WO2011113175A1

WO2011113175A1 - 阿糖胞苷前药衍生物及其在抗癌抗肿瘤中的用途

Info

Publication number: WO2011113175A1
Application number: PCT/CN2010/000321
Authority: WO
Inventors: 高峰; 徐峻
Original assignee: Gao Feng; Xu Jun
Priority date: 2010-03-15
Filing date: 2010-03-15
Publication date: 2011-09-22

Description

说明书

阿糖胞苷前药衍生物及其在抗癌抗肿瘤中的用途技术领域

本发明涉及医学技术领域，特别是涉及一种新型的阿糖胞苷前药衍生物及其合成路线，本发明还涉及阿糖胞苷前药衍生物制剂及其制备方法和阿糖胞苷前药衍生物及其制剂在抗癌抗肿瘤中的用途。

背景技术

癌症是目前危害人类生命健康的最主要的疾病，治疗癌症的现有手段主要包括：手术切除、放射性疗法、化学疗法或这些方法的并用。化学疗法已经得到了广泛的应用而且已经用于多种不同类型的癌症的治疗。然而，大多数化学疗法所用的抗癌药物都仅限于延緩癌症的恶化从而延长病人的生命， 4艮难达到治愈的目的。各类癌症的发病机理虽然各不相同，但是它们其实是具有共同特征的一大类症候群。癌细胞除了代谢旺盛、不断地分化之外，与正常细胞的生理差别不是^ ί艮大。这对于开发选择性地清除癌细胞、且不杀伤正常细胞的药物是个巨大的挑战。抗癌药物开发的另一大挑战是癌细胞耐药性，即经过一段时间化疗之后引起的耐药抗药性，用过的化疗药物，即使增加剂量，对癌细胞也不再起作用。肿瘤细胞的转移也常使得无法用化学疗法进行治疗。到目前为止，没有一种抗癌药物能够医治所有的癌症。寻找高效、高选择性、低毒、无耐药性、而且急需的新型抗癌药物仍然极具挑战性。大多化疗抗癌药物都会产生严重的副作用，从而导致化学治疗不能继续进行。因此，现有药物在治疗不同种类的肿瘤时受到极大的限制。所以，寻找高效、低毒的新型抗癌药物对维护人类健康仍然迫切需要。

阿糖胞苷是胞嘧啶核苷的类似物， DNA多聚酶的抑制剂。它能够阻止 DNA 合成，也可掺入 DNA, 干扰 DNA的复制，此外还可阻断胞嘧啶核苷酸还原成脱氧胞嘧核苷酸 (Sylvester, R. K., Fisher, A. J., and Lobell, Μ·, Drug Intelligence & Clinical Pharmacy: Vol. 21, No. 2, pp. 177-180(1987); Boyer et al.， Novel Cytarabine Monophospate Prodrugs, United States Patent Application Publication, Pub. No. ： US 2007/0037774 A 1, (Feb. 15, 2007); Colon-Cesario, M" Wang, J" Ramos, X., Garcia, H. G.， Davila, J. J., Laguna, J., Rosado, C, and Pena de Ortiz, S. J. Neurosci., 26(20): 5524 -5533(2006))。

目前，阿糖胞苷主要用于急性白血病的治疗。对急性粒细胞白血病疗效最好，对急性单核细胞白血病及急性淋巴细胞白血病也有效，对恶性淋巴瘤、肺癌、消化道癌、头颈部癌有一定疗效，对病毒性角膜炎及流行性结膜炎等也有一定疗效，然而，对多数实体肿瘤无效。阿糖胞苷的活性不是很高，为了提高疗效，阿糖胞苷一般均与其他药物，如：甲氧柔红霉素、全反式维甲酸联合三氧化二砷、吡柔比星、拓朴替康-足叶乙甙 -环磷酰胺、氟达拉滨等合并使用。阿糖胞苷具有骨髓抑制、消化道反应等副作用，少数病人可有肝功异常、发热、皮疹等副作用（Bolwell, B.J., Cassileth, P.A., Gale, R. P. Leukemia. 2(5):253-60 (1988); Kimby, E., Nygren, P., Glimelius, B. Acta Oncol. 40(2-3):231-52 (2001); Stamatopoulos, K. Leukemia Research , Volume 22 , Issue 8 , pp 759 - 761, (2003); Burnett, A.K., Milligan, D., Prentice, A.G., Goldstone, A.H., McMullin, M.F., Hills, R.K., Wheatley, K. Cancer. 109(6): 1007-10 (2007))。

阿糖胞苷为抗代谢药物，在细胞内先经脱氧胞苷酶催化磷酸化，转变为有活性的阿糖胞苷酸，再进一步转为相应的二磷酸及三磷酸阿糖胞苷而起作用。阿糖胞苷主要通过与 DNA 合成过程中所需的三磷酸脱氧胞苷竟争，而抑制 DNA多聚酶，干扰核苷酸掺入 DNA, 并能抑制核苷酸还原酶，阻止核苷酸转变为脱氧核苷酸，但对 RNA和蛋白质的合成无显著作用，属于作用于 S期的细胞周期特异性药物，对处于 S增殖期细胞的作用最为敏感，并对 G1/S及 S/G2 转换期也有作用。静脉注射后迅速从血中消失， 40 %可通过血脑屏障，药物在体内主要在肝中代谢为无活性的阿糖尿苷， 70 % ~ 90 %通过肾排泄。为了开发对实体肿瘤如肝癌有疗效的抗癌新药，必须寻找对肝脏靶向性的新药。显然，抗肝炎病毒的药物可以作为极好的借鉴。例如，米夫定及阿德福韦（adefovir, PMEA)己被批准作为乙型肝炎抗病毒治疗药物 (Starrett, et al.， "Synthesis, oral bioavailability determination, and in vitro evaluation of prodrugs of the antiviral agent 9 - [2 - (pho sphonomethoxy)ethy 1] adenine (PMEA)," J Med Chem., 37(12): 1857-64 (1994); Shaw, et al" "Pharmacokinextics and Metabolism of Selected Prodrugs of PMEA in Rats," Drug Metabolism Dis., 25(3):362-366 (1997); Wacher, V.J., et al., Advanced Drug Delivery Reviews 46:89-102 (2001); Wacher, et al., "Active Secretion and Enterocytic Drug Metabolism Barriers to Drug Absorption," Adv. Drug Del. Rev., 46:89-102 (2001); Murono, et al., "Prevention and inhibition of nasopharyngeal carcinoma growth by antiviral phosphonated nucleoside analogs," Cancer Res., 61(21):7875-7 (2001》。 2003 年， Metabasis Therapeutics, Inc 公司的科学家 K. Raja Reddy, Mark D. Erion, Michael C. Matelich, Joseph J. Kopcho 提出用环磷酸核苷类作为抗肝癌治疗药物的前药 (United States Patent 7,214,668;), 当化合物进入肝脏后，被肝脏的 CYP 3A4代谢酵催化解离成无环磷酸核苷类衍生物而具有抗癌的活性。 2007年， Metabasis Therapeutics, Inc公司又提出新的环磷酸阿糖胞苷衍生物作为抗癌前药的专利申请 (Novel Cytarabine Monophospate Prodrugs, United States Patent Application Publication, Pub. No. ： US 2007/0037774 A 1, Boyer et al., Feb. 15, 2007; Phosphonic acid based prodrugs of PMEA and its analogues, United States Patent 7,214,668, Reddy, et al. May 8, 2007)。这些专利申请的核心是将环騎 S炱接入阿糖胞苷的核糖环上的 -OCH2-核糖位置上，即 O5位置，而对阿糖胞苷胞嘧啶环上的氨基不加修饰。

阿糖胞苷一般不能用于治疗肝癌，其原因在于当其胞核苷骨架结构进入肝脏之后，它的 N4氨基（见图 1 )被代谢失效并引起毒性；另一方面是其糖甙结构上的 O5羟基（见图 1 )必须被磷酸化而激活，而此激活过程在肝内过于緩慢。发明内容

本发明旨在克服上述已有技术的不足，提供一种高效、低毒，无耐药性，能够被迅速激活的阿糖胞苷前药衍生物，并提供了阿糖胞苷前药衍生物的合成路线以及阿糖胞苷前药衍生物制剂的制备方法，本发明还提供了阿糖胞苷前药衍生物及其制剂在抗癌抗肿瘤方面的应用的实验数据。

本发明的阿糖胞苷前药衍生物，其特征在于：所述阿糖胞苷前药衍生物是具有下述通式（I ) 、 ( II ) 、 ( III ) 中的任意一种通式的化合物：

其中， W表示 C=O、 S(O)O和 C(O)O中的任意一种基团；

其中， Y表示（ CH₂ ) n或 H₂C-0-CH₂ ，其中， n=2~6;

X表示 OH、 O-P OXOR^和磷 Stt中的任意一种基团，所述碑 Stt为单磷酸基、二磷酸基和三磷酸基中的任意一种；

1. R²是 C _1S饱和的或不饱和的脂肪基团，所述不饱和的脂肪基团中含有一个或多个不饱和健，所述不饱和健包括顺式或反式异构体； A表示 O或 S或 CH₂或无基团；

P = l-5;

R³是氨基、烷基取代氨基、芳香基取代氨基、杂环基取代氨基、 NHOH、 NHOR⁴和如下基团中的任意一种：

其中 R⁴是卤原子、氨基、硝基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、羧基、羟基、氰基、三氟甲基、苄基、苯基、芳香基、酰基、羰基、取代氨基、黄酸基、酰胺基、黄酰胺基、氨基酸、碳环基和杂环基中的任意一种。

其中， R¹ 可以是 H、 Cw₈烷基、 C ₁₈环烷基，苄基，苯基和芳环基中的任意一种； R² A H、 d-C₁₈烷基、 C_3-18环烷基、 C_2-18烯基、 C_2-18炔基、环烯基、苄基、苯基、芳香基，环氨基、碳环基、杂环基、苯胺基和取代苯胺基中的任意一种。其中每一个基团可以进而取代，而且其中可含有杂原子。

本发明的通式（I )的阿糖胞苷前药衍生物包括具有下述结构式的代表性化

本发明的通式（III) 的阿糖胞苷前药衍生物包括具有下述结构式的代表性化合物：

为了清晰起见但并非限制本发明，除另外说明之外，本发明所使用的所有科技术语和在本发明领域内技术人员常使用和理解的意义相同。本发明所引用的专利申请或已发表的申请及其他论文均属于原始引用并未加修改。

本专利所用"一个"或"一种"或"一类"意指最少一个 /种 /类或一个 /种 /类或一个 /种 /类以上。

本发明所用"烷基" 意指各种饱和的直链的、带侧链的或环状的碳氢基团，特包括含有十个或十个碳以下的小烷基。例如曱基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、异己基、庚基、辛基和壬基等仅为本定义中的一些典型例子。

本发明所用 "婦基，，与上述 "烷基 "定义相同，但其中必须最少有一个碳碳双键（C=C ) , 所以本发明所用的烯基包括含有两个到十个碳原子的直链的、带有分支链的或环状的并至少含有一个碳碳双键的烃基，如乙烯基、丙烯基、丁烯基和戊烯基等。

本发明所用的"块基"为上述烷基或婦基并含有至少一个碳碳三键，所以，炔基包括含有两个到十个碳原子并含有至少一个碳碳三键的直链的、带有分支链的或环状的烃基或炔基，如乙炔基、丙炔基、丁炔基和戊炔基等。

本发明中的"饱和" 意指该基团中不含不饱和键，如碳碳双键或碳碳三键；而"不饱和" 则指该基团中含有一个或一个以上的碳碳双键或碳碳三键。

本发明所用 "环烷基"为环状的碳氢基团并优先选用含有三到八个碳的环烷基。因此环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷均为本定义下的典型例子。环烷基中含有一个或两个碳碳双键即形成 "环烯基"。环烷基上还可带有烷基、烯基、炔基和其他基团。

本发明所使用的"芳香基"为环状共轭芳香系统并可在环中含有一个或一个以上的非碳原子（除碳以外的其他杂原子如氮），如苯基、萘基和吡啶基等。

本发明中还常用到的 "杂环基"指任何多个原子通过共价键构成的环状基团和化合物，并且至少含有一个非碳原子。特指杂环基团包括含有氮，硫或氧非碳原子的五元和六元环状系统如嘧唑、吡咯、吡啶或嘧啶等。

本发明中的"烷氧基 "指把氧原子与直链或带支链的烷基连接所形成的烷基氧化基。此类烷氧基团的例子包括曱氧基、乙氧基、丙氧基或异丙氧基等。

同样地， "烷硫基"指把硫原子与直链或带支链的烷基连接所形成的烷基硫化基。此类烷硫基团的例子包括甲硫基、乙硫基、丙硫基或异丙硫基等。

本发明中的"卤原子基"为氟，氯，溴，碘。

本发明中的"氨基酸"指取代的天然和非天然的氨基酸，纯的 L- 或 D- 构型或外消旋混合物，以及其由氨基和而衍生出来的基团。

特别值得进一步说明的是，上述所定义的各种取代基还包括它们被进一步取代而构成的基团，其中这些新的取代基也可含有其他的基团。例如烷基或芳香基上的氲原子被氨基、卤素或其他基团取代即成为新的属于上述各定义中的基团。

本发明中所用的"騎酸" 或"磚酸酯" 是最高氧化态的五价磷原子上连有四个氧原子，一个氧原子以双键与磷原子相连，两个氧原子以单键与磷原子相连，而且，这两个氧原子上可以是氢原子、负电荷或如上所定义的各种烷基、芳香基等，如 -P(=O)(O-)₂, -P(O)(OR)₂。磷原子上的另外一个氧原子与本发明中的衍生物相连。

本发明中的 "前药 "指本发明的阿糖胞苷前药衍生物被用到体内后，在体内断裂或增加某个结构单元所形成的起生物作用的化合物。

本发明中提及的有机溶包括：六氟磷酸苯并三唑- 1基-氧基三吡咯垸基磷 ( PyBOP )、 4-二甲氨基吡啶（ DMAP )、 Ν,Ν-二曱基曱酰胺（ DMF )、二曱基亚砜 ( DMSO ) 、多聚乙二醇（PEG) 和四氢呋喃（THF) 。

本发明解决的另一个技术问题是提供了多个通式（I) 、 (II) 或（III) 的结构式的阿糖胞苷前药衍生物的简单有效的合成路线，其技术放案分别如下：

1. 阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，其特征在于：

( 1 ) 酸酐化合物与脂肪醇混和，加热回流或室温搅拌，反应 3-5个小时，冷却得到的第一中间产物（B) 不经进一步純化，直接用于下一步反应；

(2) 阿糖胞香，第一中间产物（B) , PyBOP和 DMAP溶于 DMF，室温 ~60°C搅拌 7~24小时，得到反应液通过柱层析色 ·ΐ脊提純，得到通式（I)的阿糖 3包苷 †生物。

所述酸酐化合物为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一中；所述脂肪醇为甲醇、乙醇、正辛醇、月桂醇、正癸醇、正十四醇、正十六醇和十八醇中的任意一种。（参考合成路线 1~5, 8、 9、 11、 12、 16-23 )

2. 阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，其特征在于：

(1)将 2， 6-二曱基氨基苯或环烷基苯并咪唑、酸酐化合物和 DMAP溶于四氢呋喃，控制温度 35〜50°C反应 3~5小时，析出固体，所得第二中间产物（ C ) 不经纯化，直接用于下一步反应；

(2)将阿糖胞苷，第二中间产物（C) , PyBOP和 DMAP溶于 DMF, 室温搅拌 12~24小时，反应液倒入水中，析出固体或将反应液通过柱层析色谱提纯，得到通式（II) 的阿糖胞苷前药衍生物。

所述酸酐化合物为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一种。（参考合成路线 14， 15)

3. 阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，其特征在于：

( 1 ) 酸酐化合物与脂肪醇混和，加热回流或室温搅拌，反应 3〜5个小时，冷却得到的第一中间产物（B) 不经进一步纯化，直接用于下一步反应；

(2) 第一中间产物（B) ， SOCl₂和 1~2滴 DMF溶于二氯曱烷，加热回流 3~4小时，旋转蒸发减压除去溶剂和过量的 SOCl₂得到第三中间产物（D ) , 不经进一步纯化，直接用于下一步反应；

( 3 ) 阿糖胞苷盐酸盐和第三中间产物（D )溶于 DMF, 室温搅拌 2〜4天，减压蒸馏除去 DMF 后得到的油状物加乙醚搅拌固化，得到的半固体产品用 NaHCO₃水溶液中和、过滤，所得固体用水洗至中性后用乙酸乙酯重结晶、过滤或所得固体溶于甲醇，过滤除去不溶物，然后通过柱层析色谱提纯，得到通式（III ) 的阿糖胞苷衍生物。

所述酸酐化合物为丁二酸酐、戊二酸、己二酸酐和二甘醇中的任意一种；所述所述脂肪醇为曱醇、乙醇、正辛醇、正癸醇、月桂醇，正十四醇、正十六醇和十八醇中的任意一种。（参考合成路线 6、 7、 10, 13 )

阿糖胞苷前药衍生物制剂的制备方法，其特征在于：

( 1 )将具有通式（ I ) 、（ II )或（ III ) 中的任意一种结构式的阿糖胞苷前药衍生物溶解到水、生理盐水、环糊精水溶液、水溶性的有机溶剂、非离子性的表面活性剂、水溶性的类脂、脂肪酸、脂肪酸酯和磷脂中的任意一种或多种的组合溶剂而制得制剂溶液；

( 2 )将所述制剂溶液再用生理盐水或葡萄糖注射液稀释而制成阿糖胞苷前药衍生物制剂。

所述有机溶剂是乙醇、丙二醇、甘油、甘油酯、多聚乙二醇（PEG ) 、 Ν,Ν- 二曱基曱酰胺（DMF )和二曱基亚砜（DMSO ) 中的任意一种或多种的组合溶剂。

本发明的阿糖胞苷前药衍生物制剂，其特征在于：是由上述阿糖胞苷前药衍生物制剂的制备方法制备得到的产品。

阿糖胞苷前药衍生物在抗癌抗肿瘤中的用途。所述癌症包括但不仅限于白血病、固体瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌和腎癌。

本发明的阿糖胞苷前药衍生物制剂在抗癌抗肿瘤中的用途。所述癌症包括但不仅限于癌症包括白血病、固体瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌和肾癌。所述阿糖胞苷前药衍生物制剂还可与其他化疗药物联合用在抗癌抗肿瘤中，所述其他化疗药物包括烷化剂、植物生物碱类、抗菌抗肿瘤横酰胺类药物、铂类药物、抗代谢类及其它已知的抗癌药物。在所述联合用药过程中，包括运用至少一种具有上述所列举的代表性的阿糖胞苷前药衍生物。

以本发明的阿糖胞苷前药衍生物为成份制备成药用制剂，可以用于口服的或非肠道途径给药。此处所指的非肠道途径给药是指皮下皮内、静脉内、动脉内、 ^！几肉内、心房内、滑膜内、胸骨内注射或滴注。

本发明采用新的设计技术构思设计出阿糖胞苷前药衍生物。阿糖胞苷（参照附图 1 ) 不能用于治疗肝癌的原因一方面在于当其胞核苷骨架结构进入肝脏之后，它的 N4氨基被代谢失效并引起毒性，另一方面是其糖甙结构上的 O5羟基必须被磷酸化而激活，而此激活过程在肝内过于緩慢。

本发明的阿糖胞苷前药衍生物的设计是通过对 N4, 05位置进行化学修饰，而设计出了新型的前药衍生物，避免 N4氨基被代谢失效并引起毒性；另外，让 05 羟基容易被磷酸化而激活，主要有益效果是：增加生物利用度，减少多重抗药性 (多靶向设计技术)，增加溶解度，增加酯溶性。本发明详细提供了阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，阿糖胞苷前药衍生物制剂及其制备方法，并通过大量的实验数据证明了本发明的阿糖胞苷前药衍生物在抗癌抗肿瘤方面的用途。

附图说明

图 1表示阿糖胞苷的结构和 N4 , 05修饰位置的示意图。

图 2表示本发明的通式 -I的具有代表性的阿糖胞苷前药衍生物的结构示意图。

图 3表示本发明的通式 -II的具有代表性的阿糖胞苷前药衍生物的结构示意图。

图 4表示本发明的通式 -III 的具有代表性的阿糖胞苷前药衍生物的结构示意图。图 5表示本发明的阿糖胞苷前药衍生物抑制 BEL-7402肝癌细胞株的药物浓度-抑制率曲线图。具体实施方式

本发明的一些代表性阿糖胞苷前药衍生物的合成路线列举如下。本发明专利中的其他类似阿糖胞苷前药衍生物通过相同或类似的方法合成得到。

1

第一中间产物 B1的合成（路线 1 )：丁二酸酐（25 g , 250 mmol )溶于曱醇（50 ml ) , 加热回流，反应 3个小时。得到的第一中间产物 B 1不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 1的合成（路线 1 ) ：阿糖胞苷（ 1.0 g, 4.1 mmol ) , 第一中间产物 Β 1 ( 0.6 g, 4,5 mmol ) , PyBOP ( 2.35 g, 4.5 mmol )和 DMAP ( 0.055 g, 0.41 mmol ) 溶于 DMF ( 20 ml ) , 室温搅拌 24小时。反应液通过柱层析色谱提纯（硅胶，展开剂：二氯曱烷 /曱醇 =9/1 )，得到阿糖胞苷前药衍生物 1 ( 16.9 mg ) , LC ( UV 254 nm ) 纯度 >95%。 LC-MS m/z 358 [M + H]十（分子式 C₁₄H₁₉N₃0₈, 分子量 357 ) 。合成路线 2:

第一中间产物 B 2的合成（路线 2)：戊二酸酐（28.5g, 250mmol)溶于乙醇 ( 100 毫升） , 加热回流，反应 5个小时。得到的第一中间产物 B2不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 2的合成（路线 2) ：阿糖胞苷（ 1.0 g, 4.1 mmol) , 第一中间产物 Β2 (0.79 g, 4.9 mmol ) , PyBOP (2.35 g, 4.5 mmol ) , 和 DMAP ( 0.055 g, 0.41 mmol )溶于 DMF ( 10 ml) ，室温搅拌 12小时。反应液通过柱层析色 i普提纯（硅肢，展开剂：二氯甲烷 /甲醇 =9/1) , 得到阿糖胞苷前药衍生物 2 ( 46.9 mg) , LC ( UV 254 nm ) 純度 >95%。 LC-MS m/z 386 [M + H]+ (分子式 C₁₆H₂₃N₃0₈, 分子量 385 ) 。

第一中间产物 B3的合成（路线 3) ：戊二酸酐（ 11.4g, 100 mmol ) 溶于曱醇

(50 ml) , 加热回流，反应 3个小时。得到的第一中间产物 B3不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 3的合成（路线 3) ：阿糖胞苷（ 1.0 g， 4.1 mmol) ，第一中间产物 B3 ( 0.72 g, 4.9 mmol ) , PyBOP (2.35 g, 4,5 mmol )和 DMAP (0.055 g, 0.41 mmol )溶于 DMF ( 10 ml ) , 室温搅拌 Ί小时。反应液通过柱层析色镨提纯（硅胶，展开剂：二氯甲烷 /曱醇 =9/1 ) ，得到阿糖胞苷前药衍生物 3 (78.3 mg),LC( UV 254 nm )純度 91%。 LC-MS m/z 372 [M + H]⁺(分子式 C₁₅H₂₁N₃O₈，分子量 371 ) 。

第一中间产物 B 4的合成（路线 4 )：戊二酸酐（ 3.4 g, 30 mmol )溶于月桂醇 ( 10 ml, 45 mmol) , 控制温度 30 。C, 反应 5个小时。得到的第一中间产物 B4不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 4的合成（路线 4) ：阿糖胞苷（1.0 g, 4.1 mmol) , 第一中间产物 Β 4 ( 1.36 g, 4.5 mmol) ， PyBOP (2.35 g, 4.5 mmol)和 DMAP ( 0.055 g, 0.41 mmol )溶于 DMF ( 10 ml) ，室温搅拌 12小时。反应液通过柱层析色 i普提纯（硅胶，展开剂：二氯曱烷 /曱醇 =9/1 ) , 得到阿糖胞苷前药衍生物 4 ( 169.3 mg) , LC ( UV 254 nm ) 纯度 98%。 LC-MS m/z 526 [M + H]十（分子式 C₂₆H₄₃N₃0₈, 分子量 525 ) ； 1H NMR (600 MHz, DMSO- d₆) δ 10.84 (s， 1H) ， 8.06 (d, 1H) , 7.20 ( d, 1H) , 6.05 ( d， 1H) ， 5.49 ( d， 2H ) ， 5.07 (t, 1H) , 4.06 (m, 1H) , 3.99 (t, 2H ) , 3.92 ( m, 1H) , 3.82 ( m, 1H) , 3.61 (m, 2H) , 2.43 (t, 2H ) , 2.32 ( t, 2H ) , 1.79 (m, 2H) , 1.55 (m， 2H) , 1.24 ( m， 18H) ， 0.85 (t, 3H ) 。合成路线 5：

第一中间产物 B 5的合成（路线 5 )：丁二酸酐（ 3.0 g, 30 mmol )溶于月桂醇 ( 8.37 g, 45 mmol ) , 室温搅拌，反应 5个小时。得到的第一中间产物 Β5不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 5的合成（路线 5) ：阿糖胞苷（ 1 g, 4.1 mmol) , 第一中间产物 Β5 ( 1.3 g, 4.5 mmol ) , PyBOP ( 2.35 g, 4.5 mmol )和 DMAP ( 0.055 g, 0.41 mmol ) 溶于 DMF ( 10 ml) , 室温搅拌 12小时。反应液通过柱层析色谱提纯（硅胶，展开剂：二氯甲烷 /甲醇 =9/1 ) ,得到阿糖胞苷前药衍生物 5 ( 16.3 mg),LC( UV 254 nm )纯度 98%。 LC-MS m/z 512 [M + H]⁺(分子式 C₂₅H₄₁N₃0₈, 分子量 511 ) 。

第一中间产物 B 6的合成（路线 4 )：戊二酸酐（ 3.4 g， 30 mmol )溶于月桂醇 ( 10 ml, 45 mmol) ，控制温度 30 。C, 反应 5个小时。得到的第一中间产物 B6不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

第三中间产物 D6的合成（路线 6) ：第一中间产物 B6 (4.0g， 13.3 mmol) , SOCl₂ (3.17 g, 26.6 mmol)和 1滴 DMF溶于二氯曱烷 ( 20 ml ) ，加热回流 3小时。旋转蒸发减压除去溶剂和过量的 SOCl₂得到第三中间产物 D6。得到的产物不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 6的合成 (路线 6 )：阿糖胞苷盐酸盐（ 0.7 g, 2.5 mmol ) 和第三中间产物 D6 ( 1.04 g, 3.26 mmol ) 溶于 DMF (6ml) ，室温搅拌 2天。减压蒸馏除去 DMF。油状物加 12.5 ml乙 ft搅拌固化，共三次。得到的半固体促产品用 5 ml , 1 mol/L的 NaHC0₃水溶液中和。过滤- ,所得固体用水洗至中性，用 60 ml乙酸乙酯重结晶，过滤、，得到阿糖胞苷前药衍生物 6 ( 89.4 mg ) ， LC ( UV 254 nm ) 纯度 >95%。 LC-MS m/z 526 [M + H]十 (分子式 C₂₆H₄₃N₃O₈, 分子量 525 ) ； 1HNMR ( 600 MHz, DMSO-^ ) 57.46 ( d, 1H) , 7.10 (brs, 1H) , 7.01 (brs, 1H ) , 6.08 ( d, 1H) , 5.65 ( d, 1H) , 5.57 ( m, 2H ) , 4.29 (dd, 1H) , 4.19 ( dd, 1H ) , 3.98 ( m, 3H ) , 3.90 (m, 1H ) , 3.88 ( s, 1H) , 2.38 (t, 2H) , 2.32 (t, 2H ) , 1.78 ( m, 2H ) , 1.55 ( m, 2H ) , 1.24 (m, 18H) , 0.85 (t, 3H ) 。

第一中间产物 B 7的合成（路线 2)：戊二酸酐（28.5 g, 250 mmol)溶于乙醇 ( 100 毫升） , 加热回流，反应 5个小时。得到的第一中间产物 B7不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

第三中间产物 D7的合成（路线 7) ：第一中间产物 B7 (6.0g, 37.5 mmol ) , SOCl₂ (8.9 g, 75 mmol), 和 1滴 DMF溶于二氯曱烷（ 40 ml ) ，加热回流 3小时。旋转蒸发除去溶剂和过量的 SOCl₂得到第三中间产物 D7,不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 7的合成 (路线 7 )：阿糖胞苷盐酸盐（ 1.4 g, 5 mmol )和第三中间产物 D7 ( 1.0 g, 5.6 mmol)溶于 DMF ( 12 ml) ，室温搅拌 2天。蒸馏除去 DMF。油状物加 25 ml乙醚搅拌固化，共三次。得到的半固体粗产品用 10 ml, 1 mol/L的 NaHCO₃水溶液中和。用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，水洗后，用无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩，放置后析出晶体。过滤，得到阿糖胞苷前药衍生物 7 (25.3 mg) , LC ( UV 254 nm )纯度 >95%。 LC-MS m/z 386 [M + H]⁺ (分子式 C₁₆H₂₃N₃0₈, 分子量 385 ) 。合成路线 8:

第一中间产物 B8的合成（路线 8 )：二甘醇酐（ 0.58 g, 5 mmol )溶于乙醇（ 20 ml) , 控制温度 40 C，反应 5个小时。得到的第一中间产物 B8不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 8的合成（路线 8) ：阿糖胞苷（ 1 g, 4.1 mmol) , 第一中间产物 Β8 ( 0.81 g, 5.0 mmol ) PyBOP ( 2.35 g, 4.5 mmol )和 DMAP ( 0.055 g, 0.41 mmol) 溶于 DMF ( 10 ml) , 室温搅拌 12小时。反应液通过柱层析色谱提纯（硅胶，展开剂：二氯甲烷 /甲醇 =15/1 ) , 得到阿糖胞苷前药衍生物 8 ( 191.5 mg) , LC ( UV 254 nm )纯度 >90% LC-MS m/z 388 [M + H]⁺ (分子式 C₁₅H₂₁N₃O₉, 分子量 387 ) 合成路线 9:

第一中间产物 B9的合成（路线 9) ：二甘醇酐（ 1.276 g, 11 mmol) 溶于月桂醇（2.42 g, 13 mmol) , 控制温度 40 C, 反应 4个小时。得到的第一中间产物 B9不经进一步純化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 9的合成（路线 9) ：阿糖胞苷（ 1 g 4.1 mmol) ，第一中间产物 B 9 ( 1.51 g, 5.0 mmol) , PyBOP (2.35 g, 4.5 mmol) , 和 DMAP ( 0.055 g, 0.41 mmol )溶于 DMF ( 10 ml) ，室温搅拌 12小时。反应液通过柱层析色谱提纯（硅胶，展开剂：二氯曱烷 /曱醇 =15/1 ) , 得到阿糖胞苷前药衍生物 9 ( 90.1 mg ) ， LC (UV 254 nm ) 純度 >90%。 LC-MS m/z 528 [M+H]+ (分子式 C₂₅H₄₁N₃O₉, 分子量 527) 。合成路线 10:

第一中间产物 BIO的合成（路线 10) ：二甘醇酐（ 1.276 g, ll mmol)溶于月桂醇（2.42 g, 13 mmol) ，控制温度 40 。C，反应 4个小时。得到的第一中间产物 B10不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

第三中间产物 D10的合成（路线 10) : 第一中间产物 B10( 1.81 g, 6.0 mmol ) , SOCl₂ (1.43 g, 12 mmol)和 1滴 DMF溶于二氯曱烷（ 20 ml ) ,加热回流 4小时。旋转蒸发除去溶剂和过量的 SOCl₂得到第三中间产物 D10，不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 10的合成 (路线 10 )：阿糖胞苷盐酸盐（ 1.4 g, 5 mmol ) 和第三中间产物 D10 ( 1.92 g, 6.0 mmol )溶于 DMF ( 12 ml) ，室温搅拌 2天。蒸馏除去 DMF。油状物加 25 ml乙酸搅拌固化，共三次。得到的半固体粗产品用 10 ml, 1 mol/L的 NaHC0₃水溶液中和。过滤，所得固体用水洗至中性，用 60 ml乙酸乙酯重结晶，过滤出固体，然后通过柱层析色谱提纯（硅胶，展开剂：二氯曱烷 /曱醇 =5/1 ) , 得到阿糖胞苷前药衍生物 10 ( 118.0mg) , LC ( UV 254 nm)纯度 >90%。 LC-MS mz 528 [M + H]⁺ (分子式 C₂₅H₄₁N₃O₉, 分子量 527)。合成路线 11:

11

第一中间产物 Bll的合成（路线 11) ：己二酸 ( 1.276 g, 11 mmol)溶于甲醇（2.42 g, 13 mmol) , 控制温度 40。C, 反应 4个小时。得到的第一中间产物 B11 (己二酸单曱酯）不经进一步純化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 11的合成（路线 11 )：阿糖胞苷（ 1 g, 4.1 mmol) , 第一中间产物 Bl 1 (己二酸单曱酯）（ 0.72 g, 4.1 mmol ) , PyBOP( 2.35 g, 4.5 mmol ) 和 DMAP (0.055 g, 0.41 mmol) 溶于 DMF ( 10 ml) ，室温搅拌 12小时。反应液通过柱层析色谱提纯（硅胶，展开剂：二氯甲烷 /甲醇 =10/1 ) , 得到阿糖胞苷前药衍生物 11 (58.6mg) , LC ( UV 254 nm )纯度 >95%。 LC-MS 々386 [M + H]⁺ (分子式 C₁₆H₂₃N₃O₈, 分子量 385 ) 。

12 第一中间产物 B12的合成（路线 12) ：己二酸酐（ 1.276 g, 11 mmol)溶于乙醇（2.42 g, 13 mmol) , 控制温度 40。C, 反应 4个小时。得到的第一中间产物 B12 (己二酸单乙酯）不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 12的合成（路线 12) ：阿糖胞苷（ 1 g， 4.1 mmol) , 第一中间产物 Β12(己二酸单乙酯）（0.8 g, 4.1 mmol), PyBOP(2.35 g, 4.5 mmol ) 和 DMAP (0.055 g, 0.41 mmol) 溶于 DMF ( 10 ml ) , 室温搅拌 12小时。反应液通过柱层析色谱提纯（硅胶，展开剂：二氯曱烷 /曱醇 =10/1 ) ，得到阿糖胞苷前药衍生物 12 ( 47.9 mg ) ， LC ( UV 254 nm )纯度〉 95%。 LC-MS m/z 400 [M + H]⁺ (分子式 C₁₇H₂₅N₃O₈, 分子量 399 ) 。

ol)溶于甲醇（2.42 g, 13 mmol) ，控制温度 40 。C，反应 4个小时。得到的第一中间产物 B13 (丁二酸单甲酯）不经进一步纯化，直接用于下一步反应

第三中间产物 D13的合成（路线 13 )：第一中间产物 B13 ( 726 mg, 5.5 mmol ) , SOCl₂ (1.31 g, 11 mmol)和 1滴 DMF溶于二氯曱烷（ 10 ml )，加热回流 3小时。减压旋转蒸发除去溶剂和过量的 SOCl₂得到第三中间产物 D13, 不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 13的合成 (路线 13 )：阿糖胞苷盐酸盐（ 1.4 g, 5 mmol ) 和第三中间产物 D13 ( 820 mg, 5.5 mmol) 溶于 DMF ( 10 ml) ，室温搅拌 2 天。蒸馏除去 DMF。油状物加乙艇搅拌固化。得到的半固体粗产品用 NaHCO₃ 水溶液中和。旋干，固体溶于曱醇，过滤除去不溶物。然后通过柱层析色谱提纯（硅胶，展开剂：二氯曱烷 /曱醇 =4/1 ) ，得到阿糖胞苷前药衍生物 13 ( 128.4 mg ), LC( UV 254 nm )纯度 >90%。 LC-MS m/z 358 [M + H]⁺(分子式 C₁₄H₁₉N₃O₈, 分子量 357) 。合成路线 14:

第二中间产物 C14的合成（路线 14) ：将如上合成路线中的 2, 6-二甲基氨基苯（1.21 g, lOmmol)溶于 10毫升 THF, 然后加入戊二酸酐（ 1.14 g, lOmmol) 和 DMAP (0.12 g， 1 mmol) ， 50°C反应 5小时，减压蒸干滤液，所得第二中间产物 C14不经纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 14的合成 (路线 14 )：将阿糖胞苷（ 2.43 g, 10 mmol ) , 第二中间产物 C14 (2.35 g, 10 mmol) , PyBOP (5.7 g, 11 mmol)和 DMAP ( 0.12 g, 1 mmol )溶于 DMF ( 10 ml) ，室温搅拌 24小时。反应液通过柱层析色谱提纯（硅胶，展开剂：二氯甲烷 /曱醇 =10/1 ) , 得到阿糖胞苷前药衍生物 14 ( 139.4 mg ) , LC ( UV 254 nm )纯度 >95% )。 LC-MS m/z 461 [M + H]+ (分子式 C₂₂H₂₈N₄O₇, 分子量 460) 。

第二中间产物 C15的合成（路线 15):将上述路线 15中的环烷基苯并咪唑（0.53 g ， 2.1 mmol) ，丁二酸酐（ 0.25 g ， 2.5 ml ) 与 DMAP ( 0.2 g , 1.6 mmol)溶于四氢呋喃（20 ml) 中，控制温度 35。C, 反应 3个小时。倒入水中，析出固体，过滤所得固体的第二中间产物 C15不经进一步纯化，直接用于下一步反应。阿糖胞苷前药衍生物 15的合成（路线 15) ：阿糖胞苷（0.39g， 1.6 mmol) ，第二中间产物 C15 ( 0.47 g, 1.3 mmol ) , PyBOP ( 0.84 g, 1.5 mmol )和 DMAP ( 0.055 g, 0.41 mmol ) 溶于 DMF ( 10 ml ) , 室温搅拌过周末。反应液倒入水中，析出固体，得到阿糖胞苷前药衍生物 15 ( 104.8 mg) , LC ( UV 254 nm ) 纯度 >99%。 LC-MS w¾ 599 [M + Na]+ (分子式 C₂₅H₂₉ClN₆O_s，分子量 576)。合成路 16

第一中间产物 B16的合成（路线 16) ：将正癸醇（4g, 26 mmol )溶于 20毫升四氢呋喃中，然后加入戊二酸酐（ 2.5 g, 22 mmol ), 60 °C下搅拌反应 4小时。得到的第一中间产物 B16不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 16的合成（路线 16): 阿糖胞苷（ 1 g, 4.1 mmol), 第一中间产物 B16 ( 1.36 g, 5 mmol ), PyBOP ( 2.35 g, 4.5 mmol ), 和 DMAP ( 0.055 g, 0.45 mmol )溶于 DMF ( 10 ml) 中，室温下搅拌 12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体再通过柱层析色语提纯（硅胶，展开剂：二氯曱烷 /曱醇 =15/1 ), 得到阿糖胞苷前药衍生物 16 (70.2 mg)。 LC ( UV 254 nm ) 纯度 97%。 LC-MS m/z 498 [M + H]⁺ (分子式 C₂₄H₃₉N₃O₈, 分子量 497 )。合成路线 17

HO

第一中间产物 B17的合成（路线 17): 戊二酸酐（2.28 g, 20 mmol ) 与正十四醇（4.28g， 20 mmol ) 混合，加热融熔，反应 4小时，冷却，得白色固体的第一中间产物 B17, 不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 17的合成（路线 17): 阿糖胞苷（ 1 g, 4.1 mmol), 第一中间产物 B17( 1.48 g， 4.5 mmol ), PyBOP(2.35 g, 4.5 mmol ),和 DMAP(0.055 g, 0.45 mmol )溶于 DMF ( 10 ml) 中， 40 °C下搅拌 12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体再通过柱层析色普提纯（硅胶，展开剂：二氯甲烷 /曱醇 =15/1 ), 得到阿糖胞苷前药衍生物 17 (31.6mg)。 LC ( UV 254 nm ) 纯度 95%。 LC-MS m/z 554 [M + H]⁺ (分子式 C₂₈H₄₇N₃O_s，分子量 553 )„ 合成路线 18:

第一中间产物 B18的合成（路线 18): 戊二酸酐（0.51 g, 4.5 mmol)与正十六醇（1.2 g, 4.9 mmol ) 混合，加热融熔，反应 4个小时，冷却，得白色固体的第一中间产物 B 18, 不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 18的合成（路线 18): 阿糖胞苷（ 1 g， 4.1 mmol ), 第一中间产物 B18 ( 1.6 g, 4.5 mmol ), PyBOP ( 2.35 g, 4.5 mmol ), 和 DMAP ( 0.055 g, 0.45 mmol )溶于 DMF ( 10 ml) 中， 60°C下搅拌 12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体再通过柱层析色普提純（硅胶，展开剂：二氯曱烷 /曱醇 =15/1)，得到阿糖胞苷前药 4汙生物 18 ( 166.7 mg)。 LC ( UV 254 nm )纯度 97%。 LC-MS m/z 604 [M+Na]⁺ (分子式 C₃₀H₅₁N₃O₈, 分子量 581)。

第一中间产物 B19的合成（路线 19): 戊二酸酐（2.24 g， 19.6 mmol) 与正十八醇（5.4g， 20 mmol)混合，加热融熔，反应 4个小时，冷却，得白色固体的第一中间产物 B 19, 不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 19的合成（路线 19): 阿糖胞苷（ 1 g, 4.1 mmol), 第一中间产物 B19 ( 1.73 g, 4.9 mmol )， PyBOP ( 2.35 g, 4.5 mmol )，和 DMAP ( 0.055 g, 0.45 mmol )溶于 DMF (10 ml) 中， 50°C下搅拌 12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体再通过柱层析色普提純（硅胶，展开剂：二氯甲坑 /曱醇 =15/1), 得到阿糖胞苷前药衍生物 19 ( 149.6 mg)。 LC ( UV 254 nm )纯度 99%。 LC-MS m/z 632 [M+Na (分子式 C₃₂H₅₅N₃O₈，分子量 609 )。合成路线 20:

第一中间产物 B20的合成（路线 20): 将正癸醇（0.77 g, 4.9 mmol) 溶于 20 毫升四氢呋喃中，然后加入二甘醇酐（0.52 g, 4.5 mmol), 回流搅拌反应 4小时，得到的第一中间产物 B20不用进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 20的合成（路线 20): 阿糖胞苷（l g, 4.1 mmol), 第一中间产物 B20 ( 1.23 g, 4.5 mmol ), PyBOP ( 2.35 g， 4.5 mmol )，和 DMAP ( 0.055 g, 0.45 mmol )溶于 DMF ( 10 ml) 中， 40 °C下搅拌 12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体通过柱层析色谱提纯（硅胶，展开剂：二氯曱烷 /曱醇 =15/1 ), 得到阿糖胞苷前药衍生物 20 ( 31.3 mg )。 LC ( UV 254 nm ) 纯度 97%。 LC-MS m/z 500 [M + H]⁺ (分子式 C₂₃H₃₇N₃O₉, 分子量 499 )。合成路线 21:

_A O

第一中间产物 B21的合成（路线 21 ): 二甘醇酐（0.52 g， 4.5 mmol)与十四醇 ( 1.05 g, 4.9 mmol ) 混合，加热融榕，反应 4小时，冷却，得白色固体的第一中间产物 B 21, 不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 21的合成（路线 21 ): 阿糖胞苷（ 1 g， 4.1 mmol), 第一中间产物 B21 ( 1.48 g, 4.5 mmol ), PyBOP ( 2.35 g， 4.5 mmol )，和 DMAP ( 0.055 g, 0.45 mmol )溶于 DMF ( 10 ml ) 中， 50°C下搅拌 12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体通过柱层析色谱提纯（硅胶，展开剂：二氯曱烷 /曱醇 =15/1 ), 得到阿糖胞苷前药衍生物 21 ( 101.2 mg )。 LC ( UV 254 nm )纯度 95%。 LC-MS m/z 556 [M + H]⁺ (分子式 C₂₇H₄₅N₃O₉，分子量 555 )。

第一中间产物 B22的合成（路线 22 ): 二甘醇酐（0.52 g, 4.5 mmol )与十六醇 ( 1.19 g, 4.9 mmol ) 混合，加热融熔，反应 4小时，冷却，得白色固体的第一中间产物 B 22 , 不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 22的合成（路线 22 ): 阿糖胞苷（ l g， 4.1 mmol ), 第一中间产物 B22 ( 1.6 g, 4.5 mmol ), PyBOP ( 2.35 g, 4.5 mmol ), 和 DMAP ( 0.055 g, 0.45 mmol )溶于 DMF ( 10 ml )中， 60 °C下搅拌 12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体通过柱层析色语提纯（硅胶，展开剂：二氯曱烷 /曱醇 =15/1 )，得到阿糖胞苷前药 4汙生物 22 ( 62.9 mg )。 LC ( UV 254 nm ) 纯度 95%。 LC-MS m/z 606 [M + Na]⁺ (分子式 C₂₉H₄₉N₃0₉, 分子量 583 )。合成路线 23:

第一中间产物 B23的合成（路线 23 ): 二甘醇酐（0.52 g, 4.5 mmol )与十八醇 ( 1.33g, 4.9 mmol ) 混合，加热融熔，反应 4小时，冷却，得白色固体的第一中间产物 B 23，不经进一步纯化，直接用于下一步反应。

阿糖胞苷前药衍生物 23的合成（路线 23 ): 阿糖胞苷（l g, 4.1 mmol ), 第一中间产物 B23 ( 1.74 g, 4.5 mmol ), PyBOP ( 2.35 g 4.5 mmol )，和 DMAP ( 0.055 g, 0.45 mmol )溶于 DMF ( 10 ml ) 中，室温下搅拌 12小时。反应液倒入水中，析出固体，固体通过柱层析色谱提纯（硅胶，展开剂：二氯曱烷 /曱醇 =15/1 ), 得到阿糖胞苷前药 4汙生物 23 ( 43.2 mg )。 LC ( UV 254 nm ) 纯度 95% LC-MS m/z 612 [M + H]⁺ (分子式 C₃₁H₅₁N₃O₉, 分子量 611 )。生物活性：

本发明所涵盖的阿糖胞苷前药衍生物具有抑制肿瘤细胞增生的功能，以及抗肿瘤作用。肿瘤细胞癌症包括但不限于血癌、肠癌、皮肤癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、子宫癌、脑瘤、色素瘤、前列腺癌等。合成药物肿瘤细胞毒性实臉搮作规程

本发明的阿糖胞苷前药衍生物及其制剂对肿瘤细胞的抑制作用试验

1. 试验材料

1) 细胞株：

HL-60细胞株，悬浮生长，用含 10%胎牛血清（Hyclone公司）的 RPMI 1640 细胞培养基培养，常规培养保持初始细胞浓度在 3*10⁵/ml左右，三天一次 1 : 3 传代。实验前一天传代（ 5* 10⁵/ml ) ，实验时细胞浓度在 7.5~10*10⁵/ml之间。

BEL-7402细胞株和 HT-29细胞株，贴壁生长，用 10%胎牛血清（ Hyclone公司 ) 的 D-MEM细胞培养基培养，常规培养初始细胞浓度在 3*10⁵/ml左右， 2〜3 天 1 : 3传代一次。实验前一天 1 : 2传代，实验时细胞浓度在 5~10*10⁵/ml之间。

2) 药物的溶解与稀释：根据提供的阿糖胞苷前药衍生物的重量和分子量，首先加入 DMSO 100~200 μΐ, 然后加入 NS , 使稀释后得到的药物浓度为 5 mM (注意 DMSO终浓度不超过 10% ) 。

3) D-MEM或 RPMI 1640细胞培养基， Gibco公司

4) 胎牛血清， Hyclone公司

5) 细包消化液， 0.25 % Trypsin + 0.02 % EDTA

6) PBS磷酸盐緩冲液

7) MTT液， MTT干粉 (Sigma), 用 PBS充分溶解配成 5 mg/ml, 0.22 μπι微孔滤-膜过滤后分装， -20 °C保存

8) 10 %酸化 SDS, 0.01N HC1

9) 离心管、吸管等（BD公司）， 96孔板（Costar公司）

2. 步骤：

1) 细胞接种：传代后 24小时的细胞，生长状态良好。常规收获细胞，用新鲜培养液调整细胞浓度为 2xl0⁵/ml (贴壁细胞 ) ~3xl0⁵/ml (悬浮细胞 )。贴壁细胞接种 100 μΐ/孔， 37 °C、 5%CO₂孵箱中培养 24 h后弃去旧培养液，加入新鲜培养液 95 μΐ/孔。悬浮细胞直接接种 95 μΐ/孔。

2) 药物处理：每一药物设 6个浓度梯度，每一浓度设 3个复孔，药物空白对照组设 5个复孔。每次试验同时做 Ara-C对照。 HT-29和 BEL-7402 细胞加入药物的浓度依次为 5、 2.5、 1.25、 0.625、 0.3125、 0.16 mM, 每孔 5 μ1, 终浓度依次为 0.25、 0.125、 0.0625、 0.03125、 0.016、 0.008 mM, 对照组加入 5 μΐ生理盐水； HL-60细胞加入药物的浓度依次为 5xl(T³、 2.5xl0—³、 1.25xl0—³、 0.625xl0—³、 0.3125x10— ³、 0.16x10— ³ mM, 对应终浓度依次为 2.5χ10^-4、 1.25χ10^-4、 6·25χ10^-5、 3·125χ10^-5、 1·6χ10^-5、 8xlO"⁶mM, 对照组加入 5 μΐ生理盐水。

3) 细胞培养与检测：加入药物后， 37。C、 5%C0₂孵箱中培养 72h, 然后每孔加入 MTT 10 μ1，继续培养 4 h,每孔加 100 μΐ 10%SDS (含 0.01N HC1 ) 溶解， 24 h后用 Bio-rad 680型 ELISA读数仪测定各孔吸光度（ A ) , 检测波长为 570nm、参考波长为 630nm。

4) 计算：首先平均各复孔的吸光度（去除过于悬殊的数据），计算每种细胞每个药物浓度下的抑制率 (IR)， IR(%)=(1- A_n/A₀) l00%, A_n为实验孔平均吸光度， A。为药物空白对照孔平均吸光度。用 EXCEL软件，绘制药物浓度效应曲线，选择合理的计算方法计算 50%细胞存活的药物浓度 (IC₅₀) 。

图 5是阿糖胞苷前药衍生物抑制 BEL-7402肝癌细胞株的药物浓度-抑制率曲线图，其中， JF001、 JF017、 JF019、 JF020和 JF033分别为根据上述合成路线 1、 17、 19、 20和 33合成得到的阿糖胞苷衍生物。

表 1-2列举了代表性阿糖胞苷前药衍生物抑制不同肿瘤细胞的生物活性。其中， JF004、 JF006、 JF007、 JF009、 JF010、 JF013、 JF014和 JF021分别为根据上述合成路线 4、 6、 7、 9、 10、 13、 14和 21合成得到的阿糖胞苷衍生物。

0.06 18.62 19.46 20.01 对肠癌抑制率高于阿糖胞苷，其它

JF010 类似

表 2、代表性阿糖胞苷前药衍生物的肿瘤细胞活性

Claims

权利要求书

1、阿糖胞苷前药衍生物，其特征在于：所述阿糖胞苷前药衍生物是具有下述通式（I) 、（II) 、 (III) 中的任意一种通式的化合物：

通式 -III 其中， w表示 c=o、 S(O)O和 C(O)O中的任意一种基团；

其中， Y表示（ CH₂ ) n或 H₂C-O-CH₂ ，其中， n=2~6;

X表示 OH、 O-P OXOR^和磷 §tt中的任意一种基团，所述磷 §tt为单磷酸基、二磷酸基和三磷酸基中的任意一种；

R¹, R²是 __1S饱和的或不饱和的脂肪基团，所述不饱和的脂肪基团中含有一个或多个不饱和健，所述不饱和健包括顺式或反式异构体； A表示 O或 S或 CH₂或无基团;

2、根据权利要求 1 所述的阿糖胞苷前药衍生物，其特征在于： R¹ 是 H、 C_1-18烷基、 C_3-18环烷基，苄基，苯基和芳环基中的任意一种； ²是11、 d-C₁₈ 烷基、 C_3-18环烷基、 C_2-18烯基、 C₂_₁₈炔基，环烯基，苄基，苯基、芳香基，环氨基、碳环基、杂环基，苯胺基和取代苯胺基中的任意一种。

3、根据权利要求 1或 2所述的阿糖胞苷前药衍生物，其特征在于：所述阿糖胞苷前药衍生物是通式（I ) 中的 X=OH时的阿糖胞苷前药衍生物。

4、根据权利要求 1或 2所述的阿糖胞苷前药衍生物，其特征在于：所述阿糖胞苷前药衍生物是通式（ II ) 中的 X=OH时的阿糖胞苷前药衍生物。

5、根据权利要求 1或 2所述的阿糖胞苷前药衍生物，其特征在于：所述阿糖胞苷前药衍生物是通式（III ) 的阿糖胞苷前药衍生物。

6、根据权利要求 3所述的阿糖胞苷前药衍生物，其特征在于：所述通式（ I ) 的阿糖胞苷前药衍生物包括具有下述结构式的代表性化合物：

、根据权利要求 4所述的阿糖胞苷前药衍生物，其特征在于：所述通式（ II ) 的阿糖

8、

于：所述通式（ III ) 的阿糖胞苷前：

9、阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，其特征在于：

( 1 ) 酸酐化合物与脂肪醇混和，加热回流或室温搅拌，反应 3~5个小时，冷却得到的第一中间产物（B ) 不经进一步纯化，直接用于下一步反应；

( 2 ) 阿糖胞香，第一中间产物（B ) , PyBOP和 DMAP溶于 DMF，室温 ~60°C搅拌 7~24小时，得到反应液通过柱层析色豫提纯，得到通式（I )的阿糖胞苷衍生物。

10、根据权利要求 9所述的阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，其特征在于：所述酸酐化合物为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一种；所述脂肪醇为甲醇、乙醇、正辛醇、月桂醇、正癸醇、正十四醇、正十六醇和十八醇中的任意一种。

11、阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，其特征在于：

( 1 )将 2， 6-二曱基氨基苯或环烷基苯并咪唑、酸酐化合物和 DMAP溶于四氢呋喃，控制温度 35〜50°C反应 3~5小时，析出固体，所得第二中间产物（C ) 不经纯化，直接用于下一步反应；

( 2 )将阿糖胞香，第二中间产物（C ) ， PyBOP和 DMAP溶于 DMF，室温搅拌 12~24小时，反应液倒入水中，析出固体或将反应液通过柱层析色谱提纯，得到通式（Π ) 的阿糖胞苷前药衍生物。

12、根据权利要求 11所述的阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，其特征在于：所述酸酐化合物为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一种。

13、阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，其特征在于：

( 2 ) 第一中间产物（B ) , SOCl₂和 1~2滴 DMF溶于二氯甲烷，加热回流 3〜4小时，旋转蒸发减压除去溶剂和过量的 S0C1₂得到第三中间产物（D ) , 不经进一步纯化，直接用于下一步反应；

( 3 ) 阿糖胞苷盐酸盐和第三中间产物（ D )溶于 DMF, 室温搅拌 2〜4天，减压蒸馏除去 DMF 后得到的油状物加乙醚搅拌固化，得到的半固体产品用 NaHCO₃水溶液中和、过滤、，所得固体用水洗至中性后用乙酸乙酯重结晶、过滤或所得固体溶于甲醇，过滤除去不溶物，然后通过柱层析色语提纯，得到通式（III ) 的阿糖胞苷衍生物。

14、根据权利要求 13所述的阿糖胞苷前药衍生物的合成路线，其特征在于：所述酸酐化合物为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一种；所述脂肪醇为曱醇、乙醇、正辛醇、正癸醇、月桂醇，正十四醇、正十六醇和十八醇中的任意一种。

15、阿糖胞苷前药衍生物制剂的制备方法，其特征在于：

16、根据权利要求 15的一种制备阿糖胞苷前药衍生物制剂的方法，其特征在于：所述有机溶剂是乙醇、丙二醇、甘油、甘油酯、多聚乙二醇、 N，N-二甲基曱酰胺和二甲基亚砜中的任意一种或多种的组合溶剂。

17、阿糖胞苷前药衍生物制剂，其特征在于：是由权利要求 15的阿糖胞苷前药衍生物制剂的制备方法制备得到的产品。

18、权利要求 1的阿糖胞苷前药衍生物在抗癌抗肿瘤中的用途。

19、根据权利要求 18的阿糖胞苷前药衍生物在抗癌抗肿瘤中的用途，其特征在于：癌症包括白血病、固体瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌和腎癌。

20、权利要求 17 的阿糖胞苷前药衍生物制剂在抗癌抗肿瘤中的用途。

21、根据权利要求 20的阿糖胞苷前药衍生物制剂在抗癌抗肿瘤中的用途，其特征在于：癌症包括白血病、固体瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌和肾癌。

22、根据权利要求 20 的阿糖胞苷前药衍生物制剂在抗癌抗肿瘤中的用途，其特征在于：所述阿糖胞苷前药衍生物制剂与其他化疗药物联合用在抗癌抗肿瘤中，所述其他化疗药物包括烷化剂、植物生物碱类、抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、铂类药物、抗代谢类及其它已知的抗癌药物。

23、根据权利要求 22 的阿糖胞苷前药衍生物制剂在抗癌抗肿瘤中的用途，其特征在于：在所述联合用药过程中，包括运用至少一种具有权利要求 6、 7 和 8所列举的代表性的阿糖胞苷前药衍生物。