CN101903404A

CN101903404A - 二价双特异性抗体

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Publication number: CN101903404A
Application number: CN2008801219004A
Authority: CN
Inventors: 克里斯蒂安·克莱因; 沃尔夫冈·谢弗
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-16
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2028-12-16
Also published as: KR101249607B1; MA31904B1; EP2225279B1; MX2010006396A; US10138293B2; CO6280542A2; US10927163B2; ECSP10010270A; IL206161A0; RU2010129549A; RU2587616C2; CA2709023C; JP5281097B2; PE20091172A1; US20120164726A1; CA2709023A1; US20140120613A1; EP2225279A1; US20090162359A1; WO2009080252A1

Abstract

本发明涉及新型的结构域交换的、二价的、双特异性抗体，及其制备和应用。

Description

二价双特异性抗体

本发明涉及新型的二价双特异性抗体，其制备和应用。

发明背景

改造的蛋白，诸如能够结合两种以上抗原的双特异性或多特异性抗体是本领域中已知的。这样的多特异性结合蛋白可以利用细胞融合、化学缀合、或重组DNA技术产生。

最近已经开发了广泛多样的重组双特异性抗体形式，例如通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如Morrison，S.L.等，Nature Biotech.(自然生物技术)15(1997)159-163；WO 2001077342；和Coloma，M.J.，Nature Biotech.(自然生物技术)25(2007)1233-1234)。

此外，开发了能够结合两种以上抗原的若干其他新型形式，其中抗体核心结构(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)不再保持诸如双抗体、三链抗体或四链抗体，微型抗体(minibodies)，若干单链形式(scFv，双-scFv)(Holliger P，等，Nature Biotech(自然生物技术)23(2005)1126-1136 2005；Fischer N.，和Léger，O.，Pathobiology(病理学)74(2007)3-14；Shen J，等，Journal ofImmunological Methods(免疫学方法杂志)318(2007)65-74；Wu，C.等，Nature Biotech(自然生物技术)25(2007)1290-1297)。

所有这样的形式使用连接体将抗体核心(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)与其他结合蛋白(例如scFv)融合或融合例如两个Fab片段或scFv(Fischer N.，Léger O.，Pathobiology(病理学)74(2007)3-14)。虽然连接体具有改造双特异性抗体的优势是明显的，但是它们也可能引起治疗设置中的问题。实际上，这些外源肽可能引起针对连接体本身或蛋白质和连接体之间连接的免疫应答。此外，这些肽的灵活的性质使得它们更加倾向于蛋白水解分裂，这潜在地导致抗体稳定性差、聚集和增高的免疫原性。另外，人们可能希望保持效应子功能，诸如例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，它们通过保持与天然存在的抗体的高度相似性而通过Fc部分来介导。

因此，理想地，人们的目标应该是开发通用结构与天然存在的抗体(如IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)非常类似的双特异性抗体，其与人序列具有最小的偏差。

在一种方法中，利用细胞杂交瘤(quadroma)技术(见Milstein，C.和A.C.Cuello，Nature(自然)，305(1983)537-40)生成了与天然抗体非常类似的双特异性抗体，所述细胞杂交瘤技术基于表达具有所需的双特异性抗体特异性的鼠单克隆抗体的两种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合。因为在产生的杂交-杂交瘤(或细胞杂交瘤)细胞系中的两个不同抗体重链和轻链的随机配对，因而生成至多10种不同的抗体种类，其中只有一种是所需的功能性双特异性抗体。由于存在错配副产物和显著降低的产率，其意味着需要技术先进的纯化程序(参见例如Morrison，S.L.，Nature Biotech(自然生物技术)25(2007)1233-1234)。一般地，如果使用重组表达技术，则相同的错配副产物问题仍存在。

用于避开错配副产物问题的方法，称为“杵-进入-臼(knobs-into-holes)”的目的在于通过将突变引入CH3结构域来改变接触界面，从而迫使两个不同抗体重链配对。在一条链上，大体积氨基酸被具有短侧链的氨基酸替换，以形成“臼(hole)”。相反地，将具有大侧链的氨基酸引入到另一个CH3结构域中，以形成“杵(knob)”。通过共表达这两条重链(和两条相同的轻链，其必须适合于这两条重链)，观察到与同型二聚体形式(‘臼-臼’或‘杵-杵’)相比，异型二聚体形式(‘杵-臼’)的高产率(Ridgway，JB，Presta，LG，Carter，P和WO 1996027011)。异型二聚体的百分比可以通过利用噬菌体展示法重建两个CH3结构域的相互作用表面和引入二硫键来稳定该异型二聚体而得到进一步增加(Merchant A.M.，等，Nature Biotech(自然生物技术)16(1998)677-681；Atwell S，Ridgway JB，Wells JA，Carter P.，J Mol.Biol.(分子生物学杂志)270(1997)26-35)。关于杵-进入-臼技术的新方法记述在例如EP 1870459A1中。尽管这种形式似乎非常吸引人，但是目前不存在记载针对临床的进展的数据。这种策略的一个重要制约是两个母体抗体的轻链必须相同，以防止错配和形成无活性的分子。因此，该技术不适合于容易地从针对第一和第二抗原的两种抗体开始开发针对两种抗原的重组、二价双特异性抗体，因为这些抗体的重链和/或相同的轻链必须被优化。

Xie，Z.等，J Immunol Methods(免疫学方法杂志)286(2005)95-101提到一种新型的双特异性抗体，其使用scFv并结合以针对FC部分的杵-进入-臼技术。

发明概述

本发明涉及二价双特异性抗体，其包括：

a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和

b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中可变结构域VL和VH相互替换。

本发明的进一步的实施方案是用于一种制备根据本发明所述的二价双特异性抗体的方法，其包括下列步骤：

a)用以下各项转化宿主细胞，

-载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子

-载体，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，其中可变结构域VL和VH相互替换；

b)在容许合成所述抗体分子的条件下培养所述宿主细胞；和

c)从所述培养物中回收所述抗体分子。

本发明的进一步的实施方案是一种宿主细胞，其包括

-载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，

-载体，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，其中可变结构域VL和VH相互替换。

本发明的进一步的实施方案是一种根据本发明所述的抗体的组合物，优选药物或诊断组合物。

本发明的进一步的实施方案是一种药物组合物，其包括根据本发明所述的抗体和至少一种药用赋形剂。

本发明的进一步的实施方案是一种用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的根据本发明所述的抗体。

发明详述

本发明涉及二价双特异性抗体，其包括：

a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和

因此，所述二价双特异性抗体包括：

a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链；和

b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH相互替换。

因此，对于所述特异性结合第二抗原的抗体，以下各项适用：

在轻链中

可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替换；

且在重链中

可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替换。

术语“抗体”用于本文中时，指完整的单克隆抗体。所述完整抗体由两对“轻链”(LC)和“重链”(HC)(所述轻链(LC)/重链对在本文中缩写为LC/HC)组成。所述抗体的轻链和重链是由若干结构域组成的多肽。在完整抗体中，每条重链包括重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括重链恒定结构域CH1、CH2和CH3(抗体类型IgA，IgD，和IgG)和任选地，重链恒定结构域CH4(抗体类型IgE和IgM)。每条轻链包括轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL。一种天然存在的完整抗体，即IgG抗体的结构显示在例如图1中。可变结构域VH和VL可以进一步再细分为高变区，称为互补性决定区(CDR)，它们之间分布有更加保守的区域，称为构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以下列顺序从氨基端向羧基端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4((Janeway CA，Jr等，(2001)Immunobiology(免疫生物学)，第5版，加兰出版社(Garland Publishing)；和WoofJ，Burton DNat Rev Immunol(自然免疫学综述)4(2004)89-99)。两对重链和轻链(HC/LC)能够特异性结合相同抗原。因此所述完整抗体是二价、单特异性抗体。所述“抗体”包括例如小鼠抗体、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和遗传改造的抗体(变异或突变抗体)，条件是保留它们的特有特性。特别优选人或人源化抗体，尤其作为重组的人抗体或人源化抗体。

存在5种由希腊字母表示的哺乳动物抗体重链类型：α，δ，ε，γ，和μ(Janeway CA，Jr等，(2001)Immunobiology(免疫生物学)，第5版，加兰出版社(Garland Publishing))。存在的重链的类型定义抗体的类型；这些链分别存在于IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM抗体中(Rhoades RA，Pflanzer RG(2002).Human Physiology(人体生理学)，第4版，汤姆森知识(ThomsonLearning))。不同的重链在尺寸和组成上不同；α和γ含有约450个氨基酸，而μ和ε具有约550个氨基酸。

每条重链具有两种区域，即恒定区和可变区。恒定区在相同同种型的所有抗体中相同，但在不同同种型的抗体中不同。重链γ，α和δ具有由3个恒定结构域CH1、CH2和CH3(处于一排中)组成的恒定区和用于增加柔性的铰链区(Woof J，Burton D Nat Rev Immunol(自然免疫学综述)4(2004)89-99)；重链μ和ε具有由4个恒定结构域CH1、CH2、CH3和CH4组成的恒定区(Janeway CA，Jr等，(2001)Immunobiology(免疫生物学)，第5版，加兰出版社(Garland Publishing))。在由不同的B细胞产生的抗体中重链的可变区不同，但对由单个B细胞或B细胞克隆产生的所有抗体都是相同的。每条重链的可变区长约110个氨基酸且由单一的抗体结构域组成。

在哺乳动物中，仅存在两类轻链，其称为λ和κ。轻链具有两种连续的结构域：1个恒定结构域CL和1个可变结构域VL。轻链的近似长度是211-217个氨基酸。优选地，轻链是κ轻链，且恒定结构域CL优选来源于kappa(κ)轻链(恒定结构域Cκ)。

术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单一的氨基酸组合物组成的抗体分子的制剂。

根据本发明的“抗体”可以是任意类型(例如IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，优选IgG或IgE)，或亚型(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2，优选IgG1)，其中根据本发明的二价双特异性抗体所源自的两种抗体具有相同亚型(例如IgG1，IgG4等，优选IgG1)的Fc部分，优选相同同种异型(例如高加索人)的Fc部分。

“抗体的Fc部分”是熟练的技术人员公知的术语并基于抗体的木瓜蛋白酶裂解而定义。根据本发明所述的抗体包含Fc部分，优选源自人来源的Fc部分和优选人恒定区的全部其他部分。抗体的Fc部分直接参与补体活化，C1q结合，C3活化和Fc受体结合。虽然抗体对补体系统的影响取决于某些条件，但是与C1q的结合由Fc部分中确定的结合位点引起。所述结合位点是现有技术中已知的且记载在例如Lukas，T.J.，等，J.Immunol.(免疫学杂志)127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.，和Cebra，J.J.，Mol.Immunol.(分子免疫学)16(1979)907-917；Burton，D.R.，等，Nature(自然)288(1980)338-344；Thommesen，J.E.，等，Mol.Immunol.(分子免疫学)37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.，等，J.Immunol.(免疫学杂志)164(2000)4178-4184；Hezareh，M.，等，J.Virol.(病毒学杂志)75(2001)12161-12168；Morgan，A.，等.，Immunology(免疫学)86(1995)319-324；和EP 0 307 434中。所述结合位点是例如L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331和P329(按照Kabat的EU目录编号，见下)。亚型IgG1，IgG2和IgG3的抗体通常显示补体活化，C1q结合和C3活化，而IgG4不活化补体系统，不结合C1q且不活化C3。优选地，Fc部分是人Fc部分。

术语“嵌合抗体”指一种抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的那些，其中恒定区已经被从原始抗体的恒定区修饰或改变以产生根据本发明所述的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。也将这种“嵌合”抗体称作“类别转换抗体”。嵌合抗体是包括编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的被表达的免疫球蛋白基因的产物。制备嵌合抗体的方法包括目前在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如，Morrison，S.L.，等，Proc.Natl.Acad Sci.USA(美国国家科学院学报)81(1984)6851-6855；美国专利号5,202,238和5,204,244。

术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰为包括与亲本免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在一个优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。见，例如，Riechmann，L.，等，Nature(自然)332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等，Nature(自然)314(1985)268-270。特别优选的CDRs对应于识别以上指出的关于嵌合抗体的抗原的那些代表性序列。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是这样的那些，其中恒定区已经另外地从原始抗体的恒定区被修饰或改变以产生根据本发明所述的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。

用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.in Chemical Biology(当前化学生物学观点)5(2001)368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生全部的或选择的人抗体成员。在所述种系突变小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将导致在抗原攻击时产生人抗体(见，例如Jakobovits，A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，等，Nature(自然)362(1993)255-258；Bruggemann，M.，等，Year Immunol.(免疫学年报)7(1993)33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227(1992)381-388；Marks，J.D.，等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222(1991)581-597)。Cole等和Boerner等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole等，Monoclonal antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R.Liss，第77页(1985)；和Boerner，P.，等，J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)86-95)。如已经对根据本发明所述的嵌合和人源化抗体所提及地，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生根据本发明所述的特性，特别是关于C1q结合和/或FcR结合，例如通过“类别转换”即Fc部分的改变或突变(例如由IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变。)

用于本文时，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NS0或CHO细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。根据本发明所述的重组人抗体已经经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列，其尽管源自并涉及人种系VH和VL序列，但在体内可能天然不存在于所有人抗体种系组成成员中。

“可变结构域”(轻链的可变结构域(VL)，重链的可变区(VH))用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链中的任一个。可变人轻链和重链的结构域具有相同的通用结构且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补性决定区，CDRs)相连接。构架区采用β-折叠构象且CDR可以形成连接β-折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区保持其三维结构并与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在根据本发明所述的抗体的结合特异性/亲和性方面具有特别重要的作用，并因此提供本发明的另一个目的。

用于本文时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“CDRs”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N端到C端包括结构域FR1，CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各条链上的CDR通过所述构架氨基酸分隔。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。按照Kabat E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫目的的蛋白质序列)，第5版，Public Health Service(公众健康服务)，National Institutes of Health(全国卫生研究所)，Bethesda，MD.(1991))的标准定义来确定CDR和FR区域。

重链和轻链的“恒定结构域”不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出多种效应子功能。根据其重链恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白被分为以下类型：

术语“二价双特异性抗体”用于本文中时，指如上所述的抗体，其中两对重链和轻链(HC/LC)中的每对特异性结合不同的抗原，即第一重链和第一轻链(源自针对第一抗原的抗体)特异性共同结合第一抗原，且第二重链和第二轻链(源自针对第二抗原的抗体)特异性共同结合第二抗原(如图2中所示)；所述二价双特异性抗体能够同时特异性结合两种不同的抗原，且不超过两种抗原，与其相反的是，一方面仅能够结合一种抗原的单特异性抗体，和另一方面例如能够同时结合四种抗原分子的四价、四特异性抗体。

根据本发明，所需二价双特异性抗体与不需要的副产物的比值可以通过替换仅一对重链和轻链(HC/LC)中的某些结构域来提高。尽管两对HC/LC对的第一对源自特异性结合第一抗原的抗体且保持基本不变，而两对HC/LC对的第二对源自特异性结合第二抗原的抗体并通过以下替换来改变：

-轻链：将可变轻链结构域VL替换为所述特异性结合第二抗原的抗体的可变重链结构域VH，和

-重链：将可变重链结构域VH替换为所述特异性结合第二抗原的抗体的可变轻链结构域VL。

因此由此生成的二价双特异性抗体是人造抗体，其包括

a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和

b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链；

其中所述(特异性结合第二抗原的抗体的)轻链包括可变结构域VH而非VL，且

其中所述(特异性结合第二抗原的抗体的)重链包括可变结构域VL而非VH。

在本发明的另一方面，这样提高的所需二价双特异性抗体与不需要的副产物的比值可以通过以下两种备选方案之一而进一步提高：

A)第一备选方案(见图3)：

所述根据本发明的二价双特异性抗体的CH3结构域可以通过“杵-进入-臼”技术改变，该技术详细地记载在例如WO 96/027011，Ridgway JB，等，Protein Eng(蛋白质工程)9(1996)617-621；和Merchant A.M.，等，NatBiotechnol(自然生物技术)16(1998)677-681中的若干实施例中。在该方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面，以增加包含这两个CH3结构域的两条重链的异型二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域之一可以是“杵”，而另一个是“臼”。二硫键的引入稳定该异型二聚体(Merchant A.M，等，Nature Biotech(自然生物技术)16(1998)677-681；Atwell S，RidgwayJB，Wells JA，Carter，P.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270(1997)26-35)，并增加产率。

因此在优选的实施方案中，二价双特异性抗体的CH3结构域通过“杵-进入-臼”技术改变，在所述二价双特异性抗体中第一CH3结构域和第二CH3结构域各自在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处相接触，所述“杵-进入-臼”技术包括通过将二硫键引入CH3结构域而进一步稳定化(记载在WO 96/027011，Ridgway JB，等，Protein Eng(蛋白质工程)9(1996)617-621；Merchant A.M.，等，Nature Biotech(自然生物技术)16(1998)677-681；和Atwell S，Ridgway JB，Wells JA，Carter，P.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270(1997)26-35中)以促进二价双特异性抗体的形成。

因此，在本发明的一个方面，所述二价双特异性抗体的特征在于

一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域各自在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处相接触；

其中改变所述界面以促进二价双特异性抗体的形成，其中所述改变的特征在于：

a)改变一条重链的CH3结构域，

由此，在与二价双特异性抗体内的另一条重链的CH3结构域的初始界面相接触的一条重链的CH3结构域的初始界面内，

氨基酸残基被替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重链的CH3结构域的界面内生成凸起，该凸起可以定位在另一条重链的CH3结构域的界面内的凹洞中

且

b)改变另一条重链的CH3结构域，

由此，在与二价双特异性抗体内的第一CH3结构域的初始界面相接触的第二CH3结构域的初始界面内，

氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二CH3结构域的界面内生成凹洞，在该凹洞中可以定位第一CH3结构域的界面内的凸起。

优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)组成的组。

优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)组成的组。

在本发明的一个方面中，进一步改变这两个CH3结构域，引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域相应位置处的氨基酸，从而使得两个CH3结构域之间可以形成二硫键。

在本发明的另一个优选实施方案中，通过使用用于杵残基的残基R409D；K370E(K409D)和用于臼残基的D399K；E357K来改变两个CH3结构域，其记载在例如EP 1870459A1中。

或

B)第二备选方案(见图4)：

通过将一个恒定重链结构域CH3替换为恒定重链结构域CH1；并且将另一个恒定重链结构域CH3替换为恒定轻链结构域CL。

替换重链结构域CH3的恒定重链结构域CH1可以是任何Ig类型(例如IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM)，或亚型(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)。

替换重链结构域CH3的恒定轻链结构域CL可以是lambda(λ)或kappa(κ)型，优选κ型。

因此，本发明的一个优选实施方案是二价双特异性抗体，其包括：

a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和

b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中可变结构域VL和VH相互替换，

且其中任选地，

c)一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域各自在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处相接触；

ca)改变一条重链的CH3结构域，

且

cb)改变另一条重链的CH3结构域，

氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二CH3结构域的界面内生成凹洞，在该凹洞中可以定位第一CH3结构域的界面内的凸起；

或d)

一个恒定重链结构域CH3被恒定重链结构域CH1替换；且另一个恒定重链结构域CH3被恒定轻链结构域CL替换。

术语“抗原”或“抗原分子”用于本文中时，可交替使用并指能够被抗体特异性结合的所有分子。二价双特异性抗体特异性结合第一抗原和第二不同抗原。术语“抗原”用于本文中时，包括例如蛋白、蛋白上的不同表位(在本发明含义内作为不同抗原)和多糖。这主要包括细菌、病毒和其他微生物的部分(外壳、被膜、细胞壁、鞭毛、菌毛(fimbrae)和毒素)。脂质和核酸仅在与蛋白和多糖组合时具有抗原性。非微生物外源(非自身)抗原可以包括花粉、蛋清和来自被移植组织和器官的蛋白或在被输注的血细胞表面上的蛋白。优选地，抗原选自由细胞因子、细胞表面蛋白、酶和受体细胞因子、细胞表面蛋白、酶和受体组成的组。

肿瘤抗原是由肿瘤细胞表面上的MHC I或MHC II分子呈递的那些抗原。这些抗原有时可以由肿瘤细胞来呈递，且从来不由正常细胞来呈递。在此情况下，它们称为肿瘤特异性抗原(TSAs)且典型地由肿瘤特异性突变产生。更常见的是由肿瘤细胞和正常细胞呈递的抗原，且它们称为肿瘤相关抗原(TAAs)。识别这些抗原的细胞毒性T淋巴细胞可能能够在肿瘤细胞增殖或转移前破坏它们。肿瘤抗原还可以采用例如突变受体的形式存在于肿瘤表面上，在这种情形中它们应该被B细胞识别。

在一个优选的实施方案中，二价双特异性抗体特异性结合的两种不同抗原(第一和第二抗原)中的至少一种是肿瘤抗原。

在另一个优选的实施方案中，二价双特异性抗体特异性结合的两种不同抗原(第一和第二抗原)均是肿瘤抗原；在该情形中，所述第一和第二抗原还可以是相同肿瘤特异性蛋白上的两种不同表位。

在另一个优选的实施方案中，二价双特异性抗体特异性结合的两种不同抗原(第一和第二抗原)之一是肿瘤抗原且另一种是效应细胞抗原，如，例如，T细胞受体，CD3，CD16等。

在另一个优选的实施方案中，二价双特异性抗体特异性结合的两种不同抗原(第一和第二抗原)之一是肿瘤抗原且另一种是抗癌物质诸如毒素或激酶抑制剂。

用于本文中时，“特异性结合”或“与……特异性结合”指特异性结合抗原的抗体。优选地，特异性结合该抗原的抗体的亲和力为10^-9mol/l以下(例如10^-10mol/l)的KD-值，优选10^-10mol/l以下(例如10^-12mol/l)的KD-值。结合亲和力使用标准结合测定法，诸如表面等离振子共振技术

来确定。

术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定子。在某些实施方案中，表位决定子包括分子的化学活性表面分组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，且或特定的带电特性。表位是抗原的被抗体结合的区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优选识别其靶抗原时，将该抗体称为与抗原特异性结合。

本发明的另一个实施方案是用于制备根据本发明的二价双特异性抗体的方法，其包括

a)用以下各项转化宿主细胞，

b)在容许合成所述抗体分子的条件下培养所述宿主细胞；和

c)从所述培养物中回收所述抗体分子。

一般地，存在两种编码所述特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链的载体，和另外两种编码所述特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链的载体。两种载体之一编码各种轻链且两种载体中的另一种编码各种重链。然而，在用于制备根据本发明的二价双特异性抗体的备选方法中，可使用仅一种编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链的第一载体和仅一种编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链的第二载体来转化宿主细胞。

本发明包括用于制备所述抗体的方法，其包括在容许合成所述抗体分子的条件下培养相应的宿主细胞和从所述培养物中回收所述抗体，其例如通过表达以下各项来实现

-第一核酸序列，其编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链，

-第二核酸序列，其编码所述特异性结合第一抗原的抗体的重链，

-第三核酸序列，其编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链，其中可变轻链结构域VL被替换为可变重链结构域VH，和

-第四核酸序列，其编码所述特异性结合第二抗原的抗体的重链，其中可变重链结构域VH被替换为可变轻链结构域VL。

本发明的另一个实施方案是一种宿主细胞，其包括

a)包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链的核酸分子的载体和包括编码特异性结合第一抗原的抗体的重链的核酸分子的载体，

b)包括编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链的核酸分子的载体和包括编码特异性结合第二抗原的抗体的重链的核酸分子的载体，其中可变结构域VL和VH相互替换。

本发明的另一个实施方案是一种根据本发明所述的二价双特异性抗体的组合物，优选药物或诊断组合物。

本发明的另一个实施方案是一种药物组合物，其包括根据本发明所述的二价双特异性抗体和至少一种药用赋形剂。

本发明的另一个实施方案是一种用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的根据本发明所述的二价双特异性抗体。

术语“核酸或核酸分子”，用于本文中时，意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。

用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移的次数。还理解所有的子代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异子代。在意指不同名称时，通过上下文其将是清楚的。

术语“转化”用于本文中时，指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果将无难以克服的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，则转染例如通过如Graham和van der Eh，Virology(病毒学)52(1978)546ff所述的磷酸钙沉淀法来进行。然而，还可以使用其他将DNA引入细胞的方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含实质细胞壁结构的细胞，例如一种转染方法是利用氯化钙的钙处理，如Cohen，F.N，等，PNAS(美国科学院院报).69(1972)7110ff所述。

利用转化重组生成抗体在现有技术中是公知的且记载在，例如，综述文章Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.(蛋白表达和纯化)17(1999)183-202；Geisse，S.，等，Protein Expr.Purif.(蛋白表达和纯化)8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.(分子生物技术)16(2000)151-161；Werner，R.G，等，Arzneimittelforschung 48(1998)870-880中以及US 6,331,415和US 4,816,567中。

用于本文中时，“表达”指将核酸转录为mRNA的过程和/或将转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽共同称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。

“载体”是核酸分子，特别是自体复制的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞之中和/或之间。该术语包括主要功能为将DNA或RNA插入细胞(例如，染色体整合)的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供多于一种上述功能的载体。

“表达载体”是多核苷酸，其在引入到合适的宿主细胞中时能够被转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指包括表达载体的适当宿主细胞，所述表达载体可以起作用产生所需的表达产物。

根据本发明所述的二价双特异性抗体优选通过重组手段生成。所述方法是本领域中普遍已知的，且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达及随后分离抗体多肽和通常纯化到药用纯度。为了蛋白质表达，通过标准方法将编码轻链和重链或其片段的核酸插入表达载体中。表达在合适的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母或大肠杆菌(E.coli)细胞中进行，且从所述细胞(溶胞后的上清或细胞)中回收抗体。二价双特异性抗体可以存在于完整细胞中、存在于细胞溶解产物中或以部分纯化或基本纯形式存在。通过标准技术，包括碱/SDS处理，柱层析法和本领域中的其他公知技术进行纯化，从而消除其他细胞成分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白。参见Ausubel，F.，等编辑，Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学方案)，Greene Publishing and Wiley Interscience，纽约(1987)。

在NS0细胞中的表达记载在，例如，Barnes，L.M.，等，Cytotechnology(细胞技术学)32(2000)109-123；和Barnes，L.M.，等，Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)73(2001)261-270中。瞬时表达记载在，例如，Durocher，Y.，等，Nucl.Acids.Res.(核酸研究)30(2002)E9中。可变结构域的克隆记载在Orlandi，R，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)86(1989)3833-3837；Carter，P.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L.，等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)204(1997)77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK 293)记载在Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，在Cytotechnology(细胞技术学)30(1999)71-83中和Schlaeger，E.-J.，在J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)194(1996)191-199中。

适合于原核生物的控制序列，例如，包括启动子，任选操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和加A信号。

当核酸被置于与另一个核酸序列的功能关系中时，其是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响所述序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在阅读框中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果不存在所述位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸接合体或连接体。

通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如例如，蛋白A-琼脂糖，羟磷灰石层析法，凝胶电泳，透析，或亲合层析法，从培养基中适当地分离二价双特异性抗体。编码单克隆抗体的DNA和RNA容易利用常规程序分离和测序。杂交瘤细胞可以起所述DNA或RNA来源的作用。一旦分离后，可以将DNA插入到表达载体中，所述表达载体随后转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如HEK 293细胞、CHO细胞、或骨髓瘤细胞中，以在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。

二价双特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)通过将适当的核苷酸改变引入到抗体DNA中，或通过核苷酸合成来制备。然而，这样的修饰仅能在非常有限的范围内，例如如上所述的范围内进行。例如，所述修饰不改变上述抗体特征诸如IgG同种型和抗原结合，但可以提高重组生产的产率、蛋白稳定性或促进纯化。

提供以下实施例、序列表和附图来帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中给出。要理解在不偏离本发明精神的条件下可以对所述步骤作出改动。

序列表

SEQ ID NO：1野生型<IGF-1R>抗体重链的氨基酸序列

SEQ ID NO：2野生型<IGF-1R>抗体轻链的氨基酸序列

SEQ ID NO：3<IGF-1R>VL-VH交换抗体的重链***(HC***)的氨基酸序列，其中重链结构域VH被替换为轻链结构域VL-变体A。

SEQ ID NO：4<IGF-1R>VL-VH交换抗体的轻链***(LC***)的氨基酸序列，其中轻链结构域VL被替换为重链结构域VH-变体A。

SEQ ID NO：5IGF-1R胞外域His-链霉亲和素结合肽-标签(IGF-1R-His-SBP ECD)的氨基酸序列

SEQ ID NO：6野生型血管生成素-2<ANGPT2>抗体重链的氨基酸序列

SEQ ID NO：7野生型血管生成素-2<ANGPT2>抗体轻链的氨基酸序列

SEQ ID NO：8用于杵-进入-臼技术中的具有T366W交换的CH3结构域(杵)的氨基酸序列

SEQ ID NO：9用于杵-进入-臼技术中的具有T366S，L368A，Y407V交换的CH3结构域(臼)的氨基酸序列

SEQ ID NO：10<IGF-1R>VL-VH交换抗体的重链***(HC***)的氨基酸序列，其中重链结构域VH被替换为轻链结构域VL-变体B。

SEQ ID NO：11<IGF-1R>VL-VH交换抗体的轻链***(LC***)的氨基酸序列，其中轻链结构域VL被替换为重链结构域VH-变体B。

SEQ ID NO：12IGF-1R胞外域His-链霉亲和素结合肽-标签(IGF-1R-His-SBP ECD)的氨基酸序列。

附图说明

图1IgG的示意图，IgG即为天然存在的特异于一种抗原的完整抗体，其具有两对重链和轻链，所述重链和轻链具有处于典型顺序的可变结构域和恒定结构域。

图2二价双特异性抗体的示意图，所述二价双特异性抗体包括：a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中可变结构域VL和VH相互替换。

图3二价双特异性抗体的示意图，所述二价双特异性抗体包括：a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中可变结构域VL和VH相互替换，且其中通过杵-进入-臼技术改变两条重链的CH3结构域。

图4二价双特异性抗体的示意图，所述二价双特异性抗体包括：a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中可变结构域VL和VH相互替换，且其中两条重链的恒定重链结构域CH3之一被替换为恒定重链结构域CH1，且另一个获恒定重链结构域CH3被替换为恒定轻链结构域CL。

图5<IGF-1R>VL-VH交换抗体的重链***<IGF-1R>HC***的蛋白序列图。

图6<IGF-1R>VL-VH交换抗体(具有κ恒定轻链结构域CL)的轻链***<IGF-1R>LC***的蛋白序列图。

图7重链***<IGF-1R>HC***表达载体pUC-HC***-IGF-1R的质粒图谱。

图8轻链***<IGF-1R>LC***表达载体pUC-LC***-IGF-1R的质粒图谱。

图94700-Hyg-OriP表达载体的质粒图谱。

图10对于I24IGF-1R表达细胞进行的用于检测功能性双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体的存在的细胞FACSIGF-1R-ANGPT2桥连测定的测定原理。

图11示范IGF-1R ECD Biacore。

图12具有HC*和LC*的单特异性二价<IGF-1R>VL-VH交换抗体(IgG1*)的SDS-PAGE和大小排阻层析，所述具有HC*和LC*的单特异性二价<IGF-1R>VL-VH交换抗体(IgG1*)是从瞬时转染HEK293E细胞后的细胞培养物上清中分离的。

图13在基于ELISA的结合测定中，单特异性<IGF-1R>VL-VH交换抗体和野生型<IGF-1R>抗体与IGF-1R ECD的结合。

图14从来自瞬时转染的HEK293E细胞的细胞培养物上清中纯化的<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体混合物的SDS-PAGE。

图15对于I24IGF-1R表达细胞进行的用于检测纯化的抗体混合物中存在功能性双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体的细胞FACSIGF-1R-ANGPT2桥连测定的样品A-F的结果。纯化的蛋白样品A-F：

A＝未处理的I24

B＝I24+2μg/mL hANGPT2+hIgG同种型

D＝I24+2μg/mL hANGPT2+来自<IGF-1R>CL-CH1交换

抗体和<ANGPT2>野生型抗体的共表达的、包括双特异性

<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体的混合物

E＝I24+2μg/mL hANGPT2+<ANGPT2>野生型抗体

F＝I24+2μg/mL hANGPT2+<IGF-1R>野生型抗体

实施例

材料和一般方法

关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat，E.A.，等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫目的的蛋白质序列)，第5版，Public Health Service(公众健康服务)，National Institutes ofHealth(全国卫生研究所)，Bethesda，MD.(1991))中提供。按照EU编号对抗体链的氨基酸进行编号和提及(Edelman，GM.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院报)63(1969)78-85；Kabat，E.A.，等，Sequences ofProteins of Immunological Interest(免疫目的的蛋白质序列)，第5版，PublicHealth Service(公众健康服务)，National Institutes ofHealth(全国卫生研究所)，Bethesda，MD.(1991))。

重组DNA技术

使用标准方法操作DNA，如Sambrook，J.等.，Molecular cloning：Alaboratory manual(分子克隆：实验室手册)；Cold Spring Harbor LaboratoryPress(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，纽约，1989中所述。分子生物学试剂按照供应商说明使用。

基因合成

所需基因区段由通过化学合成制备的寡核苷酸制备。侧连单限制性内切核酸酶裂解位点的600-1800bp长的基因区段通过寡核苷酸的退火和连接包括PCR扩增来装配，并随后通过所指出的限制位点例如KpnI/SacI或AscI/PacI克隆到基于pPCRScript(Stratagene)的pGA4克隆载体中。亚克隆基因片段的DNA序列通过DNA测序验证。基因合成片段按照Geneart的给定说明书(Regensburg，德国)来订购。

DNA序列确定

DNA序列通过在MediGenomix GmbH(Martinsried，德国)或Sequiserve GmbH(Vaterstetten，德国)进行的双链测序来确定。

DNA和代表序列合成和序列数据管理

GCG(Genetics Computer Group(遗传学计算小组)，Madison，威斯康星)的软件包10.2版和Infomax载体NT1Advance suite 8.0版用于序列构建、作图、分析、注解和说明。

表达载体

为了表达所述抗体，应用用于基于具有CMV-内含子A启动子的cDNA构造或基于具有CMV启动子的基因组构造的细胞中(例如在HEK293EBNA或HEK293-F)瞬时表达的表达质粒的变体。

除抗体表达盒以外，所述载体包括：

-复制起点，其容许该质粒在大肠杆菌中复制，和

-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。

抗体基因的转录单元由以下元件组成：

-5’末端处的特有限制性位点

-来自人巨细胞病毒的即时早期增强子和启动子，

-在cDNA构造的情形中，随后是内含子A序列，

-人抗体基因的5’-非翻译区，

-免疫球蛋白重链信号序列，

-人抗体链(野生型或具有结构域交换)，其作为cDNA或作为具有免疫球蛋白外显子-内含子构造的基因组构造

-具有加A信号序列的3’非翻译区，和

-3’末端处的特有的限制性位点。

如下所述的包括所述抗体链的融合基因通过PCR和/或基因合成产生并使用已知的重组方法和技术来装配，所述重组方法和技术通过在各种载体中例如利用特有的限制性位点来连接相应的核酸区段来实现。亚克隆的核酸序列通过DNA测序来验证。为了瞬时转染，通过来自转化的大肠杆菌培养物的质粒制备物来制备更大量的质粒(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)。

细胞培养技术

标准细胞培养技术如Current Protocols in Cell Biology(当前细胞生物学方案)(2000)，Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada，K.M.(编辑)，John Wiley & Sons，Inc中所述来使用。

双特异性抗体通过在贴壁生长的HEK293-EBNA中或在悬浮生长的HEK29-F细胞中瞬时共转染各种表达质粒来表达，如下所述。

HEK293-EBNA系统中的瞬时转染

双特异性抗体通过在贴壁生长的HEK293-EBNA细胞(表达EB病毒核抗原的人胚肾细胞系293；美国典型培养物中心，保藏号ATCC#CRL-10852，Lot.959 218)中瞬时共转染各种表达质粒(例如编码重链和修饰的重链，以及相应的轻链和修饰的轻链)来表达，所述细胞是在添加了10％超低IgG FCS(胎牛血清，Gibco)，2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，和250μg/ml遗传霉素(geneticin)(Gibco)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’smedium，Gibco(Dulbecco改良的Eagle培养基))中培养的。为了转染，FuGENE^TM 6转染试剂(Roche Molecular Biochemicals(罗氏分子生物化学))按照FuGENE^TM试剂(μl)与DNA(μg)的比例为4∶1(在3∶1～6∶1的范围内)来使用。利用摩尔比为1∶1(等摩尔)的编码(修饰的和野生型)轻链和重链的质粒，所述摩尔比范围是1∶2～2∶1，由各种质粒来分别表达蛋白。在第3天，用L-谷氨酰胺加至4mM，葡萄糖[西格玛(Sigma)]和NAA[Gibco]饲养细胞。在转染后第5-11天通过离心法收获包含双特异性抗体的细胞培养物上清并保存在-20℃。关于在例如HEK293细胞中进行人免疫球蛋白的重组表达的一般信息提供在Meissner，P.等，Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程)75(2001)197-203中。

HEK293-F系统中的瞬时转染

双特异性抗体通过利用HEK293-F系统(Invitrogen)按照供应商的说明瞬时转染各种质粒(例如编码重链和修饰的重链，以及相应的轻链和修饰的轻链)来生成。简言之，用四种表达质粒和293fectin或fectin(Invitrogen)的混合物来转染在摇瓶中或在搅拌发酵器中在无血清FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293-F(Invitrogen)。对于2L摇瓶(Corning)，HEK293-F细胞以1.0E*6细胞/mL的密度接种在600mL中并以120rpm，8％CO2温育。第二天，用ca.42mL的A)具有600μg等摩尔比的分别编码重链或修饰的重链，和相应轻链的总质粒DNA(1μg/mL)的20mL Opti-MEM(Invitrogen)和B)20ml Opti-MEM+1.2mL 293fectin或fectin(2μl/mL)的混合物，转染细胞密度为ca.1.5E*6细胞/mL的细胞。在发酵过程中根据葡萄糖的消耗，添加葡萄糖溶液。在5-10天后收获包含分泌的抗体的上清，并且直接由上清纯化抗体或冷冻并保存上清。

蛋白确定

纯化的抗体和衍生物的蛋白浓度通过利用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数确定280nm处的光密度(OD)来确定，其依照Pace等，ProteinScience(蛋白质科学)，1995，4，2411-1423。

上清中抗体浓度的确定

抗体和衍生物在细胞培养物上清中的浓度通过使用蛋白质A琼脂糖-珠(Roche(罗氏))的免疫沉淀法来评估。60μL蛋白质A琼脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，1％Nonidet-P40)洗涤三次。随后，将1-15mL细胞培养物上清应用于在TBS-NP40中预平衡的蛋白质A琼脂糖珠。室温下温育1小时后，将该珠在Ultrafree-MC-过滤柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40洗涤1次，用0.5mL 2x磷酸盐缓冲液(2xPBS，Roche(罗氏))洗涤2次并用0.5mL 100mM柠檬酸钠pH 5，0简单洗涤4次。通过添加35μl

LDS样品缓冲液(Invitrogen)洗脱结合的抗体。样品的一半分别与

样品还原剂混合或保持未还原，并在70℃加热10分钟。因此，将5-30μl应用于4-12％

Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(具有MOPS缓冲液，以用于非还原的SDS-PAGE且具有

抗氧化运行缓冲液添加剂(Invitrogen)的MES缓冲液，以用于还原的SDS-PAGE)并用考马斯蓝染色。

抗体和衍生物在细胞培养物上清中的浓度通过亲合HPLC层析法来定量测量。简言之，将包含结合蛋白质A的抗体和衍生物的细胞培养物上清应用于在200mM KH2PO4，100mM柠檬酸钠，pH 7.4中的应用生物系统(Applied Biosystems)Poros A/20柱，并在安捷伦(Agilent)HPLC 1100系统上用200mM NaCl，100mM柠檬酸，pH 2.5洗脱。洗脱的蛋白通过UV吸光度和峰面积整合来量化。纯化的标准IgG1抗体作为标准物。

备选地，抗体和衍生物在细胞培养物上清中的浓度通过夹心-IgG-ELISA来测量。简言之，将StreptaWell高结合链霉亲和素A-96孔微量滴定板(Roche(罗氏))用100μL/孔0.1μg/mL的生物素化的抗人IgG捕获分子F(ab’)2<h-Fcγ>BI(Dianova)，在室温下包被1小时或备选地在4℃包被过夜并随后用200μL/孔PBS，0.05％吐温(PBST，Sigma(西格玛))洗涤3次。将100μL/孔包含各种抗体的细胞培养物上清在PBS(Sigma(西格玛))中的稀释物系列加入到孔中并在微量滴定板摇动器上，以室温温育1-2小时。孔用200μL/孔PBST洗涤三次并且用100μl浓度为0.1μg/mL的F(ab‘)2<hFcγ>POD(Dianova)作为检测抗体，在微量滴定板摇动器上，在室温下检测结合的抗体1-2小时。未结合的检测抗体用200μL/孔PBST洗涤三次洗掉，并且结合的检测抗体通过添加100μL ABTS/孔来检测。在Tecan Fluor分光计上，以405nm的测量波长(参照波长492nm)来进行吸光度的确定。

蛋白质纯化

参考标准流程，从过滤的细胞培养物上清中纯化蛋白。简言之，将抗体应用于蛋白质A琼脂糖柱(GE healthcare(GE健康护理))并用PBS洗涤。在pH 2.8实现抗体洗脱，并随后立即中和样品。在PBS中或在20mM组氨酸，150mM NaCl pH 6.0中，通过大小排阻层析(Superdex 200，GEhealthcare(GE健康护理))将聚集的蛋白质与单体抗体分开。汇集单体抗体级分，如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩，冷冻和在-20℃或-80℃保存。提供部分样品进行随后的例如通过SDS-PAGE，大小排阻层析法或质谱法进行的蛋白质分析和分析表征。

SDS-PA GE

预制凝胶系统(Invitrogen)按照供应商的说明来使用。具体地，使用10％或4-12％

Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和MES(还原的凝胶，具有

抗氧化运行缓冲液添加剂)或MOPS(未还原的凝胶)运行缓冲液。

分析性大小排阻层析法

用于确定抗体聚集和低聚状态的大小排阻层析法通过HPLC层析法来进行。简言之，将蛋白质A纯化抗体应用于安捷伦(Agilent)HPLC 1100系统上处于300mM NaCl，50mM KH2PO4/K2HPO4，pH 7.5中的TosohTSKgel G3000SW柱或Dionex HPLC-系统上处于2x PBS中的Superdex200柱(GE healthcare(GE健康护理))。洗脱的蛋白通过UV吸光度和峰面积的整合来量化。BioRad凝胶过滤标准物151-1901作为标准物。

质谱法

交换(crossover)抗体的总去糖基化质量通过电喷射离子化质谱法(ESI-MS)来确定和验证。简言之，用在100mM KH2PO4/K2HPO4，pH 7中的50mU N-糖苷酶F(PNGaseF，ProZyme)在37℃，以至多2mg/ml的蛋白质浓度，将100μg纯化的抗体去糖基化12-24小时，并随后在SephadexG25柱(GE healthcare(GE健康护理))上通过HPLC来脱盐。各种重链和轻链的质量在去糖基化和还原后通过ESI-MS来确定。简言之，在115μl中的50μg抗体用60μl 1M TCEP和50μl 8M盐酸胍来温育，并随后脱盐。总质量和还原的重链和轻链的质量通过在装配有NanoMate源的Q-StarElite MS系统上进行ESI-MS来确定。

IGF-1R ECD结合ELISA

产生的抗体的结合特性在使用IGF-1R胞外结构域(ECD)的ELISA测定中评估。为了该目的，将IGF-1R的胞外结构域(残基1-462)，其包括与N-端His-链霉亲和素结合肽-标签(His-SBP)融合的α链(根据McKern等，1997；Ward等，2001)的人IGF-IR胞外域的天然前导序列和LI-富含半胱氨酸-12结构域(LI-cysteine rich-12domain)，克隆到pcDNA3载体衍生物中并在HEK293F细胞中瞬时表达。IGF-1R-His-SBP ECD的蛋白质序列在SEQ ID NO：12中给出。StreptaWell高结合链霉亲和素A-96孔微量滴定板(Roche(罗氏))用100μL/孔含有可溶性IGF-1R-ECD-SBP融合蛋白的细胞培养物上清在4℃包被过夜并用200μL/孔PBS，0.05％吐温(PBST，Sigma(西格玛))洗涤三次。随后，将100μL/孔在包含1％BSA(级分V，Roche(罗氏))的PBS(Sigma(西格玛))中的各种抗体的稀释物系列和作为参照的野生型<IGF-1R>抗体加入到孔中并在微量滴定板摇动器上在室温下温育1-2小时。对于稀释物系列，将等量的纯化的抗体应用于所述孔。该孔用200μL/孔PBST洗涤三次并且结合的抗体用浓度为0.1μg/mL(1∶8000)的100μL/孔F(ab‘)2<hFcγ>POD(Dianova)作为检测抗体在微量滴定板摇动器上，以室温检测1-2小时。未结合的检测抗体使用200μL/孔PBST洗涤三次洗掉，并且结合的检测抗体通过添加100μL ABTS/孔来检测。在TecanFluor分光计上，以405nm的测量波长(参照波长492nm)来进行吸光度的确定。

IGF-1R ECD Biacore

产生的抗体与人IGF-1R ECD的结合也通过利用BIACORE T100仪器(GE healthcare Biosciences AB(GE健康护理生物科学AB)，Uppsala，瑞典)的表面等离振子共振来研究。简言之，对于亲合性测量，通过用于呈递正对Fc标记的人IGF-1R ECD(human IGF-1R ECD-Fc tagged)的抗体的胺偶联在CM5芯片上固定山羊-抗-人IgG，JIR 109-005-098抗体。结合在HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐温20，ph 7.4)中，25℃测量。将IGF-1R ECD(R&D系统或内部纯化的)以不同浓度加入到溶液中。缔合通过注射IGF-1R ECD 80秒-3分钟来测量；解离通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面3-10分钟来测量且KD值利用1∶1朗缪尔结合模型(Langmuir binding model)来评估。由于<IGF-1R>抗体的低负载密度和捕获水平，获得单价IGF-1R ECD结合。从样品曲线中减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)，以用于校正系统固有的基线漂移和用于噪音信号的降低。使用Biacore T100评估软件1.1.1版用于S曲线(sensorgrams)的分析和用于亲合性数据的计算。图11显示Biacore测定的示意图。

实施例1

制备、表达、纯化和表征单特异性二价<IGF-1R>抗体，其中可变结构域 VL和VH相互替换(本文中缩写为<IGF-1R>VL-VH交换抗体)。

实施例1A

制备关于单特异性二价<IGF-1R>VL-VH交换抗体的表达质粒

包括本实施例中所述的各种前导序列的单特异性二价<IGF-1R>VL-VH交换抗体的重链和轻链可变结构域的序列源自WO 2005/005635中所述的人<IGF-1R>抗体重链(SEQ ID NO：1，质粒4843-pUC-HC-IGF-1R)和轻链(SEQ ID NO：2，质粒4842-pUC-LC-IGF-1R)，且重链和轻链恒定结构域源自人抗体(C-κ和IgG1)。

编码<IGF-1R>抗体前导序列、轻链可变结构域(VL)和人重链恒定结构域1(CH1)的基因区段连接并与人γ1-重链恒定结构域(铰链-CH2-CH3)的Fc结构域的5’末端融合。编码通过用VL结构域交换VH结构域(VL-VH交换)获得的各种融合蛋白的DNA通过基因合成产生，并在以下表示为<IGF-1R>HC***(SEQ ID NO：10)。初步地，VL-CH1结构域与稍微不同的序列(SEQ ID NO：3)融合；由于此连接的表达产量较小，因此选择显示与野生型抗体相当的表达产量的SEQ10。

<IGF-1R>抗体前导序列，重链可变结构域(VH)和人轻链恒定结构域(CL)的基因区段作为独立的链连接。编码通过用VH结构域交换VL结构域(VL-VH交换)获得的各种融合蛋白的DNA通过基因合成产生，并在以下表示为<IGF-1R>LC***(重链***)(SEQ ID NO：11)。初步地，VH-CL结构域与稍微不同的序列(SEQ ID NO：4)融合；由于此连接的表达产量较小，因此选择显示与野生型抗体相当的表达产量的SEQ ID NO：11。

图5和图6显示修饰的<IGF-1R>HC***重链和修饰的<IGF-1R>LC***轻链的蛋白质序列的示意图。

以下，简要描述各种表达载体：

载体pUC-HC＊＊＊-IGF-1R

载体pUC-HC***-IGF-1R是例如用于在HEK293(EBNA)细胞中瞬时表达VL-VH交换<IGF-1R>重链HC***(cDNA构造的表达盒；具有CMV-内含子A)或用于在CHO细胞中稳定表达的表达质粒。

除<IGF-1R>HC＊＊＊表达盒以外，该载体包含：

-来自载体pUC18的复制起点，其容许该质粒在大肠杆菌中的复制，和

-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。

<IGF-1R>HC***基因的转录单元由以下元件组成：

-5’末端处的AscI限制性位点，

-来自人巨细胞病毒的即时早期增强子和启动子，

-随后的内含子A序列，

-人抗体基因的5’-非翻译区，

-免疫球蛋白轻链信号序列，

-人<IGF-1R>成熟HC***链，其编码与人γ1-重链恒定结构域(铰链

-CH2-CH3)的Fc结构域的5’末端融合的人重链可变结构域(VH)和人κ-轻链恒定结构域(CL)的融合体

-具有加A信号序列的3’非翻译区，和

-3’末端处的限制性位点SgrAI。

重链***VL-VH交换<IGF-1R>HC***表达载体pUC-HC***-IGF-1R的质粒图谱显示在图7中。<IGF-1R>HC***(包括信号序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO：10中提供。

载体pUC-LC＊＊＊-IGF-1R

载体pUC-LC***-IGF-1R是例如用于在HEK293(EBNA)细胞中瞬时表达VL-VH交换<IGF-1R>轻链LC***(cDNA构造的表达盒；具有CMV-内含子A)或用于在CHO细胞中稳定表达的表达质粒。

除<IGF-1R>LC＊＊＊表达盒以外，该载体包含：

-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。

<IGF-1R>LC***基因的转录单元由以下元件组成：

-5’末端处的限制性位点Sse8387I

-来自人巨细胞病毒的即时早期增强子和启动子，

-随后的内含子A序列，

-人抗体基因的5’-非翻译区，

-免疫球蛋白重链信号序列，

-人<IGF-1R>成熟LC***链，其编码人轻链可变结构域(VL)和人

γ1-重链恒定结构域(CH1)的融合体

-具有加A信号序列的3’非翻译区，和

-3’末端处的限制性位点SalI和FseI。

轻链**VL-VH交换<IGF-1R>LC***表达载体pUC-LC***-IGF-1R的质粒图谱显示在图8中。<IGF-1R>LC***(包括信号序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO：11中提供。

质粒pUC-HC***-IGF-1R和pUC-LC***-IGF-1R可以用于瞬时或稳定共转染到例如HEK293，HEK293EBNA或CHO细胞(2-载体系统)中。为了比较的原因，野生型<IGF-1R>抗体由与该实施例中所述的那些类似的质粒4842-pUC-LC-IGF-1R(SEQ ID NO：2)和4843-pUC-HC-IGF-1R(SEQ IDNO：1)瞬时表达。

为了在HEK293EBNA细胞中获得瞬时表达的较高表达水平，可以将<IGF-1R>HC***表达盒经由AscI、SgrAI位点和将<IGF-1R>LC***表达盒经由Sse8387I和FseI位点亚克隆到包含以下各项的4700pUC-Hyg_OriP表达载体中：

-OriP元件，和

-潮霉素抗性基因，其作为选择性标记物。

可以将重链和轻链转录单元亚克隆到2个独立的4700-pUC-Hyg-OriP载体中，从而进行共转染(2-载体系统)或可以将它们克隆到一个共同的4700-pUC-Hyg-OriP载体(1-载体系统)中，从而随后用由此产生的载体进行瞬时或稳定转染。图9显示基础载体4700-pUC-OriP的质粒图谱。

实施例1B

制备单特异性二价<IGF-1R>VL-VH交换抗体表达质粒

包括野生型<IGF-1R>抗体的交换的Fab序列的<IGF-1R>融合基因(HC***和LC***融合基因)使用已知的重组方法和技术，通过连接相应的核酸区段来装配。

编码IGF-1R HC***和LC***的核酸序列分别通过化学合成来合成并随后在Geneart(Regensburg，德国)处，克隆到基于pPCRScript(Stratagene)的pGA4克隆载体中。将编码IGF-1R HC***的表达盒经由PvuII和BmgBI限制位点连接到各种大肠杆菌质粒中，以生成最终载体pUC-HC***-IGF-1R；将编码各种IGF-1R LC***的表达盒经由PvuII和SalI限制位点连接到各种大肠杆菌质粒中，以生成最终载体pUC-LC***-IGF-1R。亚克隆的核酸序列通过DNA测序来验证。为了瞬时和稳定转染，通过来自转化的大肠杆菌培养物的质粒制备物来制备更大量的质粒(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)。

实施例1C

瞬时表达单特异性二价<IGF-1R>VL-VH交换抗体，通过质谱法纯化和证实特征

重组<IGF-1R>VL-VH交换抗体通过在HEK293-F悬浮细胞中瞬时共转染质粒pUC-HC***-IGF-1R和pUC-LC***-IGF-1R进行表达，如上所述。

根据以上所述，通过蛋白质A亲合层析法，由过滤的细胞培养物上清中纯化表达和分泌的单特异性二价<IGF-1R>VL-VH交换抗体。简言之，来自瞬时转染的包含<IGF-1R>VL-VH交换抗体的细胞培养物上清通过离心和过滤来净化并应用于用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的蛋白质A HiTrap MabSelectXtra柱(GE healthcare(GE健康护理))。用PBS平衡缓冲液及随后的0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 5.5洗出未结合的蛋白，并用PBS洗涤。用100mM柠檬酸钠，pH 2.8实现抗体的洗脱，随后立即用300μl 2M Tris pH 9.0/2ml级分来中和样品。在20mM组氨酸，150mM NaCl pH 6.0中，通过在HiLoad26/60Superdex 200制备级柱(GE healthcare(GE健康护理))上进行的大小排阻层析法将聚集的蛋白质与单体抗体分开，且随后利用MILLIPOREAmicon Ultra-15离心浓缩器浓缩单体抗体级分。在-20℃或-80℃下冷冻和保存<IGF-1R>VL-VH交换抗体。<IGF-1R>VL-VH交换的完整性通过存在和缺乏还原剂的SDS-PAGE和随后用考马斯亮蓝染色来分析，如上所述。<IGF-1R>VL-VH交换抗体的单体状态通过分析性大小排阻层析法证实。(图12)提供表征的样品，以进行随后的蛋白质分析和功能表征。ESI质谱法验证完全去糖基化的<IGF-1R>VL-VH交换抗体的理论分子量。

实施例1D

在IGF-1R ECD结合ELISA中和通过Biacore分析单特异性二价<IGF-1R> VL-VH交换抗体的IGF-1R结合特性

单特异性二价<IGF-1R>VL-VH交换抗体的结合特性如上所述在使用IGF-1R胞外结构域(ECD)的ELISA测定中评估。为了该目的，将IGF-1R的胞外结构域(残基1-462)克隆到pcDNA3载体衍生物中并在HEK293F细胞中瞬时表达，所述IGF-1R的胞外结构域包括与N-端His-链霉亲和素结合肽-标签(His-SBP)融合的α链(根据McKern等，1997；Ward等，2001)的人IGF-IR胞外域的天然前导序列和LI-富含半胱氨酸-12结构域。IGF-1R-His-SBP ECD的蛋白质序列在上文中给出。获得的滴定曲线显示<IGF-1R>VL-VH交换抗体是功能性的并表现出在该方法的误差范围内的与野生型<IGF-1R>抗体相当的结合特性和动力学，并因此似乎是完全功能性的(图13)。

这些发现通过Biacore采用各自的纯化抗体来确证。

实施例1G

使用过表达GF-1R的I24细胞通过FACS分析单特异性二价<IGF-1R> VL-VH交换抗体的IGF-1R结合特性

为了验证，通过FACS研究<IGF-1R>VL-VH交换抗体与在I24细胞(表达重组人IGF-1R的NIH3T3细胞，Roche(罗氏))表面上过表达的IGF-1R的结合活性。简言之，5x10E5 I24细胞/FACS管用纯化的<IGF-1R>VL-VH交换抗体和作为参照的野生型<IGF-1R>抗体的稀释物来温育，并在冰上温育1小时。未结合的抗体用4ml冰冷PBS(Gibco)+2％FCS(Gibco)洗去。随后，离心细胞(5分钟，400g)并且在避光条件下，用F(ab‘)2<hFcγ>PE缀合物(Dianova)在冰上检测结合的抗体1小时。未结合的检测抗体用4ml冰冷PBS(Gibco)+2％FCS(Gibco)洗去。随后，对细胞进行离心(5分钟，400g)，重新悬浮在300-500μL PBS中，并且在FACSCalibur或FACS Canto(BD(FL2通道，10.000细胞/获得物)上量化结合的检测抗体。在实验过程中，包括各自的同种型对照，以排除任何非特异性结合事件。<IGF-1R>VL-VH交换抗体和野生型<IGF-1R>参照抗体与I24细胞上的IGF-1R的结合导致相当的平均荧光强度的浓度依赖性偏移。

实施例2

单特异性二价<ANGPT2>野生型抗体的描述

实施例2A

制备单特异性二价<ANGPT2>野生型抗体的表达质粒

包括本实施例中所述的各种前导序列的单特异性二价ANGPT2<ANGPT2>野生型抗体的重链和轻链可变结构域的序列源自WO2006/045049中所述的人<ANGPT2>抗体重链(SEQ ID NO：6)和轻链(SEQID NO：7)，且重链和轻链恒定结构域源自人抗体(C-κ和IgG1)。

将野生型<ANGPT2>抗体克隆到与前述实施例1A中所述的载体类似的质粒SB04-pUC-HC-ANGPT2(SEQ ID NO：6)和SB06-pUC-LC-ANGPT2(SEQ ID NO：7)中。

为了比较的原因和为了共表达实验(见实施例3)，由质粒SB04-pUC-HC-ANGPT2和SB06-pUC-LC-ANGPT2瞬时(共-)表达野生型<ANGPT2>抗体。

实施例2B

制备单特异性二价<ANGPT2>野生型抗体的表达质粒

编码ANGPT2>HC和LC的核酸序列分别通过化学合成来合成并随后在Geneart(Regensburg，德国)处，克隆到基于pPCRScript(Stratagene)的pGA4克隆载体中。将编码<ANGPT2>HC的表达盒克隆到各种大肠杆菌质粒中，以生成最终载体SB04-pUC-HC-ANGPT2；将编码各种<ANGPT2>LC的表达盒克隆到各种大肠杆菌质粒中，以生成最终载体SB06-pUC-LC-ANGPT2。亚克隆的核酸序列通过DNA测序来验证。为了瞬时和稳定转染，通过来自转化的大肠杆菌培养物的质粒制备物来制备更大量的质粒(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)。

实施例3

表达双特异性二价<ANGPT2-IGF-1R>抗体，其中在特异性结合IGF-1R的重链和轻链中，恒定结构域VL和VH相互替换(本文中缩写为 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体)。

实施例3A

在HEK293EBNA细胞中瞬时共表达和纯化<IGF-1R>VL-VH交换抗体和 <ANGPT2>野生型抗体以生成双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体

为了生成通过位于一侧的<IGF-1R>VL-VH交换抗体Fab识别IGF-1R并通过位于另一侧的<ANGPT2>野生型Fab区识别<ANGPT2>的功能性双特异性抗体，2个编码<IGF-1R>VL-VH交换抗体(实施例1A)的表达质粒与2个编码<ANGPT2>野生型抗体的表达质粒(实施例2A)共表达。假设野生型重链HC和VL-VH交换重链HC***统计学关联，这导致双特异性二价<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体的生成。在两种抗体同等充分表达并不考虑副产物的假设下，这应该导致比例为1∶2∶1的三种主要产物：A)<IGF-1R>VL-VH交换抗体，B)双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体和C)<ANGPT2>野生型抗体的。可以预期有几种副产物。然而，由于仅交换VL-VH结构域，副产物的频率与完整Fab交换相比应该降低。请注意，由于<ANGPT2>野生型抗体表现出比<IGF-1R>野生型和<IGF-1R>VL-VH交换抗体更高的表达瞬时表达产量，<ANGPT2>野生型抗体质粒和<IGF-1R>VL-VH交换抗体质粒的比例向着有利于<ANGPT2>野生型抗体表达的方向偏移。

为了生成主要产物A)<IGF-1R>VL-VH交换抗体，B)双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体和C)<ANGPT2>野生型抗体的混合物，在如上所述悬浮的HEK293-F细胞中共转染四种质粒pUC-HC***-IGF-1R和pUC-LC***-IGF-1R和质粒SB04-pUC-HC-ANGPT2和SB06-pUC-LC-ANGPT2。收获的上清包含主要产物A)<IGF-1R>VL-VH交换抗体，B)双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体和C)<ANGPT2>野生型抗体的混合物，并表示为“双特异性VL-VH交换混合物”。包含双特异性VL-VH交换混合物的细胞培养物上清通过离心收获并随后如上所述进行纯化。

该抗体混合物的完整性通过所述的在存在和缺乏还原剂的SDS-PAGE并随后用考马斯亮蓝染色以及通过大小排阻层析来分析。如预期地那样，SDS-PAGE显示制备物中存在2条不同的重链和轻链(还原的凝胶)(图14)。提供表征的样品，以进行随后的蛋白分析和功能表征。

实施例3B

在I24IGF-1R表达细胞上在细胞FACS桥连测定中检测功能性双特异性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体

为了证实来自实施例3A中所述的瞬时共表达的主要产物A)<IGF-1R>VL-VH交换抗体，B)双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体和C)<ANGPT2>野生型抗体的纯化双特异性VL-VH交换混合物中存在功能性双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体，对I24细胞(表达重组人IGF-1R的NIH3T3细胞，Roche(罗氏))进行细胞FACSIGF-1R-ANGPT2桥连测定。该测定的原理在图10中描述。纯化的抗体混合物中存在的的双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体能够同时结合I24细胞中的IGF-1R和结合ANGPT2；且因此应该用两个相对的Fab区桥连它的两个靶抗原。

简言之，5x10E5I24细胞/FACS管与总纯化抗体混合物温育，并在冰上温育1小时(滴定160μg/ml混合物)。将各种纯化抗体野生型<IGF-1R>和<ANGPT2>应用于I24细胞作为对照。未结合的抗体用4ml冰冷PBS(Gibco)+2％FCS(Gibco)洗去，离心细胞(5分钟，400g)并且用50μl 2μg/mL人ANGPT2(R&D Systems(R&D系统))在冰上检测结合的双特异性抗体1小时。随后，用4ml冰冷PBS(Gibco)+2％FCS(Gibco)洗涤一次或两次，洗去未结合的ANGPT2，离心细胞(5分钟，400g)并且用50μl 5μg/mL<ANGPT2>mIgG1-生物素抗体(BAM0981，R&D Systems(R&D系统))在冰上检测结合的ANGPT245分钟；备选地，用50μl 5μg/mL mIgG1-生物素-同种型对照(R&D Systems(R&D系统))温育细胞。未结合的检测抗体用4ml冰冷PBS(Gibco)+2％FCS(Gibco)洗去，离心细胞(5分钟，400g)并且在避光条件下，用50μl 1∶400链霉亲和素-PE缀合物(Invitrogen/Zymed)在冰上检测结合的检测抗体45分钟。未结合的链霉亲和素-PE缀合物用4ml冰冷PBS(Gibco)+2％FCS(Gibco)洗去。随后，对细胞进行离心(5分钟，400g)，重新悬浮在300-500μL PBS中，并且在FACSCalibur(BD(FL2通道，10.000细胞/获得物)上量化结合的链霉亲和素-PE缀合物。在实验过程中，包括各自的同种型对照，以排除任何非特异性结合事件。另外，包括纯化的单特异性二价IgG1抗体<IGF-1R>和<ANGPT2>，作为对照。

图15中的结果显示使用来自交叉抗体(<IGF-1R>VL-VH交换抗体)与野生型抗体(<ANGPT2>野生型抗体)的共表达的纯化抗体交叉混合物(<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体)温育导致荧光的显著偏移，这说明存在能够同时结合I24细胞中的IGF-1R和结合ANGPT2的功能性双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体；并由此使用两个相对的Fab区桥连它的两个靶抗原。与此相反，各自<IGF-1R>和<Ang-2>对照抗体在FACS桥连测定中不引起荧光的偏移。

总之，这些数据显示通过共表达可以生成各自的野生型和交换质粒功能性双特异性抗体。正确的双特异性抗体的产率可以通过例如使用杵-进入臼技术以及二硫键稳定作用来促进野生型和修饰的交换重链的异型二聚化来提高(见实施例4)。

实施例4

表达具有修饰的CH3结构域(杵-进入-臼)的二价双特异性 ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体

为了进一步提高双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体的产率，将杵-进入-臼技术应用于<IGF-1R>VL-VH交换和野生型<ANGPT2>抗体的共表达，以获得同质和功能性的双特异性抗体制剂。为了该目的，<IGF-1R>VL-VH交换抗体的重链*HC*中的CH3结构域被替换为具有T366W交换的SEQ ID NO：8的CH3结构域(杵)，且野生型<ANGPT2>抗体的重链中的CH3结构域被替换为具有T366S，L368A，Y407V交换的SEQ ID NO：9的CH3结构域(臼)，或反之亦然。另外，可以包括二硫键以增加稳定性和产率以及另外的残基形成离子键并增加异型二聚化产率(EP 1870459A1)。

由此生成的具有修饰的CH3结构域(杵-进入-臼)的二价双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交换抗体的瞬时共表达和纯化如实施例3中所述进行。

应该注意到异型二聚化的优化可以例如通过使用不同的杵-进入-臼技术诸如将额外的二硫键引入CH3结构域中，例如，将Y349C引入“杵链”中并将D356C引入“臼链”中和/或与由EP 1870459A1所述的用于杵残基的R409D；残基K370E(K409D)和用于臼残基的D399K；E357K相结合来实现。

与实施例4类似地，可以制备具有修饰的CH3结构域(杵-进入-臼)的其他二价双特异性VL-VH交换抗体，它们针对ANGPT2和另一靶抗原(使用上述ANGPT2重链和轻链和针对所述其他靶标的抗体的VL-VH交换重链和轻链***HC***和LC***，由此两条重链均通过“杵-进入-臼”而被修饰)，或针对IGF-1R和另一靶标(使用针对所述其他靶标的抗体的重链和轻链和上述IGF-1R VL-VH交换重链和轻链***HC***和LC***，由此两条重链均通过“杵-进入-臼”而被修饰)。

序列表

<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司

<120>二价双特异性抗体

<130>24678EP

<150>EP 07024864

<151>2007-12-21

<160>12

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>467

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>野生型<IGF-1R>抗体重链的氨基酸序列

<400>1

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly

115 120 125

Arg Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210>2

<211>235

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>野生型<IGF-1R>抗体轻链的氨基酸序列

<400>2

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser

100 105 110

Lys Trp Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys

115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210>3

<211>459

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223><IGF-1R>VL-VH交换抗体的重链***(HC***)的氨基酸序列，

其中重链结构域VH被替换为轻链结构域VL-变体A

<400>3

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser

100 105 110

Lys Trp Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Ser Val Ser

115 120 125

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

130 135 140

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

145 150 155 160

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

165 170 175

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

195 200 205

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

210 215 220

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

225 230 235 240

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

245 250 255

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

260 265 270

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

275 280 285

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

290 295 300

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

305 310 315 320

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

325 330 335

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

340 345 350

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

355 360 365

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

370 375 380

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

385 390 395 400

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

405 410 415

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

420 425 430

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

435 440 445

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210>4

<211>243

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223><IGF-1R>VL-VH交换抗体的轻链***(LC***)的氨基酸序列，

其中轻链结构域VL被替换为重链结构域VH-变体A

<400>4

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly

115 120 125

Arg Gly Thr Leu Val Glu Ser Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

130 135 140

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

145 150 155 160

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

165 170 175

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

180 185 190

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

195 200 205

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

210 215 220

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

225 230 235 240

Gly Glu Cys

<210>5

<211>557

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>IGF-1R胞外域His-链霉亲和素结合肽-标签(IGF-1R-His-SBP ECD)的氨基酸序列

<400>5

Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu

1 5 10 15

Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile

20 25 30

Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg

35 40 45

Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile

50 55 60

Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val

65 70 75 80

Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu

85 90 95

Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe

100 105 110

Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile

115 120 125

Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu

130 135 140

Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile

145 150 155 160

Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys

165 170 175

Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys

180 185 190

Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr

195 200 205

Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys

210 215 220

Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser

225 230 235 240

Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr

245 250 255

Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu

260 265 270

Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala

275 280 285

Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met

290 295 300

Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr

305 310 315 320

Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys

325 330 335

Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly

340 345 350

Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn

355 360 365

Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val

370 375 380

Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser

385 390 395 400

Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly

405 410 415

Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp

420 425 430

Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe

435 440 445

Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu

450 455 460

Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg

465 470 475 480

Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Ala Ala Ala Leu

485 490 495

Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Thr His His His His His His Ser

500 505 510

Gly Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly

515 520 525

Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro

530 535 540

Gln Gly Gln Arg Glu Pro Ser Gly Gly Cys Lys Leu Gly

545 550 555

<210>6

<211>471

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>野生型血管生成素-2<ANGPT2>抗体重链的氨基酸序列

<400>6

Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr

115 120 125

Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210>7

<211>219

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>野生型血管生成素-2<ANGPT2>抗体轻链的氨基酸序列

<400>7

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210>8

<211>107

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>用于杵-进入-臼技术中的具有T366W交换的CH3结构域(杵)的氨基酸序列

<400>8

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210>9

<211>107

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>用于杵-进入-臼技术中的具有T366S，L368A，Y407V交换的CH3结构域(臼)的氨基酸序列

<400>9

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210>10

<211>440

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223><IGF-1R>VL-VH交换抗体的重链***(HC***)的氨基酸序列，

其中重链结构域VH被替换为轻链结构域VL-变体B

<400>10

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys Ser Ser Ala Ser

100 105 110

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

115 120 125

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

130 135 140

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

145 150 155 160

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

180 185 190

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

195 200 205

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

210 215 220

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

305 310 315 320

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

385 390 395 400

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210>11

<211>225

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223><IGG-1R>VL-VH交换抗体的轻链***(LC***)的氨基酸序列，

其中轻链结构域VL被替换为重链结构域VH-变体B

<400>11

Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile

115 120 125

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val

130 135 140

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys

145 150 155 160

Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

165 170 175

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

180 185 190

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr

195 200 205

His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu

210 215 220

Cys

225

<210>12

<211>557

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<400>12

Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu

1 5 10 15

Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile

20 25 30

Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg

35 40 45

Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile

50 55 60

Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val

65 70 75 80

Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu

85 90 95

Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe

100 105 110

Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile

115 120 125

Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu

130 135 140

Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile

145 150 155 160

Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys

165 170 175

Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys

180 185 190

Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr

195 200 205

Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys

210 215 220

Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser

225 230 235 240

Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr

245 250 255

Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu

260 265 270

Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala

275 280 285

Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met

290 295 300

Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr

305 310 315 320

Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys

325 330 335

Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly

340 345 350

Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn

355 360 365

Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val

370 375 380

Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser

385 390 395 400

Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly

405 410 415

Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp

420 425 430

Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe

435 440 445

Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu

450 455 460

Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg

465 470 475 480

Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Ala Ala Ala Leu

485 490 495

Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Thr His His His His His His Ser

500 505 510

Gly Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly

515 520 525

Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro

530 535 540

Gln Gly Gln Arg Glu Pro Ser Gly Gly Cys Lys Leu Gly

545 550 555

Claims

1.二价双特异性抗体，其包括：

a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于

其中所述界面被改变以促进形成所述二价双特异性抗体，其中所述改变的特征在于：

a)改变一条重链的CH3结构域，

由此，在与所述二价双特异性抗体内的另一条重链的CH3结构域的初始界面相接触的一条重链的CH3结构域的初始界面内，

氨基酸残基被替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重链的CH3结构域的界面内生成凸起，所述凸起可以定位在另一条重链的CH3结构域的界面内的凹洞中

且

b)改变另一条重链的CH3结构域，

由此，在与所述二价双特异性抗体内的第一CH3结构域的初始界面相接触的第二CH3结构域的初始界面内，

氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在所述第二CH3结构域的界面内生成凹洞，在所述凹洞中可以定位所述第一CH3结构域的界面内的凸起。

3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于

所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)组成的组。

4.根据权利要求2或3中任一项所述的抗体，其特征在于

所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)组成的组。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的抗体，其特征在于

通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域的相应位置处的氨基酸来进一步改变两个CH3结构域。

6.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于

两条重链的恒定重链结构域CH3之一被替换为恒定重链结构域CH1；且另一个恒定重链结构域CH3被替换为恒定轻链结构域CL。

7.一种用于制备根据权利要求1所述的二价双特异性抗体的方法，其包括下列步骤：

a)用以下各项转化宿主细胞，

b)在容许合成所述抗体分子的条件下培养所述宿主细胞；和

c)从所述培养物中回收所述抗体分子。

8.一种宿主细胞，其包括

-载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子；

9.一种根据权利要求1-6所述的二价双特异性抗体的组合物，优选药物或诊断组合物。

10.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-6所述的二价双特异性抗体和至少一种药用赋形剂。