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KR20080094797A - 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정방법 - Google Patents

렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정방법 Download PDF

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KR20080094797A
KR20080094797A KR1020087020184A KR20087020184A KR20080094797A KR 20080094797 A KR20080094797 A KR 20080094797A KR 1020087020184 A KR1020087020184 A KR 1020087020184A KR 20087020184 A KR20087020184 A KR 20087020184A KR 20080094797 A KR20080094797 A KR 20080094797A
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KR
South Korea
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cholesterol
lipoprotein
remnant
measuring
apolipoprotein
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KR1020087020184A
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후미코 오기하라
마나부 니이미
타카미츠 나카노
카즈시 카나타니
Original Assignee
가부시키가이샤 짐로
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Publication date
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Abstract

시료중의 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤을, 보다 간편한 조작에 의해 또한 감도가 좋게 측정하는 방법 및 측정시약을 제공한다. 리포단백질을 함유하는 피검시료에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 디하이드로게나제를 작용시켜, 효소반응에 의해 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정하는 것에 의해 리포단백질 중의 콜레스테롤을 측정하는 방법에 있어서, 분자 중에 벤젠술폰산 구조를 갖는 계면활성제 또는 폴리아크릴산계 고분자 계면활성제를 사용하는 것을 특징으로 하는, 렘넌트유사(remnant-like) 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정방법.
렘넌트유사 리포단백질, 콜레스테롤

Description

렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정방법{METHOD FOR MEASURING CHOLESTEROL IN REMNANT-LIKE LIPOPROTEIN}
본 발명은, 임상검사에 있어서 동맥경화증 등의 위험인자로 되어 있는 렘넌트 상태의 리포단백질 중의 콜레스테롤을 측정하는 방법 및 측정시약에 관한 것이다.
임상검사에 있어서, 고밀도 리포단백질(HDL) 중의 콜레스테롤은 동맥경화증의 위험인자로서 부(負)의 인자로, 저밀도 리포단백질(LDL) 중의 콜레스테롤은 동맥경화증의 위험인자로서 정(正)의 인자로 되어 있으며, 임상검사의 분야에서 빈번하게 측정되고 있다.
최근, 렘넌트유사(remnant-like) 리포단백질과 같이, 지질의 대사 등에 기인하여 생성되는 리포단백질 중의 콜레스테롤이, 동맥경화증의 위험인자로서, LDL중의 콜레스테롤보다 밀접한 지표가 될 수 있다는 것이 나타나 있으며, 생체시료 중의 리포단백질중에서 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤을 효율적으로 측정하는 것을 과제로 하고 있다.
렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤의 효소측정방법에 관해서는, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 디하이드로게나제에, 인 지질을 분해시키기 위한 효소를 첨가하는 것에 의해, 또 경우에 따라서는, 다시 계면활성제를 첨가하는 측정방법이 보고된바 있다(예를 들면, 특허문헌1 참조).
그러나, 이와 같은 방법에 있어서도, 효소반응의 선택성이나 간편성의 측면에 있어서, 반드시 충분하다고는 할 수가 없다.
특허문헌1 : 일본국 특개평2001-231597호 공보
본 발명의 목적은, 시료중의 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤을, 보다 간편한 조작에 의해 고감도로 측정할 수 있는 방법 및 측정시약을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 종래의 측정방법에 있어서의 실정을 감안하여, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 디하이드로게나제를 사용하여 리포단백질 중의 콜레스테롤을 측정할 때의 조건을 여러가지로 검토한 결과, 특정의 계면활성제를 사용하는 것에 의해, 고밀도의 리포단백질(HDL), 저밀도의 리포단백질(LDL), 카일로마이크론(CM), 초저밀도 리포단백질(VLDL), CM렘넌트, VLDL렘넌트, 중밀도 리포단백질(IDL) 렘넌트 등의 리포단백질을 함유하는 생체시료 가운데에서 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤을 선택적으로 고감도로 측정할 수가 있다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, 리포단백질을 함유하는 피검시료에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 디하이드로게나제를 작용시켜, 효소반응에 의해 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소(補酵素)를 측정하는 것에 의해 리포단백질 중의 콜레스테롤을 측정하는 방법에 있어서, 분자 중에 벤젠술폰산 구조를 갖는 계면활성제 또는 폴리아크릴산계 고분자 계면활성제를 사용하는 것을 특징으로 하는, 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정방법에 관한 것이다.
또 본 발명은, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 디하이드로게나제, 및 분자 중에 벤젠술폰산 구조를 갖는 계면활성제 또는 폴리아크릴산계 고분자 계면활성제를 함유하는 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤 측정시약에 관한 것이다.
도 1은, 본원 발명품 1을 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 2는, 본원 발명품 2를 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 3은, 본원 발명품 3을 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 4는, 본원 발명품 4를 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 5는, 본원 발명품 5를 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 6은, 본원 발명품 6을 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 7은, 비교품 1을 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 8은, 비교품 2를 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 9는, 비교품 3을 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 10은, 비교품 4를 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 11은, 비교품 5를 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 12는, 비교품 6을 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 13은, 비교품 7을 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 14는, 비교품 8을 사용한 경우의 각 리포단백질의 반응곡선을 나타내는 도면.
도 15는, 본 발명의 측정방법에 의해 구한 흡광도값(세로축)과, 시판의 RLP-콜레스테롤 측정 키트를 사용하여 얻어지는 값(가로축)과의 상관관계를 나타낸 도면.
도 16은, 본 발명의 측정방법에 의해 구한 흡광도값(세로축)과, 시판의 RLP- 콜레스테롤 측정 키트를 사용하여 얻어지는 값(가로축)과의 상관관계를 나타낸 도면.
도 17은, 본 발명의 측정방법에 의해 구한 흡광도값(세로축)과, 시판의 RLP-콜레스테롤 측정 키트를 사용하여 얻어지는 값(가로축)과의 상관관계를 나타낸 도면. ((A):항 아포 B-100 항체 미첨가, (B):항 아포 B-100 항체 첨가).
본 발명의 측정방법에 있어서, 시약으로서는, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 디하이드로게나제, 및 분자 중에 벤젠술폰산 구조를 갖는 계면활성제 또는 폴리아크릴산계 고분자 계면활성제를 사용하고, 이것을 리포단백질을 함유하는 피검시료에 작용시켜, 효소반응에 의해 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정하는 것에 의해 리포단백질 중의 콜레스테롤을 측정하는 것이다.
본 발명의 효소반응은, 수성매체 중에서 실시되는바, 특히 완충액 중에서 실시하는 것이 바람직하다.
완충액으로 사용하는 완충제로서는, 예를 들면, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 인산 완충제, 붕산 완충제 및 굿즈 완충제(Good's buffers) 등을 들 수가 있다. 굿즈 완충제로서는, N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산(ACES), N-(2-아세트아미도)이미노2아세트산(ADA), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(BES), 3-[N,N-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시프로판술폰산(DIPSO), N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES), 2-(N-모르폴리 노)에탄술폰산(MES), 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산(이하, MOPS라고 한다), 3-(N-모르폴리노)-2-하이드록시프로판술폰산(MOPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판-3-술폰산)(POPSO) 등을 들 수가 있다.
완충액의 pH는 4~10, 바람직하게는 5~9이다. 완충액의 사용농도는 5~500mM이 바람직하고, 10~200mM이 보다 바람직하며, 20~100mM이 특히 바람직하다.
콜레스테롤 에스테라제로서는, 콜레스테롤 에스테르를 가수분해하는 능력을 갖는 효소라면 특별히 한정되지 않으며, 미생물 또는 동물 유래의 콜레스테롤 에스테라제나 리포프로테인 리파제 등을 들 수가 있다. 이 효소의 대부분은, 적잖게 상기 에스테라제 활성 외에 리포단백질 리파제 활성을 함께 갖는다는 것이 알려져 있으며, 본 발명에 있어서는, 콜레스테롤 에스테라제 활성에 비하여 리포단백질 리파제 활성이 강한 콜레스테롤 에스테라제를 적어도 1종 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로, 리포단백질 리파제와 콜레스테롤 에스테라제의 활성비율(리포단백질 리파제 활성/콜레스테롤 에스테라제 활성)이 12~7000, 바람직하게는 20~1000, 보다 바람직하게는 28~800인 콜레스테롤 에스테라제를 적어도 1종 이상 사용하는 것이 바람직하며, 이것을 사용하는 것에 의해 렘넌트유사 리포단백질에 대한 해당 효소의 선택성을 향상시킬 수가 있다. 또한, 리포단백질 리파제 활성이란, 올리브유 에멀전을 사용한 리포단백질 리파제 활성 분석법에 의해 산출하였을 때의 활성단위를 나타내며(Horiuchi Y. et al. J Biochem 1976;80:367-370), 콜레스테롤 에스테라제 활성이란, 송아지혈청을 사용한 CEN 활성 분석법에 의해 산출한 활성단위 를 나타낸다(Kameno Y. et al. Jap J Clin Path 1976;24:650).
이와 같은 활성비율을 갖는 콜레스테롤 에스테라제로서는, 예를 들면, LP(Asahi Kasei Pharma Corp.제품, 활성비율 460~800), LPBP(Asahi Kasei Pharma Corp.제품, 활성비율 5600~6900), CEN((Asahi Kasei Pharma Corp.제품, 활성비율 13.0~16.0), CE(Amano Enzyme Inc.제품, 활성비율 13.0~16.0), COE311(Toyobo Co., Ltd.제품, 활성비율 28.0~35.0) 또는 이들과 동등한 활성비율을 갖는 효소를 들 수가 있으며, 이들을 조합하여 사용하는 것이 보다 바람직하다. 구체적으로는, CEN과 LP, COE311과 LP 등의 조합을 들 수가 있다.
콜레스테롤 옥시다제로서는, 콜레스테롤을 산화시켜 과산화수소를 생성하는 능력을 갖는 효소라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 미생물 또는 동물 유래의 콜레스테롤 옥시다제를 들 수가 있다.
콜레스테롤 디하이드로게나제로서는, 콜레스테롤을 산화시켜 산화형 보효소를 환원시키는 능력을 가진 효소라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 미생물 또는 동물 유래의 콜레스테롤 디하이드로게나제를 들 수가 있다.
또한, 이들 효소는, 해당 효소의 특이성, 안정성을 더욱 향상시키기 위하여 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기(基), 수용성 올리고당 잔기, 술포프로필기 등으로 해당 효소를 화학적으로 수식한 것이라도 좋고, 또, 유전자조작에 의해 얻어지는 동등한 활성을 갖는 개량효소라도 좋다.
상기 콜레스테롤 에스테라제, 콜레스테롤 옥시다제 및 콜레스테롤 디하이드로게나제의 사용량은, 반응액 중, 각각 0.01~200U/mL가 바람직하며, 0.1~100U/mL가 보다 바람직하다.
분자 중에 벤젠술폰산 구조를 갖는 계면활성제, 또는 폴리아크릴산계 고분자 계면활성제로서는, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 디하이드로게나제의 렘넌트유사 리포단백질에 대한 선택성을 향상시킬 수가 있는 것, 즉, 해당 효소의 렘넌트유사 리포단백질에 대한 작용을 향상시키거나, 또는 해당 효소군의 렘넌트유사 리포단백질 이외의 리포단백질에 대한 작용을 저감시키는 것에 의해, 렘넌트유사 리포단백질에 대한 효소반응을 상대적으로 증강시키는 것이라면 좋다. 분자 중에 벤젠술폰산 구조를 갖는 계면활성제로서는, 예를 들면, 라우릴벤젠술폰산, 도데실벤젠술폰산 등의 알킬벤젠술폰산, 폴리스티렌술폰산, 알킬디페닐에테르디술폰산, 또는 이들의 염류 등을 적합하게 들 수가 있으며, 염류로서는, 예를 들면, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 암모늄염 등을 들 수가 있다. 구체적으로 예를 들면, 뉴렉스 R(Newrex R)(알킬벤젠술폰산 나트륨; Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), 네오펠렉스(Neopelex) No.6, 네오펠렉스 No.25(도데실벤젠술폰산 나트륨; Kao Corp.), 펠렉스 SS-L(알킬디페닐에테르디술폰산 나트륨; Kao Corp.), 폴리스티렌술폰산 칼슘(Sanwa Chemical Co., Ltd.) 등을 적합하게 들 수가 있으며, 그 중에서도 뉴렉스 R, 펠렉스 SS-L을 사용하는 것이, 효소반응의 선택성을 향상시킨다는 점에서 특히 바람직하다.
폴리아크릴산계 고분자 계면활성제로서는, 폴리아크릴산염, 가교형 폴리아크릴산염, 폴리아크릴산염 공중합체 등을 들 수가 있으며, 염으로서는, 나트륨염, 칼륨염 등을 들 수가 있으나, 특히 나트륨염이 바람직하다. 구체적으로 예를 들면, 주리머(Jurymer) AC-103(폴리아크릴산 나트륨; Nihon Junyaku Co., Ltd.), 주리머(Jurymer) AC-20N(폴리아크릴산 나트륨 공중합체; Nihon Junyaku Co., Ltd.), 레오직(Rheogic) 252L, 레오직 306L(가교형 폴리아크릴산 나트륨; Nihon Junyaku Co., Ltd.) 등을 들 수가 있으며, 이 가운데 주리머 AC-103이 바람직하다.
이와 같은 계면활성제의 사용농도는 특별히 한정되지 않으나, 0.001~10%가 바람직하며, 0.01~5%가 보다 바람직하고, 0.05~1%가 특히 바람직하다.
또, 본 발명의 측정방법에 있어서는, 다시 정상적인 리포단백에 함유되는 아포리포단백 B-100에 대하여 반응하고, 변성한 아포리포단백 B-100에는 반응하지 않는 항 아포 B-100항체를 함께 사용하는 것이 바람직하다. 이에 의해 렘넌트유사 리포단백질 이외의 리포단백질에 대한 효소반응을 억제할 수가 있으며, 렘넌트유사 리포단백질에 대한 효소반응을 상대적으로 증강시킬 수가 있다. 이와 같은 항 아포 B-100항체는, 폴리클로널항체, 모노클로널항체 중 어느 것이라도 좋으나, 예를 들면, 항 인간 아포 B-100 마우스모노클로널항체(JI-H, JIMRO사 제품)가 적합하다.
이와 같은 항체의 사용농도는, 특별히 한정되지 않으나, 0.01~10㎎/mL이 바람직하고 0.1~5㎎/mL가 보다 바람직하다.
또한, 항 아포 B-100 폴리클로널항체는, 다음과 같이 하여 제조할 수가 있다. 즉, 면역원으로서 사용하는 정상인의 혈청(LDL)은, 통상적인 방법에 의해 정제한 것을 사용할 수가 있으나, 예를 들면, 초원심법(속 생화학 실험강좌3 「막지질과 혈장 리포단백질」 597-612p)으로 적당히 제조할 수가 있다. 이어서, 해당 정제 LDL을 인간 이외의 동물에 대하여 1회 내지 복수회 면역하고, 혈청 중의 항체력가 (抗體力價)가 상승한 시점에서 채혈하여, 항혈청의 형태로 얻을 수가 있다. 또, 해당 항혈청 중에 렘넌트유사 리포단백질에 반응하는 항체가 존재하는 경우는, 필요에 따라서 렘넌트유사 리포단백질을 첨가하고, 해당 리포단백질을 흡수하는 것에 의해, 상기 항혈청을 측정에 사용할 수가 있다.
또, 항 아포 B-100 모노클로널 항체의 제조순서로서는, 우선, 상술한 정상인 혈청 유래의 정제 LDL을 항원으로 하여, 프로인드 보조액(Freund's adjuvant) 등으로 혼탁시켜서, 마우스를 수회에 걸쳐 면역시키고, 면역이 종료된 후에 적출한 비장세포를 마우스 미엘로마세포(예를 들면, NS-1세포 등)와 융합시켜서 하이브리도마를 제작하여 클론을 얻는다(일본국 특공평4-53516호 공보). 목적으로 하는 항체를 산생하는 클론의 검색은, 상술한 정상인의 정제 LDL 및 고지혈증 환자 유래의 정제 LDL에 대한 결합성을 비교하여, 정상인의 정제 LDL에 보다 강하게 결합하는 하이브리도마를 선택하는 것에 의해 목적으로 하는 클론을 얻을 수가 있다. 본 실시예에서 사용된 모노클로널 항체 JI-H도, 상기의 순서에 따라서 제조되었다.
또, 면역동물은, 필요에 따라서 마우스 이외의 동물, 예를 들면 실험쥐(rat) 등을 이용할 수도 있다. 이 경우, 미엘로마세포로서는, Y3, Ag123세포 등을 적절하게 사용할 수가 있다.
본 발명의 측정방법에 있어서, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제를 사용하는 경우는, 콜레스테롤의 반응에 의해 산소로부터 과산화수소가 발생한다. 발생한 과산화수소는, 예를 들면, 퍼옥시다제의 존재하에서, 4-아미노안티피린과 페놀류, 4-아미노안티피린과 트린더시약(Trinder reagent) 또는 고감도의 색소 원을 사용하여 정량(定量)할 수가 있다.
페놀류로서는, 예를 들면, 페놀, 4-클로로페놀, m-크레졸, 3-하이드록시-2,4,6-트리요오드 안식향산(HTIB) 등을 들 수가 있다.
트린더시약(Dojindo Laboratories, 19판 종합 카탈로그, 2002년)으로서는, N-술포프로필아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘(TOOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린(MAOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3, 5-디메톡시아닐린(DAOS), N-에틸-N-술포프로필-m-톨루이딘(TOPS), N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(HDAOS), N,N-디메틸-m-톨루이딘, N,N-디술포프로필-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-술포프로필-m-아니시딘, N-에틸-N-술포프로필아닐린, N-에틸-N-술포프로필-3,5-디메톡시아닐린, N-술포프로필-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-술포프로필-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-m-아니시딘, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-m-3-술포프로필-3-메톡시아닐린(APPS), N-에틸-N-3-술포프로필아닐린(ALPS), N-에틸-N-2-하이드록시-3-술포프록실-3-메톡시아닐린 등의 아닐린류 또는 N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민(EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민 등을 들 수가 있다.
고감도의 색소원으로서는, 일본국 특공소60-33479호 공보에 개시된 10-(N-메틸카르바모일)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진(MCDP), 일본국 특공평4-27839에 개시된 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민(BCMA), 일본국 특 개소62-296호 공보에 개시된 화합물 등을 들 수가 있다.
이들 색소원의 농도로서는, 0.01~10mM이 바람직하다.
또, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 디하이드로게나제를 사용하는 경우는, 콜레스테롤의 반응에 의해 산화형 보효소인 NAD(P)로부터 환원형 보효소인 NAD(P)H가 발생한다. NAD(P)H는, 300~500㎚, 바람직하게는 330~400㎚, 특히 바람직하게는 약 340㎚에서의 반응액의 흡광도를 측정하는 것에 의해 정량(定量)할 수가 있다. 또한, NAD(P)H의 정량은, 디아포라제, 테트라졸륨염을 첨가하여 포르마잔 색소를 생성시키고, 포르마잔 색소를 비색(比色)하여 실시할 수도 있다.
반응은, 10~50℃, 바람직하게는 30~40℃, 통상적으로 37℃에서, 1~30분간, 바람직하게는 2~10분간 실시한다.
본 발명의 측정방법은, 상기의 시약을 피검시료에 작용시키는 것인바, 피검시료가 상기 계면활성제, 또는 계면활성제와 정상적인 리포단백질에 함유되는 아포리포단백 B-100에 대하여 반응하고, 변성한 아포리포단백 B-100에는 반응하지 않는 항 아포 B-100항체와 반응하며, 이어서 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 디하이드로게나제가 반응한다는 작용순서가 유지되고 있으면, 각 시료의 첨가방법이나 첨가순서 등은 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 반응은 수성매체 중에서 실시되기 때문에, 피검시료를 완충액 등으로 구성되는 수성매체에 첨가하여 25℃~40℃에서 교반 조제한 후, 본 발명의 시약을 첨가하여 1~10분간 반응시켜서, 측정하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 시약의 구성은, 계면활성제를 함유하는 시약, 계면활성제 와 정상적인 리포단백질에 함유되는 아포리포단백 B-100에 대하여 반응하고, 변성한 아포리포단백 B-100에는 반응하지 않는 항 아포 B-100 항체를 함유하는 시약, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 디하이드로게나제를 함유하는 시약을 각각 개별적으로 준비하는 것과, 또는 이들을 일체적으로 구성하는 것 중 어느 것으로 하여도 좋다. 그리고, 개별적으로 구성한 경우에는, 그들을 순차적으로 첨가하여 사용하거나 또는 한꺼번에 첨가하여 사용할 수도 있다.
또한, 상기의 각 시약은 액상이라도 좋고, 정제, 분말 등의 고형상이라도 좋다.
또, 해당 측정시약에는, 필요에 따라서 생체시료 중의 글로불린 등의 단백질을 가용화하기 위한 여러가지 염류, 리포단백질 응집제, 그 밖의 효소 등을 함유시킬 수가 있다.
이와 같은 염류로서는, 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 아세트산마그네슘, 염화리튬, 황산리튬, 염화암모늄, 황산암모늄, 질산마그네슘, 질산칼슘 등을 들 수가 있으며, 0~100mM의 범위에서 사용된다.
리포단백질 응집제로서는, 인텅스텐산염, 덱스트란황산염, 헤파린 등의 폴리아니온이, 마그네슘, 칼슘, 코발트 등 2가의 금속염을 들 수가 있다. 그 밖의 효소로서는 아스코르빈산 옥시다제 등을 들 수가 있다.
또, 본 발명을 적용하는 피검시료는 특별히 한정되는 것은 아니며, 구체적으로는 생체시료에 있어서는 혈액자체 또는 혈장, 혈청 등의 혈액획분(血液劃分)을 사용할 수가 있다.
(실시예)
이하에, 실시예를 들어서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1
(1) 시료의 조제
혈청 성분을 렘넌트유사 리포단백질 획분, LDL획분 및 HDL획분으로 분획하고, 각 리포단백질의 측정을 실시하였다. 상기 단백질의 분획방법은 다음과 같다.
항 아포 B-100 항체 결합 어피니티 칼럼(affinity column), 항 아포 A-1 항체 결합 어피니티 칼럼을 각각 제조하고, 혈청을 첨가하여 결합 획분을 회수하여, 각각 LDL, HDL로 하였다. 또, 상술한 양 칼럼에 혈청을 첨가하고, 그대로 통과하는 획분을 회수하여 렘넌트유사 리포단백질 획분(RLP)으로 하였다. 각각의 리포단백질은 HPLC에 의한 분석으로 확인하였다. 또, 각 리포단백질 중의 콜레스테롤의 농도를 총 콜레스테롤 측정용 시약 키트를 사용하여 5㎎/dl로 조제하였다.
(2) 측정시약의 조제
하기에 나타내는 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤 측정시약을 제조하였다.
시약 1
굿즈완충제 pH6.8(PIPES, Dojindo Laboratories 제품) 50mM
HDAOS(Dojindo Laboratories 제품) 1mM
계면활성제(표 1 참조; 본발명품1~2, 비교품2~8)
시약 2
굿즈완충제 pH6.8(BES, Dojindo Laboratories 제품) 50mM
4-아미노안티피린(Kanto Chemical Co., Inc. 제품) 3mM
퍼옥시다제(Amano Enzyme, Inc. 제품) 10단위/mL
콜레스테롤 에스테라제 (COE311:활성비율 31.8, Toyobo Co., Ltd. 제품) 15단위/mL
콜레스테롤 옥시다제(Amano Enzyme, Inc. 제품) 6단위/mL
(3) 측정방법·결과
시약 1을 210μL 분광광도계의 셀에 넣고, 시료 20μL를 첨가하여 교반하고, 37℃로 가온하였다. 이어서 344초 후에 시약 2를 70μL 첨가하여 교반하고, 주파장 572㎚ 및 부파장 748㎚에서 667초 후까지 측정하였다.
시약 2를 첨가할 때, 즉 344초 후(측광포인트 20)부터 667초 후(측광포인트 38)까지의 흡광도 변화량을 구하고, RLP, HDL 및 LDL에 있어서, RLP의 흡광도 변화량을 100으로 하였을 때의 상대비율을 산출하였다. 그 결과를 표 2 및 도 1~14에 나타낸다.
시약 화합물명 회사명 농도 분류 제품명 상대비율
LDL HDL RLP
본발명품 1 알킬벤젠 술폰산 나트륨 Nippon oil & Fats Co., Ltd. 0.1% 음이온성 계면활성제 뉴렉스 R 3 8 100
본발명품 2 알킬벤젠 술폰산 나트륨 Kao Corp. 0.1% 음이온성 계면활성제 네오펠렉스 No.6 33 24 100
본발명품 3 알킬벤젠 술폰산 나트륨 Kao Corp. 0.1% 음이온성 계면활성제 네오펠렉스 No.25 53 35 100
본발명품 4 알킬디페닐 에테르 디술폰산 나트륨 Kao Corp. 0.1% 음이온성 계면활성제 펠렉스 SS-L 14 11 100
본발명품 5 폴리스티렌 술폰산칼슘 Sanwa Chemical Co., Ltd. 0.1% 음이온성 계면활성제 폴리스티렌 술폰산 Ca 43 29 100
본발명품 6 폴리아크릴산나트륨 Nihon Junyaku Co., Ltd. 0.1% 고분자 계면활성제 주리머 AC-103 65 35 100
비교품1 무첨가 - - - - 93 35 100
비교품2 폴리옥시 에틸렌폴리 옥시프로필렌블록폴리머 Asahi Denka Co., Ltd. 0.1% 비이온성 계면활성제 플루로닉 F108 17 285 100
비교품3 하이드록시 에틸에틸렌 디아민나트륨 Kawaken Fine Chemicals Co., Ltd. 0.1% 양성(兩性) 계면활성제 소프다졸린 SFD 47 102 100
비교품4 펜탄술폰산 나트륨 Avocado Research Chemicals Ltd. 0.1% 음이온성 계면활성제 펜탄술폰산 나트륨 80 40 100
비교품5 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린 공중합체 Nippon oil & Fats Co., Ltd. 0.1% 인지질계 고분자
Figure 112008058746350-PCT00001
 97 26 100
비교품6 염산알킬 디아미노 에틸글리신 Sanyo Chemical Industries, Ltd. 0.1% 양성(兩性) 계면활성제 레본 LAG40 104 124 100
비교품7 폴리옥시에틸렌트리이소 스테아린산 트리메티롤 프로판 Nihon Emulsion Co., Ltd. 0.1% 비이온성 계면활성제 EMALEX TPIS-350 128 142 100
비교품8 이미다졸리늄베타인계 Lion Corp. 0.1% 양성(兩性) 계면활성제 에나디콜 C-40H 123 118 100
표 2 및 도 1~14로부터, 본원 발명품1~6은, 비교품1~8과 비교하여, LDL 및 HDL에 대한 효소반응이 모두 억제되었으며, RLP에 대한 효소작용의 선택성이 현저히 상승되어 있었다.
실시예 2
이어서, 자동분석장치 TBA-20R(Toshiba Corp.)을 사용하여 본 발명의 측정방법에 따라서, 인간 혈청 중의 RLP-콜레스테롤량을 측정하였다. 또한, 계면활성제로는, 뉴렉스 R(본원 발명품)을 사용하였다.
시약 1
굿즈완충제 pH6.8(PIPES, Dojindo Laboratories 제품) 50mM
HDAOS(Dojindo Laboratories 제품) 1mM
뉴렉스 R (Nippon oil & Fats Co., Ltd.) 0.01%
시약 2
굿즈완충제 pH6.8(BES, Dojindo Laboratories 제품) 50mM
4-아미노안티피린(Kanto Chemical Co., Inc. 제품) 3mM
퍼옥시다제(Amano Enzyme, Inc. 제품) 10단위/mL
콜레스테롤 에스테라제 (COE311:활성비율 31.8, Toyobo Co., Ltd. 제품) 15단위/mL
콜레스테롤 옥시다제(Amano Enzyme, Inc. 제품) 6단위/mL
측정방법은, 시약 1을 210μL 분광광도계의 셀에 넣고, 혈청 5μL를 첨가하여 교반하고, 37℃로 가온하였다. 이어서 344초 후에 37℃로 예비가온된 시약 2를 70μL 첨가하여 교반하여, 주파장 572㎚ 및 부파장 748㎚에서 667초 후까지 측정하였다.
측광포인트 34~38(595~667초)의 흡광도값(블랭크:측광포인트 15~19(251~328초))을 측정하고, 시판의 RLP-콜레스테롤 측정 키트(JIMRO사 제품)와의 상관을 측정하였다(도 15). 그 결과, 도 15로부터, 본 발명의 측정방법에 의해 구한 값과, 시판되고 있는 키트 사이에는 높은 상관이 인정되었다.
실시예 3
자동분석장치 7080(Hitachi, Ltd.)를 사용하여 본 발명의 측정방법에 따라서, 인간 혈청 중의 RLP-콜레스테롤량을 측량하였다. 또한, 계면활성제로는, 펠렉스 SS-L(본원 발명품4)을 사용하고, 콜레스테롤 에스테라제로서는, COE 311(활성 31.8) 및 LP(활성비율 512)를 사용하였다.
시료 : 인간 혈청 30검체
시약 1
굿즈완충제 pH6.5(PIPES, Dojindo Laboratories 제품) 50mM
HDAOS(Dojindo Laboratories 제품) 1mM
펠렉스 SS-L 0.02%
시약 2
굿즈완충제 pH6.5(PIPES, Dojindo Laboratories 제품) 50mM
4-아미노안티피린(Kanto Chemical Co., Inc. 제품) 3mM
퍼옥시다제(Amano Enzyme, Inc. 제품) 10단위/mL
콜레스테롤 에스테라제 (COE311:활성비율 31.8, Toyobo Co., Ltd. 제품) 10단위/mL
콜레스테롤 에스테라제 (LP: 활성비율 512, Asahi Kasei Pharma Corp. 제품) 20단위/mL
측정방법은, 혈청 5μL을 분광광도계의 셀에 넣고, 시약 1을 210μL 첨가하여 교반하고, 37℃로 가온하였다. 이어서 320초 후에 시약 2를 70μL 첨가하여 교반하여, 주파장 570㎚ 및 부파장 750㎚에서 980초 후까지 측정하였다.
측광포인트 33(660초)과 측광포인트 17(340초)의 흡광도 차를 구하고, 시판의 RLP-콜레스테롤 측정 키트(JIMRO사 제품)와의 상관을 측정하였다(도 16). 그 결과, 도 16으로부터, 본 발명의 방법에 의해 구한 값과, 시판되고 있는 키트 사이에는 높은 상관(R=0.9294)이 인정되었다.
실시예 4
자동분석장치 7080(Hitachi, Ltd.)를 사용하여 본 발명의 측정방법에 따라서, 혈청 중의 RLP-콜레스테롤량을 측정하였다.
시료 : 인간 혈청 27검체
시약 1
PIPES(pH6.8)(Dojindo Laboratories 제품) 50mM
콜레스테롤 옥시다제(Amano Enzyme, Inc. 제품) 2U/mL
펠렉스 SS-L(Kao Corp. 제품) 0.05%
HDAOS(Dojindo Laboratories 제품) 1mM
항 아포 B-100 모노클로널 항체(JI-H, JIMRO Co., Ltd. 제품) 1㎎/mL
시약 2
BES(pH6.8)(Dojindo Laboratories 제품) 50mM
콜레스테롤 에스테라제(Toyobo Co., Ltd. 제품) 15U/mL
퍼옥시다제(Amano Enzyme, Inc. 제품) 10U/mL
4-아미노안티피린(Kanto Chemical Co., Inc. 제품) 3mM
소혈청 알부민(Sigma-Aldrich Japan KK 제품) 0.1%
측정조건·방법
측정 파라미터를 다음과 같이 설정하여 측정하였다.
측정방법 : 레이트법 test read timing [22]-[25]
시료의 양 : 5μL
R1량 : 210μL
R2량 : 70μL
측정파장 : 주파장 570㎚
부파장 750㎚
측정온도 : 37℃
검체 5μL에 시약 1을 210μL 첨가하여 교반하고, 37℃로 가온하였다. 이어서 5분 후에 시약 2를 70μL 첨가하여 교반하고, 주파장 570㎚ 및 부파장 750㎚에서 측정하였다. 시약 2를 첨가한 후의 1분간 마다의 흡광도 변화량을 측정하고, 시판되고 있는 RLP-콜레스테롤 측정 키트(JIMRO Co., Ltd. 제품)와의 상관을 측정하였다(도 17). 그 결과, 도 17로부터 항 아포 B-100 항체를 첨가한 경우는, 첨가하지 않은 경우와 비교하여 시판 키트와의 사이에 보다 높은 상관이 인정되었다.
본 발명의 측정방법 및 측정시약을 사용함으로써, 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤을 극히 간편한 방법으로 감도 좋게 측정할 수가 있다.

Claims (9)

  1. 리포단백질을 함유하는 피검시료에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 디하이드로게나제를 작용시켜, 효소반응에 의해 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정하는 것에 의해 리포단백질 중의 콜레스테롤을 측정하는 방법에 있어서,
    분자 중에 벤젠술폰산 구조를 갖는 계면활성제 또는 폴리아크릴산계 고분자 계면활성제를 사용하는 것을 특징으로 하는, 렘넌트유사(remnant-like) 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정방법.
  2. 제1항에 있어서,
    또한, 정상적인 리포단백에 함유되는 아포리포단백 B-100에 대하여 반응하고, 변성한 아포리포단백 B-100에는 반응하지 않는 항 아포 B-100항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 계면활성제 또는 계면활성제와 정상적인 리포단백에 함유되는 아포리포단백 B-100에 대하여 반응하고, 변성한 아포리포단백 B-100에는 반응하지 않는 항 아포 B-100항체를 피검시료에 작용시킨 후에, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 디하이드로게나제를 작용시키는 것을 특징으로 하는, 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 계면활성제로서, 알킬벤젠술폰산, 폴리스티렌술폰산, 알킬디페닐에테르디술폰산 또는 그들 염류 또는 폴리아크릴산염을 사용하는 것을 특징으로 하는, 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포단백질 리파제와 콜레스테롤 에스테라제의 활성비율(리포단백질 리파제 활성/콜레스테롤 에스테라제 활성)이 12~7000의 콜레스테롤 에스테라제를 적어도 1종 사용하는 것을 특징으로 하는, 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정방법.
  6. 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 디하이드로게나제, 및 분자 중에 벤젠술폰산 구조를 갖는 계면활성제 또는 폴리아크릴산계 고분자 계면활성제를 함유하는 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정시약.
  7. 제6항에 있어서,
    또한, 정상적인 리포단백에 함유되는 아포리포단백 B-100에 대하여 반응하고, 변성한 아포리포단백 B-100에는 반응하지 않는 항 아포 B-100항체를 함유하는 것을 특징으로 하는, 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정시약.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 계면활성제가, 알킬벤젠술폰산, 폴리스티렌술폰산, 알킬디페닐에테르디술폰산 또는 그들 염류 또는 폴리아크릴산염인 것을 특징으로 하는, 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정시약.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포단백질 리파제와 콜레스테롤 에스테라제의 활성비율(리포단백질 리파제 활성/콜레스테롤 에스테라제 활성)이 12~7000의 콜레스테롤 에스테라제를 적어도 1종 사용하는 것을 특징으로 하는, 렘넌트유사 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정시약.
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