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CN101374957A - 残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定方法 - Google Patents

残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定方法 Download PDF

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CN101374957A
CN101374957A CNA2007800032405A CN200780003240A CN101374957A CN 101374957 A CN101374957 A CN 101374957A CN A2007800032405 A CNA2007800032405 A CN A2007800032405A CN 200780003240 A CN200780003240 A CN 200780003240A CN 101374957 A CN101374957 A CN 101374957A
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CN
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lipoprotein
cholesterol
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sterol esterase
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CNA2007800032405A
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荻原富美子
新见学
中野隆光
金谷一司
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JIMRO Co Ltd
Original Assignee
JIMRO Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种操作更为简便且敏感度良好的测定试样中的残粒样脂蛋白中的胆固醇的方法和测定试剂。一种残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定方法，通过使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶作用于含有脂蛋白的被检试样，测定由酶反应生成的过氧化氢或还原型辅酶，来测定脂蛋白中的胆固醇，其特征在于，使用分子中具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系高分子表面活性剂。

Description

残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定方法
技术领域
本发明涉及临床检查中成为动脉硬化症等的危险因素的残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定方法及测定试剂。
背景技术
临床检查中，高密度脂蛋白(HDL)中的胆固醇，作为动脉硬化症的危险因素的负因素，低密度脂蛋白(LDL)中的胆固醇作为动脉硬化症的危险因素的正因素，在临床检查的领域中经常被测定。
近年来，像残粒样脂蛋白这样的，由于脂质的代谢等引起而生成的脂蛋白中的胆固醇，作为动脉硬化症的危险因素，显示出成为比LDL中的胆固醇更为紧密的指标，有效测定生物体试样中的脂蛋白中的残粒样脂蛋白中的胆固醇正成为课题。
关于残粒样脂蛋白中的胆固醇的酶测定法，报道了通过在胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶中添加用于分解磷脂的酶，并根据情况再添加表面活性剂的测定方法(例如，参照专利文献1)。
但是，这些方法中，从酶反应的选择性、简便性方面来说，未必能说是充分的。
专利文献1：特开平2001-231597号公报
发明内容
本发明的目的在于提供操作更为简便且敏感度良好的测定试样中的残粒样脂蛋白中的胆固醇的方法及测定试剂。
本发明人鉴于这种情况，研究了使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶测定脂蛋白中的胆固醇时的各种条件，发现可以通过使用特定的表面活性剂从含有高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、乳糜微粒(CM)、超低密度脂蛋白(VLDL)、CM残粒、VLDL残粒、中密度脂蛋白(IDL)残留等的脂蛋白的生物体试样中选择性地高敏感度地测定残粒样脂蛋白中的胆固醇，从而完成了本发明。
即，本发明涉及一种残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定方法，通过使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶作用于含有脂蛋白的被检试样，测定由酶反应生成的过氧化氢或还原型辅酶，从而测定脂蛋白中的胆固醇，其特征在于，使用分子中具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系高分子表面活性剂。
而且本发明还涉及残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定试剂，其含有胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶，以及分子中具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系高分子表面活性剂。
通过使用本发明的测定方法和测定试剂，可以通过极为简便的方法敏感度良好地测定残粒样脂蛋白中的胆固醇。
附图说明
图1：是表示使用本发明品1时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图2：是表示使用本发明品2时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图3：是表示使用本发明品3时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图4：是表示使用本发明品4时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图5：是表示使用本发明品5时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图6：是表示使用本发明品6时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图7：是表示使用比较品1时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图8：是表示使用比较品2时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图9：是表示使用比较品3时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图10：是表示使用比较品4时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图11：是表示使用比较品5时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图12：是表示使用比较品6时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图13：是表示使用比较品7时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图14：是表示使用比较品8时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图15：是表示由本发明的测定方法求得的吸光度值(纵轴)和使用市售的RLP-胆固醇测定试剂盒获得的值(横轴)之间的相互关系的图。
图16：是表示由本发明的测定方法求得的吸光度值(纵轴)和使用市售的RLP-胆固醇测定试剂盒获得的值(横轴)之间的相互关系的图。
图17：是表示由本发明的测定方法求得的吸光度值(纵轴)和使用市售的RLP-胆固醇测定试剂盒获得的值(横轴)之间的相互关系的图((A)：未添加抗apoB-100抗体，(B)添加抗apoB-100抗体)。
具体实施方式
本发明的测定方法为：通过使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶，以及分子中具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系高分子表面活性剂作为试剂，使它们作用于含有脂蛋白的被检试样，测定由酶反应生成的过氧化氢或还原型辅酶，来测定脂蛋白中的胆固醇。
本发明的酶反应在水性介质中进行，但特别优选在缓冲液中进行。
作为在缓冲液中使用的缓冲剂，可以列举，例如三(羟甲基)氨基甲烷、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂和Good’s缓冲剂等。作为Good’s缓冲剂，可以列举，N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、N，N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-[N，N-双(2-羟基乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(以下称为MOPS)、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-N，N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-N，N’-双(2-羟基丙烷-3-磺酸)(POPSO)等。
缓冲液的pH为4～10，优选5～9。缓冲液的使用浓度优选为5～500mM，更优选10～200mM，特别优选20～100mM。
作为胆固醇酯酶，如果是具有水解胆固醇酯的能力的酶，则没有特别的限定，可以列举来源于微生物或动物的胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶等。已知这种酶的很多除了该酯酶活性之外，还同时具有脂蛋白脂肪酶活性。本发明中，优选使用至少一种与胆固醇酯酶活性相比，脂蛋白脂肪酶活性更强的胆固醇酯酶。
具体而言，优选使用至少一种以上的脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性)为12～7000，优选20～1000，更优选28～800的胆固醇酯酶，通过使用这种酯酶，可以提高该酶对残粒样脂蛋白的选择性。而且，所谓脂蛋白脂肪酶活性，表示由使用橄榄油乳剂的脂蛋白脂肪酶活性分析法计算时的活性单位(HoriuchiY.et al，J Biochem 1976；80：367-370)，所谓胆固醇酯酶活性，表示由使用胎儿牛血清的CEN活性分析法计算出的活性单位(Kameno Y.et al，Jap J Clin Path 1976；24：650)。
作为具有这种活性比率的胆固醇酯酶，可以列举例如LP(旭化成制药公司制，活性比率460～800)、LPBP(旭化成制药公司制，活性比率5600～6900)、CEN(旭化成制药公司制，活性比率13.0～16.0)、CE(天野酶社制，活性比率13.0～16.0)、COE311(东洋纺社制，活性比率28.0～35.0)或与它们具有同等活性比率的酶，更优选将它们组合使用。具体可以列举，CEN和LP、COE311和LP等的组合。
作为胆固醇氧化酶，如果是具有氧化胆固醇而生成过氧化氢的能力的酶，则没有特别的限定，可以列举，例如微生物或动物来源的胆固醇氧化酶。
作为胆固醇脱氢酶，如果是具有氧化胆固醇而还原氧化型辅酶的能力的酶，则没有特别的限定，可以列举，例如微生物或动物来源的胆固醇脱氢酶。
而且，这些酶，可以是为了使该酶的特异性、稳定性进一步提高，在以聚乙二醇作为主要成分的基团、水溶性的寡糖残基、磺丙基等上进行化学修饰的酶，而且，也可以是通过基因操作获得的具有同等活性的改良酶。
上述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和胆固醇脱氢酶的使用量，在反应液中均优选0.01～200U/ml、更优选0.1～100U/ml。
作为分子中具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系高分子表面活性剂，可以是能够提高胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶对于残粒样脂蛋白的选择性的表面活性剂，换言之，可以是通过提高该酶对残粒样脂蛋白的作用，或者使该酶对残粒样脂蛋白之外的脂蛋白的作用降低，从而使对残粒样脂蛋白的酶反应相对地增强的表面活性剂。作为分子中具有苯磺酸结构的表面活性剂，可以优选列举，例如，月桂基苯磺酸、十二烷基苯磺酸等的烷基苯磺酸、聚苯乙烯磺酸、烷基二苯醚二磺酸或它们的盐类等，作为盐类，可以列举例如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐等。具体而言，可以优选列举例如NEWREX R(烷基苯磺酸钠；日本油脂)、NEOPELEX No.6、NEOPELEX No.25(十二烷基苯磺酸钠；花王)、PELEX SS-L(烷基二苯醚二磺酸钠；花王)、聚苯乙烯磺酸钙(三和化学)等，其中，从提高酶反应的选择性的方面出发，特别优选使用NEWREX R、PELEX SS-L。
作为聚丙烯酸系高分子表面活性剂，可以列举聚丙烯酸盐、交联型聚丙烯酸盐、聚丙烯酸盐共聚物等，作为盐，可以列举钠盐、钾盐等，特别优选钠盐。具体而言，可以列举，例如Jurymer AC-103(聚丙烯酸钠；日本纯药)、JurymerAC-20N(聚丙烯酸钠共聚物；日本纯药)、Rheogic252L、Rheogic 306L(交联型聚丙烯酸钠；日本纯药)等，这其中优选Jurymer AC-103。
这种表面活性剂的使用浓度没有特别的限定，优选0.001～10％，更优选0.01～5％，特别优选0.05～1％。
而且，本发明的测定方法中，进而优选联合使用与正常的脂蛋白中所含的载脂蛋白B-100反应、而不与变性的载脂蛋白B-100反应的抗apoB-100抗体。由此可以抑制与残粒样脂蛋白之外的脂蛋白的酶反应，可以相对地增强与残粒样脂蛋白的酶反应。这种抗apoB-100抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，例如，优选抗人apoB-100小鼠单克隆抗体(JI-H、JIMRO公司制)。
这种抗体的使用浓度没有特别的限定，但优选0.01～10mg/mL，更优选0.1～5mg/mL。
而且，抗apoB-100多克隆抗体可以按以下方式制备。也就是说，作为免疫原使用的正常人血清LDL，可以使用用常规方法纯化的产品，例如，可以按照超离心法(续生化学实验讲座3“膜脂质和血浆脂蛋白”597-612p)适当调制。然后，对于人之外的动物，单次乃至数次免疫这种纯化的LDL，在血清中的抗体效价上升时取血，可以以抗血清的形式获得。而且，该抗血清中存在与残粒样脂蛋白反应的抗体时，根据需要，通过添加残粒样脂蛋白，吸收该脂蛋白，可以在测定中使用这种抗血清。
而且，作为抗apoB-100单克隆抗体的制备步骤，首先，以上述正常人血清来源的纯化LDL作为抗原，使其与弗氏佐剂等混合，对小鼠进行数次免疫，使免疫终止后摘出的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞(例如，NS-1细胞等)融合，制备杂交瘤，获得克隆(特公平4-53516号公报)。产生目的抗体的克隆的检索，可以通过比较对于上述正常人纯化LDL和高脂血症患者来源的纯化LDL的结合性，选择与正常人纯化LDL较强结合的杂交瘤，来获得目的克隆。本实施例中使用的单克隆抗体JI-H按照该步骤制备。
而且，免疫动物还可以根据需要使用小鼠之外的动物，例如大鼠等。此时，作为骨髓瘤细胞，可以优选使用Y3、Ag123细胞等。
本发明的测定方法中，使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶时，通过胆固醇的反应由氧生成过氧化氢。可以在例如过氧化酶的存在下，使用4-氨基安替比林和苯酚类，4-氨基安替比林和Trinder试剂或高敏感度的色素源来定量生成的过氧化氢。
作为苯酚类，可以列举例如苯酚、4-氯酚、间甲酚、3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
作为Trinder试剂(同仁化学研究所第19版综合索引，2002年)，可以列举N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-甲苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-磺丙基-m-甲苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基-m-甲苯胺、N，N-二磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-m-茴香胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-茴香胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-m-3-磺丙基-3-甲氧基苯胺(APPS)、N-乙基-N-3-磺丙基苯胺(ALPS)等苯胺类或N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰基二氨基乙烷等。
作为高敏感度的色素源，可以列举特公昭60-33479号公报中所示的10-(N-甲基氨基甲酰)-3，7-双(二甲基氨基)吩噻嗪(MCDP)、特公平4-27839中所示的双[3-二(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺(BCMA)、特开昭62-296号公报中所示的化合物等。
作为这些色素源的浓度，优选0.01～10mM。
而且，使用胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶时，通过胆固醇的反应，由氧化型辅酶NAD(P)生成还原型辅酶NAD(P)H。NAD(P)H，可以通过测定300～500nm，优选330～400nm，特别优选约340nm处的反应液的吸光度来定量。而且，NAD(P)H的定量还可以通过添加黄递酶、四唑盐，使甲月替色素生成，对甲月替色素进行比色来实施。
反应在10～50℃，优选30～40℃，通常在37℃下，进行1～30分钟，优选2～10分钟。
本发明的测定方法是使上述试剂作用于被检试样的方法，如果维持被检试剂与上述表面活性剂，或与表面活性剂和正常的脂蛋白中所含的载脂蛋白B-100反应、而不与变性的载脂蛋白B-100反应的抗apoB-100抗体反应，然后胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶发生反应这样的作用顺序，则各试样的添加方法、添加顺序没有特别的限制。而且，由于反应是在水性介质中进行，因此优选在缓冲液等构成的水性介质中添加被检试样，于25℃～40℃搅拌调制后，添加本发明的试剂，使之反应1～10分钟，进行测定。
因此，本发明试剂的构成为，分别各自准备含有表面活性剂的试剂，含有表面活性剂和与正常的脂蛋白中所含的载脂蛋白B-100反应、而不与变性的载脂蛋白B-100反应的抗apoB-100抗体的试剂，含有胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶的试剂，或者也可以由它们作为一个整体来构成。分别构成时，可以将它们依次添加来使用或者也可以一次性添加来使用。
而且，上述各试剂可以是液状，也可以是片剂、粉末等固体形状。
另外，这种测定试剂中，根据需要，可以使之含有用于将生物试样中的球蛋白等蛋白质可溶化的各种盐类、脂蛋白凝集剂、其它酶等。
作为这种盐类，可以列举氯化钠，硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化镁、硫酸镁、醋酸镁、氯化锂、硫酸锂、氯化铵、硫酸铵、硝酸镁、硝酸钙等，在0～100mM的范围内使用。
作为脂蛋白凝集剂，可以列举钨磷酸盐、葡聚糖硫酸盐、肝素等的聚阴离子，镁、钙、钴等二价的金属盐。作为其它酶，可以列举抗坏血酸氧化酶等。
而且，适用于本发明的被检试样没有特别的限定，具体而言，对于生物体试样，可以使用血液本身或血浆、血清等血液成分。
实施例
以下，列举实施例对本发明进行更详细的说明。
实施例1
(1)试样的调制
将血清成分分离为残粒样脂蛋白部分，LDL部分和HDL部分，进行各脂蛋白的测定。该蛋白质的分离方法如下所示。
分别制备抗apoB-100抗体结合亲合层析柱、抗apoA-1抗体结合亲合层析柱，添加血清，回收结合部分，分别作为LDL、HDL。而且，在前述两根层析柱上添加血清，回收只流过的部分，作为残粒样脂蛋白部分(RLP)。各个脂蛋白用HPLC分析进行确认。而且，用总胆固醇测度用试剂试剂盒将各脂蛋白中的胆固醇的浓度调制为5mg/dl。
(2)测定试剂的调制
制备下述所示的残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定试剂。
表1
试剂1
Good’s缓冲剂pH6.8(PIPES，同仁化学社制)     50mM
HDAOS(同仁化学社制)                         1mM
表面活性剂(参照表1；本发明品1～2，比较品2～8)
试剂2
Good’s缓冲剂pH6.8(BES，同仁化学社制)       50mM
4-氨基安替比林(关东化学社制)                3mM
过氧化物酶(天野酶社制)                      10单位/mL
胆固醇酯酶                                  15单位/mL
(COE311：活性比率31.8、东洋纺社制)
胆固醇氧化酶(天野酶社制)                    6单位/mL
(3)测定方法·结果
将试剂1装入210μL分光光度计的小室中，添加20μL试样进行搅拌，于37℃加温。然后，在344秒后添加70μL的试剂2，进行搅拌，在主波长572nm和副波长748nm处进行测定直到667秒后。
求出添加试剂2时，即344秒后(测光点20)至667秒后(测光点38)的吸光度变化量，计算对于RLP、HDL和LDL而言以RLP的吸光度变化量为100时的相对比率。结果示于表2和图1～14中。
表2
Figure A200780003240D00121
根据表2和图1～14，本发明品1～6，与比较品1～8相比，都抑制针对LDL和HDL的酶反应，而针对RLP的酶作用的选择性显著上升了。
实施例2
然后，使用自动分析装置TBA-20R(东芝)，按照本发明测定方法测定人血清中的RLP-胆固醇量。使用NUREX R(本发明品)作为表面活性剂。
试样：人血清106样品
表3
试剂1
Good’s缓冲剂pH6.8(PIPES，同仁化学社制)      50mM
HDAOS(同仁化学社制)                          1mM
NUREX R(日本油脂社制)                        0.01％
试剂2
Good’s缓冲剂 pH6.8(BES，同仁化学社制)       50mM
4-氨基安替比林(关东化学社制)                 3mM
过氧化物酶(天野酶社制)                       10单位/mL
胆固醇酯酶                                   15单位/mL
(COE311：活性比率31.8、东洋纺社制)
胆固醇氧化酶(天野酶社制)                     6单位/mL
测定方法为，将试剂1装入210μL分光光度计的小室中，添加5μL血清进行搅拌，于37℃加温。然后，在344秒后添加在37℃下预加温的70μL的试剂2，进行搅拌，在主波长572nm和副波长748nm处进行测定直到667秒后。
求出测光点34～38(595～667秒)的吸光度(空白：测光点15～19(251～328秒))，获得与市售的RLP-胆固醇测定试剂盒(JIMRO公司制)的相互关系(图15)。根据图15确认其结果为，用本发明的测定方法求出的值与试剂盒之间有高度相关性。
实施例3
使用自动分析装置7080(日立)，通过本发明的测定方法测定人血清中的RLP-胆固醇量。而且，使用PELEX SS-L(本发明品4)作为表面活性剂，使用COE311(活性31.8)和LP(活性比率512)作为胆固醇酯酶。
试样：人血清30样品
表4
试剂1
Good’s缓冲剂pH6.5(PIPES，同仁化学社制)     50mM
HDAOS(同仁化学社制)                         1mM
PELEX SS-L                                  0.02％
试剂2
Good’s缓冲剂 pH6.5(PIPES，同仁化学社制)    50mM
4-氨基安替比林(关东化学社制)                3mM
过氧化物酶(天野酶社制)                      10单位/mL
胆固醇酯酶                                  10单位/mL
(COE311：活性比率31.8、东洋纺社制)
胆固醇酯酶                          20单位/mL
(LP：活性比率512、旭化成制药公司制)
测定方法为，将血清5μL装入分光光度计的小室中，添加210μL试剂1，进行搅拌，于37℃加温。然后，在320秒后添加70μL的试剂2，进行搅拌，在主波长570nm和副波长750nm处进行测定直到980秒后。
求出测光点33(660秒)和测光点17(340秒)的吸光度差，获得与市售的RLP-胆固醇测定试剂盒(JIMRO公司制)的相互关系(图16)。根据图16确认其结果为，用本发明法求出的值与市售的试剂盒之间有高度相关性(R＝0.9294)。
实施例4
使用自动分析装置7080(日立)，通过本发明的测定方法测定血清中的RLP-胆固醇量。
试样：人血清27样品
表5
试剂1
PIPES(pH6.8)(同仁化学社制)            50mM
胆固醇氧化酶(天野酶社制)              2U/mL
PELEX SS-L(花王社制)                  0.05％
HDAOS(同仁化学社制)                   1mM
抗apoB-100单克隆抗体
(JI-H，(株)JIMRO社制)                 1mg/mL
试剂2
BES(pH6.8)(同仁化学社制)              50mM
胆固醇酯酶(东洋纺社制)                    15U/mL
过氧化酶(天野酶社制)                      10U/mL
4-氨基安替比林(关东化学社制)              3mM
牛血清白蛋白(SIGMA-ALDRICH JAPAN公司制)   0.1％
测定条件·方法
如下述方式设定测定参数进行测定。
测定方法Rate法测试读数时机[22]-[25]
试样量：5μL
R1量：210μL
R2量：70μL
测定波长：主波长570nm
副波长：750nm
测度温度：37℃
在5μL样品中添加210μL试剂1，进行搅拌，于37℃加温。然后，在5分钟后添加70μL的试剂2，进行搅拌，在主波长570nm和副波长750nm处进行测定。求出试剂2添加后的每1分钟时的吸光度变化量，获得与市售的RLP-胆固醇测定试剂盒(JIMRO公司制)的相互关系(图17)。根据图17确认其结果为，添加apoB-100抗体的情况与未添加相比，与试剂盒之间有更高的相关性。

Claims (9)

1.一种残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定方法，通过使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶作用于含有脂蛋白的被检试样，测定由酶反应生成的过氧化氢或还原型辅酶，从而测定脂蛋白中的胆固醇，其特征在于，使用分子中具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系高分子表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，还使用与正常脂蛋白中所含的载脂蛋白B-100反应、而不与变性的载脂蛋白B-100反应的抗apoB-100抗体。
3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，使表面活性剂或使表面活性剂和抗apoB-100抗体作用于被检试样后，使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶作用，其中所述抗apoB-100抗体与正常的脂蛋白中所含的载脂蛋白B-100反应、而不与变性的载脂蛋白B-100反应。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其特征在于，作为表面活性剂，使用烷基苯磺酸、聚苯乙烯磺酸、烷基二苯醚二磺酸或它们的盐类或聚丙烯酸盐。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的测定方法，其特征在于，使用至少1种脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率为12～7000的胆固醇酯酶，其中所述活性比率是指脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性。
6.一种残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定试剂，其特征在于，含有胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶，以及分子中具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系高分子表面活性剂。
7.根据权利要求6所述的测定试剂，其特征在于，还含有与正常脂蛋白中所含的载脂蛋白B-100反应、而不与变性的载脂蛋白B-100反应的抗apoB-100抗体。
8.根据权利要求6或7所述的测定试剂，其特征在于，表面活性剂是烷基苯磺酸、聚苯乙烯磺酸、烷基二苯醚二磺酸或它们的盐类或聚丙烯酸盐。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的测定试剂，其特征在于，使用至少1种脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率为12～7000的胆固醇酯酶，其中所述活性比率是指脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性。
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