实施方案中，羟胺或羟胺衍生物与醛(例如经高碘酸钠氧化后的碳水化合物部分上的醛)反应形成肟基可应用于制备凝血蛋白的缀合物。例如，糖蛋白(例如本发明的治疗性蛋白质)首先用诸如高碘酸钠(NaIO4)等氧化剂氧化(Rothfus JA etSmith EL.，J Biol Chem 1963，238，1402-10；和Van Lenten L和Ashwell G.，J BiolChem1971，246，1889-94)。糖蛋白的高碘酸盐氧化是基于1928年描述的经典马拉普瑞德反应(Malaprade reaction)，所述反应是利用高碘酸盐对邻二醇进行氧化形成活性醛基(Malaprade L.，Analytical application，Bull Soc Chim France，1928，43，683-96)。这种氧化剂的其它实例为四乙酸铅(Pb(OAc)4)、乙酸锰(MnO(Ac)3)、乙酸钴(Co(OAc)2)、乙酸铊(TlOAc)、硫酸铈(Ce(SO4)2)(US 4,367,309)或高钌酸钾(KRuO4)(Marko等，JAm ChemSoc 1997，119，12661-2)。“氧化剂”意谓在生理学反应条件下能够氧化于碳水化合物中的邻二醇由此产生活性醛基的温和氧化性化合物。
第二步骤为含有氨氧基的聚合物与氧化型碳水化合物部分偶合，形成肟键联。在本发明的一个实施方案中，可在催化量的亲核性催化剂苯胺或苯胺衍生物的存在下进行此步骤(Dirksen A和Dawson PE，Bioconjugate Chem.2008；Zeng Y等，Nature Methods2009；6：207-9)。苯胺催化显著加速肟连接，从而允许使用极低浓度的试剂。在本发明的另一个实施方案中，通过用NaCNBH3还原形成烷氧基胺键联来使肟键联稳定(图2)。其它催化剂在下文描述。
关于氨氧基技术的其它信息可见于以下参考文献中，其中各参考文献均以全文引用的方式并入本文：EP 1681303A1(HAS化红细胞生成素)；WO 2005/014024(由肟连接基团连接的聚合物与蛋白质的缀合物)；WO96/40662(含有氨氧基的接头化合物和其在缀合物中的应用)；WO 2008/025856(修饰的蛋白质)；Peri F等，Tetrahedron 1998，54，12269-78；Kubler-Kielb J et.Pozsgay V.，J Org Chem 2005，70，6887-90；Lees A等，Vaccine2006，24(6)，716-29；和Heredia KL等，Macromoecules 2007，40(14)，4772-9。
本公开涵盖使水溶性聚合物与氨氧基接头偶合的许多方法。例如，本文中描述接头与诸如PSA的水溶性聚合物的还原端或非还原端偶合。偶合位点(例如还原端对非还原端)由偶合方法的一个或多个条件(例如，时间和温度)以及水溶性聚合物的状态(例如天然的对氧化的)确定。在一个实施方案中，通过在降低的温度(例如在2℃-8℃之间)下执行偶合反应来使诸如PSA的氧化型水溶性聚合物在其非还原端与氨氧基接头偶合。在另一个实施方案中，通过在较高的温度(例如在22℃-37℃之间)下执行偶合反应来使诸如PSA的天然(例如非氧化型)水溶性聚合物在其还原端与氨氧基接头偶合。上述的实施方案将在下文和在实施例中进行更详细描述。
如本文所述，氧化型PSA与二氨氧基接头的反应显示两个反应：在非还原端处醛基的“快速反应”，和在还原端处的“慢速反应”。如果天然PSA(其未被氧化并且不含有活性醛基)与还原端在室温下反应，可观察到衍生的PSA。因此，在各种实施方案中，为了最小化在诸如PSA的水溶性聚合物的还原端的非想要副反应，在介于2℃-8℃之间的温度下进行PSA-氨氧基接头试剂的制备。
在本公开的又一个实施方案中，提供天然PSA在还原端的衍生化。如本文所述，使天然PSA(其未被NaIO4氧化并因此在其非还原端不含有游离醛基)与二氨氧基接头在室温下反应，可观察到PSA在其还原端的衍生化。这种偶合通过在还原端的开环和随后的肟形成而发生(上述的实际副反应以及在氨氧基-PSA试剂中存在副产物的原因)。此反应可用天然PSA执行，产生至多约70％的修饰程度。
作为主产物的以下结构通过13C NMR光谱测定
所述反应可转移至其它碳水化合物如葡聚糖和淀粉或其它含有还原端基团的多糖。还涵盖亲核性催化剂如间甲苯胺或苯胺的使用。因此，本文中提供使用天然PSA(即，先前未氧化)进行的氨氧基-PSA试剂的制备，所述试剂随后可用于治疗性蛋白质的化学修饰。
因此，在本公开的各种实施方案中，提供方法，其中偶合(例如2℃-8℃孵育温度)二氨氧基接头与诸如氧化型PSA的水溶性聚合物的条件有利于偶合至非还原端，或在一个替代方案中其中偶合(例如室温孵育)二氨氧基接头与诸如天然的非氧化型PSA的水溶性聚合物的条件有利于偶合至还原端。
在本发明的各种实施方案中，根据本文所述的氨氧基技术与治疗性蛋白质(例如FVIII、FVIIa或FIX)的氧化型碳水化合物部分连接的水溶性聚合物包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、支链PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、普鲁兰糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基磷酸铵(MPC)。
亲核性催化剂
如本文所述，水溶性聚合物与治疗性蛋白质的缀合可由苯胺催化。苯胺强烈催化醛和酮与胺形成如腙和肟等稳定亚胺的水相反应。下图比较未催化相对于以苯胺催化的肟连接反应(Kohler JJ，ChemBioChem 2009；10：2147-50)：
然而，考虑到与苯胺相关的众多健康风险，需要替代催化剂。本发明提供苯胺衍生物作为替代肟连接催化剂。所述苯胺衍生物包括(但不限于)邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻甲氧基苯胺、间甲氧基苯胺和对甲氧基苯胺。
在本发明的一个实施方案中，使用间甲苯胺(也称为间甲苯胺、间甲基苯胺、3-甲基苯胺或3-氨基-1-甲基苯)来催化本文所述的缀合反应。间甲苯胺与苯胺具有类似物理性质和基本上相同的pKa值(间甲苯胺：pKa 4.73，苯胺：pKa 4.63)。
本发明的亲核性催化剂适用于肟连接(例如使用氨氧基键联)或腙形成(例如使用酰肼化学)。在本发明的各种实施方案中，缀合反应中所提供亲核性催化剂的浓度为0.1、0.2、0.3、0.5、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50mM。在一个实施方案中，所提供亲核性催化剂的浓度为介于1mM至10mM之间。在本发明的各种实施方案中，缀合反应的pH范围为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5。在一个实施方案中，pH在5.5至6.5之间。
缀合的蛋白质的纯化
在各种实施方案中，希望纯化已与氧化剂一起孵育的蛋白质和/或已与本发明的水溶性聚合物缀合的治疗性蛋白质。多种纯化技术为所属领域所已知并且包括(但不限于)色谱法(诸如离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱或其组合)、过滤法(例如UF/DF)和沉淀法以及透析程序和上述技术的任何组合(Guide to ProteinPurification，Meth.Enzymology第463卷(由Burgess RR和Deutscher MP编著)，第2版，Academic Press 2009)。
以下实施例不欲对本发明造成限制，而是仅为本发明的特定实施方案的示例。
实施例
实施例1
制备同双官能接头NH2[OCH2CH2]2ONH2
同双官能接头NH2[OCH2CH2]2ONH2
根据Boturyn等(Tetrahedron 1997；53：5485-92)，在采用伯胺的修改Gabriel合成的两步有机反应中合成含有两个活性氨氧基的(3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺)(图3)。在第一步骤中，一个2，2-氯乙醚分子与两个内-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺分子在二甲基甲酰胺(DMF)中反应。通过在乙醇中进行肼解反应从所得中间体制备所要同双官能产物。
实施例2
制备同双官能接头NH2[OCH2CH2]4ONH2
同双官能接头NH2[OCH2CH2]4ONH2
根据Boturyn等(Tetrahedron 1997；53：5485-92)，在采用伯胺的修改Gabriel合成的两步有机反应中合成含有两个活性氨氧基的(3，6，9-三氧杂-十一烷-1，11-二氧基胺)(图3)。在第一步骤中，一个双-(2-(2-氯乙氧基)-乙基)-醚分子与两个内-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺分子在DMF中反应。通过在乙醇中进行肼解反应从所得中间体制备所要同双官能产物。
实施例3
制备同双官能接头NH2[OCH2CH2]6ONH2
同双官能接头NH2[OCH2CH2]6ONH2
根据Boturyn等(Tetrahedron 1997；53：5485-92)，在采用伯胺的修改Gabriel合成的两步有机反应中合成含有两个活性氨氧基的(3，6，9，12，15-五氧杂-十七烷-1，17-二氧基胺)。在第一步骤中，一个二氯化六乙二醇分子与两个内-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺分子在DMF中反应。通过在乙醇中进行肼解反应从所得中间体制备所要同双官能产物。
实施例4
氨氧基-PSA试剂的详细合成
根据Botyryn等(Tetrahedron 1997；53：5485-92)，在如实施例1中所概述的两步有机合成中合成3-氧杂-戊烷-1，5二氧基胺。
步骤1：
向内-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺(59.0g；1.00当量)于700ml无水N，N-二甲基甲酰胺中的溶液中添加无水K2CO3(45.51g；1.00当量)和2，2-二氯乙醚(15.84ml；0.41当量)。在50℃下搅拌反应混合物22小时。在减压下蒸发混合物至干燥。使残余物悬浮于2L二氯甲烷中并且用饱和NaCl水溶液提取两次(每次1L)。二氯甲烷层用Na2SO4脱水，接着在减压下蒸发至干燥并在高度真空下干燥，得到64.5g呈白黄色固体状的3-氧杂戊烷-1，5-二氧基-内-2′，3′-二甲酰亚胺降冰片烯(中间体1)。
步骤2：
向中间体1(64.25g；1.00当量)于800ml无水乙醇中的溶液中添加31.0ml水合肼(4.26当量)。然后将反应混合物回流2小时。通过在减压下蒸发溶剂将混合物浓缩到起始体积的一半。滤出产生的沉淀物。在减压下蒸发残余乙醇层至干燥。在真空中干燥含有粗产物3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺的残余物，得到46.3g。进一步通过柱色谱(硅胶60；用二氯甲烷/甲醇混合物9/1进行等度洗脱)纯化粗产物，得到11.7g纯的最终产物3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺。
实施例5
制备氨氧基-PSA
将自印度血清研究所(Serum Institute of India)(Pune，India)获得的1000mg氧化型PSA(MW＝20kD)溶解于16ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中。接着向反应混合物中提供170mg 3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺。在室温下振荡2小时后，添加78.5mg氰基硼氢化钠并且反应进行18小时过夜。接着使用由再生纤维素制成的具有5kD截断值的膜(50cm2，Millipore)对反应混合物进行超滤/渗滤程序(UF/DF)。
实施例6
使用色谱纯化步骤制备氨氧基-PSA
将自印度血清研究所(Pune，India)获得的1290mg氧化型PSA(MW＝20kD)溶解于25ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)(缓冲液A)中。接着向反应混合物中提供209mg 3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺。在室温下振荡1小时后，添加101mg氰基硼氢化钠并且反应3小时。接着使用Fractogel EMD DEAE 650-M色谱凝胶(柱尺寸：XK26/135)对混合物进行弱阴离子交换色谱步骤。将反应混合物用110ml缓冲液A稀释并以1cm/min的流速加载到以缓冲液A预平衡的DEAE柱上。然后将柱以流速为2cm/min的20CV缓冲液B(20mM Hepes，pH 6.0)洗涤，以移除游离的3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺和氰化物。然后以由67％缓冲液B和43％缓冲液C(20mMHepes，1M NaCl，pH7.5)组成的阶段梯度洗脱氨氧基-PSA试剂。通过UF/DF，使用由聚醚砜制成的5kD膜(50cm2，Millipore)浓缩洗脱液。针对缓冲液D(20mM Hepes、90mM NaCl，pH 7.4)进行最后渗滤步骤。通过测量总PSA(间苯二酚测定)和总氨氧基(TNBS测定)以测定修饰程度而以分析法表征制剂。此外，测定多分散性以及游离3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺和氰化物。
实施例7
不使用还原步骤下制备氨氧基-PSA
将自印度血清研究所(Pune，India)获得的573mg氧化型PSA(MW＝20kD)溶解于11.3ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)(缓冲液A)中。接着向反应混合物中提供94mg 3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺。在室温下振荡5小时后，接着使用Fractogel EMD DEAE 650-M色谱凝胶(柱尺寸：XK16/105)对混合物进行弱阴离子交换色谱步骤。将反应混合物用50ml缓冲液A稀释并以1cm/min的流速加载到用缓冲液A预平衡的DEAE柱上。然后将柱以流速为2cm/min的20CV缓冲液B(20mM Hepes，pH 6.0)洗涤，以移除游离的3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺和氰化物。然后以由67％缓冲液B和43％缓冲液C(20mM Hepes，1M NaCl，pH 7.5)组成的阶段梯度洗脱氨氧基-PSA试剂。通过UF/DF，使用由聚醚砜制成的5kD膜(50cm2，Millipore)浓缩洗脱液。针对缓冲液D(20mM Hepes、90mM NaCl，pH 7.4)进行最后渗滤步骤。通过测量总PSA(间苯二酚测定)和总氨氧基(TNBS测定)以测定修饰程度而以分析法表征制剂。此外，测定多分散性以及游离3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺。
实施例8
不使用还原步骤并且在亲核性催化剂间甲苯胺存在下制备氨氧基-PSA
将自印度血清研究所(Pune，India)获得的573mg氧化型PSA(MW＝20kD)溶解于9ml50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)(缓冲液A)中。接着向此溶液中提供94mg 3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺。随后将2.3ml 50mM间甲苯胺储备溶液添加至此反应混合物中。在室温下振荡2小时后，接着使用Fractogel EMD DEAE 650-M色谱凝胶(柱尺寸：XK16/105)对混合物进行弱阴离子交换色谱步骤。将反应混合物用50ml缓冲液A稀释并以1cm/min的流速加载到用缓冲液A预平衡的DEAE柱上。然后将柱以流速为2cm/min的20CV缓冲液B(20mM Hepes，pH 6.0)洗涤，以移除游离的3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺和氰化物。然后以由67％缓冲液B和43％缓冲液C(20mM Hepes，1M NaCl，pH 7.5)组成的阶段梯度洗脱氨氧基-PSA试剂。通过UF/DF，使用由聚醚砜制成的5kD膜(50cm2，Millipore)浓缩洗脱液。针对缓冲液D(20mM Hepes、90mMNaCl，pH 7.4)进行最后渗滤步骤。通过测量总PSA(间苯二酚测定)和总氨氧基(TNBS测定)以测定修饰程度而以分析法表征制剂。此外，测定多分散性以及游离3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺。
实施例9
制备氨氧基-PSA试剂
根据实施例4-8制备氨氧基-PSA试剂。渗滤后，在-80℃下冷冻产物并且冻干。冻干后，将试剂溶解于适当体积的水中并且用于经由碳水化合物修饰来制备PSA-蛋白质缀合物。
实施例10
评估不同替代性亲核性催化剂的功效
在标准化条件(含1mg/ml rFIX的20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2(pH6.0)，5倍摩尔浓度氨氧基-PSA试剂过量，100μM NaIO4)下，使用不同亲核性催化剂(苯胺、间甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯甲酰胺、对氨基苯磺酸/标准浓度：10mM)将rFIX与高碘酸钠、氨氧基-PSA试剂一起孵育。在室温下在黑暗中在温和搅拌下反应2小时并且在室温下通过添加最终浓度为1mM的半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。
通过SDS-PAGE，使用Invitrogen X-cell小系统测定偶合效率。将十二烷基硫酸锂(lithium dodecyl sulfate，LDS)缓冲液掺入样品中并且在70℃下变性10分钟。然后将样品施加在3-8％TRIS-乙酸凝胶上并且在150V下跑胶60分钟。随后用考马斯法对凝胶进行染色。
另外，通过使用SEC-HPLC系统，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion 2006；46：1959-77)下表征样品。
注射未稀释的50μl样品并且用20mM NaH2PO4、50mM Na2SO4(pH 6.1)的0.22μm滤液以0.5ml/min的流速等度洗脱。在280nm下记录洗脱图谱。
结果总结于图5A-C和6(SDS PAGE)和表2(SEC-HPLC结果)中。说明不同制剂的催化效果。已显示，使用间甲苯胺产生与用苯胺所获得的结果相等的结果。
表2
实施例11
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使rFIX聚唾液酸化
方法1：
将12.3mg rFIX溶解于6.1ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加254μl高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加6.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin 15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型rFIX的渗余物(8.8ml)与2.46ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
借助于阴离子交换色谱(AEC)移除游离rFIX。用15ml缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2，pH 7.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl、5mM CaCl2，pH7.5)洗脱柱。游离rFIX以12-25mS/cm之间的传导率洗脱并且缀合物以27-45mS/cm之间的传导率洗脱。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mMCaCl2，pH 6.9)升至190mS/cm并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl、5mM CaCl2，pH6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离氨氧基-PSA试剂。随后用100％缓冲液E(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF，使用Vivaspin 15R 10kD离心过滤器浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl和5mM CaCl2的组氨酸缓冲液(Ph 7.2)进行最后渗滤步骤。通过测量总蛋白质(布莱德法)和FIX产色活性以分析法表征制剂。PSA-rFIX缀合物显示与天然rFIX相比，测得比活性＞50％。
方法2：
将12.3mg rFIX溶解于L-组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中，得到1mg rFIX/ml的最终蛋白质浓度。添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下在pH 6.0下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加1M L-半胱氨酸水溶液(或其它淬灭试剂)来淬灭，持续15分钟，得到10mM的最终浓度。随后使用Vivaspin 15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型rFIX的所得渗余物(8.8ml)与间甲苯胺水溶液(50mM)混合，得到10mM的最终浓度并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在pH 6.0下孵育此混合物2.5小时；在+4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育0.5小时至18小时。
借助于阴离子交换色谱(AEC)移除游离rFIX。用适量缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2，pH 7.5)稀释反应混合物以校正溶液传导率和pH，随后加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mMHepes、1M NaCl、5mM CaCl2，pH 7.5)洗脱柱。通过阶段梯度，使用25％缓冲液B洗脱游离rFIX，使得所得级分中的传导率在12-25mS/cm之间，并且使用50％缓冲液B的阶段梯度洗脱缀合物，使得缀合物级分中的传导率在27-45mS/cm之间。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mM CaCl2，pH 6.9，或通过使用抗离液盐，例如硫酸铵、乙酸铵等)升至190mS/cm并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl、5mM CaCl2，pH6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT或类似HIC介质)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离氨氧基-PSA试剂。随后用100％缓冲液E(50mM Hepes、5mMCaCl2，pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD，Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl和5mM CaCl2的L-组氨酸缓冲液(pH 7.2)进行最后渗滤步骤。通过测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和FIX产色和凝结活性以分析法表征制剂。对于PSA-rFIX缀合物，与天然rFIX相比，测得比活性＞50％。
方法3：
将25.4mg rFIX溶解于18.7ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加531μl高碘酸钠水溶液(5mM)和5.07ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加25μl1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。
借助于阴离子交换色谱(AEC)移除游离rFIX。用20ml缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2，pH 7.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl、5mM CaCl2，pH7.5)洗脱柱。游离rFIX以12-25mS/cm之间的传导率洗脱并且缀合物以27-45mS/cm之间的传导率洗脱。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mMCaCl2，pH 6.9)升至190mS/cm并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl、5mM CaCl2，pH6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离氨氧基-PSA试剂。随后用100％缓冲液E(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD，Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl和5mM CaCl2的组氨酸缓冲液(pH 7.2)进行最后渗滤步骤。通过测量总蛋白质(布莱德法)和FIX产色活性以分析法表征制剂。对于PSA-rFIX缀合物，与天然rFIX相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion 2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离FIX。缀合物由57％单聚唾液酸化产物和31％二聚唾液酸化产物和12％三聚唾液酸化产物组成。
方法4：
将25.4mg rFIX溶解于L-组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中，得到2mg rFIX/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)移除游离rFIX。用适量缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2，pH 7.5)稀释反应混合物以校正溶液传导率和pH值，随后加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mMHepes、1M NaCl、5mM CaCl2，pH 7.5)洗脱柱。通过阶段梯度，使用25％缓冲液B洗脱游离rFIX，使得所得级分中的传导率在12-25mS/cm之间，并且使用50％缓冲液B的阶段梯度洗脱缀合物，使得缀合物级分中的传导率在27-45mS/cm之间。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mM CaCl2，pH 6.9；通过使用抗离液盐，例如乙酸铵)升至190mS/cm并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl、5mM CaCl2，pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT；或类似HIC介质)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离氨氧基-PSA试剂。随后用100％缓冲液E(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD，Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl和5mM CaCl2的L-组氨酸缓冲液(pH 7.2)进行最后渗滤步骤。通过测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和FIX产色和凝结活性以分析法表征制剂。对于PSA-rFIX缀合物，与天然rFIX相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离FIX。缀合物由57％单聚唾液酸化产物和31％二聚唾液酸化产物和12％三聚唾液酸化产物组成。
实施例12
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使rFVIII聚唾液酸化
方法1：
将50mg rFVIII转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。使溶液通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2，pH7.0)平衡并且体积为20ml的IEX柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡柱。接着用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化型rFVIII。收集含有rFVIII的级分。测定蛋白质含量(考马斯法、布莱德法)并且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。接着添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基-PSA试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)使反应混合物的传导率升至130mS/cm并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后，收集含有PSA-rFVIII的级分并且通过使用由再生纤维素制成的30kD膜(88cm2，Millipore)进行UF/DF。通过测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和FVIII产色活性以分析法表征制剂。PSA-rFVIII缀合物显示与天然rFVIII相比，测得比活性＞70％。
方法2：
将含来源于ADVATE过程的58mg重组因子VIII(rFVIII)的Hepes缓冲液(50mMHEPES、约350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.1％聚山梨酸酯80，pH 7.4)溶解于反应缓冲液(50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200tM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
进一步通过阴离子交换色谱，在EMD TMAE(M)(Merck)上纯化氧化型rFVIII。将混合物用缓冲液A(20mM Hepes，5mM CaCl2，pH6.5)稀释，得到5ms/cm的传导率。使用1.5cm/min的流速将此溶液加载于具有10ml柱体积的IEX柱(床高度：5.4cm)上。随后用5CV的缓冲液A和缓冲液B(20mM Hepes，5mM CaCl2，1.0M NaCl，pH 7.0)的92∶8混合物(w/w)洗涤(流速：1.5cm/min)此柱。接着用缓冲液A与缓冲液B的50∶50(w/w)混合物洗脱氧化型rFVIII，随后用5CV缓冲液B进行后洗脱步骤。通过使用1.0cm/min的流速进行洗脱步骤。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型rFVIII的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC)，使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm并且所得柱体积(CV)为81ml的柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PSA-rFVIII缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵掺入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合并且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/min的流速加载于HIC柱上，随后使用＞3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙，pH 6.9)进行洗涤步骤。
为了移除反应副产物和抗离液盐，用＞5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes，3M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)以2cm/min的流速以向上的方式进行第二洗涤步骤。然后使用40％洗涤缓冲液2(50mM Hepes，1.5M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)和60％洗脱缓冲液(20mM Hepes，5mM氯化钙，pH 7.5)的阶段梯度以1cm/min的流速以向下的方式进行纯化的PSA-rFVIII缀合物的洗脱。在UV 280nm下监控PSA-rFVIII缀合物的洗脱并且在＜4CV内收集含有缀合物的洗脱液。用＞3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFVIII。
最后，通过超滤/渗滤(UF/DF)，使用由再生纤维素制成并且分子量截断值为30kD的膜(88cm2，Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过测量总蛋白质、FVIII产色活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。对于所得缀合物，计算得到比活性＞50％和PSA程度＞5.0。
方法3：
将50mg rFVIII转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。接着添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(最终浓度：10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)使反应混合物的传导率升至130mS/cm并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween80(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后，收集含有PSA-rFVIII的级分并且通过使用由再生纤维素制成的30kD膜(88cm2，Millipore)进行UF/DF。通过测量总蛋白质(布莱德法)和FVIII产色活性以分析法表征制剂。对于PSA-rFVIII缀合物，与天然rFVIII相比，测得比活性≥70％。
方法4：
将含来源于ADVATE过程的50mg重组因子VIII(rFVIII)的50mM Hepes缓冲液(50mMHEPES、约350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.1％聚山梨酸酯80，pH 7.4)溶解于反应缓冲液(50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此rFVIII溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC)，使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm并且所得柱体积(CV)为81ml的柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PSA-rFVIII缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵掺入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合并且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/min的流速加载于HIC柱上，随后使用＞3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙，pH 6.9)进行洗涤步骤。
为了移除反应副产物和抗离液盐，用＞5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes，3M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)以2cm/min的流速以向上的方式进行第二洗涤步骤。然后使用40％洗涤缓冲液2(50mM Hepes，1.5M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)和60％洗脱缓冲液(20mM Hepes，5mM氯化钙，pH 7.5)的阶段梯度以1cm/min的流速以向下的方式进行纯化的rFVIII缀合物的洗脱。在UV 280nm下监控PSA-rFVIII缀合物的洗脱并且在＜4CV内收集含有缀合物的洗脱液。用＞3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFVIII。
最后，通过超滤/渗滤(UF/DF)，使用由再生纤维素制成并且具有分子量截断值30kD的膜(88cm2，Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过测量总蛋白质、FVIII产色活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
分析数据(6个连续批次的平均值)：
过程产率(布莱德法)：58.9％
过程产率(FVIII色谱)：46.4％
比活性：(FVIII产色活性/mg蛋白质)：4148IU/mg
比活性(起始材料％)：79.9％
PSA程度(mol/mol)：8.1
实施例13
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺来使rFVIII聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFVIII聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将14.7mg rFVIII溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加296μl高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin 15R10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型rFVIII的渗余物(10.9ml)与2.94ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱，在Q琼脂糖FF上纯化PEG-rFVIII缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用30kD膜(50cm2，Millipore)进行UF/DF。通过测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和FVIII产色活性以分析法表征制剂。预期PEG-rFVIII缀合物将显示与天然rFVIII相比，测得比活性＞70％。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFVIII聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将起始重量或浓度的rFVIII溶解于或转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
进一步通过阴离子交换色谱，在EMD TMAE(M)(Merck)上纯化氧化型rFVIII。将混合物用缓冲液A(20mM Hepes，5mM CaCl2，pH6.5)稀释，得到5ms/cm的传导率。使用1.5cm/min的流速将此溶液加载于具有10ml柱体积的IEX柱(床高度：5.4cm)上。随后用5CV的缓冲液A和缓冲液B(20mM Hepes，5mM CaCl2，1.0M NaCl，pH 7.0)的92∶8混合物(w/w)洗涤(流速：1.5cm/min)此柱。接着用缓冲液A与缓冲液B的50∶50(w/w)混合物洗脱氧化型rFVIII，随后用5CV缓冲液B进行后洗脱步骤。通过使用1.0cm/min的流速进行洗脱步骤。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型rFVIII的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC)，使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm并且所得柱体积(CV)为81ml的柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PEG-rFVIII缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵掺入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合并且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/min的流速加载于HIC柱上，随后使用＞3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙，pH 6.9)进行洗涤步骤。
为了移除反应副产物和抗离液盐，用＞5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes，3M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)以2cm/min的流速以向上的方式进行第二洗涤步骤。然后使用40％洗涤缓冲液2(50mM Hepes，1.5M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)和60％洗脱缓冲液(20mM Hepes，5mM氯化钙，pH 7.5)的阶段梯度以1cm/min的流速以向下的方式进行纯化的rFVIII缀合物的洗脱。在UV 280nm下监控PEG-rFVIII缀合物的洗脱并且在＜4CV内收集含有缀合物的洗脱液。用＞3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFVIII。
最后，通过超滤/渗滤(UF/DF)，使用由再生纤维素制成并且具有分子量截断值30kD的膜(Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFVIII聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将溶解于6mlHepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中的7.84mg rFVIII与314μl高碘酸钠水溶液(10mM)和1.57ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-rFVIII缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用30kD膜(88cm2，Millipore)进行UF/DF。通过FVIII产色测定和测定总蛋白质(布莱德法)以分析法表征缀合物，显示与rFVIII起始材料相比，比活性＞60％。
方法4：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFVIII聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的rFVIII转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg rFVIII/ml的最终蛋白质浓度。随后，在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)移除游离rFVIII。用适量缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2，pH 7.5)稀释反应混合物以校正溶液传导率和pH值，随后加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mMHepes、1M NaCl、5mM CaCl2，pH 7.5)洗脱柱。通过阶段梯度，使用25％缓冲液B洗脱游离rFVIII，使得所得级分的传导率在12-25mS/cm之间，并且使用50％缓冲液B的阶段梯度洗脱缀合物，使得缀合物级分的传导率在27-45mS/cm之间。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mM CaCl2，pH 6.9；通过使用抗离液盐，例如硫酸铵、乙酸铵等)升高并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl、5mM CaCl2，pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT；或类似HIC介质)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PEG-试剂。随后用100％缓冲液E(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD，Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例14
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使rFVIIa聚唾液酸化
方法1：
将起始浓度或重量的重组因子VIIa(rFVIIa)转移至或溶解于反应缓冲液(50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到50μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
进一步通过阴离子交换色谱，在EMD TMAE(M)(Merck)上纯化氧化型rFVIIa。将混合物用缓冲液A(20mM Hepes，5mM CaCl2，pH 6.5)稀释，得到5mS/cm的传导率。使用1.5cm/min的流速将此溶液加载于具有10ml柱体积的IEX柱(床高度：5.4cm)上。随后用5CV的缓冲液A和缓冲液B(20mM Hepes，5mM CaCl2，1.0M NaCl，pH 7.0)的92∶8混合物(w/w)洗涤(流速：1.5cm/min)此柱。接着用缓冲液A与缓冲液B的50∶50(w/w)混合物洗脱氧化型rFVIIa，随后用5CV缓冲液B进行后洗脱步骤。通过使用1.0cm/min的流速进行洗脱步骤。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型rFVIIa的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC)，使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm并且所得柱体积(CV)为81ml的柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PSA-rFVIIa缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵掺入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合并且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/min的流速加载于HIC柱上，随后使用＞3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙，pH 6.9)进行洗涤步骤。
为了移除反应副产物和抗离液盐，用＞5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes，3M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)以2cm/min的流速以向上的方式进行第二洗涤步骤。然后使用40％洗涤缓冲液2(50mM Hepes，1.5M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)和60％洗脱缓冲液(20mM Hepes，5mM氯化钙，pH 7.5)的阶段梯度以1cm/min的流速以向下的方式进行纯化的rFVIIa缀合物的洗脱。在UV 280nm下监控PSA-rFVIIa缀合物的洗脱并且在＜4CV内收集含有缀合物的洗脱液。用＞3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFVIIa。
最后，通过超滤/渗滤(UF/DF)，使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(例如10kD MWCO，88cm2，Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法2：
将起始重量或浓度的rFVIIa溶解于或转移至反应缓冲液(50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此rFVIIa溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到150μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC)，使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm并且所得柱体积(CV)为81ml的柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PSA-rFVIIa缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵掺入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合并且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/min的流速加载于HIC柱上，随后使用＞3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙，pH 6.9)进行洗涤步骤。
为了移除反应副产物和抗离液盐，用＞5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes，3M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)以2cm/min的流速以向上的方式进行第二洗涤步骤。然后使用40％洗涤缓冲液2(50mM Hepes，1.5M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)和60％洗脱缓冲液(20mM Hepes，5mM氯化钙，pH 7.5)的阶段梯度以1cm/min的流速以向下的方式进行纯化的rFVIIa缀合物的洗脱。在UV 280nm下监控PSA-rFVIIa缀合物的洗脱并且在＜4CV内收集含有缀合物的洗脱液。用＞3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFVIII。
最后，通过超滤/渗滤(UF/DF)，使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例15
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使rFIX聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFIX聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将起始重量或浓度的rFIX溶解于或转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
进一步通过阴离子交换色谱，在EMD TMAE(M)(Merck)上纯化氧化型rFVIII。将混合物用缓冲液A(20mM Hepes，5mM CaCl2，pH 6.5)稀释，得到5mS/cm的传导率。使用1.5cm/min的流速将此溶液加载于具有10ml柱体积的IEX柱(床高度：5.4cm)上。随后用5CV的缓冲液A和缓冲液B(20mM Hepes，5mM CaCl2，1.0M NaCl，pH 7.0)的92∶8混合物(w/w)洗涤(流速：1.5cm/min)此柱。接着用缓冲液A与缓冲液B的50∶50(w/w)混合物洗脱氧化型rFIX，随后用5CV缓冲液B进行后洗脱步骤。通过使用1.0cm/min的流速进行洗脱步骤。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型rFIX的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC)，使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm并且所得柱体积(CV)为81ml的柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PEG-rFIX缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵掺入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合并且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/min的流速加载于HIC柱上，随后使用＞3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙，pH 6.9)进行洗涤步骤。
为了移除反应副产物和抗离液盐，用＞5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes，3M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)以2cm/min的流速以向上的方式进行第二洗涤步骤。然后使用40％洗涤缓冲液2(50mM Hepes，1.5M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)和60％洗脱缓冲液(20mM Hepes，5mM氯化钙，pH 7.5)的阶段梯度以1cm/min的流速以向下的方式进行纯化的rFIX缀合物的洗脱。在UV 280nm下监控PEG-rFIX缀合物的洗脱并且在＜4CV内收集含有缀合物的洗脱液。用＞3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFIX。
最后，通过超滤/渗滤(UF/DF)，使用由再生纤维素制成并且具有分子量截断值10kD的膜(88cm2，Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFIX聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的rFIX转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg rFIX/ml的最终蛋白质浓度。随后，在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)移除游离rFIX。用适量缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2，pH 7.5)稀释反应混合物以校正溶液传导率和pH值，随后加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mMHepes、1M NaCl、5mM CaCl2，pH 7.5)洗脱柱。通过阶段梯度，使用25％缓冲液B洗脱游离rFIX，使得所得级分的传导率在12-25mS/cm之间，并且使用50％缓冲液B的阶段梯度洗脱缀合物，使得缀合物级分的传导率在27-45mS/cm之间。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mM CaCl2，pH 6.9；通过使用抗离液盐，例如乙酸铵等)升高并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl、5mM CaCl2，pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT；或类似HIC介质)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离氨氧基-PEG试剂。随后用100％缓冲液E(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD，Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例16
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使rFVIIa聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFVIIa聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将起始重量或浓度的rFVIIa溶解于或转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到50μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
进一步通过阴离子交换色谱，在EMD TMAE(M)(Merck)上纯化氧化型rFVIIa。将混合物用缓冲液A(20mM Hepes，5mM CaCl2，pH 6.5)稀释，得到5ms/cm的传导率。使用1.5cm/min的流速将此溶液加载于具有10ml柱体积的IEX柱(床高度：5.4cm)上。随后用5CV的缓冲液A和缓冲液B(20mM Hepes，5mM CaCl2，1.0M NaCl，pH 7.0)的92∶8混合物(w/w)洗涤(流速：1.5cm/min)此柱。接着用缓冲液A与缓冲液B的50∶50(w/w)混合物洗脱氧化型rFVIIa，随后用5CV缓冲液B进行后洗脱步骤。通过使用1.0cm/min的流速进行洗脱步骤。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型rFVIIa的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC)，使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm并且所得柱体积(CV)为81ml的柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PEG-rFVIIa缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵掺入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合并且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/min的流速加载于HIC柱上，随后使用＞3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙，pH 6.9)进行洗涤步骤。
为了移除反应副产物和抗离液盐，用＞5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes，3M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)以2cm/min的流速以向上的方式进行第二洗涤步骤。然后使用40％洗涤缓冲液2(50mM Hepes，1.5M氯化钠，5mM氯化钙，pH 6.9)和60％洗脱缓冲液(20mM Hepes，5mM氯化钙，pH 7.5)的阶段梯度以1cm/min的流速以向下的方式进行纯化的rFVIIa缀合物的洗脱。在UV 280nm下监控PEG-rFVIIa缀合物的洗脱并且在＜4CV内收集含有缀合物的洗脱液。用＞3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFVIIa。
最后，通过超滤/渗滤(UF/DF)，使用由再生纤维素制成并且具有分子量截断值10kD的膜(Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFVIIa聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的rFVIIa转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg rFVIIa/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)移除游离rFVIIa。用适量缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2，pH 7.5)稀释反应混合物以校正溶液传导率和pH值，随后加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mMHepes、1M NaCl、5mM CaCl2，pH 7.5)洗脱柱。通过阶段梯度，使用25％缓冲液B洗脱游离rFVIIa，使得所得级分的传导率在12-25mS/cm之间，并且使用50％缓冲液B的阶段梯度洗脱缀合物，使得缀合物级分的传导率在27-45mS/cm之间。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mM CaCl2，pH 6.9；通过使用抗离液盐，例如乙酸铵)升高并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl、5mM CaCl2，pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT；或类似HIC介质)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PEG-试剂。随后用100％缓冲液E(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD，Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例17
在邻氨基苯甲酸存在下使rFIX聚唾液酸化
方法1：
将8.2mg rFIX溶解于4.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加82μl高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加4μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin 6 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型rFIX的渗余物(6.5ml)与1.64ml邻氨基苯甲酸水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
缀合物的进一步纯化如本文所述进行。
方法2：
制备含有5倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)的1mg rFIX于0.65ml磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中的溶液。接着，添加333μl的邻氨基苯甲酸水溶液(30mM)作为亲核性催化剂，得到10mM的最终浓度。随后，添加20μl的NaIO4水溶液(5mM)，产生100μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合过程2小时并且在室温下通过添加1μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。缀合物的进一步纯化如本文所述进行。
实施例18
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使EPO聚唾液酸化
方法1：
将起始浓度的红细胞生成素(EPO)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物，或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.0)平衡并且体积为20ml的IEX柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化型EPO。收集含有EPO的级分。测定蛋白质含量(考马斯法、布莱德法)并且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH 6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基-PSA试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mMHepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-EPO的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(MWCO10kD，50cm2，Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。
将10mg EPO溶解于5ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加100μl高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加50μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型EPO的渗余物(约7ml)与2ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
借助于阴离子交换色谱(AEC)移除游离EPO。用20ml缓冲液A(50mM Hepes，pH 7.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10柱(GEHealthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl，pH 7.5)洗脱柱。通过用25％缓冲液B洗涤柱来洗脱游离EPO并且用50％缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl，pH 6.9)升至约190mS/cm并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl，pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GEHealthcare，Fairfield，CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后，用100％缓冲液E(50mM Hepes，pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH7.2)进行最后渗滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA-EPO缀合物，与天然EPO相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion 2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离EPO。
方法2：
将EPO转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型EPO。收集洗脱液中含有氧化型EPO的级分并且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型EPO的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在pH 6.0下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度：1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-EPO缀合物。收集含有PSA-EPO缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
将红细胞生成素(EPO)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween 80(pH 6.9)预平衡并且填充有苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用50mMHepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-EPO的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(MWCO 10kD，88cm2，Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。将10mg EPO溶解于8ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加200μl高碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加100μl1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。
借助于阴离子交换色谱(AEC)移除游离EPO。用20ml缓冲液A(50mM Hepes，pH 7.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10柱(GEHealthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl，pH 7.5)洗脱柱。通过用25％缓冲液B洗涤柱来洗脱游离EPO并且用50％缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl，pH 6.9)升至约190mS/cm并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl，pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GEHealthcare，Fairfield，CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后，用100％缓冲液E(50mM Hepes，pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD，Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH7.2)进行最后渗滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA-EPO缀合物，与天然EPO相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion 2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离EPO。
方法4：
将EPO溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此EPO溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得PSA-EPO缀合物。收集洗脱液中含有PSA-EPO的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(MWCO 10kD，88cm2，Millipore)进行超滤/渗滤(UF/DF)来浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例19
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使Ang-2聚唾液酸化
方法1：
将起始浓度的促血管生成素-2(Ang-2)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物，或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.0)平衡并且体积为20ml的IEX柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化型Ang-2。收集含有Ang-2的级分。测定蛋白质含量(考马斯法、布莱德法)并且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-Ang-2的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。将促血管生成素-2(Ang-2)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-Ang-2缀合物的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
将Ang-2转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型Ang-2。收集洗脱液中含有氧化型Ang-2的级分并且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型Ang-2的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在pH 6.0下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度：1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-Ang-2缀合物。
收集含有PSA-Ang-2缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
将促血管生成素-2(Ang-2)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的PSA氨氧基试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween 80(pH 6.9)预平衡并且填充有苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用50mMHepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA Ang-2的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。将促血管生成素-2(Ang-2)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的PSA氨氧基试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后，在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)并且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSA Ang-2的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
将Ang-2溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此Ang-2溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得PSA-Ang-2缀合物。收集洗脱液中含有PSA-Ang-2的级分并且通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例20
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使VEGF聚唾液酸化
方法1：
将起始浓度的血管内皮生长因子(VEGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物，或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.0)平衡并且体积为20ml的IEX柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化型VEGF。收集含有VEGF的级分。测定蛋白质含量(考马斯法、布莱德法)并且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M NaOH调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-VEGF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。将血管内皮生长因子(VEGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-VEGF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
将VEGF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型VEGF。收集洗脱液中含有氧化型VEGF的级分并且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型VEGF的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在pH 6.0下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度：1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-VEGF缀合物。收集含有PSA-VEGF缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
将血管内皮生长因子(VEGF)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的PSA氨氧基试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween 80(pH 6.9)预平衡并且填充有苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用50mMHepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-VEGF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。将血管内皮生长因子(VEGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后，在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)并且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSA-VEGF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
将VEGF溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此VEGF溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得VEGF-缀合物。收集洗脱液中含有PSA-VEGF的级分并且通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例21
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使EGF聚唾液酸化
方法1：
将起始浓度的表皮生长因子(EGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物，或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.0)平衡并且体积为20ml的IEX柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化型EGF。收集含有EGF的级分。测定蛋白质含量(考马斯法、布莱德法)并且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH 6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-EGF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。将表皮生长因子(EGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-EGF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
将EGF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型EGF。收集洗脱液中含有氧化型EGF的级分并且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型EGF的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在pH 6.0下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度：1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-EGF缀合物。收集含有PSA-EGF缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
将表皮生长因子(EGF)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的PSA氨氧基试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween 80(pH 6.9)预平衡并且填充有苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用50mMHepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-EGF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。将表皮生长因子(EGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的PSA氨氧基试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后，在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)并且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
将EGF溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此EGF溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得EGF-缀合物。收集洗脱液中含有PSA-EGF的级分并且通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例22
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使NGF聚唾液酸化
方法1：
将起始浓度的神经生长因子(NGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物，或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.0)平衡并且体积为20ml的IEX柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化型NGF。收集含有NGF的级分。测定蛋白质含量(考马斯法、布莱德法)并且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH 6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-NGF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。将神经生长因子(NGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-NGF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
将NGF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型NGF。收集洗脱液中含有氧化型NGF的级分并且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型NGF的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在pH 6.0下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度：1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-NGF缀合物。收集含有PSA-NGF缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
将神经生长因子(NGF)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween 80(pH 6.9)预平衡并且填充有苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用50mMHepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-NGF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。将神经生长因子(NGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后，在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)并且通过离子交换色谱纯化缀合物。接着收集洗脱液中含有PSA-NGF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
将NGF溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此NGF溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得NGF-缀合物。收集洗脱液中含有PSA-NGF的级分并且通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例23
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使HGH聚唾液酸化
方法1：
如本文所述，人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使HGH糖基化。
将起始浓度的人生长激素(HGH)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物，或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.0)平衡并且体积为20ml的IEX柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化型HGH。收集含有HGH的级分。测定蛋白质含量(考马斯法、布莱德法)并且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH 6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-HGH的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。如本文所述，人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使HGH糖基化。将HGH转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-HGH的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
如本文所述，人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使HGH糖基化。
将HGH转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型HGH。收集洗脱液中含有氧化型HGH的级分并且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型HGH的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在pH 6.0下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度：1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-HGH缀合物。收集含有PSA-HGH缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
如本文所述，人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使HGH糖基化。
将人生长激素(HGH)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween 80(pH 6.9)预平衡并且填充有苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA HGH的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。如本文所述，人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使HGH糖基化。将HGH转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后，在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)并且通过离子交换色谱纯化缀合物。接着收集洗脱液中含有PSA-HGH的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
如本文所述，人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使HGH糖基化。
将HGH溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此HGH溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得HGH-缀合物。收集洗脱液中含有PSA-HGH的级分并且通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例24
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使TNF-α聚唾液酸化
将起始浓度的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物，或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.0)平衡并且体积为20ml的IEX柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化型TNF-α。收集含有TNF-α的级分。测定蛋白质含量(考马斯法、布莱德法)并且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-TNF-α的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。将肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-TNF-α的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
将TNF-α转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型TNF-α。收集洗脱液中含有氧化型TNF-α的级分并且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型TNF-α的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在pH 6.0下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度：1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-TNF-α缀合物。收集含有PSA-TNF-α缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
将肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转移至反应缓冲液(例如50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween 80(pH6.9)预平衡并且填充有苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用50mMHepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-TNF-α的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。将肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后，在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)并且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSA-TNF-α的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
将TNF-α溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此TNF-α溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得TNF-α缀合物。收集洗脱液中含有PSA-TNF-α的级分并且通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例25
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使胰岛素聚唾液酸化
方法1：
如本文所述，胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使胰岛素糖基化。将起始浓度的胰岛素转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物，或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.0)平衡并且体积为20ml的IEX柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化型胰岛素。收集含有胰岛素的级分。测定蛋白质含量(考马斯法、布莱德法)并且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-胰岛素的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。如本文所述，胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使胰岛素糖基化。将胰岛素转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-胰岛素的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
如本文所述，胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使胰岛素糖基化。
将胰岛素转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型胰岛素。收集洗脱液中含有氧化型胰岛素的级分并且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型胰岛素的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在pH 6.0下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度：1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-胰岛素缀合物。收集含有PSA-胰岛素缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
如本文所述，胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使胰岛素糖基化。
将胰岛素转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mMHepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween 80(pH 6.9)预平衡并且填充有苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-胰岛素的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。如本文所述，胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使胰岛素糖基化。
将胰岛素转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后，在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)并且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSA-胰岛素的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
如本文所述，胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使胰岛素糖基化。
将胰岛素溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此胰岛素溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得胰岛素缀合物。收集洗脱液中含有PSA-胰岛素的级分并且通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例26
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使干扰素-α聚唾液酸化
方法1：
将起始浓度的干扰素-α转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物，或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.0)平衡并且体积为20ml的IEX柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化型干扰素-α。收集含有干扰素-α的级分。测定蛋白质含量(考马斯法、布莱德法)并且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-干扰素-α的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。将干扰素-α转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-干扰素-α的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
将干扰素-α转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型干扰素-α。收集洗脱液中含有氧化型干扰素-α的级分并且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型干扰素-α的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在pH 6.0下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度：1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-干扰素-α缀合物。收集含有PSA-干扰素-α缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
方法3：
将干扰素-α转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的PSA氨氧基试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mMHepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween 80(pH 6.9)预平衡并且填充有苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-干扰素-α的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。将干扰素-α转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后，在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)并且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSA-干扰素-α的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
将干扰素-α溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此干扰素-α溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得干扰素-α缀合物。收集洗脱液中含有PSA-干扰素-α的级分并且通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例27
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使干扰素-γ聚唾液酸化
方法1：
将10mg干扰素-γ溶解于5ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl)中。接着添加100μl高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加50μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin 15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型干扰素-γ的渗余物(约7ml)与2ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
借助于阳离子交换色谱(cation exchange chromatography，CEC)移除游离干扰素-γ。用20ml缓冲液A(50mM Hepes，pH 6.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep SPFF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mMHepes、1M NaCl，pH 6.5)洗脱柱。通过用25％缓冲液B洗涤柱来洗脱游离干扰素-γ并且用50％缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5MNaCl，pH 6.9)升至约190mS/cm并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl，pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后，用100％缓冲液E(50mM Hepes，pH 6.9)洗脱缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD，Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后渗滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA-干扰素-γ缀合物，与天然干扰素-γ相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion 2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离干扰素γ。
方法2：
将10mg干扰素-γ溶解于8ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl)中。接着添加200μl高碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加100μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。
借助于阳离子交换色谱(CEC)移除游离干扰素γ。用20ml缓冲液A(50mM Hepes，pH6.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep SPFF 16/10柱(GEHealthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl，pH 6.5)洗脱柱。通过用25％缓冲液B洗涤柱来洗脱游离干扰素-γ并且用50％缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl，pH 6.9)升至约190mS/em并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl，pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后，用100％缓冲液E(50mM Hepes，pH 6.9)洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后渗滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA-干扰素-γ缀合物，与天然干扰素-γ相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离干扰素-γ。
方法3：
将10mg干扰素-γ溶解于8ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl)中。接着添加200μl高碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加100μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。
借助于阳离子交换色谱(CEC)移除游离干扰素γ。用20ml缓冲液A(50mM Hepes，pH6.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep SPFF 16/10柱(GEHealthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl，pH 6.5)洗脱柱。通过用25％缓冲液B洗涤柱来洗脱游离干扰素-γ并且用50％缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl，pH 6.9)升至约190mS/em并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl，pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后，用100％缓冲液E(50mM Hepes，pH 6.9)洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后渗滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA-干扰素-γ缀合物，与天然干扰素-γ相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离干扰素-γ。
方法4：
将干扰素-γ溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此干扰素-γ溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得干扰素-γ缀合物。收集洗脱液中含有PSA-干扰素-γ的级分并且通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例28
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使G-CSF聚唾液酸化
方法1：
将起始浓度的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物，或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.0)平衡并且体积为20ml的IEX柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化型G-CSF。收集含有G-CSF的级分。测定蛋白质含量(考马斯法、布莱德法)并且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-G-CSF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。将粒细胞集落刺激因子(G-CSF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-G-CSF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
将G-CSF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型G-CSF。收集洗脱液中含有氧化型G-CSF的级分并且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型G-CSF的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在pH 6.0下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度：1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-G-CSF缀合物。收集含有PSA-G-CSF缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
将粒细胞集落刺激因子(G-CSF)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween 80(pH6.9)预平衡并且填充有苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用50mMHepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-G-CSF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。将粒细胞集落刺激因子(G-CSF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后，在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)并且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSA-G-CSF的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
将G-CSF溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此G-CSF溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得G-CSF缀合物。收集洗脱液中含有PSA-G-CSF的级分并且通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例29
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使修美乐聚唾液酸化
方法1：
将起始浓度的修美乐(Humira)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物，或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.0)平衡并且体积为20ml的IEX柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化型修美乐。收集含有修美乐的级分。测定蛋白质含量(考马斯法、布莱德法)并且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-修美乐的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。将修美乐转移至反应缓冲液(例如50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量的氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-修美乐的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
将修美乐转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型修美乐。收集洗脱液中含有氧化型修美乐的级分并且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型修美乐的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在pH 6.0下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度：1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-修美乐缀合物。收集含有PSA-修美乐缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
将修美乐转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mMHepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween 80(pH 6.9)预平衡并且填充有苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-修美乐的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。将修美乐转移至反应缓冲液(例如50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后，在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)并且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSA-修美乐的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
将修美乐溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此修美乐溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得修美乐-缀合物。收集洗脱液中含有PSA-修美乐的级分并且通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例30
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使普罗利亚聚唾液酸化
方法1：
将起始浓度的普罗利亚(Prolia)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4，得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应，持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物，或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.0)平衡并且体积为20ml的IEX柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化型普罗利亚。收集含有普罗利亚的级分。测定蛋白质含量(考马斯法、布莱德法)并且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度：10mM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡并且填充有80ml苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-普罗利亚的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。将10mg普罗利亚溶解于5ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加100μl高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加50μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin 15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型普罗利亚的渗余物(约7ml)与2ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
借助于阳离子交换色谱(CEC)移除游离普罗利亚。用20ml缓冲液A(50mM Hepes，pH6.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep SPFF 16/10柱(GEHealthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl，pH 6.5)洗脱柱。通过用25％缓冲液B洗涤柱来洗脱游离普罗利亚并且用50％缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl，pH 6.9)升至约190mS/cm并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl，pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GEHealthcare，Fairfield，CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后，用100％缓冲液E(50mM Hepes，pH 6.9)洗脱缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD，Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH6.9)进行最后渗滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA-普罗利亚缀合物，与天然普罗利亚相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离普罗利亚。
方法2：
将普罗利亚转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型普罗利亚。收集洗脱液中含有氧化型普罗利亚的级分并且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型普罗利亚的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在pH 6.0下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度：1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得普罗利亚缀合物。收集含有普罗利亚缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
将普罗利亚转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且稀释，获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度：400μM)。在室温下在黑暗中在温和振荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应，持续60分钟(半胱氨酸浓度：10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)调整反应混合物的传导率并且加载于以50mMHepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween 80(pH 6.9)预平衡并且填充有苯基琼脂糖FF的柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA普罗利亚的级分并且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。将10mg普罗利亚溶解于8ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加200μl高碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加100μl1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。
借助于阳离子交换色谱(CEC)移除游离普罗利亚。用20ml缓冲液A(50mM Hepes，pH6.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep SPFF 16/10柱(GEHealthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl，pH 6.5)洗脱柱。通过用25％缓冲液B洗涤柱来洗脱游离普罗利亚并且用50％缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的级分的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl，pH 6.9)升至约190mS/cm并且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl，pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10柱(GEHealthcare，Fairfield，CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后，用100％缓冲液E(50mM Hepes，pH 6.9)洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH6.9)进行最后渗滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA-普罗利亚缀合物，与天然普罗利亚相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离普罗利亚。
方法4：
将普罗利亚溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此普罗利亚溶液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。最后，添加40mM高碘酸钠水溶液，得到400μM的浓度。
在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得普罗利亚缀合物。收集洗脱液中含有PSA-普罗利亚的级分并且通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例31
其它治疗性蛋白质的聚唾液酸化
在替代性亲核性催化剂(如本文所述的间甲苯胺或邻氨基苯甲酸)存在下进行的聚唾液酸化反应可扩展至其它治疗性蛋白质。例如，在本发明的各种方面，对于治疗性蛋白质(诸如本文所述的那些蛋白质)重复如本文所述的以上使用PSA氨氧基或PEG氨氧基试剂的聚唾液酸化或聚乙二醇化反应。
实施例32
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使EPO聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使红细胞生成素(EPO)聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将EPO溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型EPO的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱(例如在Q琼脂糖FF上)纯化PEG-EPO缀合物。例如，将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EPO聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将10mg EPO溶解于5ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加100μl高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加50μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型EPO的渗余物(约7ml)与2ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱，在Q琼脂糖FF上纯化PEG-EPO缀合物。用20ml缓冲液A(50mM Hepes，pH 7.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl，pH7.5)洗脱柱。通过用25％缓冲液B洗涤柱来洗脱游离EPO并且用50％缓冲液B洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 7.2)进行最后渗滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PEG-EPO缀合物，与天然EPO相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion 2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离EPO。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EPO聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。
将EPO转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型EPO。收集洗脱液中含有氧化型EPO的级分并且用于缀合反应。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型EPO的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-EPO缀合物。收集含有PEG-EPO缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EPO聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将EPO溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q琼脂糖FF上纯化PEG-EPO缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EPO聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将10mg EPO溶解于约8ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加200μl高碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加100μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q琼脂糖FF上纯化PEG-EPO缀合物。用20ml缓冲液A(50mM Hepes，pH 7.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl，pH7.5)洗脱柱。通过用25％缓冲液B洗涤柱来洗脱游离EPO并且用50％缓冲液B洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 7.2)进行最后渗滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PEG-EPO缀合物，与天然EPO相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion 2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离EPO。
方法4：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EPO聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的EPO转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg EPO/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-EPO缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例33
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使Ang-2聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使Ang-2聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将Ang-2溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型Ang-2的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱(例如在Q琼脂糖FF上)纯化PEG-Ang-2缀合物。例如，将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使Ang-2聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将Ang-2溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型Ang-2的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-Ang-2缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的级分，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使Ang-2聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。
将Ang-2转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型Ang-2。收集洗脱液中含有氧化型Ang-2的级分并且用于缀合反应。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型Ang-2的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-Ang-2缀合物。收集含有PEG-Ang-2缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使Ang-2聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将Ang-2溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q琼脂糖FF上纯化PEG-Ang-2缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使Ang-2聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将Ang-2溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-Ang-2缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的级分并接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使Ang-2聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的Ang-2转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg Ang-2/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-Ang-2缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
随后，借助于离子交换色谱(IEC)移除游离Ang-2。通过UF/DF浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。
实施例34
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使VEGF聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使VEGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将VEGF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型VEGF的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱(例如在Q琼脂糖FF上)纯化PEG-VEGF缀合物。例如，将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使VEGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将VEGF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型VEGF的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-VEGF缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的级分并接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使VEGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将VEGF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型VEGF。收集洗脱液中含有氧化型VEGF的级分并且用于缀合反应。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型VEGF的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-VEGF缀合物。收集含有PEG-VEGF缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使VEGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将VEGF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q琼脂糖FF上纯化PEG-VEGF缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使VEGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将VEGF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-VEGF缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的级分，接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使VEGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的VEGF转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg VEGF/ml的最终蛋白质浓度。随后，在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-VEGF缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例35
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使EGF聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将EGF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型EGF的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱(例如在Q琼脂糖FF上)纯化PEG-EGF缀合物。例如，将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将EGF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型EGF的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-EGF缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的级分，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将EGF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型EGF。收集洗脱液中含有氧化型EGF的级分并且用于缀合反应。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型NGF的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-EGF缀合物。收集含有PEG-EGF缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将EGF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-EGF缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将EGF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-EGF缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的级分，接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的EGF转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg EGF/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-EGF缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布菜德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例36
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使NGF聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20 kD聚乙二醇化试剂使NGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将NGF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型NGF的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-NGF缀合物。例如，将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布菜德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使NGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将NGF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型NGF的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-NGF缀合物。(收集洗脱液中含有缀合物的级分并接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使NGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将NGF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型NGF。收集洗脱液中含有氧化型NGF的级分并且用于缀合反应。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型NGF的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-NGF缀合物。收集含有PEG-NGF缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使NGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将NGF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q琼脂糖FF上纯化PEG-NGF缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使NGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将NGF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-NGF缀合物。收集含有缀合物的级分，接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使NGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的NGF转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg NGF/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-NGF缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布菜德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例37
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使HGH聚乙二醇化
方法1：
如本文所述，人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使HGH糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使HGH聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将HGH溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型HGH的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱(例如在Q琼脂糖FF上)纯化PEG-HGH缀合物。例如，将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在替代实施方案中，如下进行方法1。如本文所述，人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使HGH糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使HGH聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将HGH溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型HGH的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-HGH缀合物。(收集洗脱液中含有缀合物的级分并接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
如本文所述，人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使HGH糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使HGH聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将HGH转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型HGH。收集洗脱液中含有氧化型HGH的级分并且用于缀合反应。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型HGH的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-HGH缀合物。收集含有PEG-NGF缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
如本文所述，人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使HGH糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使HGH聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将HGH溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-HGH缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。如本文所述，人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使HGH糖基化。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使HGH聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将HGH溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-HGH缀合物。收集含有缀合物的级分，接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布菜德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
如本文所述，人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使HGH糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使HGH聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的HGH转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg HGH/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-HGH缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布菜德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例38
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使TNF-α聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使TNF-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将TNF-α溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型TNF-α的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-TNF-α缀合物。例如，将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使TNF-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将TNF-α溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型TNF-α的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-TNF-α缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的级分，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使TNF-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将TNF-α转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型TNF-α。收集洗脱液中含有氧化型TNF-α的级分并且用于缀合反应。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型TNFα的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-TNF-α缀合物。收集含有PEG-TNF-α缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使TNF-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将TNF-α溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-TNF-α缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使TNF-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将TNF-α溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-TNF-α缀合物。收集含有缀合物的级分，接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布菜德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使TNF-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的TNF-α转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg TNF-α/ml的最终蛋白质浓度。随后，在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-TNF-α缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例39
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使胰岛素聚乙二醇化
方法1：
如本文所述，胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使胰岛素糖基化。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使胰岛素聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将胰岛素溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型胰岛素的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-胰岛素缀合物。例如，将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mMCaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布菜德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。如本文所述，胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使胰岛素糖基化。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使胰岛素聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将胰岛素溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氯酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型胰岛素的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-胰岛素缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的级分，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
如本文所述，胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使胰岛素糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使胰岛素聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将胰岛素转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型胰岛素。收集洗脱液中含有氧化型胰岛素的级分并且用于缀合反应。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型胰岛素的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-胰岛素缀合物。收集含有PEG-胰岛素缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
如本文所述，胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使胰岛素糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使胰岛素聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将胰岛素溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q琼脂糖FF上纯化PEG-胰岛素缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。如本文所述，胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使胰岛素糖基化。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使胰岛素聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将胰岛素溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱纯化胰岛素缀合物。收集含有缀合物的级分，接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
如本文所述，胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后，根据所属领域中已知的方法体外使胰岛素糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使胰岛素聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的胰岛素转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg胰岛素/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-胰岛素缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布菜德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例40
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使干扰素-α聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将干扰素-α溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型干扰素-α的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-干扰素-α缀合物。例如，将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mMCaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将干扰素-α溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型干扰素-α的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-干扰素-α缀合物。收集含有缀合物的级分，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布菜德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将干扰素-α转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5NHCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型干扰素-α。收集洗脱液中含有氧化型干扰素-α的级分并且用于缀合反应。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型干扰素-α的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-干扰素-α缀合物。收集含有PEG-干扰素α缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将干扰素-α溶解于Hepes缓冲液(50mMHepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-干扰素-α缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将干扰素-α溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-干扰素-α缀合物。收集含有缀合物的级分，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布菜德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的干扰素-α转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中，得到2mg干扰素-α/ml的最终蛋白质浓度。随后，在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-干扰素-α缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例41
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使干扰素-γ聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-γ聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将10mg干扰素-γ溶解于5ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加100μl高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加50μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin 15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型干扰素-γ的渗余物(约7ml)与2ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱，在SP琼脂糖FF上纯化PEG-干扰素-γ缀合物。用20ml缓冲液A(50mM Hepes，pH 6.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrepSPFF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl，pH 6.5)洗脱柱。通过用25％缓冲液B洗涤柱来洗脱游离干扰素-γ并且用50％缓冲液B洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后渗滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PEG-干扰素-γ缀合物，与天然干扰素-γ相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion 2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离干扰素-γ。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-γ聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将干扰素-γ转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型干扰素-γ。收集洗脱液中含有氧化型干扰素-γ的级分并且用于缀合反应。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型干扰素-α的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-干扰素-γ缀合物。收集含有PEG-干扰素-γ缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-γ聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将10mg干扰素-γ溶解于约8ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加200μl高碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加100μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在SP-琼脂糖FF上纯化PEG-干扰素-γ缀合物。用20ml缓冲液A(50mM Hepes，pH 6.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrepSP FF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl，pH 6.5)洗脱柱。通过用25％缓冲液B洗涤柱来洗脱游离干扰素-γ并且用50％缓冲液B洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后渗滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PEG-干扰素-γ缀合物，与天然干扰素-γ相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion 2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离干扰素-γ。
方法4：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-γ聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的干扰素-γ转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中，得到2mg干扰素-γ/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-干扰素-γ缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例42
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使G-CSF聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使G-CSF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将G-CSF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型G-CSF的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-G-CSF缀合物。例如，将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使G-CSF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将G-CSF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型G-CSF的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-G-CSF缀合物。(收集洗脱液中含有缀合物的级分并接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使G-CSF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将G-CSF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型G-CSF。收集洗脱液中含有氧化型G-CSF的级分并且用于缀合反应。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型G-CSF的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-G-CSF缀合物。收集含有PEG-G-CSF缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
方法3：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使G-CSF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将G-CSF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-G-CSF缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使G-CSF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将G-CSF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-G-CSF缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的级分，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使G-CSF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的G-CSF转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg G-CSF/ml的最终蛋白质浓度。随后，在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化G-CSF缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例43
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使修美乐聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使修美乐聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将修美乐溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型修美乐的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-修美乐缀合物。例如，将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使修美乐聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将修美乐溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型修美乐的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-修美乐缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的级分，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使修美乐聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将修美乐转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型修美乐。收集洗脱液中含有氧化型修美乐的级分并且用于缀合反应。
随后，在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型修美乐的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-修美乐缀合物。收集含有PEG-修美乐缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
方法3：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使修美乐聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将修美乐溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-修美乐缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使修美乐聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将修美乐溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱纯化PEG-修美乐缀合物。收集含有缀合物的级分，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使修美乐聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的修美乐转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg修美乐/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化修美乐缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例44
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使普罗利亚聚乙二醇化
方法1：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使普罗利亚聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将普罗利亚溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型普罗利亚的渗余物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-普罗利亚缀合物。例如，将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(考马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使普罗利亚聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将10mg rFIX溶解于5ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加100μl高碘酸钠水溶液(5mM)并且在4℃下在黑暗中在温和搅拌下孵育反应混合物1小时，在室温下通过添加50μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。随后使用Vivaspin15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量高碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型普罗利亚的渗余物(约7ml)与2ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合并且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后，通过离子交换色谱，在SP琼脂糖FF上纯化PEG-普罗利亚缀合物。用20ml缓冲液A(50mM Hepes，pH 6.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep SPFF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl，pH6.5)洗脱柱。通过用25％缓冲液B洗涤柱来洗脱游离普罗利亚并且用50％缓冲液B洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后渗滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PEG-普罗利亚缀合物，与天然普罗利亚相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion 2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离普罗利亚。
方法2：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使普罗利亚聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将普罗利亚转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM高碘酸钠水溶液，得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T＝+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应，得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型普罗利亚。收集洗脱液中含有氧化型修美乐的级分并且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在温和搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型普罗利亚的洗脱液中。接着，在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)，得到10mM的最终浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在温和振荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-普罗利亚缀合物。收集含有PEG-普罗利亚缀合物的级分并通过超滤/渗滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成并且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
方法3：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使普罗利亚聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将EPO溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中并且与高碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂，产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-普罗利亚缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物，接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中，如下进行方法3。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使普罗利亚聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将10mg普罗利亚溶解于约8ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加200μl高碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且在室温下通过添加100μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭，持续15分钟。
最后，通过离子交换色谱，在SP-琼脂糖FF上纯化PEG-普罗利亚缀合物。用20ml缓冲液A(50mM Hepes，pH 6.5)稀释反应混合物并且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrepSPFF 16/10柱(GE Healthcare，Fairfield，CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl，pH 6.5)洗脱柱。通过用25％缓冲液B洗涤柱来洗脱游离普罗利亚并且用50％缓冲液B洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的级分。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后渗滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PEG-普罗利亚缀合物，与天然普罗利亚相比，测得比活性＞50％。另外通过尺寸排阻HPLC，使用装备有Shodex KW 803柱的Agilent 1200HPLC系统，在如先前所述的条件(Kolarich等，Transfusion 2006；46：1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离普罗利亚。
方法4：
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使普罗利亚聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的CA系列。将初始浓度或重量的修美乐转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中，得到2mg普罗利亚/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM高碘酸钠水溶液，得到100μM的最终浓度，随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液，得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述)，产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后，在室温下在黑暗中在温和搅拌下孵育混合物2小时并且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭，持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化普罗利亚缀合物。通过UF/DF，使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2，截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的级分。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2，pH 7.5)进行最后渗滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例45
使用支链PEG使治疗性蛋白质聚乙二醇化
本发明的治疗性蛋白质的聚乙二醇化可扩展至支链或线性聚乙二醇化试剂，其由醛和含有活性氨氧基的适合接头制成。
实施例46
二氨氧基接头与天然PSA的偶合
此实例描述使用天然PSA(即，先前未氧化)制备氨氧基-PSA试剂的程序，所述试剂随后可用于治疗性蛋白质的化学修饰。
a)环境温度下的偶合
将自印度血清研究所(Pune，India)获得的52.2mg天然PSA(MW＝20kD)溶解于1.05ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中。接着向反应混合物中逐滴加入10.3mg 3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺(接头分子)。在室温下在黑暗中在轻轻搅拌下孵育反应2小时。
b)在升高温度下的偶合
将自印度血清研究所(Pune，India)获得的52.2mg天然PSA(MW＝20kD)溶解于1.05ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中。接着向反应混合物中逐滴加入10.3mg 3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺(接头分子)。在室温下在黑暗中在轻轻搅拌下孵育反应2小时。接着使温度升高至32℃-37℃并且将反应混合物孵育另外的14小时。
c)在升高温度下和在增加的接头过量下的偶合
将自印度血清研究所(Pune，India)获得的52.2mg天然PSA(MW＝20kD)溶解于1.05ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中。接着向反应混合物中逐滴加入10.3mg 3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺(接头分子)。在室温下在黑暗中在轻轻搅拌下孵育反应2小时。接着向反应中逐滴加入26.3mg 3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺，使反应升高至32℃-37℃并且将反应混合物孵育另外的14小时。
d)PSA衍生物的纯化
在孵育完成后，通过充分透析纯化在a-c点下生成的反应混合物。因此，将反应混合物的样品加载于Slide-A-Lyzer透析盒(0-5-3ml，MWCO 3.5kD，增强型纤维素，Pierce)中并根据以下模式用10mM磷酸盐缓冲液pH 8.0透析。
在室温下用500ml缓冲液持续2小时
在室温下用500ml缓冲液持续2小时
在4℃下用500ml缓冲液持续12小时
在室温下用50ml“Slide-A-Lyzer透析用浓缩溶液”持续1小时，获得达到初始样品体积的浓度。
纯化的氨氧基-PSA因此准备好用于根据例如以上实施例11、12、14和17-31的蛋白质缀合反应中。同样，本文所述的任何水溶性聚合物可与此实施例中所述的氨氧基接头偶合并接着与以上实施例中所列的蛋白质缀合。
通过测量总PSA(间苯二酚测定)和总氨氧基(TNBS测定)以测定修饰程度而以分析法表征制剂。对于制备测得(a)修饰程度(MD)为0.35，对于(b)MD＝0.54，而对于(c)MD＝0.58。此外，测定多分散性以及游离3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺。对于所有制备，多分散性低于1.15并且游离接头的含量低于PSA浓度的0.15mol％。
对于在还原端修饰的PSA，通过13C NMR光谱测定以下结构。
实施例47
在4℃下使用色谱纯化步骤制备氨氧基-PSA
在室温下制备的氨氧基-PSA试剂的详细分析表征期间，NMR研究(参见例如美国临时专利申请号61/647,814，其以全部内容通过引用结合在此)揭示，用二氨氧基接头对氧化型PSA的衍生化由两个不同反应组成：在PSA非还原端的醛基的快速反应和在PSA的还原端的醛基(以半缩酮的形式)的慢速反应。后一反应可被视为是为了产生试剂而将要避免的非想要副反应。
因此，已如本实施例中所述优化了用于氨氧基-PSA试剂制备的方法。如果在室温下执行所述方法，还原端的反应仅将发生至显著程度。因此，对方法进行调整并在2℃-8℃下进行。通过在2℃-8℃下执行整个方法(化学反应和IEX对PSA试剂的纯化)，在PSA的还原端的副反应得以实质性减少。这种方法改变因此导致更高质量的试剂。
程序
将自印度血清研究所(Pune，India)获得的1290mg氧化型PSA(MW＝20kD)溶解于25ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)(缓冲液A)中。接着向反应混合物中添加209mg 3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺并且在2℃-8℃下在黑暗中在轻轻搅拌下孵育1小时。
在孵育后，采用在2-8℃温度下的冷室内执行的Fractogel EMD DEAE 650-M色谱凝胶(柱尺寸：XK26/135)对混合物进行弱阴离子交换色谱步骤。将反应混合物用预冷的110ml缓冲液A稀释并以1cm/min的流速加载到用缓冲液A预平衡的DEAE柱上。然后将柱以流速为2cm/min的20CV缓冲液B(20mM Hepes，pH 6.0)洗涤，以移除游离的3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺。接着用由67％缓冲液B与43％缓冲液C组成的阶段梯度(20mM Hepes、1M NaCl，pH7.5)洗脱氨氧基-PSA试剂。通过UF/DF，使用由聚醚砜制成的5kD膜(50cm2，Millipore)浓缩洗脱液。通过测量总PSA(间苯二酚测定)和总氨氧基(TNBS测定)以测定修饰程度而以分析法表征制剂。最终制剂中的PSA浓度为46.0mg/ml并且修饰程度为83.5％。此外，测得1.131的多分散性值。另外，测得游离3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺的浓度为0.22μg/ml(0.07mol％的PSA)。
纯化的氨氧基-PSA因此准备好用于根据以上实施例11、12、14和17-31的缀合反应中。

Claims (112)

1.一种使水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分缀合的方法，其包括在允许缀合的条件下使所述氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物接触；
其中，所述水溶性聚合物是PSA，所述活化的水溶性聚合物是活化的PSA，其含有活性氨氧基；
其中所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物通过以下方法制备，所述方法包括：
a)在允许在氧化型水溶性聚合物与包含活性氨氧基的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含所述氧化型水溶性聚合物的溶液与所述活化的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含介于1分钟与24小时之间的时段；介于2℃与8℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；从而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和
b)在介于2℃与8℃之间的温度下，通过选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组的方法来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；
所述碳水化合物部分通过与包含选自由以下组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而氧化：高碘酸钠(NaIO4)、四乙酸铅(Pb(OAc)4)和高钌酸钾(KRuO4)；
其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟键联；并且
其中所述肟键联形成由选自由以下组成的组的亲核性催化剂催化：邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含所述氧化型水溶性聚合物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接头在4℃下孵育1小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过在4℃温度下的阴离子交换色谱来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述氧化型水溶性聚合物是通过与NaIO4一起孵育而氧化形成的。
5.一种使水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分缀合的方法，其包括在允许缀合的条件下使所述氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物接触；
其中，所述水溶性聚合物是PSA，所述活化的水溶性聚合物是活化的PSA，其含有活性氨氧基；
其中所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物通过以下方法制备，所述方法包括：
a)在允许在非氧化水溶性聚合物与包含活性氨氧基的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含所述非氧化水溶性聚合物的溶液与所述活化的氨氧基接头一起孵育，所述条件如下：在光不存在下，在搅拌下将包含所述水溶性聚合物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接头在22℃下孵育2小时；所述方法还包括将所述溶液的温度增加到介于32℃与37℃之间的温度并孵育另外12-24小时的步骤从而形成所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和
b)通过选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组的方法来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；
所述碳水化合物部分通过与包含选自由以下组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而氧化：高碘酸钠(NaIO4)、四乙酸铅(Pb(OAc)4)和高钌酸钾(KRuO4)；
其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟键联；并且
其中所述肟键联形成是由选自由以下组成的组的亲核性催化剂催化：苯胺、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻甲氧基苯胺、间甲氧基苯胺和对甲氧基苯胺。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含所述水溶性聚合物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接头在22℃下孵育2小时。
7.根据权利要求5所述的方法，其包括就在增加所述温度之前添加另外量的包含活性氨氧基的氨氧基接头的另外步骤。
8.根据权利要求5所述的方法，其中在22℃温度下通过选自由透析、超滤/渗滤(UF/DF)和色谱组成的组的方法纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其还包括在4℃下通过选自由透析、UF/DF或色谱组成的组的方法纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物的步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是糖蛋白或在体外糖基化的治疗性蛋白质，且选自由以下组成的组：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干扰素-α(IFN-α)、复合干扰素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管生成素样多肽1(ANGPTL1)、血管生成素样多肽2(ANGPTL2)、血管生成素样多肽3(ANGPTL3)、血管生成素样多肽4(ANGPTL4)、血管生成素样多肽5(ANGPTL5)、血管生成素样多肽6(ANGPTL6)、血管生成素样多肽7(ANGPTL7)、玻粘蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型态发生蛋白-1、骨型态发生蛋白-2、骨型态发生蛋白-3、骨型态发生蛋白-4、骨型态发生蛋白-5、骨型态发生蛋白-6、骨型态发生蛋白-7、骨型态发生蛋白-8、骨型态发生蛋白-9、骨型态发生蛋白-10、骨型态发生蛋白-11、骨型态发生蛋白-12、骨型态发生蛋白-13、骨型态发生蛋白-14、骨型态发生蛋白-15、骨型态发生蛋白受体IA、骨型态发生蛋白受体IB、骨型态发生蛋白受体II、脑源性神经营养因子、心脏营养素-1、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、畸胎癌源性生长因子、潜伏蛋白、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、表皮素、表皮调节素、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、肝细胞瘤源性生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生成素、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盘生长因子、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子受体α、血小板源性生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子(SCF)、干细胞因子受体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜伏转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰岛素、植物凝集素蓖麻毒素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲状腺素、组织纤溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黄体化激素、雌激素、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、修美乐(阿达木单抗)、普罗利亚(迪诺赛单抗)、恩利(依那西普)、说明书表1中的蛋白质、或其生物活性片段、衍生物或变体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在与所述活化的水溶性聚合物接触之前，包含初始浓度介于0.3mg/ml与3.0mg/ml之间的所述治疗性蛋白质的溶液被调整至介于5.0与8.0之间的pH值。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述治疗性蛋白质的初始浓度为1.0mg/ml并且所述pH值为6.0。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是与期望的过量浓度的活化的水溶性聚合物接触，其中所述过量浓度介于1倍摩尔浓度与300倍摩尔浓度过量之间。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述过量浓度为50倍摩尔浓度过量。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述治疗性蛋白质在包含以下的条件下与所述活化的水溶性聚合物一起孵育：介于0.5小时与24小时之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述条件包含120分钟的时段、22℃的温度、不存在光；和在搅拌下。
17.根据权利要求10所述的方法，其中所述亲核性催化剂在包含以下的条件下以使得亲核性催化剂的最终浓度介于1.0mM与50mM之间的量添加：介于0.1分钟与30分钟之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述亲核性催化剂的最终浓度为10mM，并且所述条件包含至多15分钟的时段、22℃的温度、不存在光；和在搅拌下。
19.根据权利要求10所述的方法，其中所述氧化剂在包含以下的条件下以使得氧化剂的最终浓度介于50μM与1000μM之间的量添加，介于0.1分钟与120分钟之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述氧化剂的最终浓度为400μM，并且所述条件包含10分钟的时段、22℃的温度、不存在光和在搅拌下。
21.根据权利要求10所述的方法，其中所述水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分的缀合通过添加选自由以下组成的组的淬灭剂而终止：L-半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、偏亚硫酸氢钠(Na2S2O5)、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或其衍生物、甲酚、咪唑和其组合；
其中所述淬灭剂在包含以下的条件下以使得淬灭剂的最终浓度介于1mM与100mM之间的量添加：介于5分钟与120分钟之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述淬灭剂为L-半胱氨酸。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述L-半胱氨酸添加成使得最终浓度为10mM并且所述条件包含60分钟的时段、22℃的温度、不存在光和在搅拌下。
24.根据权利要求10所述的方法，其包括：
a)第一步骤，其包括将包含所述治疗性蛋白质的溶液的pH值调整至介于5.0与8.0之间的pH值，其中所述治疗性蛋白质浓度介于0.3mg/ml与3.0mg/ml之间；
b)第二步骤，其包括氧化所述治疗性蛋白质上的一个或多个碳水化合物，其中所述氧化剂在包含以下的条件下添加至所述第一步骤中的溶液中以使得最终浓度介于50μM与1000μM之间：介于0.1分钟与120分钟之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；
c)第三步骤，其包括在包含以下的条件下使所述治疗性蛋白质与期望的过量浓度的活化的水溶性聚合物接触，其中所述过量浓度介于1倍摩尔浓度过量与300倍摩尔浓度过量之间：介于0.5小时与24小时之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；
d)第四步骤，其包括将亲核性催化剂添加至所述第三步骤的溶液中，其中所述亲核性催化剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度介于1mM与50mM之间：介于0.1分钟与30分钟之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；
e)第五步骤，其中所述治疗性蛋白质在允许所述活化的水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质上的一个或多个氧化型碳水化合物缀合的条件下与所述活化的水溶性聚合物和亲核性催化剂一起孵育，所述条件包含介于0.5小时与24小时之间的时段、介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；和
f)第六步骤，其中所述第五步骤中所述水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质的一个或多个氧化型碳水化合物的缀合通过添加选自由以下组成的组的淬灭剂而终止：L-半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、Na2S2O5(偏亚硫酸氢钠)、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或其衍生物、甲酚、咪唑和其组合；其中所述淬灭剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度为1mM和100mM：介于5分钟与120分钟之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
25.根据权利要求10所述的方法，包括：
a)第一步骤，其包括将包含所述治疗性蛋白质的溶液的pH值调整至6.0的pH值，其中所述治疗性蛋白质的初始浓度为1.0mg/ml；
b)第二步骤，其包括氧化所述治疗性蛋白质上的一个或多个碳水化合物，其中所述氧化剂在包含以下的条件下添加至所述第一步骤中的溶液中以使得最终浓度为400μM：10分钟的时段；22℃的温度；在光不存在下；和在搅拌下；
c)第三步骤，其包括在包含以下的条件下使所述治疗性蛋白质与期望的过量浓度的活化的水溶性聚合物接触，其中所述过量浓度为50倍摩尔浓度过量：15分钟的时段；22℃的温度；在光不存在下；和在搅拌下；
d)第四步骤，其包括将亲核性催化剂添加至所述第三步骤的溶液中，其中所述亲核性催化剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度为10mM，15分钟的时段；22℃的温度；在光不存在下；和在搅拌下；
e)第五步骤，其中所述治疗性蛋白质在允许所述活化的水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质上的一个或多个氧化型碳水化合物缀合的条件下与所述活化的水溶性聚合物和亲核性催化剂一起孵育，所述条件包含2小时的时段、22℃的温度；在光不存在下；和在搅拌下；和
f)第六步骤，其中所述第五步骤中所述水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质的一个或多个氧化型碳水化合物的缀合通过添加淬灭剂L-半胱氨酸而终止；其中所述L-半胱氨酸在包含以下的条件下添加成使得最终浓度为10mM：60分钟的时段；22℃的温度；在光不存在下；和在搅拌下。
26.根据权利要求1或10所述的方法，其中所述PSA由10-300个唾液酸单元构成。
27.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗性蛋白质为FIX。
28.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗性蛋白质为FVIIa。
29.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗性蛋白质为FVIII。
30.根据权利要求10所述的方法，其中所述氧化剂为高碘酸钠(NaIO4)。
31.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分位于治疗性蛋白的活化肽中，所述治疗性蛋白选自由FIX、FVIIa和FVIII构成的群。
32.根据权利要求1或10所述的方法，其中所述PSA包含选自由以下组成的组的活化的氨氧基接头：
a)下式的3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺接头：
b)下式的3,6,9-三氧杂-十一烷-1,11-二氧基胺接头：
以及
c)下式的3,6,9,12,15-五氧杂-十七烷-1,17-二氧基胺接头：
其中所述PSA通过与氧化剂一起孵育而氧化以在所述PSA的非还原端形成末端醛基。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述氨氧基接头为3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。
34.根据权利要求10所述的方法，其中所述亲核性催化剂以介于1mM与50mM之间的浓度提供。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述亲核性催化剂为间甲苯胺。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述间甲苯胺以10mM的浓度存在于所述缀合反应中。
37.根据权利要求10所述的方法，其还包括纯化所述缀合的治疗性蛋白质的步骤。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述缀合的治疗性蛋白质通过选自由色谱、过滤和沉淀组成的组的方法来纯化。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述色谱选自由以下组成的组：疏水性相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱(IEC)、尺寸排阻色谱(SEC)、亲和色谱和反相色谱。
40.根据权利要求39所述的方法，其中于色谱加载步骤和色谱洗涤步骤中使用抗离液盐。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述色谱在柱中进行。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述柱包含选自由苯基-琼脂糖FF和丁基-琼脂糖FF组成的组的色谱树脂。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述树脂以介于5cm与20cm之间的床高度存在于所述柱中。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述床高度为10cm。
45.根据权利要求41所述的方法，其包括一个或多个洗涤步骤，其中流动方向设定为向上流动并且其中流速介于0.2cm/min与6.7cm/min之间。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述流速为2cm/min。
47.根据权利要求41所述的方法，其包括一个或多个洗脱步骤，其中流动方向设定为向下流动并且其中流速介于0.1cm/min与6.7cm/min之间。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述流速为1cm/min。
49.根据权利要求37所述的方法，其还包括通过超滤/渗滤(UF/DF)浓缩所述缀合的治疗性蛋白质。
50.根据权利要求37所述的方法，其中所述治疗性蛋白质的最终浓度介于0.5mg/ml与3mg/ml之间。
51.根据权利要求37所述的方法，其中所述缀合的治疗性蛋白质包含5个至11个水溶性聚合物部分。
52.根据权利要求10所述的方法，其中所述缀合的治疗性蛋白质使用色谱纯化；其中于加载步骤和洗涤步骤使用抗离液盐；所述方法包括一个或多个洗涤步骤，其中流动方向设定为向上流动并且其中流速介于0.2cm/min与6.7cm/min之间；和一个或多个洗脱步骤，其中流动方向设定为向下流动并且其中流速介于0.2cm/min与6.7cm/min之间；所述方法还包括通过超滤/渗滤(UF/DF)浓缩所述缀合的治疗性蛋白质。
53.根据权利要求46所述的方法，其中所述色谱为疏水性相互作用色谱(HIC)；其中所述一个或多个洗涤步骤流速为2cm/min；并且其中所述一个或多个洗脱步骤流速为1cm/min。
54.一种含有修饰的治疗性蛋白质的组合物，该组合物通过根据权利要求1所述的方法产生。
55.一种制备含有活性氨氧基的水溶性聚合物的方法，其包括：
a)在允许在氧化型水溶性聚合物与包含活性氨氧基的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含所述氧化型水溶性聚合物的溶液与所述活化的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含介于1分钟与24小时之间的时段；介于2℃与8℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；从而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和
b)在介于2℃与8℃之间的温度下，通过选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组的方法来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；
所述水溶性聚合物为PSA；
从而在所述水溶性聚合物与所述氨氧基接头之间形成肟键联。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述肟键联形成由选自由以下组成的组的亲核性催化剂催化：邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
57.根据权利要求55所述的方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含所述氧化型水溶性聚合物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接头在4℃下孵育1小时。
58.根据权利要求57所述的方法，其中通过在4℃温度下的阴离子交换色谱来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
59.一种制备含有活性氨氧基的水溶性聚合物的方法，其包括：
a)在允许在非氧化型水溶性聚合物与包含活性氨氧基的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含所述非氧化型水溶性聚合物的溶液与所述活化的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含2小时的时段；22℃的温度；在光不存在下；和在搅拌下；该方法中还包括以下步骤：将该溶液温度提升至32℃至37℃之间，再额外孵化12-24小时，从而形成所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和
b)通过选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组的方法来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；
从而在所述水溶性聚合物与氨氧基接头之间形成肟键联；其中，该水溶性聚合物为PSA。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述肟键联形成由选自由以下组成的组的亲核性催化剂催化：邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
61.根据权利要求59所述的方法，其包括就在增加所述温度之前添加另外量的包含活性氨氧基的氨氧基接头的另外步骤。
62.根据权利要求59所述的方法，其中在22℃温度下通过选自由透析、超滤/渗滤(UF/DF)和色谱组成的组的方法纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
63.根据权利要求62所述的方法，其还包括在4℃下通过选自由透析、UF/DF或色谱组成的组的方法纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物的步骤。
64.一种由氨氧基制备PSA-氨氧基试剂的方法，其包括：
a)在允许在氧化型PSA与包含活性氨氧基的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含所述氧化型PSA的溶液与所述活化的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含1小时的时段；4℃的温度；在光不存在下，和在搅拌下；从而形成含有活性氨氧基的PSA；和
b)在4℃的温度下通过阴离子交换色谱纯化所述含有活性氨氧基的PSA；
所述活化的氨氧基接头为下式的3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺接头：
从而在所述PSA与所述氨氧基接头之间形成肟键联。
65.一种由氨氧基制备PSA-氨氧基试剂的方法，其包括：
a)在允许在非氧化型PSA与包含活性氨氧基的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含所述非氧化型PSA的溶液与所述活化的氨氧基接头一起孵育，所述条件如下：在光不存在下，在搅拌下将包含所述水溶性聚合物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接头在22℃下孵育2小时；所述方法还包括将所述溶液的温度增加到介于32℃与37℃之间的温度以及孵育另外12-24小时的步骤；从而形成含有活性氨氧基的PSA；和
b)在22℃的温度下通过透析纯化所述含有活性氨氧基的PSA；
所述活化的氨氧基接头为下式的3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺接头：
从而在所述非氧化型PSA与所述氨氧基接头之间形成肟键联。
66.根据权利要求10所述的方法，其中，所述治疗性蛋白质选自由以下构成的组：生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、胎盘生长因子2、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB。
67.根据权利要求5所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是糖蛋白或在体外糖基化的治疗性蛋白质，且选自由以下组成的组：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干扰素-α(IFN-α)、复合干扰素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管生成素样多肽1(ANGPTL1)、血管生成素样多肽2(ANGPTL2)、血管生成素样多肽3(ANGPTL3)、血管生成素样多肽4(ANGPTL4)、血管生成素样多肽5(ANGPTL5)、血管生成素样多肽6(ANGPTL6)、血管生成素样多肽7(ANGPTL7)、玻粘蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型态发生蛋白-1、骨型态发生蛋白-2、骨型态发生蛋白-3、骨型态发生蛋白-4、骨型态发生蛋白-5、骨型态发生蛋白-6、骨型态发生蛋白-7、骨型态发生蛋白-8、骨型态发生蛋白-9、骨型态发生蛋白-10、骨型态发生蛋白-11、骨型态发生蛋白-12、骨型态发生蛋白-13、骨型态发生蛋白-14、骨型态发生蛋白-15、骨型态发生蛋白受体IA、骨型态发生蛋白受体IB、骨型态发生蛋白受体II、脑源性神经营养因子、心脏营养素-1、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、畸胎癌源性生长因子、潜伏蛋白、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、表皮素、表皮调节素、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、肝细胞瘤源性生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生成素、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盘生长因子、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子受体α、血小板源性生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子(SCF)、干细胞因子受体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜伏转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰岛素、植物凝集素蓖麻毒素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲状腺素、组织纤溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黄体化激素、雌激素、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、修美乐(阿达木单抗)、普罗利亚(迪诺赛单抗)、恩利(依那西普)、说明书表1中的蛋白质、或其生物活性片段、衍生物或变体。
68.根据权利要求67所述的方法，其中在与所述活化的水溶性聚合物接触之前，包含初始浓度介于0.3mg/ml与3.0mg/ml之间的所述治疗性蛋白质的溶液被调整至介于5.0与8.0之间的pH值。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述治疗性蛋白质的初始浓度为1.0mg/ml并且所述pH值为6.0。
70.根据权利要求67所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是与期望的过量浓度的活化的水溶性聚合物接触，其中所述过量浓度介于1倍摩尔浓度与300倍摩尔浓度过量之间。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述过量浓度为50倍摩尔浓度过量。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述治疗性蛋白质在包含以下的条件下与所述活化的水溶性聚合物一起孵育：介于0.5小时与24小时之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述条件包含120分钟的时段、22℃的温度、不存在光；和在搅拌下。
74.根据权利要求67所述的方法，其中所述亲核性催化剂在包含以下的条件下以使得亲核性催化剂的最终浓度介于1.0mM与50mM之间的量添加：介于0.1分钟与30分钟之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述亲核性催化剂的最终浓度为10mM，并且所述条件包含至多15分钟的时段、22℃的温度、不存在光；和在搅拌下。
76.根据权利要求67所述的方法，其中所述氧化剂在包含以下的条件下以使得氧化剂的最终浓度介于50μM与1000μM之间的量添加，介于0.1分钟与120分钟之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述氧化剂的最终浓度为400μM，并且所述条件包含10分钟的时段、22℃的温度、不存在光和在搅拌下。
78.根据权利要求67所述的方法，其中所述水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分的缀合通过添加选自由以下组成的组的淬灭剂而终止：L-半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、偏亚硫酸氢钠(Na2S2O5)、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或其衍生物、甲酚、咪唑和其组合；
其中所述淬灭剂在包含以下的条件下以使得淬灭剂的最终浓度介于1mM与100mM之间的量添加：介于5分钟与120分钟之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述淬灭剂为L-半胱氨酸。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述L-半胱氨酸添加成使得最终浓度为10mM并且所述条件包含60分钟的时段、22℃的温度、不存在光和在搅拌下。
81.根据权利要求67所述的方法，其包括：
a)第一步骤，其包括将包含所述治疗性蛋白质的溶液的pH值调整至介于5.0与8.0之间的pH值，其中所述治疗性蛋白质浓度介于0.3mg/ml与3.0mg/ml之间；
b)第二步骤，其包括氧化所述治疗性蛋白质上的一个或多个碳水化合物，其中所述氧化剂在包含以下的条件下添加至所述第一步骤中的溶液中以使得最终浓度介于50μM与1000μM之间：介于0.1分钟与120分钟之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；
c)第三步骤，其包括在包含以下的条件下使所述治疗性蛋白质与期望的过量浓度的活化的水溶性聚合物接触，其中所述过量浓度介于1倍摩尔浓度过量与300倍摩尔浓度过量之间：介于0.5小时与24小时之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；
d)第四步骤，其包括将亲核性催化剂添加至所述第三步骤的溶液中，其中所述亲核性催化剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度介于1mM与50mM之间：介于0.1分钟与30分钟之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；
e)第五步骤，其中所述治疗性蛋白质在允许所述活化的水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质上的一个或多个氧化型碳水化合物缀合的条件下与所述活化的水溶性聚合物和亲核性催化剂一起孵育，所述条件包含介于0.5小时与24小时之间的时段、介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；和
f)第六步骤，其中所述第五步骤中所述水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质的一个或多个氧化型碳水化合物的缀合通过添加选自由以下组成的组的淬灭剂而终止：L-半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、Na2S2O5(偏亚硫酸氢钠)、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或其衍生物、甲酚、咪唑和其组合；其中所述淬灭剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度为1mM和100mM：介于5分钟与120分钟之间的时段；介于2℃与37℃之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
82.根据权利要求67所述的方法，包括：
a)第一步骤，其包括将包含所述治疗性蛋白质的溶液的pH值调整至6.0的pH值，其中所述治疗性蛋白质的初始浓度为1.0mg/ml；
b)第二步骤，其包括氧化所述治疗性蛋白质上的一个或多个碳水化合物，其中所述氧化剂在包含以下的条件下添加至所述第一步骤中的溶液中以使得最终浓度为400μM：10分钟的时段；22℃的温度；在光不存在下；和在搅拌下；
c)第三步骤，其包括在包含以下的条件下使所述治疗性蛋白质与期望的过量浓度的活化的水溶性聚合物接触，其中所述过量浓度为50倍摩尔浓度过量：15分钟的时段；22℃的温度；在光不存在下；和在搅拌下；
d)第四步骤，其包括将亲核性催化剂添加至所述第三步骤的溶液中，其中所述亲核性催化剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度为10mM，15分钟的时段；22℃的温度；在光不存在下；和在搅拌下；
e)第五步骤，其中所述治疗性蛋白质在允许所述活化的水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质上的一个或多个氧化型碳水化合物缀合的条件下与所述活化的水溶性聚合物和亲核性催化剂一起孵育，所述条件包含2小时的时段、22℃的温度；在光不存在下；和在搅拌下；和
f)第六步骤，其中所述第五步骤中所述水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质的一个或多个氧化型碳水化合物的缀合通过添加L-半胱氨酸而终止；其中所述L-半胱氨酸在包含以下的条件下添加成使得最终浓度为10mM：60分钟的时段；22℃的温度；在光不存在下；和在搅拌下。
83.根据权利要求67所述的方法，其中所述PSA由10-300个唾液酸单元构成。
84.根据权利要求67所述的方法，其中所述治疗性蛋白质为FIX。
85.根据权利要求67所述的方法，其中所述治疗性蛋白质为FVIIa。
86.根据权利要求67所述的方法，其中所述治疗性蛋白质为FVIII。
87.根据权利要求67所述的方法，其中所述氧化剂为高碘酸钠(NaIO4)。
88.根据权利要求67所述的方法，其中所述治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分位于治疗性蛋白的活化肽中，所述治疗性蛋白选自由FIX、FVIIa和FVIII构成的群。
89.根据权利要求67所述的方法，其中所述PSA包含选自由以下组成的组的活化的氨氧基接头：
a)下式的3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺接头：
b)下式的3,6,9-三氧杂-十一烷-1,11-二氧基胺接头：
以及
c)下式的3,6,9,12,15-五氧杂-十七烷-1,17-二氧基胺接头：
其中所述PSA通过与氧化剂一起孵育而氧化以在所述PSA的非还原端形成末端醛基。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述氨氧基接头为3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。
91.根据权利要求67所述的方法，其中所述亲核性催化剂以介于1mM与50mM之间的浓度提供。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述亲核性催化剂为间甲苯胺。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述间甲苯胺以10mM的浓度存在于所述缀合反应中。
94.根据权利要求67所述的方法，其还包括纯化所述缀合的治疗性蛋白质的步骤。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述缀合的治疗性蛋白质通过选自由色谱、过滤和沉淀组成的组的方法来纯化。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述色谱选自由以下组成的组：疏水性相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱(IEC)、尺寸排阻色谱(SEC)、亲和色谱和反相色谱。
97.根据权利要求96所述的方法，其中于色谱加载步骤和色谱洗涤步骤中使用抗离液盐。
98.根据权利要求96所述的方法，其中所述色谱在柱中进行。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述柱包含选自由苯基-琼脂糖FF和丁基-琼脂糖FF组成的组的色谱树脂。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述树脂以介于5cm与20cm之间的床高度存在于所述柱中。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述床高度为10cm。
102.根据权利要求98所述的方法，其包括一个或多个洗涤步骤，其中流动方向设定为向上流动并且其中流速介于0.2cm/min与6.7cm/min之间。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述流速为2cm/min。
104.根据权利要求98所述的方法，其包括一个或多个洗脱步骤，其中流动方向设定为向下流动并且其中流速介于0.1cm/min与6.7cm/min之间。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述流速为1cm/min。
106.根据权利要求94所述的方法，其还包括通过超滤/渗滤(UF/DF)浓缩所述缀合的治疗性蛋白质。
107.根据权利要求94所述的方法，其中所述治疗性蛋白质的最终浓度介于0.5mg/ml与3mg/ml之间。
108.根据权利要求94所述的方法，其中所述缀合的治疗性蛋白质包含5个至11个水溶性聚合物部分。
109.根据权利要求67所述的方法，其中所述缀合的治疗性蛋白质使用色谱纯化；其中于加载步骤和洗涤步骤使用抗离液盐；所述方法包括一个或多个洗涤步骤，其中流动方向设定为向上流动并且其中流速介于0.2cm/min与6.7cm/min之间；和一个或多个洗脱步骤，其中流动方向设定为向下流动并且其中流速介于0.2cm/min与6.7cm/min之间；所述方法还包括通过超滤/渗滤(UF/DF)浓缩所述缀合的治疗性蛋白质。
110.根据权利要求103所述的方法，其中所述色谱为疏水性相互作用色谱(HIC)；其中所述一个或多个洗涤步骤流速为2cm/min；并且其中所述一个或多个洗脱步骤流速为1cm/min。
111.一种含有修饰的治疗性蛋白质的组合物，该组合物通过根据权利要求5所述的方法产生。
112.根据权利要求67所述的方法，其中，所述治疗性蛋白质选自由以下构成的组：生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、胎盘生长因子2、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB。
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