CN100529094C - L-氨基酸的生产方法 - Google Patents

Abstract

一种生产L-氨基酸的方法，包括：在培养基中培养能产生L-氨基酸的微生物，在培养基中积累L-氨基酸，从培养基收集L-氨基酸。培养的微生物为具有恩特纳-道德洛夫途径的革兰氏阴性细菌，且它已经被改造过，使得它的6-磷酸葡糖酸脱水酶或2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶的活性被分别或同时增强。

Description

L-氨基酸的生产方法

发明领域

本发明涉及生产L-氨基酸的方法和生产过程中使用的菌株。确切的说，本发明涉及了生产L-氨基酸能力增强的细菌和用这种细菌生产L-氨基酸的方法。

背景技术

传统上，利用短棒状细菌的发酵作用生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)，这种短棒状细菌属于短杆菌属、棒状杆菌属或者微杆菌属(“氨基酸发酵”，GakkaiShuppan Center，pp，195-215，1986)。进一步发展用芽孢杆菌属、链霉菌属、青霉素属(U.S.Patente No.3,220,929)、假单胞菌属、节杆菌属、沙雷菌属、气杆菌属、念珠菌属(U.S.Patent No.3,563,857)、埃希氏菌属(Japanese PatentLaid-open Publication(kokai)No.5-244970)等细菌生产L-氨基酸。后来又用肠杆菌属(EP1078989A2)克雷白菌属，欧文菌属和泛菌属(Japanese patent Laid-openPublication No.2000-106869)的细菌生产L-氨基酸，如L-谷氨酸。

此外，已经公开了许多通过应用DNA重组技术来增强L-氨基酸生物合成过程中所需要的酶，以便提高L-氨基酸的产量的技术。例如，已公开的一种方法是用导入了柠檬酸合酶基因的肠杆菌属或克雷白菌属细菌合成L-谷氨酸(EP0999282A2)；另一种方法是用导入了柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、谷氨酸脱氢酶基因的肠杆菌属的细菌合成L-谷氨酸(EP 1 078 989A2)。

另外，通过导入编码糖酵解酶的基因来增加L-氨基酸产量的方法也已得到广泛认可，这些糖酵解酶例如是葡糖-6-磷酸异构酶(WO 01/02542 Al)、果糖磷酸转移酶(WO 01/48146 Al)和烯醇化酶(WO 01/02543 Al)。

同时，许多包括肠道杆菌在内的革兰氏阴性菌都可通过恩特纳-道德洛夫途径(Entner-Doudoroff)进行葡萄糖酵解。这个途径包括6-磷酸葡糖酸脱水酶(简称EDD)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶(以下简称EDA)，前者可催化6-磷酸葡糖酸分解产生2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸，后者可将2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸分解为甘油醛-3-磷酸和丙酮酸。目前已经从大肠埃希氏菌、运动发酵单胞发酵单孢菌等细菌中克隆了编码EDD和EDA的基因，它们的核苷酸序列已有报导。来自大肠埃希氏菌的EDD(edd)和EDA(eda)基因的核苷酸序列已在GenBank注册，编号为L20897。另外，在数据库中，来自运动发酵单胞菌的EDA基因核苷酸序列在GenBank注册，编号为X58364；编码EDD基因核苷酸序列已在GeneBnk注册，编号为M60615，M37982。

然而，恩特纳-道德洛夫途径和L-氨基酸产量的关系目前还不十分清楚。

发明概述

本发明的目的是提供一种不同于已知技术的新技术，提高细菌中L-氨基酸的产率。

发明人关注的是革兰氏阴性菌所具有的恩特纳-道德洛夫途径。在由糖转化为L-氨基酸(如L-谷氨酸)的代谢途径中，二氧化碳产生于6-磷酸葡糖酸脱氢酶催化6-磷酸葡糖酸分解产生核酮糖5-磷酸的反应中。在菌株中有大量的碳流入戊糖磷酸的路径，尤其是上面提到的反应中有大量的二氧化碳产生。因此，他们认为可通过避免流入戊糖磷酸路径的方法来提高细菌合成L-氨基酸(如L-谷氨酸)的能力。

发明人设计了两种方法减少碳流入戊糖磷酸路径：(1)去除或降低葡糖-6-磷酸脱氢酶或6-磷酸葡糖酸脱氢酶的活性；(2)增强恩特纳-道德洛夫途径。期望这两种方法都能有效绕开戊糖磷酸路径。然而，在方法(2)中，需要考虑到一点就是，既然通过调节EDD和EDA的活性能够改变与戊糖磷酸路径相关的碳分布，那么戊糖磷酸路径的中间物质的衍生物例如核苷酸也能得到补充。另外，经过大量研究，发明人发现增强恩特纳-道德洛夫途径可提高细菌生产L-氨基酸的能力。这样就完成了本项发明。

本发明提供如下内容：

(1)生产L-氨基酸的方法包括，在培养基中培养能产生L-氨基酸的微生物，以在培养基中生产和富集L-氨基酸，并从培养基收集L-氨基酸，其中培养的微生物为具有恩特纳-道德洛夫途径的革兰氏阴性细菌，且它已经被改造过，使得它的6-磷酸葡萄糖酸脱水酶或2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶的活性被分别或同时增强，并且以丙酮酸做中间物的生物合成途径可产生多种L-氨基酸，从中选择特定的L-氨基酸。

(2)方法根据方法(1)，其中细菌为一种肠道杆菌。

(3)方法根据方法(2)，其中细菌属于肠杆菌属。

(4)方法根据方法(1)-(3)中的任一方法，通过增加编码6-磷酸葡萄糖酸脱水酶基因或2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶基因的拷贝数提高这两种酶的活性，或者通过修饰基因的表达调节序列，使细菌细胞中二者的表达量提高。

(5)方法根据方法(1)，但其中的L-氨基酸是L-谷氨酸，或者是利用L-谷氨酸做为中间物或氨基供体经生物合成的L-氨基酸。

(6)方法根据方法(1)到(5)中的任一种方法，但其中的L-氨基酸是选自L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸的。

(7)方法根据方法(6)，但其中的L-氨基酸是L-谷氨酸。

使用本发明方法，通过提高恩特纳-道德洛夫途径，可以提高具有此途径的微生物合成L-氨基酸的能力。

附图说明

图1表示edd基因和eda基因表达增强菌株的生长情况(A)和合成L-谷氨酸的量(B)。

图2表示edd基因和eda基因表达增强菌株合成3-羟基丁酮和2，3-丁二醇的量：(A)培养基中3-羟基丁酮的量，(B)培养基中2，3-丁二醇的量，(C)平均每单位细菌细胞(是指单位干细胞的重量)产生的3-羟基丁酮和2，3-丁二醇量的总和。

发明具体实施方式

以下为本发明的详细描述

<1>本发明中的细菌

本发明所用的革兰氏阴性细菌具有生产L-氨基酸的能力，并且具有恩特纳-道德洛夫途径。

术语“生产L-氨基酸的能力”在本发明中是指当用培养基培养本发明所用细菌时，培养基中累积L-氨基酸的能力。这种生产L-氨基酸的能力可能是革兰氏阴性菌野生株的特性或经繁殖传代后所获得或增强的特性的。本发明中所用到的L-氨基酸是以丙酮酸做为中间物的生物合成途径产生的。其具体例包括L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸等等。

正如后面所述实施例显示，具有通过增强EDD和EDA活性而增强恩特纳-道德洛夫途径的细菌，可增加3-羟基丁酮和2，3-丁二醇的产量。因为2，3-丁二醇是由3-羟基丁酮合成，而3-羟基丁酮是由丙酮酸合成的，3-羟基丁酮和2，3-丁二醇的产量增加表明增加了丙酮酸的供应量。因此，人们期望通过加强的恩特纳-道德洛夫途径的细菌来提高以丙酮酸做为中间产物的生物合成途径生产L-氨基酸的能力。

具体的具有恩特纳-道德洛夫途径的细菌主要属于肠杆菌属、克雷白菌属、沙雷菌属、欧文菌属或泛菌属、埃希氏菌属、假单孢菌属、节杆菌属、气杆菌属等等。如何判别一种细菌是否具有恩特纳-道德洛夫途径，举例来说就是将细胞碎片悬浊液与甘油醛-3-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸以及乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸混合，然后通过测定365nm处吸收增强来检测是否有以6-磷酸葡萄糖酸为底物合成的3-磷酸甘油醛。如果一种细菌被证明可产生甘油醛3-磷酸，那么该细菌就具有恩特纳-道德洛夫途径。

本发明中所用到的细菌可以根据所需要合成的L-氨基酸的种类而适当选择。下面详细的列举了一些适合生产L-氨基酸的细菌。但本发明的范围不受这些例子的限制。

肠杆菌属中的具体细菌如下：

成团肠杆菌

产气肠杆菌

河生肠杆菌

阿氏肠杆菌

阴沟肠杆菌

溶解肠杆菌

日勾维肠杆菌

霍氏肠杆菌

中间肠杆菌

超压肠杆菌

阪崎肠杆菌

泰洛肠杆菌

更优选下列细菌菌株

成团肠杆菌ATCC12287

成团肠杆菌AJ13355

成团肠杆菌AJ13356

成团肠杆菌AJ13601

成团肠杆菌AJ13355和AJ13556于1998年2月19日在国家生物科学和人类技术研究所的工业科学技术代理处(National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)(目前为一个独立的管理公司，国际性专利组织保藏中心、国家高级工业科学技术研究所(International Patent Organism Depositary，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology)，地址：Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，postal code.305-5466)保藏，其受理登记号分别为FERM P-16644和FERM P-16645。然后根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的有关规定在1999年1月11日该保藏成为国际保藏，其受理登记号为FERM BP-6614和FERM BP-6615。1999年8月18日成团肠杆菌AJ13601在国家生物科学和人类技术研究所的工业科学技术代理处(National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)开始保藏，其受理登记号为FERM P-17516。然后根据布达佩斯条约的有关规定在2000年7月6日该保藏成为国际性保藏，其受理登记号为FERM BP-7207。成团肠杆菌ATCC 12287可从ATCC获得(美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，U.S.A.)。

克雷白菌属细菌举例如下：

植生克雷白菌

土生克雷白菌

更优选植生克雷白菌AJ13399。植生克雷白菌AJ13399于1998年2月19日在国家生物科学和人类技术研究所的科学技术代理处(National Institute ofBioscience and Human-Technology，Agency of Science and Technology)(目前为一个独立的管理公司，国际性专利组织保藏中心、国家高级工业科学技术研究所)保藏，其受理登记号为FERM P-16646。然后根据布达佩斯条约的有关规定在1999年1月11日该保藏成为国际保藏，其受理登记号为FERM BP-6616。

植生克雷白菌AJ13399菌株是从北海道札幌(Sapporo-Shi，Hokkaido)的土壤中分离得到的。

用于本发明的沙雷菌属细菌的例子如下：

液化沙雷菌

嗜虫沙雷菌

无花果沙雷菌

居泉沙雷菌

格氏沙雷菌

变形斑沙雷菌

气味沙雷菌

普利茅斯沙雷菌

深红沙雷菌

更优选下列细菌菌株：

液化沙雷菌ATCC 14460

液化沙雷菌ATCC 14460可从ATCC获得。

用于本发明的欧文菌属细菌的例子如下：

草生欧文菌(现在已划归成团泛菌属)

菠萝欧文菌

仙人掌腐烂病欧文菌

菊欧文菌

野梧桐欧文菌

桃色欧文菌

番石榴欧文菌

栎欧文菌

大黄欧文菌

生红欧文菌

柳欧文菌

噬夏孢欧文菌

更优选草生欧文菌IAM1595(成团泛菌AJ2666)。草生欧文菌IAM1595可从东京大学分子细胞生物学研究所(Institute of Molecular and Cellular Bioscience，the University of Tokyo)获得。

在伯格的《鉴定细菌学手册》第9版(Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology，9th，Ed)中没有提到草生欧文菌，因为它已被划归为成团泛菌。欧文菌属细菌和泛菌属细菌彼此紧密相关，所以泛菌属细菌可同样做为欧文菌属细菌使用。以上提到的成团泛菌和分散泛菌以及菠萝泛菌就属于这种泛菌属。草生欧文菌IAM1595被指定为成团泛菌AJ2666，1999年2月25日，在国家生物科学和人类技术研究所的科学技术代理处(目前为一个独立的管理公司，国际性专利组织的保藏中心、国家先进工业科学技术研究所(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology))保藏，根据布达佩斯条约的有关规定申请获得国际保藏，其受理登记号为FERM BP-6660。

用于本发明的埃希氏菌属细菌的例子包括大肠埃希氏杆菌。

更优选具有抗缬氨酸的大肠埃希氏杆菌，具体的例子包括以下菌株：

大肠埃希氏杆菌K-12(ATCC 10798)

大肠埃希氏杆菌W(ATCC 9637)

大肠埃希氏杆菌K-12(ATCC 10798)和大肠埃希氏杆菌W(ATCC 9637)可从ATCC获得。

本发明中所用到的革兰氏阴性细菌具有生产L-氨基酸的能力，和前面提到的恩特纳-道德洛夫途径，并且经过修饰使得EDD和EDA的活性分别或同时得到增强。本发明中所用的细菌优选革兰氏阴性细菌，其经过修饰使得EDD和EDA活性同时得到增强。

“经过修饰使得EDD或EDA活性增强”的含义是指修饰过的菌株单位细胞中EDD或EDA活性比野生菌株的要高。例如可以提及的是单位细胞中EDD或EDA的分子数量增加，单位EDD或EDA分子中EDD或EDA特定活性的增强等等。另外，与之相比较的野生菌株没有经过任何以增强EDD或EDA活性为目的的处理。

可通过增加编码EDD和/或EDA的基因的拷贝数来增强细菌的EDD和/或EDA活性。例如，将编码EDD和/或EDA的基因片段与一个在靶细菌中有功能的载体(优选多拷贝载体)相连接制备成重组DNA，然后可将重组DNA导入细菌使之转化。为了使EDD和EDA的活性同时增强，可以将编码EDD和EDA的基因片段分别引入到不同的载体上，但优选将二者引入到相同的载体上。可将重组DNA导入具有生产L-氨基酸能力的细菌中，也可选择性的导入野生菌株中获得转化菌株，赋予该转化菌株生产L-氨基酸的能力。

象编码EDD和编码EDA的基因一样，可以使用具有恩特纳-道德洛夫途径的衍生自革兰氏阴性菌的任何基因。特别要提及的是衍生自埃希氏菌属细菌的基因。有研究报道衍生自大肠杆菌的编码EDD的基因(edd)和编码EDA的基因(eda)可组成一种操纵子(J.Bacteriol.，174(14)：4638-46，July 1992)。在下文中edd就指编码EDD的基因，eda就指编码EDA的基因。此外，也有研究报道了从发酵单孢菌属细菌中得到基因，通过PCR法(Polymerase ChainReaction，参见White，T.J.et al.，Trends Genet.5,185(1989))或杂交可得到edd和eda基因，前者所用的引物主要是来自这些基因的序列，后者所用探针基于前面所提到的基因序列。例如，可利用edd-F(SEQ ID NO：1)和eda-R(SEQ ID NO：2)作引物(描述见后)通过PCR方法获得一个包含有大肠杆菌edd基因和eda基因的操纵子片段。也可通过类似的方法获得其它微生物的edd基因和eda基因。研究表明适宜的杂交条件是在60℃，盐离子浓度为1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS的条件下进行洗涤。

另外，本发明中所使用的edd基因和eda基因并不局限为野生型基因，它们也可以是突变型或人工改造的基因，这些基因编码的产物包括氨基酸的置换、缺失、插入、叠加等，可以是在一个或多个位点出现有一个或几个氨基酸的上述变化，但只要EDD和EDA的功能不被削弱即可。虽然上面所提到的“几个”氨基酸数量的不同是由蛋白质三维结构中的氨基酸残基的位置和类型所决定的，但这可能是特定的由2到60，优选从2到40，更优选从2到20。另外，因为这种DNA编码的蛋白质与前面所提到的EDD和或EDA基本上相同，可以用它和已知的edd或eda基因(例如GenBank accession L20897，X58364，M60615，M37892)的核苷酸序列或由这些核苷酸序列制备的探针在严格条件下进行DNA杂交，并合成与EDD或EDA活性相似的蛋白质。这里所说的“严格条件”是指在此条件下只产生特异性的杂交，而不产生非特异性的杂交。很难用数字来清楚的描述这种反应条件，然而，举例来说严格条件包括DNA具有高度同源性的情况，例如DNA的同源性达到50％或以上时可发生DNA间的杂交，但DNA的同源性低于50％则DNA之间不发生杂交。研究表明，可选择的DNA之间杂交的严格条件是盐离子浓度符合Southern杂交的常规洗涤条件，即在60℃，1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS。

利用Saito和Miura方法(参见H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，Text for Bioengineering Experiments，Edited by the Society forBioscience and Bioengineering，Japan，pp.97-98，Baifukan，1992)或类似的方法，以细菌做为DNA供体制备染色体DNA。

如果通过PCR方法扩增的edd基因和/或eda基因片段与在大肠杆菌或类似细菌中具有DNA自主复制功能的载体连接，构建重组DNA，然后再将重组DNA导入大肠杆菌细胞中，那么接下来的工作就比较容易了。在大肠杆菌中具有自主复制功能的载体主要有：pMW219，pSTV28，pUC19，pUC18，pHSG299，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pBR322，pACYC184等等。

可以使用到目前为止文献报道的转化方法，将上面所提到的重组DNA导入革兰氏阴性细菌中。例如，可提及的方法有D.A.Morrison(Methods inEnzymology，68,326(1979))方法，一种用氯化钙处理受体细菌以增加DNA通透性的方法(Mandel.，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，电穿孔方法(Miller J.H.，″A Short Course in Bacterial Genetics；Handbook″，Cold Spring HarborLaboratory Press，U.S.A.，p.279，1992)等等。

通过细菌染色体DNA容纳edd基因和/或eda基因的多拷贝也能增加edd基因和/或eda基因的拷贝数。用染色体DNA中存在的多拷贝序列做为靶位点，进行同源重组，以便将edd和/或eda基因的多拷贝导入细菌的染色体DNA中。因为多拷贝序列是存在于染色体DNA上的，所以可以利用位于转座因子末端的重复DNA或反向重复。另外，据日本专利局的公开出版物(Japanese PatentLaid-open Publication)No.2-109985的报道，可将edd和/或eda基因合并进一个转座子中，然后转化细菌，使基因的多拷贝插入染色体DNA中。

除了上面所提到的基因扩增的方法外，还可通过用更强的表达调节序列替代诸如染色体DNA或质粒上调节edd和/或eda基因的启动子的表达调节序列的方法来增加EDD和/或EDA的活性。例如，lac启动子，trp启动子、trc启动子等都是公知的强启动子。另外，国际专利出版物(International PatentPublication)WO00/18935中介绍了另外一种方法，在edd基因和/或eda基因的启动子上取代几个核苷酸，被修改的启动子变为强启动子。对这些启动子的取代或修饰提高了edd基因和/或eda基因的表达水平，从而使EDD和域EDA的活性增加。可将这些表达调节序列进行修饰的方法与增加edd基因和/或eda基因拷贝数的方法结合使用。

将细胞碎片悬浊液与甘油醛-3-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸混合，然后检测是否有以6-磷酸葡糖酸为底物合成的甘油醛3-磷酸，这样可判断EDD和EDA的活性是否增强。在该反应中，可通过对加入6-磷酸葡糖酸脱氢酶反应后残存的6-磷酸葡糖酸定量来测定EDD的活性，或是使用乳酸脱氢酶在2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶过量时所产生的丙酮酸定量来测定EDD的活性。以在脱氢酶反应过程中NADH的增加来对6-磷酸葡糖酸和丙酮酸进行定量。另外，EDA的活性也可通过在乳酸脱氢酶作用下以2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸为底物合成丙酮酸的量来判定。

在本发明的革兰氏阴性细菌中，除了EDD和EDA外，也可增强其它参与L-氨基酸的生物合成的酶活性，只要这种作用不会减低EDD和EDA的活性就行。

例如，当靶L-氨基酸是L-谷氨酸时，这些酶包括谷氨酸脱氢酶(以下简称为GDH)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合成酶(以下简称CS)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下简称PEPC)、磷酸烯醇丙酮酸合酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖磷酸激酶、葡糖磷酸异构酶等等。当用于合成L-谷氨酸的细菌属肠杆菌菌属时，优选上面所提到的酶中CS、PEPC和GDH任何一种到三种。更优选CS、PEPC和GDH这三种酶的活性都增强。特别优选乳糖发酵短杆菌属的CS，因为它不受α-酮戊二酸、L-谷氨酸和NADH的抑制。

至于哪些有机体能够作为编码CS的基因(gltA)、编码GDH的基因(gdhA)和编码PEPC的基因(ppc)的供体，只要有机体具有CS、PEPC和GDH活性，都可被利用。特别是那些属于原核生物的细菌，例如肠杆菌属、克雷白菌属、欧文菌属、泛菌属、沙雷菌属、埃希氏菌属、棒状杆菌属、短杆菌属或芽孢杆菌属等。具体的菌株包括：大肠杆菌、乳糖发酵短杆菌等等。从上面所提到的微生物染色体DNA中都可分离出gltA、ppc和gdhA基因。

通过不含CS，PEPC和GDH的突变株与前面所提到的微生物染色体DNA中分离出的DNA片段进行营养缺陷的补充作用可分别获得gltA、PPc和gdhA基因。另外，因为大肠杆菌和棒状杆菌的核苷酸序列已经全部阐明(Biochemistry，22.5243-5249，1983：J.Biochem.，95：909-916，1984；Gene，27：193-199，1984.Microbiology，140：1817-1828，1994；Mol.Gen.Genet.，218，330-339，1989；Molecular Microbiology，6：317-326，1992)，就可通过其各自的核苷酸序列进行引物设计，以染色体DNA为模板通过PCR获得这些基因片段。关于将这些基因导入肠道杆菌等革兰氏阴性细菌过程的详细说明，可见EP 0670370A2，U.S.PatentNo.6,197,559，EP 0 999 282A2和EP 1 078 989 A2。

提高CS、PEPC、GDH以及前面所提到的其它酶的活性的方法与上面所介绍的增强EDD和EDA活性的方法相同。

另外，在本发明所用细菌中，可以减低或消除那些参与在合成靶L-氨基酸的生物途径的分支中合成其它产物的酶活性，但只要不影响EDD和/或EDA活性的增强就可以。例如，在合成L-谷氨酸时，这些酶的例子包括α-酮戊二酸脱氢酶(以下简称αKGDH)，异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、L-谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶等等。

为了降低或消除前面所提到的酶活性，可采用紫外线照射处理微生物的方法，或者使用一些常规的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸进行诱变，然后选择那些靶酶活性降低的突变株，也可采用基因裂解方法或类似的方法，在同源重组的基础上进行基因置换。编码αKGDH的基因的裂解方法详见U.S.Patent No.5,977,331。

如果想要将除edd基因和eda基因以外的其它基因转导入本发明中的细菌时，优选使用尽可能少的载体种类。因为，一种载体通常都带有一个标志基因，这就需要在培养基中加入所需的相应试剂。如果使用了多种载体，也就必须有大量的试剂加入培养基中。这可能会影响菌株的生长，所以，通常情况下优选使用较少的载体种类。优选使用两种或两种以下，更优选一种载体或一个载体。

此外，当使用两种或两种以上具有不同拷贝数的载体时，优选根据导入基因种类，来确定在高拷贝载体和低拷贝载体间的基因分布。

用于基因分离、基因导入宿主细菌、基因裂解等的方法可以是本领域技术人员所熟知的通常方法，主要包括染色体DNA的制备、创建染色体DNA文库、杂交、PCR、制备质粒DNA、消化裂解DNA、转化、设计一段寡核苷酸序列做为引物等方法。这些方法在1989年冷泉港实验室出版的由Sambrook J.，Fritsch E F，and Maniatis T.编写的《分子克隆与实验技术指南》第二版等书中(Sambrook J.，Fritsch E F，and Maniatis T.，“Molecular Cloning A LaboratoryManual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989))有详细描述。

<2>使用本发明的细菌生产L-氨基酸

在培养基中培养前面所提到的通过本发明的方法获得的细菌来生产L-氨基酸，在培养基中产生和累积了L-氨基酸，并从培养基中收集L-氨基酸。

为了使用本发明的细菌生产L-氨基酸，可使用普通的培养基，培养基中主要含有一般培养基所需要的碳源、氮源、无机盐、微量有机养分如氨基酸和维生素等。合成培养基和天然培养基都可以。只要是能被培养的细菌利用，可以使用任何碳源和氮源。

糖类可作为碳源使用，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和蜜糖。有机酸如醋酸、柠檬酸；醇类如乙醇等，可单独使用这些物质，也可与其它含碳源联合使用。在这些物质中优选葡萄糖和蔗糖。

可以使用的氮源有：氨水，铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和醋酸铵，硝酸盐等。

微量有机养分可以是：氨基酸、维生素、脂肪酸和核苷酸，还可有蛋白胨、酪蛋白氨基酸、和含有它们的酵母提取液和大豆蛋白分解产物等等。当培养营养缺陷型变异株时，优选提供所需的营养物质。

无机盐可以使用：磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。

培养基主要是由所用细菌的类型来决定，需氧培养的条件通常是控制酵解温度在20-45℃之间，PH值在5-9之间。在培养过程中当PH值降低时可加入碳酸钙，或者用氨气等碱性物质来中和培养物。用这种方法培养10到120个小时，就可在肉汤培养基中积累大量的L-谷氨酸。

可以使用公知的方法从完成培养后的肉汤培养基中提取L-氨基酸，如利用离子交换树脂法、沉淀法等等。

实施例

下面将参照实施例更详细地阐述本发明。

<1>恩特纳-道德洛夫途径所涉及的酶的基因克隆

已经从大肠杆菌和运动发酵单孢菌等细菌中克隆出了edd基因和eda基因，它们分别编码参与恩特纳-道德洛夫途径的两种酶EDD和EDA。成团肠杆菌在分类上属肠杆菌属，但通常认为它与大肠杆菌紧密相关。另外有研究发现大肠杆菌的基因可在成团肠杆菌中表达。因此，决定从大肠杆菌中克隆edd和eda基因。

在大肠杆菌中edd和eda基因构成一个操纵子(J.Bacteriol.，174(14)：4638-46，July 1992)，因此设计了edd-F(SEQ ID NO：1)和eda-R(SEQ ID NO：2)这样一对引物，通过PCR的方法同时扩增两个基因和包括两个基因的DNA片段。PCR使用的是PyrobestDNA聚合酶(由Takara Shuzo生产)，反应条件：在94℃条件下反应1min，然后是在94℃条件下反应30sec，在60℃条件下反应30sec，在72℃条件下反应3min，重复30个循环。

然后将得到的扩增片断用限制性内切酶Sal I和BamH I进行消化，将消化后的产物与同样用限制性内切酶Sal I和BamH I消化的质粒pMW219进行连接，然后转化大肠杆菌JM109(购自Takara Shuzo)。从转化菌中筛选出五株含有目的片段的克隆菌株，从这些菌株中提取质粒。

利用电穿孔方法将每个质粒转入成团肠杆菌AJ13601菌株中(Miller J.H.，″AShort Course in Bacterial Genetics；Handbook″，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，U.S.A.，p.279，1992)，然后检测EDD和EDA的活性，筛选出表达edd基因和eda基因的克隆菌株。

通过以下方法得到AJ13601菌株。从土壤中分离出成团肠杆菌AJ13355，这种菌的特点是在酸性环境下对L-谷氨酸耐受，并且其生长速度很快。然后从AJ13355菌株中得到一株低粘附力的变异株，将其αKGDH基因破坏从而得到AJ13356菌株。因为其αKGDH-E1蛋白亚单位的基因SUCA被破坏，所以该菌株不具有αKGDH酶活性。然后，将质粒RSFCPG和pSTVCB共转化AJ13356菌株，前者含有从大肠杆菌分离的柠檬酸合成酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)，后者含有从乳糖发酵短杆菌分离的gltA基因，这样就得到了SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株。由该菌株筛选出的AJ13601菌株在低PH的环境下对L-谷氨酸的抗性增强，其生长速度也达到最佳(EP1 078 989 A2)。

用前面描述的含有edd基因和eda基因的质粒转化细菌，随机挑选出几株菌，在LBGM9液体培养基(该培养基中包括10g/L的胰蛋白胨，5g/L的酵母提取液5g/L NaCl和5g/L的葡萄糖，1/10体积的消毒的10倍的M9液(128g/L Na₂HPO₄·7H₂O，30g/L KH₂PO₄，5g/L NaCl，10g/L of NH₄Cl))中培养15个小时，同时培养基中加入了四环素、氯霉素和卡那霉素，浓度分别为12.5mg/L，25mg/L或25mg/L。然后离心肉汤培养基回收细胞，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)和10mM MgCl₂洗两次，再用同样的缓冲液重悬。用超生波进行细胞破碎，15000rpm离心30分钟，将上层清液作为粗制酶溶液。

利用分光光度法测定这两种酶的反应产物来同时检测EDD和EDA的活性。即将50mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM MgCl₂，1mM EDTA，1mM APAD(乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸)，5mM K₂HPO₄，20单位的甘油醛3-磷酸、6-磷酸葡糖酸和粗制酶溶液混合在一起，用测量365nm波长吸光度的增加值来测定以6-磷酸葡糖为底物合成的甘油醛3-磷酸的量。用同样的方法可测定转化一个载体的菌株，结果见表1。

表1

菌株	活性(nmol/min/mg蛋白质)
		PMW219转化株	1.9
edd/eda增强菌株1	13.4
		edd/eda增强菌株2	11.5
edd/eda增强菌株3	13.2
		edd/eda增强菌株4	5.0
edd/eda增强菌株5	10.9

已经证明所有菌株的活性都得到增强，活性最高增加了约7.2倍，该菌株所含质粒称为pMW-EDDA。

<2>使用恩特纳-道德洛夫途径增强型菌株生产L-谷氨酸

首先检测恩特纳-道德洛夫途径增强型菌株对生产L-谷氨酸的影响。

上述章节提到的成团肠杆菌AJ13601菌株含有两种质粒，进一步又导入了edd基因和eda基因的菌株含有三种质粒。因此，在培养基中就必须加入三种试剂，这就使细菌的生长受到抑制，即在产生L-谷氨酸的培养系统中几乎没有细菌生长。因此只能使用两种质粒，这就需要将乳酸发酵短杆菌的柠檬酸合成酶(以下简称CS)基因、edd基因和eda基因连接入一个质粒。

载体pSTV28用来构建含有乳酸发酵短杆菌CS基因的质粒PSTVCB，载体pMW219用来克隆edd基因和eda基因，而前者是高拷贝载体。如果考虑在乳酸发酵短杆菌AJ13601菌株中利用pSTV28载体增加CS基因的数量，就必须利用pMW219载体导入这种基因来增加它的表达量。因此，构建一个基因，其特点是用来自大肠杆菌的CS基因启动子区域替代CS基因的启动子区域。

首先，以大肠杆菌W3110的染色体DNA为模板，用GLTES1(SEQ ID NO：3)和GLTEB0(SEQ ID NO.4)做引物扩增CS基因的启动子片段。然后，以短杆菌属乳酸发酵菌2256的染色体DNA为模板，用GLTBB0(SEQ ID NO：5)和GLTBA1(SEQ ID NO：6)作引物，扩增CS基因的ORF片段。用以上两种片段做模板，以GLTES2(SEQ ID NO：7)和GLTBA2(SEQ ID NO：8)做引物，采用遗传交换型PCR方法获得靶片段。将该片段用限制性内切酶SmaI和HindIII消化，然后连接到pSTV28载体上相同的位点，获得了新的质粒pSTV-C^B(^*)，这种质粒再经限制性内切酶KpnI和HindIII消化，就可得到一段包含有大肠杆菌CS基因的启动子和乳酸发酵短杆菌CS基因编码区的融合基因片段，再用T4DNA聚合酶将末端补平。将这段融合基因连接到pMW219载体上的SmaI位点构成新的质粒pMW-C^B(^*)。另外，将pMW-EDDA质粒用BamH I消化后与上面的融合片段连接，再用T4DNA聚合酶将末端补平，构成新的质粒pMW-C^B(^*)·ED。

接下来，将AJ13601菌株在LBGM9液体培养基中于31.5℃振荡过夜，适当的稀释后涂到加有12.5mg/L四环素的LBGM9培养皿中，要保证每个平皿中有100到200个克隆菌落。挑出合适的菌落在含有12.5mg/L四环素和25mg/L氯霉素的LBGM9培养皿中复制，从中再挑出耐氯霉素的菌株G106S。G106S菌株只含有RSFCPG不含有pSTVCB.在这种菌株中再转化pMW-C^B(^*)或pMW-C^B(^*)·ED质粒，分别构建成G106S pMW-C^B(^*)和G106S pMW-C^B(^*)·ED。

为了评价这些菌株生产L-谷氨酸的能力，采用发酵罐方法进行评价。所用培养基是300ml的液体培养基，其包括了50g/L的蔗糖，0.4g/L MgSO₄，0.1ml/L GD-113(消泡剂)，4g/L of(NH₄)₂SO₄，2g/L KH₂PO₄，4g/L的酵母提取液，10mg/L FeSO₄·7H₂O，10mg/L of MnSO₄·4-5H₂O，0.4g/L L-赖氨酸，0.4g/L DL-蛋氨酸0.4g/L二氨基庚二酸，12.5mg/L四环素和25mg/L氯霉素。培养条件是通气量1/1VVM，1300rpm的转速，用氨水调节PH在6.0直到蔗糖被分解完毕。培养基的660nm吸光度随时间而变化，培养基中L-谷氨酸的产量，见图1所示。L-谷氨酸的最终产量见表2。

表2

	OD620nm(x1/101)	培养时间(小时)	L-谷氨酸(g/L)
				G106S pMW-C<sup>B</sup>(<sup>*</sup>)	0.334	12	30.4
G106S pMW-C<sup>B</sup>(<sup>*</sup>)·ED	0.258	16	36.8

结果表明虽然培养的时间延长了，但通过加强恩特纳-道德洛夫途径，可以增强菌株生产L-谷氨酸的能力。

<3>恩特纳-道德洛夫途径增强型菌株生产3-羟基丁酮和2，3-丁二醇的研究

用与<2>中评价L-氨基酸生产能力的方法培养前面所提到的G106SpMW.-C^B(^*)和G106S pMW.-C^B(^*)·ED菌株，在培养过程中测定培养基和细胞中的3-羟基丁酮和2，3-丁二醇的产量。测量方法采用气相色谱法(ShimadzuCorporation，GC-1700A)，具体条件如下：

色谱柱：VARIAN PORAPLOTQ PLOT FS25×32(0.32mm×25M)

温度：气化室温度：250℃，柱内温度：240℃，FID：250℃

色谱柱进口压力：180kPa

载气流量：1.6062ml/min

结果见图2A(培养基中3-羟基丁酮的量)，图2B(培养基中2，3-丁二醇的产量)和图2C(单位细胞中3-羟基丁酮和2，3-丁二醇的产量总和)。结果显示：增强恩特纳-道德洛夫途径可提高3-羟基丁酮和2，3-丁二醇的产量。

序列列表

<110>味之素株式会社

<120>L-氨基酸的生产方法

<130>OP1517

<140>

<141>2003-03-

<150>JP 2002-88668

<151>2002-03-27

<160>8

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>1

cgctagtcga ccaattttta cactttcagg cctcg                        35

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>2

gggggggatc cagtcagaat gtcacgtttg ataat                               35

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>3

cccccgggtc tgttacctgc agacgtcg                                       28

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>4

acgcacgata tccctttcaa acatttaagg tctccttagc gc                       42

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>5

gtttgaaagg gatatcgtgg ct                                             22

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>6

aaaagcttat cgacgctccc ctcccca                                        27

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>7

cccccgggat ttccttcctc cggtctgctt                                     30

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>8

taaagcttgg tcagggcgtt ggcggtggcg                                     30

Claims (4)

1.一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养能产生L-氨基酸的微生物，在培养基中累积L-氨基酸，从培养基收集L-氨基酸，其中培养的微生物为具有恩特纳-道德洛夫途径的肠道杆菌，且所述微生物已经被改造过，使得它的6-磷酸葡糖酸脱水酶或2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶的活性被分别或同时增强，以丙酮酸做中间物的生物合成途径可产生多种L-氨基酸，从中选择此特定的L-氨基酸，其中所述L-氨基酸通过利用L-谷氨酸作为中间体或氨基供体的生物合成途径产生而且选自L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸。

2.权利要求1的方法，其中细菌属于肠杆菌属或泛菌属。

3.权利要求1的方法，其中通过增加编码6-磷酸葡糖酸脱水酶或2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶的基因的拷贝数提高这两种酶的活性，或者通过修饰基因的表达调节序列，使细菌细胞中二者的表达量提高，从而提高这两种酶的活性。

4.权利要求1-3的任何一项的方法，其中的L-氨基酸是L-谷氨酸。

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