CN101787064B

CN101787064B - 阿糖胞苷衍生物及其在抗癌抗肿瘤中的用途

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Publication number: CN101787064B
Application number: CN 200910001175
Authority: CN
Inventors: 高峰; 徐峻
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-01-23
Filing date: 2009-01-23
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2029-01-23
Also published as: CN101787064A

Abstract

本发明提供了通过对阿糖胞苷的N4，O5位置进行化学修饰，避免N4氨基被代谢失效并引起毒性，让O5羟基容易被磷酸化而激活，将阿司匹林多功能基团引入到阿糖胞苷的前药分子中，以增加其药物功能来提高抗实体瘤的活性的新型的抗肿瘤的阿糖胞苷衍生物。本发明还详细提供了该阿糖胞苷衍生物的多种合成路线，阿糖胞苷衍生物制剂及其制备方法，并通过大量的实验数据证明了本发明的阿糖胞苷衍生物在抗癌抗肿瘤方面的用途。本发明的阿糖胞苷衍生物具有多靶多功能，主要有益效果是：增加生物利用度，减少多重抗药性，增加溶解度，增加酯溶性。

Description

阿糖胞苷衍生物及其在抗癌抗肿瘤中的用途

技术领域

本发明涉及医学技术领域，特别是涉及阿糖胞苷衍生物及其合成路线，本发明还涉及阿糖胞苷衍生物制剂及其制备方法和阿糖胞苷衍生物及其制剂在抗癌抗肿瘤中的用途。

背景技术

癌症是目前危害人类生命健康的最主要的疾病，治疗癌症的现有手段主要包括：手术切除、放射性疗法、化学疗法或这些方法的并用。化学疗法已经得到了广泛的应用而且已经用于多种不同类型的癌症的治疗。然而，大多数化学疗法所用的抗癌药物都仅限于延缓癌症的恶化从而延长病人的生命，很难达到治愈的目的。各类癌症的发病机理虽然各不相同，但是它们其实是具有共同特征的一大类症候群。癌细胞除了代谢旺盛、不断地分化之外，与正常细胞的生理差别不是很大。这对于开发选择性地清除癌细胞、且不杀伤正常细胞的药物是个巨大的挑战。抗癌药物开发的另一大挑战是癌细胞耐药性，即经过一段时间化疗之后引起的耐药抗药性，用过的化疗药物，即使增加剂量，对癌细胞也不再起作用。肿瘤细胞的转移也常使得无法用化学疗法进行治疗。到目前为止，没有一种抗癌药物能够医治所有的癌症。寻找高效、高选择性、低毒、无耐药性、而且急需的新型抗癌药物仍然极具挑战性。大多化疗抗癌药物都会产生严重的副作用，从而导致化学治疗不能继续进行。因此，现有药物在治疗不同种类的肿瘤时受到极大的限制。所以，寻找高效、低毒的新型抗癌药物对维护人类健康仍然迫切需要。

阿糖胞苷是胞嘧啶核苷的类似物，DNA多聚酶的抑制剂。它能够阻止DNA合成，也可掺入DNA，干扰DNA的复制，此外还可阻断胞嘧啶核苷酸还原成脱氧胞嘧啶核苷酸(Sylvester，R.K.，Fisher，A.J.，and Lobell，M.，Drug Intelligence&Clinical Pharmacy：Vol.21，No.2，pp.177-180(1987)；Boyer et al.，NovelCytarabine Monophospate Prodrugs，United States Patent Application Publication，Pub.No.：US 2007/0037774A1，(Feb.15，2007)；Colon-Cesario，M.，Wang，J.，Ramos，X.，Garcia，H.G.，Davila，J.J.，Laguna，J.，Rosado，C.，and Pena de Ortiz，S.，J.Neurosci.，26(20)：5524-5533(2006))。

目前，阿糖胞苷主要用于急性白血病的治疗。对急性粒细胞白血病疗效最好，对急性单核细胞白血病及急性淋巴细胞白血病也有效，对恶性淋巴瘤、肺癌、消化道癌、头颈部癌有一定疗效，对病毒性角膜炎及流行性结膜炎等也有一定疗效，然而，对多数实体肿瘤无效。阿糖胞苷的活性不是很高，为了提高疗效，阿糖胞苷一般均与其他药物，如：甲氧柔红霉素、全反式维甲酸联合三氧化二砷、吡柔比星、拓扑替康-足叶乙甙-环磷酰胺、氟达拉滨等合并使用。阿糖胞苷具有骨髓抑制、消化道反应等副作用，少数病人可有肝功异常、发热、皮疹等副作用(Bolwell，B.J.，Cassileth，P.A.，Gale，R.P.Leukemia.2(5)：253-60(1988)；Kimby，E.，Nygren，P.，Glimelius，B.Acta Oncol.40(2-3)：231-52(2001)；Stamatopoulos，K.Leukemia Research，Volume 22，Issue 8，pp 759-761，(2003)；Burnett，A.K.，Milligan，D.，Prentice，A.G.，Goldstone，A.H.，McMullin，M.F.，Hills，R.K.，Wheatley，K.Cancer.109(6)：1007-10(2007))。

阿糖胞苷为抗代谢药物，在细胞内先经脱氧胞苷酶催化磷酸化，转变为有活性的阿糖胞苷酸，再进一步转为相应的二磷酸及三磷酸阿糖胞苷而起作用。阿糖胞苷主要通过与DNA合成过程中所需的三磷酸脱氧胞苷竞争，而抑制DNA多聚酶，干扰核苷酸掺入DNA，并能抑制核苷酸还原酶，阻止核苷酸转变为脱氧核苷酸，但对RNA和蛋白质的合成无显著作用，属于作用于S期的细胞周期特异性药物，对处于S增殖期细胞的作用最为敏感，并对G1/S及S/G2转换期也有作用。静脉注射后迅速从血中消失，40％可通过血脑屏障，药物在体内主要在肝中代谢为无活性的阿糖尿苷，70％～90％通过肾排泄。为了开发对实体肿瘤如肝癌有疗效的抗癌新药，必须寻找对肝脏靶向性的新药。显然，抗肝炎病毒的药物可以作为极好的借鉴。例如，米夫定及阿德福韦(adefovir，PMEA)己被批准作为乙型肝炎抗病毒治疗药物(Starrett，et al.，″Synthesis，oralbioavailability determination，and in vitro evaluation of prodrugs of the antiviralagent 9-[2-(phosphonomethoxy)ethyl]adenine(PMEA)，″J Med Chem.，37(12)：1857-64(1994)；Shaw，et al.，″Pharmacokinextics and Metabolism ofSelected Prodrugs of PMEA in Rats，″Drug Metabolism Dis.，25(3)：362-366(1997)；Wacher，V.J.，et al.，Advanced Drug Delivery Reviews 46：89-102(2001)；Wacher，et al.，″Active Secretion and Enterocytic Drug Metabolism Barriers to DrugAbsorption，″Adv.Drug Del.Rev.，46：89-102(2001)；Murono，et al.，″Preventionand inhibition of nasopharyngeal carcinoma growth by antiviral phosphonatednucleoside analogs，″Cancer Res.，61(21)：7875-7(2001))。2003年，MetabasisTherapeutics，Inc公司的科学家K.Raja Reddy，Mark D.Erion，Michael C.Matelich，Joseph J.Kopcho提出用环磷酸核苷类作为抗肝癌治疗药物的前药(United States Patent 7,214,668；)，当化合物进入肝脏后，被肝脏的CYP 3A4代谢酶催化解离成无环磷酸核苷类衍生物而具有抗癌的活性。2007年，MetabasisTherapeutics，Inc公司又提出新的环磷酸阿糖胞苷衍生物作为抗癌前药的专利申请(Novel Cytarabine Monophospate Prodrugs，United States Patent ApplicationPublication，Pub.No.：US 2007/0037774A1，Boyer et al.，Feb.15，2007；Phosphonic acid based prodrugs of PMEA and its analogues，United States Patent7,214,668，Reddy，et al.May 8，2007)。这些专利申请的核心是将环磷酸接入阿糖胞苷的核糖环上的-OCH2-核糖位置上，即O5位置，而对阿糖胞苷胞嘧啶环上的氨基不加修饰。

阿糖胞苷一般不能用于治疗肝癌，其原因在于当其胞核苷骨架结构进入肝脏之后，它的N4氨基(见图1)被代谢失效并引起毒性；另一方面是其糖甙结构上的O5羟基(见图1)必须被磷酸化而激活，而此激活过程在肝内过于缓慢。

发明内容

本发明旨在克服上述已有技术的不足，提供一种高效、低毒，无耐药性，能够被迅速激活的阿糖胞苷衍生物，并提供了阿糖胞苷衍生物的合成路线以及阿糖胞苷衍生物制剂的制备方法，本发明还提供了阿糖胞苷衍生物及其制剂在抗癌抗肿瘤方面的应用的实验数据。

本发明的阿糖胞苷衍生物，其特征在于：所述阿糖胞苷衍生物是具有下述通式(I)的化合物：

通式-I

其中，X是OH、O-P(O)(OR)₂和磷酸基中的任意一种，所述磷酸基包括单磷酸基、二磷酸基和三磷酸基；R是H、C_1-16烷基、环烷基，苄基、苯基和芳环基中的任意一种；

其中，A是多靶药中的第二片药物基或功能基，用下式中的任意一个结构式表示：

R¹是H、烷烃基、烷烯基、烷炔基和芳香基中的任意一种；R²是硝基、氨基、取代氨基、卤素原子基、腈基、羧基和酰胺基中的任意一种；

其中，L是连接单元，用下面的任意一种结构单元表示：

其中，n＝0，1-5；m＝0，1-18；曲线表示上述连接单元L与其相邻基团以共价键相连；所述连接L中苯环或环己烷环上的两个基团为邻位、间位或对位相连。

在上述定义中的每一个基团可以进而取代，而且其中可含有杂原子。

本发明的通式(I)的阿糖胞苷前药衍生物包括具有下述结构式的代表性化合物：

为了清晰起见但并非限制本发明，除另外说明之外，本发明所使用的所有科技术语和在本发明领域内技术人员常使用和理解的意义相同。本发明所引用的专利申请或已发表的申请及其他论文均属于原始引用并未加修改。

本专利所用“一个”或“一种”或“一类”意指最少一个/种/类或一个/种/类或一个/种/类以上。

本发明所用“烷基”意指各种饱和的直链的、带侧链的或环状的碳氢基团，特包括含有十个或十个碳以下的小烷基。例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、异己基、庚基、辛基和壬基等仅为本定义中的一些典型例子。

本发明所用“烯基”与上述“烷基”定义相同，但其中必须最少有一个碳碳双键(C＝C)，所以本发明所用的烯基包括含有两个到十个碳原子的直链的、带有分支链的或环状的并至少含有一个碳碳双键的烃基，如乙烯基、丙烯基、丁烯基和戊烯基等。

本发明所用的“炔基”为上述烷基或烯基并含有至少一个碳碳三键，所以，炔基包括含有两个到十个碳原子并含有至少一个碳碳三键的直链的、带有分支链的或环状的烃基或炔基，如乙炔基、丙炔基、丁炔基和戊炔基等。

本发明中的“饱和”意指该基团中不含不饱和键，如碳碳双键或碳碳三键；而“不饱和”则指该基团中含有一个或一个以上的碳碳双键或碳碳三键。

本发明所用“环烷基”为环状的碳氢基团并优先选用含有三到八个碳的环烷基。因此环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷均为本定义下的典型例子。环烷基中含有一个或两个碳碳双键即形成“环烯基”。环烷基上还可带有烷基、烯基、炔基和其他基团。

本发明所使用的“芳香基”为环状共轭芳香系统并可在环中含有一个或一个以上的非碳原子(除碳以外的其他杂原子如氮)，如苯基、萘基和吡啶基等。

本发明中还常用到的“杂环基”指任何多个原子通过共价键构成的环状基团和化合物，并且至少含有一个非碳原子。特指杂环基团包括含有氮，硫或氧非碳原子的五元和六元环状系统如嘧唑、吡咯、吡啶或嘧啶等。

本发明中的“烷氧基”指把氧原子与直链或带支链的烷基连接所形成的烷基氧化基。此类烷氧基团的例子包括甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙氧基等。

同样地，“烷硫基”指把硫原子与直链或带支链的烷基连接所形成的烷基硫化基。此类烷硫基团的例子包括甲硫基、乙硫基、丙硫基或异丙硫基等。

本发明中的“卤原子基”为氟、氯、溴、碘。

本发明中的“氨基酸”指取代的天然和非天然的氨基酸，纯的L-或D-构型或外消旋混合物，以及其由氨基和羧基而衍生出来的基团。

特别值得进一步说明的是，上述所定义的各种取代基还包括它们被进一步取代而构成的基团，其中这些新的取代基也可含有其他的基团。例如烷基或芳香基上的氢原子被氨基、卤素或其他基团取代即成为新的属于上述各定义中的基团。

本发明中所用的“磷酸”或“磷酸酯”是最高氧化态的五价磷原子上连有四个氧原子，一个氧原子以双键与磷原子相连，两个氧原子以单键与磷原子相连，而且，这两个氧原子上可以是氢原子、负电荷或如上所定义的各种烷基、芳香基等，如-P(＝O)(O-)₂，-P(O)(OR)₂。磷原子上的另外一个氧原子与本发明中的衍生物相连。

本发明中的“多靶药”指分子中的一个以上的结构单元通过对多个靶向作用而具有生物药效。

本发明中的“多功能”指分子中不同基团具有多于一种生物功能。本发明中的“药物基”或“功能基”指该基团是具有某生物功能的药物或非药物基团。本发明中，阿糖胞苷衍生物是在阿糖胞苷的结构式上接入阿司匹林基团。阿司匹林(Aspirin，又名乙酰水杨酸)是个多功能药，具有抗血栓(Antithrombus)、抗惊厥(Antieclampsia)、抗痴呆(Antidementia)、抗白内障(Anticataract)、抗癌(Anticancer)等功能特点，是以水杨酸为原料，使之与乙酸酐直接反应制备而得。阿司匹林是世界上应用最广泛的解热、镇痛和抗炎药，也是作为比较和评价其他药物的标准制剂。在体内具有抗血栓的作用，它能抑制血小板的释放反应，抑制血小板的聚集，临床上用于预防心脑血管疾病的发作。

本发明中的“连接单元”(Linker)指用本连接单元把两个基团或药物基或功能基连接起来可以形成本发明中的分子。

本发明中的“前药”指本发明中的阿糖胞苷衍生物被用到体内后，在体内断裂或增加某个结构单元所形成的进而起生物作用的化合物。

本发明中所使用的曲线是药物化学中常用的一种表示方法，代表该基团或药物基或功能基由该处与通式(I)中的相应原子相连接。

本发明中提及的有机溶剂包括：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、多聚乙二醇(PEG)和四氢呋喃(THF)。

本发明解决的另一个技术问题是提供了通式(I)的阿糖胞苷衍生物的合成路线，其技术方案分别如下：

1.阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括如下步骤：

(1)将水杨酸与脂肪族二元醇混合，然后滴加3～5滴浓硫酸，加热至80℃反应4～12个小时，反应结束后，减压蒸干或通过柱层析色谱提纯，得到第一中间产物(B)；

(2)将第一中间产物(B)溶于CH₂Cl₂或四氢呋喃，然后加入酸酐化合物和DMAP，加热回流反应5～12小时或室温下搅拌反应24小时，得到的第二中间产物(C)不经进一步纯化，直接用于下一步反应；

(3)将阿糖胞苷、第二中间产物(C)、PyBOP和DMAP溶于DMF，室温搅拌12～24小时，反应液直接通过柱层析色谱提纯得到得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物或将该反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯，得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物。

所述脂肪族二元醇为乙二醇、丁二醇、1，6-己二醇、1，8-辛二醇、1，10-癸二醇和1，12-十二二醇中的任意一种；所述酸酐化合物为丁二酸酐、邻苯二甲酸酐、戊二酸酐和二甘醇酐中的任意一种。(参考合成路线1、2、7～24)

2.阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括以下步骤：

(1)水杨酸和碳酸钠溶于3-氯丙醇中，加热回流2.5小时，得到的反应液倒入冷水中分层，用NaHCO₃溶液洗涤有机层至弱碱性，有机层再用少量饱和盐水洗涤后，加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，得到第三中间产物(D)，直接用于下一步反应；

(2)将第三中间产物(D)溶于CH₂Cl₂或四氢呋喃中，然后加入酸酐化合物和DMAP，室温下搅拌反应24小时，过滤反应液，滤液减压蒸干，得到的第四中间产物(E)直接用于下一步反应；

(3)将阿糖胞苷、第四中间产物(E)、PyBOP和DMAP溶于DMF，室温搅拌12～24小时，反应液直接通过柱层析色谱提纯得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物或将先该反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯，得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物。

所述酸酐化合物为丁二酸酐、邻苯二甲酸酐、戊二酸酐和二甘醇酐中的任意一种。(参考合成路线3)

3.阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括以下步骤：

(1)水杨酸甲酯和氨基丙醇溶于二氧六环中，室温搅拌12小时，旋转蒸发除去溶剂，加饱和盐水，用盐酸调节PH至4-5后，用乙酸乙酯提取多次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，所得第五中间产物(F)直接用于下一步反应。

(2)将第五中间产物(F)溶于CH₂Cl₂或四氢呋喃中，然后加入酸酐化合物和DMAP，室温下搅拌反应24小时，过滤反应液，滤液减压蒸干，所得粗产品的第六中间产物(G)不经进一步纯化，直接用于下一步反应；

(3)将阿糖胞苷，第六中间产物(G)，PyBOP和DMAP溶于DMF，室温搅拌12～24小时，得到的反应液直接通过柱层析色谱提纯得到产品或将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯，得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物。

所述酸酐化合物为丁二酸酐、邻苯二甲酸酐、戊二酸酐和二甘醇酐中的任意一种。(参考合成路线4，6)

4.阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括以下步骤：

(1)邻甲氧基苯甲酸和SOCl₂溶于二氯甲烷，加热回流4小时，旋转蒸发除去溶剂和过量的SOCl₂得到的第七中间产物(H)不用进一步纯化，直接用于下一步反应；

(2)将氨基丙醇溶于二氯甲烷中，冷至0℃时，滴加溶于二氯甲烷的第七中间产物(H)，0.5小时滴加完毕，而后室温搅拌5小时，加浓盐酸酸化至pH＝5，旋转蒸发除去溶剂，得到的产物加少量水溶解，乙酸乙酯提取多次，乙酸乙酯液用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥、过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得第八中间产物(J)不经提纯直接用于下一步反应；

(3)将第八中间产物(J)溶于四氢呋喃中，然后加入酸酐化合物和DMAP，室温下搅拌反应24小时，过滤，减压蒸干滤液，所得第九中间产物(K)不经提纯直接用于下一步反应；

(4)将阿糖胞苷，第九中间产物(K)，PyBOP和DMAP溶于DMF，室温搅拌12～24小时，反应液直接通过柱层析色谱提纯得到产品或将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯，得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物。

所述酸酐化合物为丁二酸酐，邻苯二甲酸酐、戊二酸酐和二甘醇酐中的任意一种。(参考合成路线5)

5.阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括如下步骤：

(1)将脂肪族二元酸加入到SOCl₂中，加DMF，加热回流，反应3小时，旋去SOCl₂，得到的第十中间产物(M)不用进一步纯化，直接用于下一步反应；

(2)将邻硝基苯胺溶于苯再加入吡啶，滴加到溶解于苯的第十中间产物(M)中，反应4h，将溶剂蒸去，将反应物溶于水中，调节PH值至酸性，过滤沉淀，水洗，将沉淀溶于异丙醇中，重结晶，析出固体的第十一中间产物(N)；

(3)将阿糖胞苷，固体的第十一中间产物(N)，PyBOP和DMAP溶于DMF，室温搅拌12小时，反应液倒入水中，析出固体，再通过柱层析色谱提纯，得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物。

所述脂肪族二元酸为乙二酸、丁二酸、1，6-己二醇和1，8-辛二酸中的任意一种。(参考合成路线25)

6.阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括以下步骤：

(1)将邻硝基苯甲酸和SOCl₂溶于DMF，回流反应2小时，得到的第十二中间产物(S)不用进一步纯化，直接用于下一步反应。

(2)将第十二中间产物(S)溶于四氢呋喃，滴加至氨基酸化合物的水溶液中，同时滴加氢氧化钠水溶液，控制PH＝8～9，控制温度在10℃左右，30分钟滴加完毕，搅拌40分钟并调节PH值至3，减压蒸去四氢呋喃，水溶液用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液无水硫酸钠干燥、浓缩，放置重结晶，过滤，得淡黄色固体的第十三中间产物(T)；所述氨基酸化合物为丙氨酸或氨基己酸；

(3)将阿糖胞苷、第十三中间产物(T)、PyBOP和DMAP溶于DMF；室温搅拌12小时，反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯，得到第十四中间产物(U)；

(4)将第十四中间产物(U)进一步溶于四氢呋喃，催化氢解，搅拌，过滤，滤液旋干，得到高纯度的通式(I)的阿糖胞苷衍生物。(参考合成路线26、27)

7.阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括以下步骤：

(1)将硝基苯甲酸或烟酸、氨基己醇、PyBOP和DMAP溶于DMF，室温搅拌12小时，反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯，得到第十五中间产物(V)；

(2)将第十五中间产物(V)溶于四氢呋喃中，然后加入邻苯二甲酸酐和DMAP，加热回流反应12小时，得到的第十六中间产物(W)不经进一步纯化，直接用于下一步反应；

(3)将阿糖胞苷、第十六中间产物(W)、PyBOP和DMAP溶于DMF，室温搅拌12小时，反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯，得到第十七中间产物(Y)；

(4)将第十七中间产物(Y)进一步溶于四氢呋喃，催化氢解，搅拌，过滤，滤液旋干，得到高纯度的通式(I)的阿糖胞苷衍生物。(参考合成路线28、29)

本发明的阿糖胞苷衍生物制剂的制备方法，其特征在于：

(1)将通式(I)的阿糖胞苷衍生物溶解到水、生理盐水、环糊精水溶液、水溶性的有机溶剂、非离子性的表面活性剂、水溶性的类脂、脂肪酸、脂肪酸酯和磷脂中的任意一种或多种的组合溶剂而制得制剂溶液；

(2)将所述制剂溶液再用生理盐水或葡萄糖注射液稀释而制成阿糖胞苷衍生物制剂。

所述有机溶剂可以是乙醇、丙二醇、甘油、甘油酯、多聚乙二醇(PEG)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)中的任意一种或多种的组合溶剂。

本发明的阿糖胞苷衍生物制剂，其特征在于：是由上述的阿糖胞苷衍生物制剂的制备方法制备得到的产品。

本发明的阿糖胞苷衍生物在抗癌抗肿瘤中的用途。通式(I)的阿糖胞苷衍生物可用于治疗或缓解某一组织或器官的癌症。癌症包括但不只限于白血病、固体瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌和肾癌。

本发明的阿糖胞苷衍生物制剂在抗癌抗肿瘤中的用途。癌症包括白血病、固体瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌和肾癌。本发明的阿糖胞苷衍生物制剂还可与其他化疗药物联合用在抗肿瘤化疗中，可以与本发明的阿糖胞苷衍生物的制剂联合使用的抗肿瘤药物包括但不限于烷化剂、植物生物碱类、抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、铂类药物、抗代谢类及其它已知的抗癌药物。本发明所指的联合用药治疗过程中，包括运用至少一种本发明所例举的阿糖胞苷衍生物。

以本发明的阿糖胞苷衍生物为成份制备成药用制剂，可以用于口服的或非肠道途径给药。此处所指的非肠道途径给药是指皮下皮内、静脉内、动脉内、肌肉内、心房内、滑膜内、胸骨内注射或滴注。

本发明采用新的设计技术构思设计出阿糖胞苷衍生物。阿糖胞苷(参照图1)不能用于治疗肝癌的原因一方面在于当其胞核苷骨架结构进入肝脏之后，它的N4氨基被代谢失效并引起毒性，另一方面是其糖甙结构上的O5羟基必须被磷酸化而激活，而此激活过程在肝内过于缓慢。

本发明的阿糖胞苷衍生物的设计是通过对N4，O5位置进行化学修饰，避免N4氨基被代谢失效并引起毒性，让O5羟基容易被磷酸化而激活，将阿司匹林多功能药进入到阿糖胞苷的前药分子中，以增加其药物功能来提高抗实体瘤的活性，设计出了新型的抗肿瘤的前药衍生物。本发明的阿糖胞苷衍生物具有多靶多功能，主要有益效果是：增加生物利用度，减少多重抗药性(多靶向设计技术)，增加溶解度，增加酯溶性。本发明详细提供了通式(I)的阿糖胞苷衍生物的多种合成路线，阿糖胞苷衍生物制剂及其制备方法，并通过大量的实验数据证明了本发明的阿糖胞苷衍生物在抗癌抗肿瘤方面的用途。

附图说明

图1表示阿糖胞苷的结构和N4，O5修饰位置的示意图。

图2表示本发明的具有代表性的阿糖胞苷衍生物的结构示意图。

图3表示本发明的阿糖胞苷衍生物抑制BEL-7402肝癌细胞株的药物浓度-抑制率曲线图。

具体实施方式

本发明的一些代表性阿糖胞苷衍生物的合成路线列举如下，本发明专利中的其他阿糖胞苷衍生物通过相同或类似的方法合成得到。

合成路线1：

第一中间产物B1的合成(路线1)：将水杨酸(13.8g，100mmol)溶于40毫升丁二醇中，然后滴加5滴浓硫酸，回流反应4个小时，反应结束后减压蒸干，所得第一中间产物B1直接用于下一步反应

第二中间产物C1的合成(路线1)：将第一中间产物B1(2.1g，100mmol)溶于10毫升四氢呋喃中，然后加入丁二酸酐(1.0g，100mmol)和DMAP(1.2g，100mmol)，室温下搅拌反应24小时，过滤反应液，滤液减压蒸干，所得第二中间产物C1直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物1的合成(路线1)：将阿糖胞苷(2.43g，100mmol)，第二中间产物C1(3.1g，100mmol)，PyBOP(5.7g，110mmol)和DMAP(0.12g，10mmol)溶于DMF(10ml)中，室温下搅拌24小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷衍生物1(42mg)。LC(UV 254nm)纯度95％。LC-MS m/z 536[M+H]⁺(分子式C₂₄H₂₉N₃O₁₁，分子量535)；¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ10.90(s，1H)，10.56(s，1H)，8.04(d，1H)，7.79(d，1H)，7.54(t，1H)，7.15(d，1H)，6.99(m，2H)，6.05(d，1H)，5.48(t，2H)，5.06(t，1H)，4.34(t，2H)，4.09(t，3H)，3.62(t，1H)，3.33(t，1H)，2.69(d，2H)，2.58(d，2H)，2.50(s，2H)，1.78(d，2H)，1.73(d，2H)。

合成路线2：

第一中间产物B2的合成(路线2)：将水杨酸(13.8g，100mmol)溶于40毫升丁二醇中，然后滴加5滴浓硫酸，回流反应4个小时，反应结束后减压蒸干，所得第一中间产物B2直接用于下一步反应。

第二中间产物C2的合成(路线2)：将第一中间产物B2(2.1g，100mmol)溶于10毫升的四氢呋喃中，然后加入戊二酸酐(1.14g，100mmol)和DMAP(1.2g，100mmol)，在室温下搅拌反应24小时。过滤反应混合物，滤液在减压下蒸干，所得第二中间产物C2直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物2的合成(路线2)：将阿糖胞苷(2.43g，100mmol)，第二中间产物C2(3.24g，100mmol)，PyBOP(5.7g，110mmol)和DMAP(0.12g，10mmol)溶解于DMF(10ml)中。室温下搅拌24小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷衍生物2(93.9mg)，LC(UV 254nm)纯度＞95％。LC-MS m/z 550[M+H]⁺(分子式C₂₅H₃₁N₃O₁₁，分子量549)。

合成路线3：

第三中间产物D3的合成(路线3)：水杨酸(82.8g，600mmol)，碳酸钠(31.8g，300mmol)溶于3-氯丙醇(180ml)中，加热回流2.5小时。反应液倒入冷水中分层，用NaHCO₃溶液洗涤有机层至弱碱性，有机层再用少量饱和盐水洗涤后，加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，第三中间产物D3直接用于下一步反应。

第四中间产物E3的合成(路线3)：将第三中间产物D3(1.96g，100mmol)溶于10毫升四氢呋喃中，然后加入丁二酸酐(1.0g，100mmol)和DMAP(1.2g，100mmol)，室温下搅拌反应24小时，过滤反应液，滤液减压蒸干，第四中间产物E3直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物3的合成(路线3)：将阿糖胞苷(2.43g，100mmol)，第四中间产物E3(2.96g，100mmol)，PyBOP(5.7g，110mmol)和DMAP(0.12g，10mmol)溶于DMF(10ml)中，室温下搅拌24小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷衍生物3(20mg)。LC(UV 254nm)纯度94％。LC-MS m/z 522[M+H]⁺(分子式C₂₃H₂₇N₃O₁₁，分子量521)。

合成路线4：

第五中间产物F4的合成(路线4)：水杨酸甲酯(20g，130mmol)，氨基丙醇(15g，200mmol)溶于二氧六环(50ml)中，室温搅拌12小时。旋转蒸发除去溶剂，加饱和盐水，用盐酸调节PH至4-5后，用乙酸乙酯提取十次。乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，所得第五中间产物F4直接用于下一步反应。

第六中间产物G的合成(路线4)：将第五中间产物F4(1.95g，100mmol)溶于10毫升THF中，然后加入丁二酸酐(1.3g，130mmol)和DMAP(1.56g，130mmol)，室温下搅拌反应24小时，过滤反应液，滤液减压蒸干，所得第六中间产物G不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物4的合成(路线4)：将阿糖胞苷(2.43g，100mmol)，第六中间产物G(2.95g，100mmol)，PyBOP(5.7g，110mmol)和DMAP(0.12g，10mmol)溶于DMF(10ml)中，室温下搅拌24小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷衍生物4(75mg)，LC(UV 254nm)纯度92％。LC-MS m/z 521[M+H]⁺(分子式C₂₃H₂₈N₄O₁₀，分子量520)。

合成路线5：

第七中间产物H5的合成路线(路线5)：邻甲氧基苯甲酸(20g，131.6mmol)，SOCl₂(15ml)，溶于二氯甲烷(50ml)，加热回流4小时。旋转蒸发除去溶剂和过量的SOCl₂得到第七中间产物H5不用进一步纯化，直接用于下一步反应。

第八中间产物J5的合成路线(路线5)：将氨基丙醇(12.4g，164mmol)溶于二氯甲烷(70ml)中，冷至0℃时，滴加溶于二氯甲烷(10ml)的第七中间产物H5(14g，82mmol)，0.5小时滴加完毕。而后室温搅拌5小时。加浓盐酸酸化至pH＝5，旋转蒸发除去溶剂。产物加少量水溶解，乙酸乙酯提取4次，乙酸乙酯液用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得第八中间产物J5不经提纯直接用于下一步反应。

第九中间产物K5的合成路线(路线5)：将第八中间产物J5(2.09g，10mmol)溶于10毫升THF中，然后加入丁二酐(1.00g，10mmol)和DMAP(1.2g，10mmol)，室温下搅拌反应24小时，过滤，减压蒸干滤液，所得第九中间产物K5不经提纯直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物5的合成(路线5)：将阿糖胞苷(2.43g，10mmol)，第九中间产物K5(3.09g，10mmol)，PyBOP(5.7g，11mmol)和DMAP(0.12g，1mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌24小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷衍生物5(38.7mg)；LC(UV 254nm)纯度＞90％。LC-MS m/z 535[M+H]⁺(分子式C₂₄H₃₀N₄O₁₀，分子量534)。

合成路线6：

第五中间产物F6的合成(路线6)：水杨酸甲酯(20g，130mmol)，氨基丙醇(15g，200mmol)溶于二氧六环(50ml)中，室温搅拌12小时。旋转蒸发除去溶剂，加饱和盐水，用盐酸调节PH至4-5后，用乙酸乙酯提取十次。乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，所得第五中间产物F6直接用于下一步反应。

第六中间产物G6的合成(路线6)：将第五中间产物F6(1.95g，10mmol)溶于10毫升THF，然后加入戊二酸酐(1.14g，10mmol)和DMAP(1.2g，10mmol)，室温反应24小时，过滤，减压蒸干滤液，所得第六中间产物G6不经纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物6的合成(路线6)：将阿糖胞苷(2.43g，10mmol)，第六中间产物G6(3.09g，10mmol)，PyBOP(5.7g，11mmol)和DMAP(0.12g，1mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌24小时。反应液通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷衍生物6(82.2mg)，LC(UV 254nm)纯度＞95％)。LC-MS m/z 535[M+H]⁺(分子式C₂₄H₃₀N₄O₁₀，分子量534)。

合成路线7：

第一中间产物B7的合成(路线7)：将水杨酸(27.6g，200mmol)溶于70克的乙二醇中，然后滴加3ml浓硫酸，回流反应4个小时，反应结束后减压蒸干，所得第一中间产物B7(水杨酸乙二醇酯)直接用于下一步反应。

第二中间产物C7的合成(路线7)：第一中间产物B7(水杨酸乙二醇酯)(2.7g，15mmol)，戊二酸酐(1.7g，15mmol)和DMAP(0.2g，1.5mmol)溶于CH₂Cl₂(30ml)，加热回流5个小时。得到的第二中间产物C7不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物7的合成(路线7)：阿糖胞苷(2.5g，10mmol)，第二中间产物C7(3g，10mmol)，PyBOP(5.2g，10mmol)和DMAP(0.2g，2mmol)溶于DMF(25ml)，室温搅拌12小时。反应液以水混悬，用乙酸乙酯萃取，萃取液用柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷衍生物7(23.7mg)，LC(UV 254nm)纯度95％。LC-MS m/z 522[M+H]⁺(分子式C₂₃H₂₇N₃O₁₁，分子量521)。

合成路线8：

第一中间产物B8的合成(路线8)：将水杨酸(27.6g，200mmol)溶于70克的乙二醇中，然后滴加3ml浓硫酸，回流反应4个小时，反应结束后减压蒸干，所得第一中间产物B8(水杨酸乙二醇酯)直接用于下一步反应。

第二中间产物C8的合成(路线8)：第一中间产物B8(水杨酸乙二醇酯)(8.7g，47mmol)，丁二酸酐(4.8g，48mmol)和DMAP(0.6g，5mmol)溶于CH₂Cl₂(50ml)，加热回流5个小时。得到的第二中间产物C8不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物8的合成(路线8)：阿糖胞苷(2.5g，10mmol)，第二中间产物C8(5g，15mmol)，PyBOP(5.2g，10mmol)和DMAP(0.2g，2mmol)溶于DMF(25ml)，室温搅拌12小时。反应液以水混悬，用乙酸乙酯萃取，萃取液用柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷衍生物8(298.3mg)，LC(UV 254nm)纯度95％。LC-MS m/z 508[M+H]⁺(分子式C₂₂H₂₅N₃O₁₁，分子量507)。

合成路线9：

第一中间产物B9的合成(路线9)：将水杨酸(13.8g，100mmol)与1，6-己二醇(23.6g，200mmol)混合，然后滴加5滴浓硫酸，加热至80℃反应5个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B9。

第二中间产物C9的合成(路线9)：将第一中间产物B9(2.4g，10mmol)溶于THF(30ml)，然后加入戊二酸酐(1.6g，13mmol)和DMAP(1.7g，13mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C9不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物9的合成(路线9)：将阿糖胞苷(2.4g，10mmol)，第二中间产物C9(3.5g，10mmol)，PyBOP(5.7g，11mmol)，和DMAP(0.12g，1mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌24小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷衍生物9(67.8mg)。LC(UV 254nm)纯度95％。LC-MS m/z 578[M+H]⁺(分子式C₂₇H₃₅N₃O₁₁，分子量577)。

合成路线10：

第一中间产物B10的合成(路线10)：将水杨酸(6.9g，50mmol)与1，8-辛二醇(14.6g，100mmol)混合，然后滴加5滴浓硫酸，加热至80℃反应12个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B10。

第二中间产物C10的合成(路线10)：将第一中间产物B10(1.33g，5mmol)溶于THF(100ml)，然后加入戊二酸酐(0.74g，6.5mmol)和DMAP(0.79g，6.5mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C10不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物10的合成(路线10)：将阿糖胞苷(1.2g，5mmol)，第二中间产物C10(1.9g，5mmol)，PyBOP(3.1g，5mmol)，和DMAP(60mg，0.5mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷衍生物10(44.7mg)。LC(UV 254nm)纯度96％。LC-MS m/z 606[M+H]⁺(分子式C₂₉H₃₉N₃O₁₁，分子量605)。

合成路线11：

第一中间产物B11的合成(路线11)：将水杨酸(13.8g，100mmol)与1，10-癸二醇(34.8g，200mmol)混合，然后滴加5滴浓硫酸，加热至80℃反应12个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B11。

第二中间产物C11的合成(路线11)：将第一中间产物B11(2.9g，10mmol)溶于THF(100ml)，然后加入戊二酸酐(1.4g，12mmol)和DMAP(1.5g，12mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C11不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物11的合成(路线11)：将阿糖胞苷(2.4g，10mmol)，第二中间产物C11(4.1g，10mmol)，PyBOP(5.7g，11mmol)和DMAP(0.12g，1mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌24小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝25/1)，得到阿糖胞苷衍生物11(88.8mg)。LC(UV 254nm)纯度96％。LC-MS m/z 634[M+H]⁺(分子式C₃₁H₄₃N₃O₁₁，分子量633)。

合成路线12：

第一中间产物B12的合成(路线12)：将水杨酸(3.45g，25mmol)与1，12-十二二醇(10.1g，50mmol)混合，然后滴加5滴浓硫酸，加热至80℃反应5个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B12。

第二中间产物C12的合成(路线12)：将第一中间产物B12(0.966g，3mmol)溶于THF(30ml)，然后加入戊二酸酐(0.455g，3.9mmol)和DMAP(0.475g，3.9mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C12不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物12的合成(路线12)：将阿糖胞苷(0.729g，3mmol)，第二中间产物C12(1.308g，3mmol)，PyBOP(1.848g，3.3mmol)和DMAP(0.06g，0.5mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷衍生物12(20.9mg)。LC(UV 254nm)纯度80％。LC-MS m/z 662[M+H]⁺(分子式C₃₃H₄₇N₃O₁₁，分子量661)。

合成路线13：

第一中间产物B13的合成(路线13)：将水杨酸(3.45g，25mmol)与1，6-己二醇(5.9g，50mmol)混合，然后滴加5滴浓硫酸，加热至80℃反应5个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B13。

第二中间产物C13的合成(路线13)：将第一中间产物B13(0.65g，2.74mmol)溶于THF(30ml)，然后加入二甘醇酐(0.38g，3.29mmol)和DMAP(0.4g，3.29mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C13不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物13的合成(路线13)：将阿糖胞苷(0.67g，2.74mmol)，第二中间产物C13(0.97g，2.74mmol)，PyBOP(1.5g，2.9mmol)和DMAP(0.05g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷衍生物13(50.5mg)。LC(UV 254nm)纯度91％。LC-MS m/z 580[M+H]⁺(分子式C₂₆H₃₃N₃O₁₂，分子量579)。

合成路线14：

第一中间产物B14的合成(路线14)：将水杨酸(6.9g，50mmol)与1，8-辛二醇(14.6g，100mmol)混合，然后滴加5滴浓硫酸，加热至80℃反应12个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B14。

第二中间产物C14的合成(路线14)：将第一中间产物B14(0.48g，1.8mmol)溶于THF(30ml)，然后加入二甘醇酐(0.25g，2.2mmol)和DMAP(0.27g，2.2mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C14不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物14的合成(路线14)：将阿糖胞苷(0.44g，1.8mmol)，第二中间产物C14(0.69g，1.8mmol)，PyBOP(0.94g，1.8mmol)和DMAP(0.022g，0.18mmol)溶于DMF(5ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷衍生物14(22.9mg)。LC(UV 254nm)纯度85％。LC-MS m/z 608[M+H]⁺(分子式C₂₈H₃₇N₃O₁₂，分子量607)。

合成路线15：

第一中间产物B15的合成(路线15)：将水杨酸(13.8g，100mmol)与1，10-癸二醇(34.8g，200mmol)混合，然后滴加5滴浓硫酸，加热至80℃反应12个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B15。

第二中间产物C15的合成(路线15)：将第一中间产物B15(2.7g，9.2mmol)溶于THF(50ml)，然后加入二甘醇酐(1.4g，12mmol)和DMAP(1.5g，12mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C15不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物15的合成(路线15)：将阿糖胞苷(1.3g，5mmol)，第二中间产物C15(2.1g，5mmol)，PyBOP(2.9g，5.5mmol)，和DMAP(0.06g，0.5mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌24小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝25/1)，得到阿糖胞苷衍生物15(120.6mg)。LC(UV 254nm)纯度93％。LC-MS m/z 636[M+H]⁺(分子式C₃₀H₄₁N₃O₁₂，分子量635)。

合成路线16：

第一中间产物B16的合成(路线16)：将水杨酸(3.45g，25mmol)与1，12-十二二醇(10.1g，50mmol)混合，然后滴加5滴浓硫酸，加热至80℃反应5个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B16

第二中间产物C16的合成(路线16)：将第一中间产物B16(0.966g，3mmol)溶于THF(30ml)，然后加入二甘醇酐(0.452g，3.9mmol)和DMAP(0.475g，3.9mmol)，加热回流反应12小时，得到的第二中间产物C16不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物16的合成(路线16)：阿糖胞苷(0.729g，3mmol)，第二中间产物C16(1.314g，3mmol)，PyBOP(1.848g，3.3mmol)和DMAP(0.06g，0.5mmol)溶于DMF(30ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷衍生物16(26.6mg)。LC(UV 254nm)纯度80％。LC-MS m/z 664[M+H]⁺(分子式C₃₂H₄₅N₃O₁₂，分子量663)。

合成路线17：

第一中间产物B17的合成(路线17)：将水杨酸(13.8g，100mmol)与1，6-己二醇(23.6g，200mmol)混合，然后滴加5滴浓硫酸，加热至80℃反应5个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B17。

第二中间产物C17的合成(路线17)：将第一中间产物B17(1.5g，6.3mmol)溶于THF(30ml)，然后加入邻苯二甲酸酐(1.05g，6.3mmol)和DMAP(0.84g，6.9mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C17不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物17的合成(路线17)：将阿糖胞苷(1.5g，6.3mmol)，第二中间产物C17(2.43g，6.3mmol)，PyBOP(3.28g，6.3mmol)和DMAP(0.08g，0.65mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝30/1)，得到阿糖胞苷衍生物17(66.1mg)。LC(UV 254nm)纯度96％。LC-MS m/z 612[M+H]⁺(分子式C₃₀H₃₃N₃O₁₁，分子量611)。

合成路线18：

第一中间产物B18的合成(路线18)：将水杨酸(6.9g，50mmol)与1，8-辛二醇(14.6g，100mmol)混合，然后滴加3滴浓硫酸，加热至80℃反应5个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B18。

第二中间产物C18的合成(路线18)：将第一中间产物B18(2.00g，7.5mmol)溶于THF(100ml)，然后加入邻苯二甲酸酐(1.45g，9.8mmol)和DMAP(1.20g，9.8mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C18不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物18的合成(路线18)：将阿糖胞苷(1.82g，7.5mmol)，第二中间产物C18(3.11g，7.5mmol)，PyBOP(4.3g，8.3mmol)和DMAP(91.5mg，0.75mmol)溶于DMF(15ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷衍生物18(78.8mg)。LC(UV 254nm)纯度99％。LC-MS m/z 640[M+H]⁺(分子式C₃₂H₃₇N₃O₁₁，分子量639)。

合成路线19：

第一中间产物B19的合成(路线19)：将水杨酸(13.8g，100mmol)与1，10-癸二醇(34.8g，200mmol)混合，然后滴加5滴浓硫酸，加热至80℃反应5个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B19。

第二中间产物C19的合成(路线19)：将第一中间产物B19(3.0g，10mmol)溶于THF(100ml)，然后加入邻苯二甲酸酐(1.8g，12mmol)和DMAP(1.5g，12mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C19不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物19的合成(路线19)：将阿糖胞苷(2.4g，10mmol)，第二中间产物C19(4.4g，10mmol)，PyBOP(5.7g，11mmol)，和DMAP(0.12g，1mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌24小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝25/1)，得到阿糖胞苷衍生物19(48mg)。LC(UV 254nm)纯度94％。LC-MS m/z 668[M+H]⁺(分子式C₃₄H₄₁N₃O₁₁，分子量667)。

合成路线20：

第一中间产物B20的合成(路线20)：将水杨酸(1.38g，10mmol)与1，12-十二二醇(4.04g，20mmol)混合，然后滴加3滴浓硫酸，加热至80℃反应5个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B20。

第二中间产物C20的合成(路线20)：将第一中间产物B20(1.96g，6.1mmol)溶于THF(40ml)，然后加入邻苯二甲酸酐(0.9g，6.1mmol)和DMAP(0.74g，6.1mmol)，加热回流反应12小时，得到的第二中间产物C20不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物20的合成(路线20)：将阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第二中间产物C20(2.76g，6.1mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.05g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷衍生物20(18.1mg)。LC(UV 254nm)纯度96％。LC-MS m/z 696[M+H]⁺(分子式C₃₆H₄₅N₃O₁₁，分子量695)。

合成路线21：

第一中间产物B21的合成(路线21)：将水杨酸(13.8g，100mmol)与1，6-己二醇(23.6g，200mmol)混合，然后滴加5滴浓硫酸，加热至80℃反应5个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B21。

第二中间产物C21的合成(路线21)：将第一中间产物B21(7.2g，30mmol)溶于THF(20ml)，然后加入酸酐(5.6g，36mmol)和DMAP(4.4g，36mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C21不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物21的合成(路线21)：将阿糖胞苷(2.4g，10mmol)，第二中间产物C21(3.9g，10mmol)，PyBOP(5.7g，11mmol)，和DMAP(0.12g，1mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌24小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷衍生物21(151.3mg)。LC(UV 254nm)纯度96％。LC-MS m/z 618[M+H]⁺(分子式C₃₀H₃₉N₃O₁₁，分子量617)。

合成路线22：

第一中间产物B22的合成(路线22)：将水杨酸(6.9g，50mmol)与1，8-辛二醇(14.6g，50mmol)混合，然后滴加5滴浓硫酸，加热至80℃反应5个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B22。

第二中间产物C22的合成(路线22)：将第一中间产物B22(1.4g，5.3mmol)溶于THF(20ml)，然后加入酸酐(0.97g，6.3mmol)和DMAP(0.77g，6.3mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C22不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物22的合成(路线22)：将阿糖胞苷(1.7g，6.9mmol)，第二中间产物C22(2.2g，5.3mmol)，PyBOP(3.6g，6.9mmol)，和DMAP(0.12g，1mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌24小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝25/1)，得到阿糖胞苷衍生物22(129.2mg)。LC(UV 254nm)纯度98％。LC-MS m/z 646[M+H]⁺(分子式C₃₂H₄₃N₃O₁₁，分子量645)。

合成路线23：

第一中间产物B23的合成(路线23)：将水杨酸(13.8g，100mmol)与1，10-癸二醇(34.8g，200mmol)混合，然后滴加5滴浓硫酸，加热至80℃反应12个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B23。

第二中间产物C23的合成(路线23)：将第一中间产物B23(3.0g，10mmol)溶于THF(100ml)，然后加入酸酐(2.0g，13mmol)和DMAP(1.6g，13mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C23不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物23的合成(路线23)：将阿糖胞苷(3.2g，13mmol)，第二中间产物C23(4.5g，10mmol)，PyBOP(7.8g，15mmol)，和DMAP(0.12g，1mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌24小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝25/1)，得到阿糖胞苷衍生物23(98.3mg)。LC(UV 254nm)纯度91％。LC-MS m/z 674[M+H]⁺(分子式C₃₄H₄₇N₃O₁₁，分子量673)。

合成路线24：

第一中间产物B24的合成(路线24)：将水杨酸(1.38g，10mmol)与1，12-十二二醇(4.04g，20mmol)混合，然后滴加3滴浓硫酸，加热至80℃反应5个小时，反应结束后，通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到第一中间产物B24。

第二中间产物C24的合成(路线24)：将第一中间产物B24(0.8g，2.5mmol)溶于THF(30ml)，然后加入酸酐(0.5g，3.2mmol)和DMAP(0.4g，3.2mmol)，加热回流反应12小时。得到的第二中间产物C24不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物24的合成(路线24)：将阿糖胞苷(0.9g，3.9mmol)，第二中间产物C24(1.5g，3.2mmol)，PyBOP(2.0g，3.9mmol)，和DMAP(0.012g，0.1mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌24小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝25/1)，得到阿糖胞苷衍生物24(26.6mg)。LC(UV 254nm)纯度84％。LC-MS m/z 702[M+H]⁺(分子式C₃₆H₅₁N₃O₁₁，分子量701)。

合成路线25：

第十中间产物M25的合成(路线25)：将1，8-辛二酸(3.48g，20mmol)加入到SOCl₂(15ml)中，加DMF(1滴)，加热回流，反应3小时。旋去SOCl₂，得到的第十中间产物M25不用进一步纯化，直接用于下一步反应。第十一中间产物N25的合成(路线25)：将邻硝基苯胺(2.76g，20mmol)溶于苯(20ml)再加入吡啶(8ml)，室温下将邻硝基苯胺滴加到溶于苯(40ml)的第十中间产物M25(4.04g，20mmol)中，反应4h，将溶剂蒸去。将反应物溶于水中，调节PH值至酸性，过滤沉淀，水洗，将沉淀溶于异丙醇中，重结晶，析出土黄色固体的第十一中间产物N25。

阿糖胞苷衍生物25的合成(路线25)：阿糖胞苷(0.42g，1.7mmol)，第十一中间产物N25(0.5g，1.7mmol)，PyBOP(0.97g，1.87mmol)和DMAP(0.021g，0.17mmol)溶于DMF(5ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷衍生物25(31.3mg)。LC(UV 254nm)纯度95％。LC-MS m/z 520[M+H]⁺(分子式C₂₃H₂₉N₅O₉，分子量519)。

合成路线26：

第十二中间产物S26的合成(路线26)：将邻硝基苯甲酸(3.34g，20mmol)和SOCl₂(12ml)溶于DMF(10ml)，回流反应2小时。得到的第十二中间产物S26不用进一步纯化，直接用于下一步反应。

第十三中间产物T26的合成(路线26)：将第十二中间产物S26(3.6g，20mmol)溶于THF(20ml)，滴加至丙氨酸(1.8g，20mmol)的水溶液中，同时滴加氢氧化钠(0.8g，20mmol)水溶液，控制PH＝8-9，控制温度在10℃左右。30min滴加完毕，搅拌40min。调节PH＝3，减压蒸去THF，水溶液用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液无水硫酸钠干燥，浓缩，放置重结晶，过滤，得淡黄色固体的第十三中间产物T26。

第十四中间产物U26的合成(路线26)：将阿糖胞苷(1.56g，6mmol)，第十三中间产物T26(1.43g，6mmol)，PyBOP(3.12g，6mmol)和DMAP(0.07g，0.6mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝6/1)，得到第十四中间产物U26。

阿糖胞苷衍生物26的合成(路线26)：将第十四中间产物U26(about 40mg，0.086mmol)溶于THF(30ml)加入催化量Pd/C，通入氢气，搅拌2h，过滤，滤液旋干，得到阿糖胞苷衍生物26(24.7mg)。LC(UV 254nm)纯度94％。LC-MS m/z 434[M+H]⁺(分子式C₁₉H₂₃N₅O₇，分子量433)。

合成路线27：

第十二中间产物S27的合成(路线27)：将邻硝基苯甲酸(1.67g，10mmol)和SOCl₂(10ml)溶于DMF(10ml)，回流反应2小时，得到的第十二中间产物S27不用进一步纯化，直接用于下一步反应。

第十三中间产物T27的合成(路线27)：将第十二中间产物S27(1.8g，10mmol)溶于THF(20ml)，滴加至氨基己酸(1.5g，12mmol)的水溶液中，同时滴加氢氧化钠(0.96g，24mmol)水溶液，控制PH＝8-9，控制温度在10℃左右。30min滴加完毕，搅拌40min。调节PH＝3，减压蒸去THF，水溶液用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，减压旋干，柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到第十三中间产物T27。

第十四中间产物U27的合成(路线27)：将阿糖胞苷(2.4g，10mmol)，第十三中间产物T27(2.8g，10mmol)，PyBOP(5.7g，11mmol)和DMAP(0.12g，1mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到第十四中间产物U27。

阿糖胞苷衍生物27的合成(路线27)：将第十四中间产物U27(about 40mg，0.08mmol)溶于THF(30ml)加入催化量Pd/C，通入氢气，搅拌2h，过滤，滤液旋干，得到阿糖胞苷衍生物27(36.2mg)。LC(UV 254nm)纯度97％。LC-MS m/z 476[M+H]⁺(分子式C₂₂H₂₉N₅O₇，分子量475)。

合成路线28：

第十五中间产物V28的合成(路线28)：将邻硝基苯甲酸(1.67g，10mmol)，氨基己醇(1.17g，10mmol)，PyBOP(5.72g，10mmol)和DMAP(0.12g，1mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝50/1)，得到第十五中间产物V28。第十六中间产物W28的合成(路线28)：将第十五中间产物V28(2.1g，8mmol)溶于40毫升四氢呋喃中，然后加入邻苯二甲酸酐(1.48g，10mmol)和DMAP(1.22g，10mmol)，加热回流反应12小时。得到的第十六中间产物W28不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

第十七中间产物Y28的合成(路线28)：将阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第十六中间产物W28(1.86g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.05g，0.4mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到第十七中间产物Y28。

阿糖胞苷衍生物28的合成(路线28)：将第十七中间产物Y28(50mg，0.1mmol)溶于THF(30ml)加入催化量Pd/C，通入氢气，搅拌2h，过滤，滤液旋干，得到阿糖胞苷衍生物28(45.1mg)。LC(UV 254nm)纯度94％。LC-MS m/z 610[M+H]⁺(分子式C₃₀H₃₅N₅O₉，分子量609)。

合成路线29：

第十五中间产物V29的合成(路线29)：将烟酸(1.35g，11mmol)，6-氨基-1-己醇B(1.17g，10mmol)，PyBOP(5.72g，11mmol)和DMAP(0.12g，1mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到第十五中间产物V29。第十六中间产物W29的合成(路线29)：将第十五中间产物V29(1.14g，5.1mmol)溶于40毫升四氢呋喃中，然后加入邻苯二甲酸酐(0.83g，5.6mmol)和DMAP(0.68g，5.6mmol)，加热回流反应12小时。得到的第十六中间产物W29不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷衍生物29的合成(路线29)：阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第十六中间产物W29(1.89g，5.1mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.05g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室温搅拌12小时。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯(硅胶，展开剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷衍生物29(32.1mg)。LC(UV 254nm)纯度92％。LC-MS m/z 596[M+H]⁺(分子式C₂₉H₃₃N₅O₉，分子量595)。

合成药物肿瘤细胞毒性试验操作规程

本发明的阿糖胞苷衍生物及其制剂对肿瘤细胞的抑制作用试验

1.试验材料

1)细胞株：

HL-60细胞株，悬浮生长，用含10％胎牛血清(Hyclone公司)的RPMI1640细胞培养基培养，常规培养保持初始细胞浓度在3*10⁵/ml左右，三天一次1:3传代。实验前一天传代(5*10⁵/ml)，实验时细胞浓度在7.5～10*10⁵/ml之间。

BEL-7402细胞株和HT-29细胞株，贴壁生长，用10％胎牛血清(Hyclone公司)的D-MEM细胞培养基培养，常规培养初始细胞浓度在3*10⁵/ml左右，2～3天1:3传代一次。实验前一天1:2传代，实验时细胞浓度在5～10*10⁵/ml之间。

2)药物的溶解与稀释：根据提供的阿糖胞苷衍生物的重量和分子量，首先加入DMSO 100～200μl，然后加入生理盐水(NS)，使稀释后得到的药物浓度为5mM(注意DMSO终浓度不超过10％)。

3)D-MEM或RPMI 1640细胞培养基，Gibco公司

4)胎牛血清，Hyclone公司

5)细胞消化液，0.25％Trypsin+0.02％EDTA

6)PBS磷酸盐缓冲液

7)MTT液，MTT干粉(Sigma)，用PBS充分溶解配成5mg/ml，0.22μm微孔滤膜过滤后分装，-20℃保存

8)10％酸化SDS，0.01N HCl

9)离心管、吸管等(BD公司)，96孔板(Costar公司)

2.步骤：

1)细胞接种：传代后24小时的细胞，生长状态良好。常规收获细胞，用新鲜培养液调整细胞浓度为2×10⁵/ml(贴壁细胞)～3×10⁵/ml(悬浮细胞)。

贴壁细胞接种100μl/孔，37℃、5％CO₂孵箱中培养24h后弃去旧培养液，加入新鲜培养液95μl/孔。

悬浮细胞直接接种95μl/孔。

2)药物处理：每一药物设6个浓度梯度，每一浓度设3个复孔，药物空白对照组设5个复孔。每次试验同时做Ara-C对照。HT-29和BEL-7402细胞加入药物的浓度依次为5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.16mM，每孔5μl，终浓度依次为0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.016、0.008mM，对照组加入5μl生理盐水；HL60细胞加入药物的浓度依次为5×10^-3、2.5×10^-3、1.25×10^-3、0.625×10^-3、0.3125×10^-3、0.16×10^-3mM，对应终浓度依次为2.5×10^-4、1.25×10^-4、6.25×10^-5、3.125×10^-5、1.6×10^-5、8×10^-6mM，对照组加入5μl生理盐水。

3)细胞培养与检测：加入药物后，37℃、5％CO₂孵箱中培养72h，然后每孔加入MTT 10μl，继续培养4h，每孔加100μl 10％SDS(含0.01NHCl)溶解，24h后用Bio-rad 680型ELISA读数仪测定各孔吸光度(A)，检测波长为570nm、参考波长为630nm。

4)计算：首先平均各复孔的吸光度(去除过于悬殊的数据)，计算每种细胞每个药物浓度下的抑制率(IR)，IR(％)＝(1-A_n/A₀)×100％，A_n为实验孔平均吸光度，A₀为药物空白对照孔平均吸光度。用EXCEL软件，绘制药物浓度效应曲线，选择合理的计算方法计算50％细胞存活的药物浓度(IC₅₀)。

图3是本发明的阿糖胞苷衍生物抑制BEL-7402肝癌细胞株的药物浓度-抑制率曲线图。JF007、JF017、JF019、JF020和JF029分别为根据合成路线7、17、19、20和29合成的阿糖胞苷衍生物。

表1列举了代表性阿糖胞苷衍生物抑制不同肿瘤细胞的生物活性。其中，JF002、JF003、JF004和JF006分别为根据合成路线2、3、4和6合成的阿糖胞苷衍生物。

表1

试验证明，本发明的阿糖胞苷衍生物具有抗实体瘤的生物活性。

Claims

1.阿糖胞苷衍生物，其特征在于：所述阿糖胞苷衍生物是具有下述通式(I)的化合物：

通式-I

其中，X是OH；

R¹是H；R²是硝基、氨基、卤素原子基、腈基、羧基和酰胺基中的任意一种；

L是连接单元，用下面的任意一种结构单元表示：

其中，n＝0，1-5；m＝0，1-18；曲线表示上述连接单元L与其相邻基团以共价键相连；所述连接单元L中苯环或环己烷环上的两个基团为邻位、间位或对位相连。

2.根据权利要求1所述的阿糖胞苷衍生物，其特征在于：所述阿糖胞苷衍生物的结构式是下述结构式的任意一种：

。

3.权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括如下步骤：

(2)将步骤(1)的第一中间产物(B)溶于CH₂Cl₂或四氢呋喃，然后加入酸酐化合物和DMAP，加热回流反应5～12小时或室温下搅拌反应24小时，得到的第二中间产物(C)不经进一步纯化，直接用于下一步反应；

(3)将阿糖胞苷、第二中间产物(C)、PyBOP和DMAP溶于DMF，室温搅拌12～24小时，反应液直接通过柱层析色谱提纯得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物或将该反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯，得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物。

4.根据权利要求3所述的权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的合成路线，其特征在于：所述脂肪族二元醇为乙二醇、丁二醇、1，6-己二醇、1，8-辛二醇、1，10-癸二醇和1，12-十二二醇中的任意一种；所述酸酐化合物为丁二酸酐、邻苯二甲酸酐、戊二酸酐和二甘醇酐中的任意一种。

5.权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括以下步骤：

(3)将阿糖胞苷、第四中间产物(E)、PyBOP和DMAP溶于DMF，室温搅拌12～24小时，反应液直接通过柱层析色谱提纯得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物或将该反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯，得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物。

6.根据权利要求5所述的权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的合成路线，其特征在于：所述酸酐化合物为丁二酸酐。

7.权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括以下步骤：

(1)水杨酸甲酯和氨基丙醇溶于二氧六环中，室温搅拌12小时，旋转蒸发除去溶剂，加饱和盐水，用盐酸调节pH至4～5后，用乙酸乙酯提取多次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，所得第五中间产物(F)直接用于下一步反应；

(2)将第五中间产物(F)溶于CH₂Cl₂或四氢呋喃中，然后加入酸酐化合物和DMAP，室温下搅拌反应24小时，过滤反应液，滤液减压蒸干，所得的第六中间产物(G)不经进一步纯化，直接用于下一步反应；

(3)将阿糖胞苷、第六中间产物(G)、PyBOP和DMAP溶于DMF，室温搅拌12～24小时，反应液直接通过柱层析色谱提纯得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物或将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯，得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物。

8.根据权利要求7所述的权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的合成路线，其特征在于：所述酸酐化合物为丁二酸酐。

9.权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括以下步骤：

(1)邻甲氧基苯甲酸和SOCl₂溶于二氯甲烷，加热回流4小时，旋转蒸发除去溶剂和过量的SOCl₂得到的第七中间产物(H)；

(4)将阿糖胞苷、第九中间产物(K)、PyBOP和DMAP溶于DMF，室温搅拌12～24小时，反应液直接通过柱层析色谱提纯得到产品或将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯，得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物。

10.根据权利要求9所述的权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的合成路线，其特征在于：所述酸酐化合物为丁二酸酐。

11.权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括如下步骤：

(2)将邻硝基苯胺溶于苯再加入吡啶，滴加到溶解于苯的第十中间产物(M)中，反应2～4h，将溶剂蒸去，将反应物溶于水中，调节pH值至酸性，过滤沉淀，水洗，将沉淀溶于异丙醇中，重结晶，析出固体的第十一中间产物(N)；

12.根据权利要求11所述的权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的合成路线，其特征在于：所述脂肪族二元酸为1，8-辛二酸。

13.权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括以下步骤：

(1)将邻硝基苯甲酸和SOCl₂溶于DMF，回流反应2小时，得到的第十二中间产物(S)不用进一步纯化，直接用于下一步反应；

(2)将第十二中间产物(S)溶于四氢呋喃，滴加至氨基酸化合物的水溶液中，同时滴加氢氧化钠水溶液，控制pH＝8～9，控制温度在10℃，30分钟滴加完毕，搅拌40分钟并调节pH值至3，减压蒸去四氢呋喃，水溶液用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液无水硫酸钠干燥、浓缩，放置重结晶，过滤，得固体的第十三中间产物(T)；

所述氨基酸化合物为丙氨酸；

(3)将阿糖胞苷、第十三中间产物(T)、PyBOP和DMAP溶于DMF，室温搅拌12小时，反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸干，再通过柱层析色谱提纯，得到第十四中间产物(U)；

(4)将第十四中间产物(U)溶于四氢呋喃，催化氢解，搅拌，过滤，滤液旋干，得到高纯度的通式(I)的阿糖胞苷衍生物。

14.权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的合成路线，包括以下步骤：

(4)将第十七中间产物(Y)溶于四氢呋喃，催化氢解，搅拌，过滤，滤液旋干，得到高纯度的通式(I)的阿糖胞苷衍生物。

15.含有权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的制剂的制备方法，其特征在于：

(1)将通式(I)的阿糖胞苷衍生物溶解到水、生理盐水、环糊精水溶液、水溶性的有机溶剂、非离子性的表面活性剂、水溶性的类脂、脂肪酸和脂肪酸酯中的任意一种或多种的组合溶剂而制得制剂溶液；

16.根据权利要求15的含有权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的制剂的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂是乙醇、丙二醇、甘油、多聚乙二醇、N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的任意一种或多种的组合溶剂。

17.含有权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物的制剂，其特征在于：是由权利要求15的阿糖胞苷衍生物制剂的制备方法制备得到的产品。

18.权利要求1中通式(I)所示的阿糖胞苷衍生物在制备抗癌药物中的用途，其特征在于：癌症包括白血病、结肠癌和肝癌。

19.权利要求17的阿糖胞苷衍生物制剂在制备抗癌药物中的用途，其特征在于：癌症包括白血病、结肠癌和肝癌。

20.权利要求19的阿糖胞苷衍生物制剂在制备抗癌药物中的用途，其特征在于：所述阿糖胞苷衍生物制剂与其他化疗药物联合用药，所述其他化疗药物为烷化剂、植物生物碱类、抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、铂类药物、抗代谢类及其它已知的抗癌药物。

21.根据权利要求20的阿糖胞苷衍生物制剂在制备抗癌药物中的用途，其特征在于：在联合用药过程中，包括运用至少一种具有权利要求2的结构式的阿糖胞苷衍生物。