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CN103261434A - 测定对象成分的测定方法 - Google Patents

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CN103261434A CN201180059537XA CN201180059537A CN103261434A CN 103261434 A CN103261434 A CN 103261434A CN 201180059537X A CN201180059537X A CN 201180059537XA CN 201180059537 A CN201180059537 A CN 201180059537A CN 103261434 A CN103261434 A CN 103261434A
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Abstract

一种样品中的测定对象成分的测定方法，其特征在于，将样品中的测定对象成分转换成过氧化氢，在α-酮酸存在下，使用氧化发色型色原体测定所生成的过氧化氢。一种抑制过氧化物的影响的方法，其特征在于，在将样品中的测定对象成分转换成过氧化氢、使用氧化发色型色原体测定所生成的过氧化氢的测定方法中，使用α-酮酸。通过本发明的使用α-酮酸的测定方法以及抑制方法，过氧化物的影响得到抑制，能够进行正确的样品中的测定对象成分的测定。

Description

测定对象成分的测定方法
技术领域
本发明涉及样品中的测定对象成分的测定方法、测定用试剂、测定用试剂盒以及抑制过氧化物的影响的方法。
背景技术
在临床诊断中，使用全血、血清、血浆、尿等生物试样，进行生物试样中的测定对象成分的测定。生物试样中的测定对象成分通过使用酶的方法或使用抗原抗体的免疫测定法等来测定。在使用酶的生物试样中的测定对象成分的测定中，经常如下进行：通过氧化酶将测定对象成分转换成过氧化氢后，使所生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下与氧化发色型色原体反应，测定所生成的色素的吸光度。
基于该过氧化氢定量体系的生物试样中的测定对象成分的测定，由于温和的反应条件、操作的简便性等，多用于使用自动分析装置的多样品的连续测定。但是，该方法受到生物试样中存在的胆红素和血红蛋白等的影响，受到测定值低于理论值的所谓负影响而成为问题。针对该问题，至今为止报道了使用铁氰化合物的方法(例如，非专利文献1)等方法。
另一方面，在基于过氧化氢定量体系的生物试样中的测定对象成分的测定中，经常使用表面活性剂。表面活性剂用于基于酶与底物的相互作用的酶的特异性控制、基于与酶的相互作用的酶的反应性控制、样品的预处理等。其中，从其种类的多样性和获得可能性出发多采用聚氧乙烯类表面活性剂、聚氧丙烯类表面活性剂等聚氧化烯烃类表面活性剂。
但是，聚氧化烯烃类表面活性剂由于其结构容易生成过氧化物(例如，专利文献1)，所生成的过氧化物给过氧化氢定量体系带来正影响，测定值高于理论值而成为问题。特别是生物试样测定用试剂和生物试样测定用试剂盒的保存状态不充分的情况下，在这些试剂和试剂盒中，经常生成过氧化物，引起试剂和试剂盒的性能降低。
另外，在诊断用试剂盒中，含有盐、缓冲剂、酶、防腐剂等添加物的情况较多，有时由于在使用这些添加物的试剂盒制造步骤中生成或混入的过氧化物、或者长期保存中由于氧化而生成的过氧化物，给测定带来正影响。另外，也有时由于生物体中的氧化应激或酶反应等、或者给药等，在全血、血清、血浆、尿等生物试样中生成过氧化物，该过氧化物给测定带来正影响。
丙酮酸为α-酮酸中的一种，在生物体内作为糖酵解系统的中间产物生成。已知丙酮酸具有比较强的抗氧化活性(例如，专利文献2)，报道了中和细胞中的氧自由基的作用(例如，专利文献3)。
在基于过氧化氢定量体系的生物试样中的测定对象成分的测定中，正寻求过氧化物的影响能得到抑制的测定方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-204701号公报
专利文献2：日本特开2004-217932号公报
专利文献3：日本特表平9-511746号公报
非专利文献
非专利文献1：クリニカルケミストリー、26卷、2号、227-231页(1980年)
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于，提供在过氧化氢定量体系中的过氧化物的影响得到抑制的样品中的测定对象成分的测定方法、测定用试剂、测定用试剂盒以及抑制过氧化物的影响的方法。
用于解决课题的方法
本发明人为了解决本课题反复进行了深入的研究，结果得到如下见解，在将样品中的测定对象成分转换成过氧化氢并测定所生成的过氧化氢的方法中，通过使用α-酮酸，能够在不影响过氧化氢定量体系的前提下抑制过氧化物的影响，从而能够进行正确的样品中的测定对象成分的测定，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下的[1]～[20]。
[1]一种样品中的测定对象成分的测定方法，其特征在于，将样品中的测定对象成分转换成过氧化氢，在α-酮酸存在下，使用氧化发色型色原体测定所生成的过氧化氢。
[2]一种抑制样品中的测定对象成分的测定方法中的过氧化物的影响的方法，其特征在于，在将样品中的测定对象成分转换成过氧化氢、使所生成的过氧化氢与氧化发色型色原体反应的样品中的测定对象成分的测定方法中，在α-酮酸存在下进行所生成的过氧化氢与氧化发色型色原体的反应。
[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，α-酮酸为选自由丙酮酸、α-酮戊二酸以及草酰乙酸组成的组中的α-酮酸。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，氧化发色型色原体为无色型色原体。
[5]如[4]所述的方法，其中，无色型色原体为吩噻嗪衍生物。
[6]如[5]所述的方法，其中，吩噻嗪衍生物为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪。
[7]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，氧化发色型色原体为氧化偶合型色原体。
[8]如[7]所述的方法，其中，氧化偶合型色原体是偶合剂与苯胺衍生物或苯酚衍生物的组合。
[9]一种样品中的测定对象成分的测定用试剂，其特征在于，含有过氧化氢生成试剂、α-酮酸、过氧化活性物质以及氧化发色型色原体。
[10]如[9]所述的试剂，其中，α-酮酸为选自由丙酮酸、α-酮戊二酸以及草酰乙酸组成的组中的α-酮酸。
[11]如[9]或[10]所述的试剂，其中，氧化发色型色原体为无色型色原体。
[12]如[11]所述的试剂，其中，无色型色原体为吩噻嗪衍生物。
[13]如[12]所述的试剂，其中，吩噻嗪衍生物为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪。
[14]如[9]或[10]所述的试剂，其中，氧化发色型色原体为氧化偶合型色原体。
[15]如[14]所述的试剂，其中，氧化偶合型色原体是偶合剂与苯胺衍生物或苯酚衍生物的组合。
[16]一种试剂盒，是包含第一试剂和第二试剂的用于测定样品中的测定对象成分的试剂盒，其特征在于，无色型色原体和过氧化活性物质分别包含于第一试剂和第二试剂中，过氧化氢生成试剂以及α-酮酸分别包含于第一试剂和第二试剂中的一者或两者中。
[17]如[16]所述的试剂盒，其中，无色型色原体为吩噻嗪衍生物。
[18]如[17]所述的试剂盒，其中，吩噻嗪衍生物为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪。
[19]一种试剂盒，是包含第一试剂和第二试剂的用于测定样品中的测定对象成分的试剂盒，其特征在于，偶合剂、和苯胺衍生物或苯酚衍生物分别包含于第一试剂和第二试剂中，过氧化活性物质、过氧化氢生成试剂以及α-酮酸分别包含于第一试剂和第二试剂中的一者或两者中。
[20]如[16]～[19]中任一项所述的试剂盒，其中，α-酮酸为选自由丙酮酸、α-酮戊二酸以及草酰乙酸组成的组中的α-酮酸。
发明效果
根据本发明，提供过氧化物的影响得到抑制的样品中的测定对象成分的测定方法、测定用试剂、测定用试剂盒以及抑制过氧化物的影响的方法。
附图说明
图1是表示使用实施例5(1)的含有丙酮酸的血红蛋白A1c测定用试剂盒以及实施例5(4)的不含α-酮酸的血红蛋白A1c测定用试剂盒的血红蛋白A1c测定方法中、血红蛋白A1c浓度与吸光度的关系的曲线图。横轴表示血红蛋白A1c浓度(μmol/L)，纵轴表示吸光度(Abs)。○表示使用含有丙酮酸的试剂盒的测定的曲线，△表示使用不含α-酮酸的试剂盒的测定的曲线。
图2是表示使用实施例5(2)的含有α-酮戊二酸的血红蛋白A1c测定用试剂盒以及实施例5(4)的不含α-酮酸的血红蛋白A1c测定用试剂盒的血红蛋白A1c测定方法中、血红蛋白A1c浓度与吸光度的关系的曲线图。横轴表示血红蛋白A1c浓度(μmol/L)，纵轴表示吸光度(Abs)。○表示使用含有α-酮戊二酸的试剂盒的测定的曲线，△表示使用不含α-酮酸的试剂盒的测定的曲线。
图3是表示使用实施例5(3)的含有草酰乙酸的血红蛋白A1c测定用试剂盒以及实施例5(4)的不含α-酮酸的血红蛋白A1c测定用试剂盒的血红蛋白A1c测定方法中、血红蛋白A1c浓度与吸光度的关系的曲线图。横轴表示血红蛋白A1c浓度(μmol/L)，纵轴表示吸光度(Abs)。○表示使用含有草酰乙酸的试剂盒的测定的曲线，△表示使用不含α-酮酸的试剂盒的测定的曲线。
具体实施方式
(1)测定对象成分的测定方法
本发明的测定对象成分的测定方法的特征在于，将样品中的测定对象成分转换成过氧化氢，在α-酮酸存在下，使用氧化发色型色原体测定所生成的过氧化氢。本发明的测定对象成分的测定方法，能够抑制样品中存在的过氧化物的影响，从而正确地测定样品中的测定对象成分。
作为本发明中的样品，只要能够进行本发明的测定方法，则没有特别限制，可以列举例如：全血、血清、血浆、尿等。
本发明的测定方法，只要能够抑制过氧化物的影响，则没有特别限制，可以列举例如包括以下步骤的方法等。
步骤1：使样品中的测定对象成分与过氧化氢生成试剂反应、生成过氧化氢的步骤；
步骤2：使步骤1中生成的过氧化氢在α-酮酸以及过氧化活性物质的存在下、与氧化发色型色原体反应、生成色素的步骤；
步骤3：测定步骤2中生成的色素的吸光度的步骤；
步骤4：将步骤3中测定的吸光度代入使用已知浓度的测定对象成分制作的、表示测定对象成分的浓度或活性与吸光度的关系的标准曲线的步骤；和
步骤5：确定样品中的测定对象成分的浓度或活性的步骤。
上述步骤1的反应可以在α-酮酸存在下进行。另外，步骤1与步骤2可以同时进行，也可以分步进行。
对于步骤1中的样品中的测定对象成分与过氧化氢生成试剂的反应，只要是生成过氧化氢的条件，则可以为任意的反应条件，例如在10～50℃、优选20～40℃下进行1分钟～3小时、优选2.5分钟～1小时。
对于步骤2中的在α-酮酸以及过氧化活性物质存在下的过氧化氢与氧化发色型色原体的反应，只要是生成色素的条件，则可以为任意的反应条件，例如在10～50℃、优选20～40℃下进行1分钟～3小时、优选2.5分钟～1小时。作为该反应中的α-酮酸的浓度，只要是能够抑制过氧化物的影响的浓度，则没有特别限制，例如为0.001～20g/L。
对于步骤3中的测定所生成的色素的吸光度的方法，只要是能够测定吸光度的方法，则可以为任意的方法，可以列举例如使用分光光度计进行测定的方法等。
步骤1中的过氧化氢生成试剂是与测定对象成分反应而生成过氧化氢的试剂，可以列举例如：(A)将测定对象成分直接转换成过氧化氢的试剂[以下，记载为试剂(A)]、(B)将测定对象成分间接地转换成过氧化氢的试剂[以下，记载为试剂(B)]、(C)由测定对象成分直接生成过氧化氢的试剂[以下，记载为试剂(C)]、(D)由测定对象成分间接地生成过氧化氢的试剂[以下，记载为试剂(D)]等。
试剂(A)是将样品中的测定对象成分直接转换成过氧化氢的试剂。可适用试剂(A)的测定对象成分例如为氧化酶的底物等。作为试剂(A)，可以列举例如包含测定对象成分的氧化酶的试剂等。将测定对象成分与试剂(A)的组合的具体例示于表1。
表1
测定对象成分 试剂(A)
胆碱 包含胆碱氧化酶的试剂
尿酸 包含尿酸酶(尿酸氧化酶)的试剂
葡萄糖 包含葡萄糖氧化酶的试剂
丙酮酸 包含丙酮酸氧化酶的试剂
乳酸 包含乳酸氧化酶的试剂
甘油 包含甘油氧化酶的试剂
肌氨酸 包含肌氨酸氧化酶的试剂
脂酰辅酶A 包含脂酰辅酶A氧化酶的试剂
黄嘌呤 包含黄嘌呤氧化酶的试剂
果糖氨基酸 包含果糖氨基酸氧化酶的试剂
果糖肽 包含果糖肽氧化酶的试剂
L-天冬氨酸 包含L-天冬氨酸氧化酶的试剂
游离型胆固醇 包含胆固醇氧化酶的试剂
各种脂蛋白中的游离型胆固醇 包含胆固醇氧化酶的试剂
果糖二肽 包含果糖肽氧化酶的试剂
果糖氨基酸 包含果糖氨基酸氧化酶的试剂
需要说明的是，上述中各种脂蛋白是指HDL、LDL、VLDL、IDL、残粒脂蛋白、sdLDL等。以下同样。
另外，作为测定对象的氧化酶的底物，可以是经过多个反应衍生出的物质。该情况下，向氧化酶的底物转换的测定对象成分，经过多个反应转换成氧化酶的底物后，通过与氧化酶的反应生成过氧化氢。作为向该氧化酶的底物转换的物质、氧化酶的底物以及氧化酶的组合，可以列举例如表2所示的组合等。
表2
Figure BDA00003329165400091
需要说明的是，总胆固醇是指全部脂蛋白中的游离型胆固醇与酯型胆固醇的总和，各种脂蛋白中的胆固醇是指各种脂蛋白中的游离型胆固醇与酯型胆固醇的总和，总酯型胆固醇是指全部脂蛋白中的酯型胆固醇。
试剂(B)是将样品中的测定对象成分间接地转换成过氧化氢的试剂。可适用试剂(B)的测定对象成分，可以列举例如经过两个以上的酶反应转换成过氧化氢这样的酶的底物等。作为试剂(B)，可以列举例如：含有与该底物反应的酶、将该底物转换生成的物质向存在对应的氧化酶的物质转换的酶或者酶及其底物、以及该氧化酶的试剂等。将测定对象成分与试剂(B)的组合示于表3。
表3
Figure BDA00003329165400101
试剂(C)是由测定对象成分直接生成过氧化氢的试剂。可适用试剂(C)的测定对象成分，可以列举例如生成过氧化氢的氧化酶等。作为试剂(C)，可以列举例如含有该氧化酶的底物的试剂等。将测定对象成分与试剂(C)的组合的具体例示于表4。
表4
测定对象成分 试剂(C)
胆碱氧化酶 包含胆碱的试剂
尿酸酶(尿酸氧化酶) 包含尿酸的试剂
葡萄糖氧化酶 包含葡萄糖的试剂
丙酮酸氧化酶 包含丙酮酸的试剂
乳酸氧化酶 包含乳酸的试剂
甘油氧化酶 包含甘油的试剂
肌氨酸氧化酶 包含肌氨酸的试剂
脂酰辅酶A氧化酶 包含脂酰辅酶A的试剂
黄嘌呤氧化酶 包含黄嘌呤的试剂
果糖氨基酸氧化酶 包含果糖氨基酸的试剂
果糖肽氧化酶 包含果糖肽的试剂
L-天冬氨酸氧化酶 包含L-天冬氨酸的试剂
单胺氧化酶 包含烯丙胺的试剂
多胺氧化酶 包含多胺的试剂
胆固醇氧化酶 包含游离型胆固醇的试剂
胆固醇氧化酶 包含各种脂蛋白中的游离型胆固醇的试剂
试剂(D)是由测定对象成分间接地生成过氧化氢的试剂。可适用试剂(D)的测定对象成分，可以列举例如经过两个以上反应生成过氧化氢这样的酶等。作为试剂(D)，可以列举例如：含有该酶的底物、将由该酶与该底物的反应生成的物质向存在对应的氧化酶的物质转换的酶或者酶及其底物、以及该氧化酶的试剂等。将测定对象成分与试剂(D)的组合的具体例示于表5。
表5
Figure BDA00003329165400121
本发明中，氧化发色型色原体在过氧化活性物质的存在下与过氧化氢反应，生成色素。作为过氧化活性物质，可以列举例如过氧化物酶等。作为氧化发色型色原体，可以列举：氧化偶合型色原体、无色型色原体等，优选为无色型色原体。
无色型色原体是在过氧化氢以及过氧化活性物质的存在下、单独向色素转换的物质。
作为无色型色原体，可以列举例如：吩噻嗪类色原体、三苯基甲烷类色原体、二苯胺类色原体、邻苯二胺、羟基丙酸、二氨基联苯胺、四甲基联苯胺等，优选为吩噻嗪类色原体。
作为吩噻嗪类色原体，可以列举例如：10-N-羧甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)等。吩噻嗪类色原体中，特别优选10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)。
作为三苯基甲烷类色原体，可以列举例如：N,N,N’,N’,N’’,N’’-六(3-磺丙基)-4,4’,4’’-三氨基三苯基甲烷(TPM-PS)等。
作为二苯胺类色原体，可以列举例如：N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(DA-64)、4,4’-双(二甲氨基)二苯胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)等。
氧化偶合型色原体是在过氧化氢以及过氧化活性物质的存在下、两种化合物发生氧化偶合而生成色素的物质。作为两种化合物的组合，可以列举：偶合剂与苯胺类(Trinder's试剂)的组合、偶合剂与苯酚类的组合等。
作为偶合剂，可以列举例如：4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮肼等。
作为苯胺类，可以列举：N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N,N-二甲基-3-甲基苯胺、N,N-双(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N'-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N'-乙酰乙二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3,5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。
作为苯酚类，可以列举：苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
本发明中，过氧化物是在本发明的测定方法中产生正影响的物质，可以列举来自能生成过氧化物的表面活性剂的过氧化物等。本发明中，过氧化物可以为来自样品的过氧化物，也可以为来自测定试剂的过氧化物。作为能生成过氧化物的表面活性剂，可以列举例如聚氧化烯烃类表面活性剂等。作为聚氧化烯烃类表面活性剂，可以列举例如：聚氧乙烯类表面活性剂、聚氧丙烯类表面活性剂、聚氧丁烯类表面活性剂等。聚氧化烯烃类表面活性剂可以列举：非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂等，优选为非离子型表面活性剂。作为非离子型表面活性剂，可以列举例如：聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烯基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物等。
过氧化物可以通过过氧化值、羰基值、硫巴比妥酸值等油脂氧化的指标进行检测、测定或定量。
本发明中的α-酮酸，只要能够进行本发明的测定方法，则没有特别限制，可以列举例如：丙酮酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸、草酸等，优选为丙酮酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸，特别优选为丙酮酸。本发明中的α-酮酸可以为盐的形式，作为盐，可以列举例如：钠盐、钾盐、铵盐、钙盐等。
本发明的测定方法中使用的α-酮酸的浓度只要是能够进行本发明的测定方法的浓度，则没有特别限制，例如为0.001～20g/L。
本发明的测定方法中，测定对象成分与过氧化氢生成试剂的反应优选在水性介质中进行。另外，测定对象成分与过氧化氢生成试剂的反应，也可以在稳定剂、防腐剂、干扰物消除剂、反应加速剂等共存下进行。
作为水性介质，可以列举例如：去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选为缓冲液。作为缓冲液的pH，为pH4.0～10.0，优选为pH6.0～8.0。作为缓冲液中使用的缓冲剂，可以列举例如：磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、Good's缓冲剂等。
作为Good's缓冲剂，可以列举例如：2-吗啉代乙磺酸(MES)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、二(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等。
缓冲液的浓度只要是适合测定的浓度则没有特别限制，优选为0.001～2.0mol/L，更优选为0.005～1.0mol/L。
作为稳定剂，可以列举例如：乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙、亚铁氰化钾、牛血清白蛋白(BSA)等。作为防腐剂，可以列举例如：叠氮化钠、抗生素等。作为干扰物消除剂，可以列举例如：用于消除抗坏血酸的影响的抗坏血酸氧化酶等。作为反应加速剂，可以列举例如：辅脂肪酶、磷脂酶等酶、硫酸钠、氯化钠等盐类。
(2)测定对象成分的测定用试剂以及测定用试剂盒
本发明的样品中的测定对象成分的测定用试剂，为本发明的测定方法中使用的试剂，包括过氧化氢生成试剂、α-酮酸、过氧化活性物质以及氧化发色型色原体。
以下示出本发明的测定用试剂的具体方式。
·测定用试剂1
包含过氧化氢生成试剂、α-酮酸、过氧化活性物质以及无色型色原体的试剂。
·测定用试剂2
包含过氧化氢生成试剂、α-酮酸、过氧化活性物质以及偶合型色原体的试剂。
本发明的样品中的测定对象成分的测定用试剂可以以试剂盒的形式保存、流通、使用。本发明的测定用试剂盒用于本发明的测定方法，可以列举：双试剂类、三试剂类等试剂盒，优选为双试剂类的试剂盒。
对于本发明的测定用试剂盒，在作为氧化发色型色原体使用无色型色原体的双试剂类的试剂盒的情况下，可以列举：无色型色原体和过氧化活性物质分别包含于第一试剂和第二试剂中、过氧化氢生成试剂以及α-酮酸分别包含于第一试剂和第二试剂中的一者或两者中的试剂盒等。
另外，对于本发明的测定用试剂盒，在作为氧化发色型色原体使用氧化偶合型色原体的双试剂类的试剂盒的情况下，可以列举：偶合剂、和苯胺衍生物或苯酚衍生物分别包含于第一试剂和第二试剂中、过氧化活性物质、过氧化氢生成试剂以及α-酮酸分别包含于第一试剂和第二试剂中的一者或两者中的试剂盒等。
以下记载了本发明的测定用试剂盒的具体方式。
·测定用试剂盒1
第一试剂
包含无色型色原体以及α-酮酸的试剂。
第二试剂
包含过氧化活性物质以及过氧化氢生成试剂的试剂。
·测定用试剂盒2
第一试剂
包含无色型色原体、α-酮酸以及过氧化氢生成试剂的试剂。
第二试剂
包含过氧化活性物质以及过氧化氢生成试剂的试剂。
·测定用试剂盒3
第一试剂
包含无色型色原体、α-酮酸以及过氧化氢生成试剂的试剂。
第二试剂
包含过氧化活性物质、α-酮酸以及过氧化氢生成试剂的试剂。
·测定用试剂盒4
第一试剂
包含过氧化活性物质以及α-酮酸的试剂。
第二试剂
包含无色型色原体以及过氧化氢生成试剂的试剂。
·测定用试剂盒5
第一试剂
包含过氧化活性物质、α-酮酸以及过氧化氢生成试剂的试剂。
第二试剂
包含无色型色原体以及过氧化氢生成试剂的试剂。
·测定用试剂盒6
第一试剂
包含过氧化活性物质、α-酮酸以及过氧化氢生成试剂的试剂。
第二试剂
包含无色型色原体、α-酮酸以及过氧化氢生成试剂的试剂。
·测定用试剂盒7
第一试剂
包含偶合剂以及α-酮酸的试剂。
第二试剂
包含苯胺衍生物或苯酚衍生物、过氧化活性物质以及过氧化氢生成试剂的试剂。
·测定用试剂盒8
第一试剂
包含苯胺衍生物或苯酚衍生物以及α-酮酸的试剂。
第二试剂
包含偶合剂、过氧化活性物质以及过氧化氢生成试剂的试剂。
·测定用试剂盒9
第一试剂
包含偶合剂、α-酮酸以及过氧化氢生成试剂的试剂。
第二试剂
包含苯胺衍生物或苯酚衍生物、过氧化活性物质以及过氧化氢生成试剂的试剂。
·测定用试剂盒10
第一试剂
包含苯胺衍生物或苯酚衍生物、α-酮酸以及过氧化氢生成试剂的试剂。
第二试剂
包含偶合剂、过氧化活性物质以及过氧化氢生成试剂的试剂。
·测定用试剂盒11
第一试剂
包含偶合剂、α-酮酸以及过氧化氢生成试剂的试剂。
第二试剂
包含苯胺衍生物或苯酚衍生物、过氧化活性物质、α-酮酸以及过氧化氢生成试剂的试剂。
·测定用试剂盒12
第一试剂
包含苯胺衍生物或苯酚衍生物、α-酮酸以及过氧化氢生成试剂的试剂。
第二试剂
包含偶合剂、过氧化活性物质、α-酮酸以及过氧化氢生成试剂的试剂。
作为本发明的测定用试剂以及测定用试剂盒中的过氧化氢生成试剂，可以列举上述所示的试剂(A)～试剂(D)等。作为本发明的测定用试剂以及测定用试剂盒中的α-酮酸、过氧化活性物质以及氧化发色型色原体，可以列举上述(1)中记载的物质。
本发明的测定用试剂以及测定用试剂盒，根据需要还可以含有稳定剂、防腐剂、干扰物消除剂、反应加速剂等。稳定剂、防腐剂、干扰物消除剂、反应加速剂可以列举上述(1)中记载的物质。
(3)抑制过氧化物的影响的方法
本发明的抑制过氧化物的影响的方法的特征在于，在将样品中的测定对象成分转换成过氧化氢并使所生成的过氧化氢与氧化发色型色原体反应的、样品中的测定对象成分的测定方法中，使所生成的过氧化氢与氧化发色型色原体的反应在α-酮酸存在下进行。
作为本发明的抑制过氧化物的影响的方法中的样品、测定对象成分、氧化发色型色原体、α-酮酸，分别可以列举前述样品、测定对象成分、氧化发色型色原体、α-酮酸等。另外，作为通过本发明的抑制方法使其影响受到抑制的过氧化物，可以列举例如前述过氧化物等。
通过本发明的抑制过氧化物的影响的方法，可以正确地测定样品中的测定对象成分。
本发明中，过氧化物的影响的抑制可以通过例如以下的步骤来进行评价。
步骤1：制备包含α-酮酸的试剂[以下，称为试剂(+)]、和不含α-酮酸的试剂[以下，称为试剂(-)]的步骤；
步骤2：使样品与试剂(+)反应、测定所生成的色素的吸光度的步骤；
步骤3：使样品与试剂(-)反应、测定所生成的色素的吸光度的步骤；
步骤4：将步骤2中测定的吸光度与步骤3中测定的吸光度进行比较的步骤。
上述步骤4中，如果步骤2中测定的吸光度、即使用试剂(+)时的吸光度比步骤3中测定的吸光度、即使用试剂(-)时的吸光度低，则可以评价为通过α-酮酸使过氧化物的影响得以抑制。
以下，通过实施例对本发明更详细地进行说明，但这些实施例对本发明的范围没有任何限定。
需要说明的是，本实施例、比较例以及试验例中，使用下述制造商的试剂以及酶。
MES(同仁化学研究所公司制)、Bis-Tris(同仁化学研究所公司制)、ADA(同仁化学研究所公司制)、过氧化物酶(POD；东洋纺织公司制)、丙酮酸钠(关东化学公司制)、α-酮戊二酸(关东化学公司制)、草酰乙酸(关东化学公司制)、DA-67(和光纯药工业公司制)、4-AA(埼京化成公司制)、EMSE(ダイトーケミックス公司制)、氯化钙二水合物(和光纯药工业公司制)、硫酸钠(关东化学公司制)、硝酸钠(关东化学公司制)、癸基三甲基溴化铵(C10TMA；东京化成公司制)、1-十二烷基氯化吡啶(东京化成公司制)、葡萄糖(MERCK制)、果糖VHLTPE(果糖六肽；肽研究所公司制)、葡萄糖氧化酶(GOD；东洋纺织公司制)、嗜热菌蛋白酶(蛋白酶；天野酶公司制)、链霉蛋白酶E(蛋白酶；科研制药公司制)、FPOX-CE(果糖肽氧化酶；龟甲万公司制)、FPOX-CET(果糖肽氧化酶；龟甲万公司制)、ディスパノールTOC(聚氧乙烯三癸基醚；日油公司制)、非离子E230(聚氧乙烯油烯基醚；日油公司制)。
实施例1
(1)含有丙酮酸的葡萄糖测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的葡萄糖测定用试剂盒(试剂盒A)。
第一试剂
MES(pH6.25)    20mmol/L
DA-67          50μmol/L
丙酮酸钠       5g/L
第二试剂
MES(pH6.25)    20mmol/L
POD            10kU/L
GOD            5kU/L
(2)不含丙酮酸的葡萄糖测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的葡萄糖测定用试剂盒(试剂盒a)。
第一试剂
MES(pH6.25)    20mmol/L
DA-67          50μmol/L
第二试剂
MES(pH6.25)    20mmol/L
POD            10kU/L
GOD            5kU/L
(3)含有过氧化物的样品的制备
制备以下的四种样品。
·样品1：含有葡萄糖以及ディスパノールTOC各自90μmol/L、0%的水溶液
·样品2：含有葡萄糖以及ディスパノールTOC各自90μmol/L、0.25%的水溶液
·样品3：含有葡萄糖以及ディスパノールTOC各自90μmol/L、0.5%的水溶液
·样品4：含有葡萄糖以及ディスパノールTOC各自90μmol/L、1%的水溶液
ディスパノールTOC为聚氧乙烯类表面活性剂，是过氧化物的生成源。在样品1～4中，依赖于ディスパノールTOC浓度，大量含有过氧化物。
(4)由丙酮酸带来的抑制过氧化氢定量体系中的过氧化物的影响的效果的评价
使上述(3)中制备的样品1(1.5μL)与(1)中制备的试剂盒A的第一试剂(150μL)在37℃下反应5分钟，在主波长660nm、副波长800nm处测定吸光度(E1)。接着，添加试剂盒A的第二试剂(50μL)，进一步在37℃下反应5分钟，在主波长660nm、副波长800nm处测定吸光度(E2)。测定通过日立H7180进行。从吸光度(E2)减去吸光度(E1)，得到样品1的反应吸光度(E1A)。
接着，使用生理盐水代替样品1，进行同样的测定，得到空白吸光度(E空白)。从样品1的反应吸光度(E1A)减去空白吸光度(E空白)，得到样品1的吸光度(ΔE1A)。
对样品2～4也分别进行对样品1进行的一系列操作，确定样品2的吸光度(ΔE2A)、样品3的吸光度(ΔE3A)、样品4的吸光度的测定值(ΔE4A)。将样品1的吸光度(ΔE1A)设定为100时的样品2～4的吸光度(ΔE2A～ΔE4A)的相对值示于表6。
另外，除了使用(2)中制备的试剂盒a代替(1)中制备的试剂盒A以外，进行同样的方法，确定样品1～4各自的吸光度的相对值(ΔE1a～ΔE4a)。将样品1的吸光度(ΔE1a)设定为100时的样品2～4的吸光度(ΔE2a～ΔE4a)的相对值示于表6。
表6
Figure BDA00003329165400231
由表6可知，在使用作为无色型色原体的DA-67的葡萄糖定量体系中，使用含有丙酮酸的试剂盒A的测定与使用不含丙酮酸的试剂盒a的测定相比，由来自ディスパノールTOC的过氧化物产生的影响得到显著抑制，能够进行更正确的葡萄糖的测定。
实施例2
(1)含有丙酮酸的葡萄糖测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的葡萄糖测定用试剂盒(试剂盒B)。
第一试剂
MES(pH6.25)    20mmol/L
EMSE           0.3g/L
丙酮酸钠       5g/L
第二试剂
Figure BDA00003329165400241
(2)不含丙酮酸的葡萄糖测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的葡萄糖测定用试剂盒(试剂盒b)。
第一试剂
MES(pH6.25)    20mmol/L
EMSE           0.3g/L
第二试剂
Figure BDA00003329165400242
(3)含有过氧化物的样品的制备
使用实施例1中制备的样品1～4。
(4)由丙酮酸带来的抑制过氧化氢定量体系中的过氧化物的影响的效果的评价
使上述(3)中制备的样品1(15μL)与(1)中制备的试剂盒A的第一试剂(150μL)在37℃下反应5分钟，在主波长660nm、副波长800nm处测定吸光度(E1)。接着，添加试剂盒A的第二试剂(50μL)，进一步在37℃下反应5分钟，在主波长546nm、副波长800nm处测定吸光度(E2)。测定通过日立H7180进行。从吸光度(E2)减去吸光度(E1)，得到样品1的反应吸光度(E1B)。
接着，使用生理盐水代替样品1，进行同样的测定，得到空白吸光度(E空白)。从样品1的反应吸光度(E1B)减去空白吸光度(E空白)，得到样品1的吸光度(ΔE1B)。
对样品2～4也分别进行对样品1进行的一系列操作，确定样品2的吸光度(ΔE2B)、样品3的吸光度(ΔE3B)、样品4的吸光度的测定值(ΔE4B)。将样品1的吸光度(ΔE1B)设定为100时的样品2～4的吸光度(ΔE2B～ΔE4B)的相对值示于表7。
另外，除了使用(2)中制备的试剂盒b代替(1)中制备的试剂盒B以外，进行同样的方法，确定样品1～4各自的吸光度的相对值(ΔE1b～ΔE4b)。将样品1的吸光度(ΔE1b)设定为100时的样品2～4的吸光度(ΔE2b～ΔE4b)的相对值示于表7。
表7
Figure BDA00003329165400251
由表7可知，在使用作为偶合型色原体的4-AA与EMSE的组合的葡萄糖定量体系中，使用含有丙酮酸的试剂盒B的测定与使用不含丙酮酸的试剂盒b的测定相比，由来自ディスパノールTOC的过氧化物产生的影响得到显著抑制，能够进行更正确的葡萄糖的测定。
实施例3
(1)含有丙酮酸的果糖VHLTPE测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的果糖VHLTPE测定用试剂盒(试剂盒C)。
第一试剂
Figure BDA00003329165400261
第二试剂
ADA(pH7.0)      50mmol/L
POD             120kU/L
FPOX-CE         12kU/L
(2)不含丙酮酸的果糖VHLTPE测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的果糖VHLTPE测定用试剂盒(试剂盒c)。
第一试剂
Figure BDA00003329165400262
第二试剂
ADA(pH7.0)   50mmol/L
POD          120kU/L
FPOX-CE      12kU/L
(3)含有过氧化物的样品的制备
制备以下的四种样品。
·样品1：含有果糖VHLTPE以及ディスパノールTOC各自18μmol/L、0%的水溶液
·样品2：含有果糖VHLTPE以及ディスパノールTOC各自18μmol/L、0.05%的水溶液
·样品3：含有果糖VHLTPE以及ディスパノールTOC各自18μmol/L、0.1%的水溶液
·样品4：含有果糖VHLTPE以及ディスパノールTOC各自18μmol/L、0.2%的水溶液
ディスパノールTOC为聚氧乙烯类表面活性剂，是过氧化物的生成源。在样品1～4中，依赖于ディスパノールTOC浓度，大量含有过氧化物。
(4)由丙酮酸带来的抑制过氧化氢定量体系中的过氧化物的影响的效果的评价
使上述(3)中制备的样品1(9.6μL)与(1)中制备的试剂盒C的第一试剂(120μL)在37℃下反应5分钟，在主波长660nm、副波长800nm处测定吸光度(E1)。接着，添加试剂盒C的第二试剂(40μL)，进一步在37℃下反应5分钟，在主波长660nm、副波长800nm处测定吸光度(E2)。测定通过日立H7180进行。从吸光度(E2)减去吸光度(E1)，得到样品1的反应吸光度(E1C)。
接着，使用生理盐水代替样品1，进行同样的测定，得到空白吸光度(E空白)。从样品1的反应吸光度(E1C)减去空白吸光度(E空白)，得到样品1的吸光度(ΔE1C)。
对样品2～4也分别进行对样品1进行的一系列操作，确定样品2的吸光度(ΔE2C)、样品3的吸光度(ΔE3C)、样品4的吸光度的测定值(ΔE4C)。将样品1的吸光度(ΔE1C)设定为100时的样品2～4的吸光度(ΔE2C～ΔE4C)的相对值示于表8。
另外，除了使用(2)中制备的试剂盒c代替(1)中制备的试剂盒C以外，进行同样的方法，确定样品1～4各自的吸光度的相对值(ΔE1c～ΔE4c)。将样品1的吸光度(ΔE1c)设定为100时的样品2～4的吸光度(ΔE2c～ΔE4c)的相对值示于表8。
表8
由表8可知，在使用作为无色型色原体的DA-67的果糖VHLTPE定量体系中，使用含有丙酮酸的试剂盒C的测定与使用不含丙酮酸的试剂盒c的测定相比，由来自ディスパノールTOC的过氧化物带来的影响得到显著抑制，能够进行更正确的果糖VHLTPE的测定。
实施例4
在葡萄糖测定体系中的由α-酮酸带来的减轻试剂中的过氧化物的影响的效果的研究
(1)含有丙酮酸的葡萄糖测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的葡萄糖测定用试剂盒(试剂盒D1～D3)。试剂盒D1表示第一试剂中的非离子E230浓度为0%的试剂盒，试剂盒D2表示第一试剂中的非离子E230浓度为0.02%的试剂盒，试剂盒D3表示第一试剂中的非离子E230浓度为0.1%的试剂盒。
第一试剂
Figure BDA00003329165400282
Figure BDA00003329165400291
第二试剂
Figure BDA00003329165400292
(2)含有α-酮戊二酸的葡萄糖测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的葡萄糖测定用试剂盒(试剂盒E1～E3)。试剂盒E1表示第一试剂中的非离子E230浓度为0%的试剂盒，试剂盒E2表示第一试剂中的非离子E230浓度为0.02%的试剂盒，试剂盒E3表示第一试剂中的非离子E230浓度为0.1%的试剂盒。
第一试剂
Figure BDA00003329165400293
第二试剂
Figure BDA00003329165400294
(3)含有草酰乙酸的葡萄糖测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的葡萄糖测定用试剂盒(试剂盒F1～F3)。试剂盒F1表示第一试剂中的非离子E230浓度为0%的试剂盒，试剂盒F2表示第一试剂中的非离子E230浓度为0.02%的试剂盒，试剂盒F3表示第一试剂中的非离子E230浓度为0.1%的试剂盒。
第一试剂
Figure BDA00003329165400301
第二试剂
Figure BDA00003329165400302
(4)不含α-酮酸的葡萄糖测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的葡萄糖测定用试剂盒(试剂盒d1～d3)。试剂盒d1表示第一试剂中的非离子E230浓度为0%的试剂盒，试剂盒d2表示第一试剂中的非离子E230浓度为0.02%的试剂盒，试剂盒d3表示第一试剂中的非离子E230浓度为0.1%的试剂盒。
第一试剂
MES(pH6.5)    50mmol/L
EMSE          0.3g/L
非离子E230    0%、0.02%或0.1%
第二试剂
Figure BDA00003329165400303
(5)由丙酮酸带来的抑制过氧化物的影响的效果的评价
使生理盐水(2.0μL)与(1)中制备的试剂盒D1的第一试剂(180μL)在37℃下反应5分钟，在主波长546nm、副波长700nm处测定吸光度(E1)。接着，添加试剂盒D1的第二试剂(60μL)，进一步在37℃下反应5分钟，在主波长546nm、副波长700nm处测定吸光度(E2)。测定通过日立H7170进行。从吸光度(E2)减去吸光度(E1)，得到生理盐水的空白吸光度(ED1)。
接着，使用试剂盒D2代替试剂盒D1，进行同样的测定，计算生理盐水的空白吸光度(ED2)。
另外，使用试剂盒D3代替试剂盒D1，进行同样的测定，计算生理盐水的空白吸光度(ED3)。
将试剂盒D1的空白吸光度(ΔED1)设定为0，从空白吸光度(ED2)中减去空白吸光度(ED1)，得到试剂盒D2的空白吸光度(ΔED2)。同样地从空白吸光度(ED3)中减去空白吸光度(ED1)，得到试剂盒D3的空白吸光度(ΔED3)。将试剂盒D1～试剂盒D3各试剂盒的空白吸光度(ΔED1～ΔED3)示于表9。
(6)由α-酮戊二酸带来的抑制过氧化物的影响的效果的评价
除了分别使用上述(2)中制备的含有α-酮戊二酸的试剂盒E1～E3代替试剂盒D1～D3以外，通过与(5)同样的方法，计算试剂盒E1～E3各试剂盒的空白吸光度(ΔEE1～ΔEE3)。将试剂盒E1～试剂盒E3各试剂盒的空白吸光度(ΔEE1～ΔEE3)示于表9。
(7)由草酰乙酸产生的过氧化物的影响抑制效果的评价
除了分别使用上述(3)中制备的含有草酰乙酸的试剂盒F1～F3代替试剂盒D1～D3以外，通过与(5)同样的方法，计算试剂盒F1～F3各试剂盒的空白吸光度(ΔEF1～ΔEF3)。将试剂盒F1～试剂盒F3各试剂盒的空白吸光度(ΔEF1～ΔEF3)示于表9。
(8)使用不含α-酮酸的试剂盒的抑制过氧化物的影响的效果的评价
除了分别使用上述(4)中制备的不含α-酮酸的试剂盒d1～d3代替试剂盒D1～D3以外，通过与(5)同样的方法，计算试剂盒d1～d3各试剂盒的空白吸光度(ΔEd1～ΔEd3)。将试剂盒d1～试剂盒d3各试剂盒的空白吸光度(ΔEd1～ΔEd3)示于表9。
表9
Figure BDA00003329165400321
由表9可知，在使用作为α-酮酸含有丙酮酸、α-酮戊二酸或草酰乙酸的试剂盒的情况下，与不含α-酮酸的试剂盒相比，即使在非离子E230浓度增高时，空白吸光度也显著降低。非离子E230为容易生成过氧化物的表面活性剂。因此判断，通过α-酮酸，由非离子E230引起的过氧化物的影响得到显著抑制，能够进行更正确的葡萄糖的测定。
实施例5
在血红蛋白A1c测定体系中的由α-酮酸带来的抑制试剂中的过氧化物的影响的效果的研究
(1)含有丙酮酸的血红蛋白A1c测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的血红蛋白A1c测定用试剂盒(试剂盒G)。
第一试剂
Figure BDA00003329165400322
第二试剂
Bis-Tris(pH7.0) 50mmol/L
FPOX-CET        6kU/L
POD             120kU/L
(2)含有α-酮戊二酸的血红蛋白A1c测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的血红蛋白A1c测定用试剂盒(试剂盒H)。
第一试剂
Figure BDA00003329165400331
第二试剂
Bis-Tris(pH7.0) 50mmol/L
FPOX-CET        6kU/L
POD             120kU/L
(3)含有草酰乙酸的血红蛋白A1c测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的血红蛋白A1c测定用试剂盒(试剂盒I)。
第一试剂
Figure BDA00003329165400332
Figure BDA00003329165400341
第二试剂
Bis-Tris(pH7.0) 50mmol/L
FPOX-CET        6kU/L
POD             120kU/L
(4)不含α-酮酸的血红蛋白A1c测定用试剂盒
制备由以下的组成构成的血红蛋白A1c测定用试剂盒(试剂盒e)。
第一试剂
Figure BDA00003329165400342
第二试剂
Bis-Tris(pH7.0) 50mmol/L
FPOX-CET        6kU/L
POD             120kU/L
(5)由丙酮酸带来的抑制过氧化物的影响的效果的评价
使用血红蛋白A1c浓度为3.2、4.0、4.9、5.6、6.5、7.6、9.7μmol/L的各血细胞以及生理盐水(血红蛋白A1c浓度：0μmol/L)作为样品。
使各样品(12μL)与(1)中制备的含有丙酮酸的试剂盒G的第一试剂(150μL)在37℃下反应5分钟，在主波长660nm、副波长800nm处测定吸光度(E1)。接着，添加试剂盒G的第二试剂(50μL)，进一步在37℃下反应5分钟，在主波长660nm、副波长800nm处测定吸光度(E2)。测定通过日立H7170进行。从吸光度(E2)减去吸光度(E1)，得到使用试剂盒G时的各样品的反应吸光度(EG)。
将使用不含α-酮酸的上述(4)的试剂盒e同样计算出的使用试剂盒e时的各样品的反应吸光度(Ee)作为对照。将使用试剂盒G时的各样品的反应吸光度(EG)以及使用试剂盒e时的各样品的反应吸光度(Ee)示于图1。
(6)由α-酮戊二酸带来的抑制过氧化物的影响的效果的评价
除了使用上述(2)中制备的含有α-酮戊二酸的试剂盒H代替试剂盒G以外，通过与(5)同样的方法，计算使用试剂盒H时的各样品的反应吸光度(ΔEH)。将使用试剂盒H时的各样品的反应吸光度(EH)以及使用试剂盒e时的各样品的反应吸光度(Ee)示于图2。
(7)由草酰乙酸带来的抑制过氧化物的影响的效果的评价
除了使用上述(3)中制备的含有草酰乙酸的试剂盒I代替试剂盒G以外，通过与(5)同样的方法，计算使用试剂盒I时的各样品的反应吸光度(ΔEI)。将使用试剂盒I时的各样品的反应吸光度(EI)以及使用试剂盒e时的各样品的反应吸光度(Ee)示于图3。
由图1～图3可知，在使用不含α-酮酸的试剂盒的测定中，使用生理盐水作为样品的情况下，作为空白，得到由来自过氧化物的发色产生的吸光度。另外，在作为样品使用血红蛋白A1c浓度3.2μmol/L的血细胞的情况下，得到低于空白的吸光度的吸光度。可以认为这是由于，通过血细胞中包含的血红蛋白的还原作用，除去了过氧化物以及来自血红蛋白A1c的过氧化氢。
另一方面，在使用含有α-酮酸的试剂盒的测定中，即使在使用血红蛋白A1c浓度3.2μmol/L的血细胞的情况下，也没有观察到吸光度的减少，在血红蛋白A1c浓度与吸光度之间观察到良好的线性。可以认为这是由于，α-酮酸与过氧化物相互作用，除去过氧化物，另一方面，α-酮酸不与过氧化氢相互作用，并不除去来自血红蛋白A1c的过氧化氢。
由此可知，在使用含有丙酮酸、α-酮戊二酸或草酰乙酸的试剂盒的测定中，来自非离子E230的过氧化物的影响得到抑制，能够进行更正确的血红蛋白A1c浓度的测定。
产业上的可利用性
根据本发明，提供过氧化氢定量体系中的过氧化物的影响得到抑制的样品中的测定对象成分的测定方法、测定用试剂、测定用试剂盒以及抑制过氧化物的影响的方法。本发明在临床诊断等中有用。

Claims (20)

1.一种样品中的测定对象成分的测定方法，其特征在于，将样品中的测定对象成分转换成过氧化氢，在α-酮酸存在下，使用氧化发色型色原体测定所生成的过氧化氢。
2.一种抑制样品中的测定对象成分的测定方法中的过氧化物的影响的方法，其特征在于，在将样品中的测定对象成分转换成过氧化氢、使所生成的过氧化氢与氧化发色型色原体反应的样品中的测定对象成分的测定方法中，在α-酮酸存在下进行所生成的过氧化氢与氧化发色型色原体的反应。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，α-酮酸为选自由丙酮酸、α-酮戊二酸以及草酰乙酸组成的组中的α-酮酸。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，氧化发色型色原体为无色型色原体。
5.如权利要求4所述的方法，其中，无色型色原体为吩噻嗪衍生物。
6.如权利要求5所述的方法，其中，吩噻嗪衍生物为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪。
7.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，氧化发色型色原体为氧化偶合型色原体。
8.如权利要求7所述的方法，其中，氧化偶合型色原体是偶合剂与苯胺衍生物或苯酚衍生物的组合。
9.一种样品中的测定对象成分的测定用试剂，其特征在于，含有过氧化氢生成试剂、α-酮酸、过氧化活性物质以及氧化发色型色原体。
10.如权利要求9所述的试剂，其中，α-酮酸为选自由丙酮酸、α-酮戊二酸以及草酰乙酸组成的组中的α-酮酸。
11.如权利要求9或10所述的试剂，其中，氧化发色型色原体为无色型色原体。
12.如权利要求11所述的试剂，其中，无色型色原体为吩噻嗪衍生物。
13.如权利要求12所述的试剂，其中，吩噻嗪衍生物为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪。
14.如权利要求9或10所述的试剂，其中，氧化发色型色原体为氧化偶合型色原体。
15.如权利要求14所述的试剂，其中，氧化偶合型色原体是偶合剂与苯胺衍生物或苯酚衍生物的组合。
16.一种试剂盒，是包含第一试剂和第二试剂的用于测定样品中的测定对象成分的试剂盒，其特征在于，无色型色原体和过氧化活性物质分别包含于第一试剂和第二试剂中，过氧化氢生成试剂以及α-酮酸分别包含于第一试剂和第二试剂中的一者或两者中。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其中，无色型色原体为吩噻嗪衍生物。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其中，吩噻嗪衍生物为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪。
19.一种试剂盒，是包含第一试剂和第二试剂的用于测定样品中的测定对象成分的试剂盒，其特征在于，偶合剂和苯胺衍生物或苯酚衍生物分别包含于第一试剂和第二试剂中，过氧化活性物质、过氧化氢生成试剂以及α-酮酸分别包含于第一试剂和第二试剂中的一者或两者中。
20.如权利要求16～19中任一项所述的试剂盒，其中，α-酮酸为选自由丙酮酸、α-酮戊二酸以及草酰乙酸组成的组中的α-酮酸。
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